Artykuł metodologiczny

Test obrazowania oparty na płytkach do ilościowego określania reakcji fotoperiodycznych w Neurospora crassa przy użyciu rozwoju protoperitecjum

DOI:

10.3791/71271

⸱

9 czerwca 2026

 , 
1Center for Computational and Integrative Biology (CCIB) Rutgers, The State University of New Jersey, 2Rutgers University-Camden, Department of Biology Rutgers, The State University of New Jersey, 3Institute for Empowering Equitable Education in STEM (E3-STEM)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test Protoperithecia służy do ilościowego określania reakcji fotoperiodycznych w Neurospora crassa poprzez pomiar formowania się protoperitecjum w określonych cyklach światło-cień. Ta metoda oparta na płytkach zapewnia prosty i skalowalny sposób porównywania fotoperiodycznie uzależnionych reakcji rozwojowych w różnych warunkach eksperymentalnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurospora crassa to dobrze ugruntowany organizm modelowy do badania biologicznego timingu i rozwoju regulowanego przez światło. Protoperitecjalny Test (PPA) to metoda oparta na obrazowaniu na płytkach do ilościowego określania reakcji fotoperiodicznych poprzez pomiar formowania się protoperitecjów jako wyniku rozwojowego. Celem tego protokołu jest zapewnienie powtarzalnego i skalowalnego procesu oceny, jak określone cykle światło-ciemność wpływają na rozwój płciowy grzybów. W tym teście kultury grzybów są hodowane na syntetycznym podłożu krzyżowania w kontrolowanych warunkach fotoperiodycznych, po czym następuje standaryzowane usuwanie zarodników powierzchniowych w celu poprawy wizualizacji. Protoperitecje są ilościowo określane poprzez ręczne liczenie oparte na obrazie, a średnie liczby na płytce są używane do porównań statystycznych między warunkami fotoperiodycznymi. W odróżnieniu od wcześniejszych podejść, PPA integruje standaryzowane warunki hodowli, kontrolowane narażenie na fotoperiody i kwardranową obrazowanie, aby umożliwić powtarzalne ilościowe porównania między szczepami. Ten proces wykracza poza podstawowy protokół, ustanawiając spójną i skalowalną ramę do pomiaru fotoperiodycznie uzależnionego wyjścia rozwojowego w określonych warunkach eksperymentalnych. Metoda wymaga około tygodnia od inokulacji do analizy i może być zastosowana w wielu szczepach w określonych warunkach środowiskowych. PPA zapewnia prostą i dostępną platformę do porównawczej analizy rozwoju zależnego od fotoperiodu u grzybów w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test protoperytecji (PPA) ilościowo ocenia reakcje fotoperiodyczne u grzyba Neurospora crassa. Wiele organizmów mierzy długość dnia i nocy, aby koordynować procesy biologiczne w zjawisku znanym jako fotoperiodyzm1,2,3,4,5,6,7,8. W tym teście, rozwój żeńskiej struktury seksualnej, protoperytecji, służy jako mierzalny, zależny od światła surogat reakcji fotoperiodycznej. Chociaż fotoperiodyzm jest dobrze opisany u roślin poprzez eksperymenty z przerywaniem nocy3, istnieje mniej zstandaryzowanych podejść do ilościowego określania reakcji fotoperiodycznych u eukariontów niefotosyntetyzujących, takich jak grzyby. N. crassa zapewnia dobry model systemu do tego celu ze względu na jego dobrze zdefiniowaną genetykę i zależne od światła szlaki rozwojowe. Regulacja zależna od fotoperiodu czasu rozmnażania została zaobserwowana u wielu organizmów1,2,3,4,5,6,7,8, co potwierdza znaczenie fizjologicznych reakcji sterowanych światłem; jednak badania mechanistyczne u grzybów są ograniczone przez brak reprodukowalnych testów.

Protoperytecje to wczesne żeńskie struktury seksualne u N. crassa. Powstają z askogoniów, które tworzą zwoje trikhoginowców, które łączą się z grzybniami lub konidiami przeciwnego typu rozrodczego9. Po fuzji, jądra z “męskiego” partnera wchodzą do protoperytecji. Liczba wytwarzanych protoperytecji jest sezonowo regulowana i silnie indukowana światłem10. Regulacja fotoperiodyczna jest centralna dla ekologii, chronobiologii i fizjologii grzybów, ponieważ wiele procesów kontrolowanych przez zegar zależy od światła. Światło wpływa na liczne szlaki genetyczne, w tym na fotoreceptory, kinazy i mechanizmy przekazywania światła związane z rozwojem seksualnym11. Protoperytecje są dobrze przystosowane do pomiaru wyjścia fotoperiodycznego, ponieważ są łatwo wizualizacyjne pod mikroskopem i reagują wrażliwie na światło.

Mimo ważności fotoperiodyzmu u grzybów, dostępne są nieliczne zstandaryzowane i powtarzalne testy służące do ilościowego określania produkcji protoperytecji w kontrolowanych cyklach światła. Test średniego przepływu, oparty na płytkach, jest cenny, ponieważ grzyby są tanimi i łatwymi w utrzymaniu organizmami modelowymi, umożliwiającymi systematyczną analizę rozwoju seksualnego indukowanego światłem i funkcji genów. Większość badań nad fotoperiodyzmem koncentrowała się na roślinach, podczas gdy odpowiednie ramy ilościowe dla systemów grzybowych pozostają ograniczone. U innych organizmów, w tym owadów, zjawiska zależne od światła, takie jak diapauza, są dobrze opisane7, ale porównywalne podejścia u grzybów są niedostępne. Ta luka ogranicza możliwość reprodukowalnego porównywania reakcji fotoperiodycznych między szczepami i warunkami eksperymentalnymi.

Test PPA opiera się na badaniu z 2004 roku, które mierzyło produkcję protoperytecji w rosnącym długości dnia, od stałej ciemności do stałego światła, u mutanta paska (bd) (ras-1bd), który był używany w badaniach rytmicznych4,12. Zmiany zależne od fotoperiodu w produkcji protoperytecji zostały zaobserwowane w tym tle. Obecny proces adaptuje i rozszerza to podejście, używając szczepu referencyjnego FGSC 2489, który jest związany z sekwencjonowaniem całego genomu i zasobami knockout13,14. Test ilościowo ocenia średnią liczbę protoperytecji wytwarzanych w określonych fotoperiodach przez jeden tydzień jako surogat reakcji fotoperiodycznej. To podejście standaryzuje warunki hodowli, obrazowanie i ilościową analizę, umożliwiając reprodukowalne porównanie między warunkami eksperymentalnymi i szczepami. Kluczowe postępy metodologiczne obejmują standaryzowane warunki hodowli na płytkach, zdefiniowane parametry ekspozycji na fotoperiody, obrazowanie oparte na kwardranach i reprodukowalny proces ilościowej analizy.

Ten protokół ilościowo ocenia reakcje fotoperiodyczne u N. crassa poprzez pomiar formowania się protoperytecji po ekspozycji na określone cykle światło-ciemność. Dla każdego warunku fotoperiodycznego używa się czterech powtórzeń biologicznych, z których każde składa się z jednej niezależnie inokulowanej syntetycznej płytki skrzyżowania (SC). Cztery obrazy są zbierane na płycie i uśredniane, aby wygenerować pojedynczą wartość na powtórzenie biologiczne do analizy statystycznej. Płyty są inkubowane przez siedem dni w kalibrowanych fotoperiodach (np. cykle 12 h:12 h lub 8 h:16 h światło-ciemność).

Rejest

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sprzęt, odczynniki i programy użyte w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie mediów i materiałów

(Estymowana czas: 1–1,5 h aktywnego czasu; chłodzenie przez noc opcjonalne)

  1. Przygotowanie medium syntetycznego (SC)
    1. Przygotuj medium SC: 0,2% sacharozy, 5 µg/L biotyny, 1,5% agaru i soli Westergaarda (pH 6,5 z 1 N NaOH)15.
    2. Autoklawuj medium. Pozostaw do schłodzenia do 50–55 °C, aż osiągnie stan, w którym można je rozlać.
      ​OSTROŻNOŚĆ: Podczas wyjmowania kolb z autoklawu używaj rękawic odpornych na wysoką temperaturę.
  2. Wylanie płytek
    1. Wylej 10 mL stopionego medium do 60 mm naczyń Petriego za pomocą jednorazowej pipety.
    2. Pozwól płytkom zestalić się w temperaturze pokojowej przez 30–45 min.
    3. Przechowuj płytki do góry nogami w 4 °C do 4 tygodni.
      ​UWAGA: Utrzymuj nawilżenie płytek. Nie przechowuj płytek dłużej niż 4 tygodnie w 4 °C.
  3. Przygotowanie szczepów grzybów
    1. Wyhoduj każdy szczep w małych szklanych probówkach zawierających pełne lub minimalne medium przygotowane zgodnie z instrukcjami z podręcznika laboratoryjnego15.
    2. Inkubauj probówki w ciągłej ciemności (DD) w 30 °C, aż pojawi się widoczny pokrywający powierzchnię rurek mycelium (zwykle 2–3 dni).
      OSTROŻNOŚĆ: Obsługuj kultury grzybów zgodnie ze standardowymi praktykami mikrobiologicznymi i pracuj w kabinie biobezpieczeństwa, aby zminimalizować zakażenia.

2. Inokulacja płytek

(Estymowana czas: 15–30 min na zestaw płytek)

  1. Przenoszenie zarodników grzybowych
    1. Zainokuluj każdą płytkę SC stosując sterylną technikę i pętelkę inokulacyjną.
    2. Umieść zarodniki w centrum płytki, aby zapewnić jednolite wzrost (Rysunek 1A). Zarodniki wyglądają jak proszkowe, jasne zarodki pokrywające powierzchnię kolonii.
    3. Naładuj około 1–2 µL skoncentrowanej zawiesiny zarodników (lub równoważną ilość pętelką) aby standaryzować inokulację na płytkach.
  2. Przygotowanie płytek do inkubacji
    1. Zabezpiecz płytki, aby zapobiec zanieczyszczeniu, jednocześnie umożliwiając wymianę gazów.
    2. Znacz każdą płytkę z nazwą szczepu, datą i warunkiem fotoperiodycznym.

3. Konfiguracja eksperymentu fotoperiodycznego

(Estymowana czas: 10 min konfiguracji + 7-dniowa inkubacja)

  1. Kalibracja komory wzrostowej
    1. Ustaw temperaturę komory na 25 °C.
    2. Ustaw wilgotność na 50% (akceptowalny zakres: 40%–60%) aby zapobiec wysychaniu płytek.
    3. Zaprogramuj cykle fotoperiodyczne: Równodzień (EQ): 12 h światła / 12 h ciemności i Krótki Dzień (SDP): 8 h światła / 16 h ciemności
    4. Ustaw intensywność światła na >1000 luksów na poziomie płytki używając skalibrowanego miernika światła. Unikaj intensywności, która podnosi temperaturę komory powyżej 25 °C.
      UWAGA: Upewnij się, że światła komory nie przegrzeją wnętrza.
      ​OSTROŻNOŚĆ: Nie używaj Parafilmu lub plastikowych toreb do utrzymania wilgotności, ponieważ ograniczają one wymianę gazów i zaburzają wzrost grzybów. Jeśli kontrola wilgotności jest niedostępna, umieść zbiornik wodny wewnątrz komory.
  2. Umieść płytki w komorze
    1. Ułóż płytki równomiernie na półkach, aby zapewnić jednolite naświetlenie.
    2. Umieść logger danych wewnątrz komory, aby ciągle monitorować temperaturę i wilgotność oraz zweryfikować stabilne warunki środowiskowe.
  3. Rozpocznij badanie
    1. Inkubuje płytki w zaprogramowanym fotoperiodzie przez 7 dni bez zakłóceń.

4. Monitorowanie i przygotowanie płytek do obrazowania

(Estymowana czas: 15–20 min na płytkę)

  1. Wyjmowanie płytek z komory
    1. Wyjmuj płytki po 7 dniach inkubacji.
    2. Sprawdź płytki pod kątem wzrostu zarodników i formowania się protoperitecjum.
  2. Oczyszczanie pły

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po zaszczepieniu szczepem dzikiego typu, zarodniki pokryły powierzchnię SC w ciągu 36–48 h. Po 7 dniach ekspozycji na okresowe światło, utworzyła się gęsta warstwa zarodników, którą usunięto zwilżonym ręcznikiem papierowym nasyconym 70% alkoholem (Rysunek 1). Ten krok odsłonił podstawowe protoperitecjum bez zakłócania ich struktury. Pod mikroskopem protoperitecja wyglądały jak ciemne, okrągłe struktury rozmieszczone na powierzchni płytki. Te struktury wykazywały kulistą morfologię i były roz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem PPA jest wykorzystanie rozwoju seksualnego u grzybów jako zastępczego wskaźnika do określenia, czy organizm postrzega określony fotoperiod. Poprzez ilościową ocenę średniej liczby protoperitecj wytwarzanych w różnych cyklach świetlnych, można oceniać i porównywać reakcje fotoperiodyczne w różnych warunkach. Zgodnie z poprzednimi obserwacjami4,16, N. crassa wykazuje wyższą produkcję protoperitecj w warunkach przypominających równonoc, podczas gdy kr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Cathyrn Maienza, Myo Thinzar Htin Aung, Aye Thinzar Htin Aung oraz Morgan Bartleson za wsparcie, pomoc i wkład w ten projekt. Autorzy wyrażają również wdzięczność Departamentowi Biologii na Rutgers University–Camden oraz Centrum Biologii Obliczeniowej i Integracyjnej (CCIB) za zapewnienie wsparcia instytucjonalnego, zaplecza badawczego i zasobów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarBD90000-786Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów
Alcohol burner flameWards470346-104Do sterylizacji pętli inokulacyjnej
Ammonium iron sulfate hexahydrateSupelcoFX0245-1Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów
Ammonium nitrate (NH4NO3)BeanTown ChemicalBT134170-250GDo minimalnego pożywki
AutoclaveVWR International76683-456Do sterylizacji szklańców i mediów
Biological Safety CabinetThermoFischer Scientific 1323TSDo redukcji skażenia płytek i laboratorium.
BiotinVWR97061-444Do syntetycznych mediów krzyżowych
Boric acid (H3BO3)Electron Microscopy Sciences100503-696Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów
Calcium chloride (CaCl2)AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLCJT1311-1Do syntetycznych mediów krzyżowych
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)Sigma-Aldrich223506-25GDo minimalnego pożywki
Citric acid monohydrate (C6H8O7·H2O)Sigma-Aldrich1002440500Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów
Copper sulfate pentahydrate (CuSO4·5H2O H2O)BeanTown ChemicalBT121245-1KGDo syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów
EthanolDecon Labs71001-754Stosowany do usuwania zarodników z powierzchni płytki i sterylizacji pętli inokulacyjnej
FIJI/ImageJNational Institutes of Health (NIH)N/ADo analizy obrazów/liczenia
RękawiczkiSW Safety Solutions76382-944Dla bezpieczeństwa
GraphPad PrismGraphPad Software, LLCN/ADo wykonywania testów statystycznych i tworzenia figur
Growth ChamberCaron Products & Services6320 & 6340 SeriesProgramowalny dla cykli fotoperiodu
HOBO Data LoggerOnset Computer CorporationMX2202Do logowania intensywności światła i temperatury
Pętla inokulacyjnaVWR International10806-354Do przenoszenia materiału grzybowego do miseczek Petriego
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O)BeanTown ChemicalBT145380-1KGDo syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów
Manganese sulfate monohydrate (MnSO4·H2O H2O)Sigma-Aldrich1059410250Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów
Mikroskop (Leica S6 D Greenough Stereo Microscope)Leica Microsystems10446297Do przeglądania
Neurospora crassa FGSC 2489Fungal Genetics Stock Center74-OR23-1VA, JCM19069Odmianka grzyba
Ręczniki papieroweKimberly-Clark Professional, Scott and Kleenex6666114Do polewania pożywki
Marker permanentnySharpie30072Do oznaczania płytek
Petri DishesVWR International25384-164Do platerowania syntetycznych mediów krzyżowych
PipettesVWR International75816-090Do polewania pożywki
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)BeanTown ChemicalBT225070-500GDo syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów
Potassium nitrate (KNO3)Sigma-Aldrich221295-100GDo syntetycznych mediów krzyżowych
Małe jednorazowe szklane probówkiVWR International470211-698Do początkowego wzrostu odmiany grzyba
Sodium chloride (NaCl)VWR InternationalBDH9286-500GDo syntetycznych mediów krzyżowych
Sodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7·2H2O)VWR97061-008Do minimalnego pożywki
Sodium hydroxide (NaOH)AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLCJT5635-2Do syntetycznych mediów krzyżowych
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O)Supelco1.06524.1000Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów
SucroseVWR InternationalBDH9308-500GDo syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O)BeanTown ChemicalBT122545-500GDo syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Protoperithecia AssayFungal Sexual DevelopmentLight Dark CyclesSynthetic Crossing MediumImage Based CountingPhotoperiod ExposureDevelopmental Output
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły