Test Protoperithecia służy do ilościowego określania reakcji fotoperiodycznych w Neurospora crassa poprzez pomiar formowania się protoperitecjum w określonych cyklach światło-cień. Ta metoda oparta na płytkach zapewnia prosty i skalowalny sposób porównywania fotoperiodycznie uzależnionych reakcji rozwojowych w różnych warunkach eksperymentalnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test obrazowania oparty na płytkach do ilościowego określania reakcji fotoperiodycznych w Neurospora crassa przy użyciu rozwoju protoperitecjum
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neurospora crassa to dobrze ugruntowany organizm modelowy do badania biologicznego timingu i rozwoju regulowanego przez światło. Protoperitecjalny Test (PPA) to metoda oparta na obrazowaniu na płytkach do ilościowego określania reakcji fotoperiodicznych poprzez pomiar formowania się protoperitecjów jako wyniku rozwojowego. Celem tego protokołu jest zapewnienie powtarzalnego i skalowalnego procesu oceny, jak określone cykle światło-ciemność wpływają na rozwój płciowy grzybów. W tym teście kultury grzybów są hodowane na syntetycznym podłożu krzyżowania w kontrolowanych warunkach fotoperiodycznych, po czym następuje standaryzowane usuwanie zarodników powierzchniowych w celu poprawy wizualizacji. Protoperitecje są ilościowo określane poprzez ręczne liczenie oparte na obrazie, a średnie liczby na płytce są używane do porównań statystycznych między warunkami fotoperiodycznymi. W odróżnieniu od wcześniejszych podejść, PPA integruje standaryzowane warunki hodowli, kontrolowane narażenie na fotoperiody i kwardranową obrazowanie, aby umożliwić powtarzalne ilościowe porównania między szczepami. Ten proces wykracza poza podstawowy protokół, ustanawiając spójną i skalowalną ramę do pomiaru fotoperiodycznie uzależnionego wyjścia rozwojowego w określonych warunkach eksperymentalnych. Metoda wymaga około tygodnia od inokulacji do analizy i może być zastosowana w wielu szczepach w określonych warunkach środowiskowych. PPA zapewnia prostą i dostępną platformę do porównawczej analizy rozwoju zależnego od fotoperiodu u grzybów w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.
Wprowadzenie
Test protoperytecji (PPA) ilościowo ocenia reakcje fotoperiodyczne u grzyba Neurospora crassa. Wiele organizmów mierzy długość dnia i nocy, aby koordynować procesy biologiczne w zjawisku znanym jako fotoperiodyzm1,2,3,4,5,6,7,8. W tym teście, rozwój żeńskiej struktury seksualnej, protoperytecji, służy jako mierzalny, zależny od światła surogat reakcji fotoperiodycznej. Chociaż fotoperiodyzm jest dobrze opisany u roślin poprzez eksperymenty z przerywaniem nocy3, istnieje mniej zstandaryzowanych podejść do ilościowego określania reakcji fotoperiodycznych u eukariontów niefotosyntetyzujących, takich jak grzyby. N. crassa zapewnia dobry model systemu do tego celu ze względu na jego dobrze zdefiniowaną genetykę i zależne od światła szlaki rozwojowe. Regulacja zależna od fotoperiodu czasu rozmnażania została zaobserwowana u wielu organizmów1,2,3,4,5,6,7,8, co potwierdza znaczenie fizjologicznych reakcji sterowanych światłem; jednak badania mechanistyczne u grzybów są ograniczone przez brak reprodukowalnych testów.
Protoperytecje to wczesne żeńskie struktury seksualne u N. crassa. Powstają z askogoniów, które tworzą zwoje trikhoginowców, które łączą się z grzybniami lub konidiami przeciwnego typu rozrodczego9. Po fuzji, jądra z “męskiego” partnera wchodzą do protoperytecji. Liczba wytwarzanych protoperytecji jest sezonowo regulowana i silnie indukowana światłem10. Regulacja fotoperiodyczna jest centralna dla ekologii, chronobiologii i fizjologii grzybów, ponieważ wiele procesów kontrolowanych przez zegar zależy od światła. Światło wpływa na liczne szlaki genetyczne, w tym na fotoreceptory, kinazy i mechanizmy przekazywania światła związane z rozwojem seksualnym11. Protoperytecje są dobrze przystosowane do pomiaru wyjścia fotoperiodycznego, ponieważ są łatwo wizualizacyjne pod mikroskopem i reagują wrażliwie na światło.
Mimo ważności fotoperiodyzmu u grzybów, dostępne są nieliczne zstandaryzowane i powtarzalne testy służące do ilościowego określania produkcji protoperytecji w kontrolowanych cyklach światła. Test średniego przepływu, oparty na płytkach, jest cenny, ponieważ grzyby są tanimi i łatwymi w utrzymaniu organizmami modelowymi, umożliwiającymi systematyczną analizę rozwoju seksualnego indukowanego światłem i funkcji genów. Większość badań nad fotoperiodyzmem koncentrowała się na roślinach, podczas gdy odpowiednie ramy ilościowe dla systemów grzybowych pozostają ograniczone. U innych organizmów, w tym owadów, zjawiska zależne od światła, takie jak diapauza, są dobrze opisane7, ale porównywalne podejścia u grzybów są niedostępne. Ta luka ogranicza możliwość reprodukowalnego porównywania reakcji fotoperiodycznych między szczepami i warunkami eksperymentalnymi.
Test PPA opiera się na badaniu z 2004 roku, które mierzyło produkcję protoperytecji w rosnącym długości dnia, od stałej ciemności do stałego światła, u mutanta paska (bd) (ras-1bd), który był używany w badaniach rytmicznych4,12. Zmiany zależne od fotoperiodu w produkcji protoperytecji zostały zaobserwowane w tym tle. Obecny proces adaptuje i rozszerza to podejście, używając szczepu referencyjnego FGSC 2489, który jest związany z sekwencjonowaniem całego genomu i zasobami knockout13,14. Test ilościowo ocenia średnią liczbę protoperytecji wytwarzanych w określonych fotoperiodach przez jeden tydzień jako surogat reakcji fotoperiodycznej. To podejście standaryzuje warunki hodowli, obrazowanie i ilościową analizę, umożliwiając reprodukowalne porównanie między warunkami eksperymentalnymi i szczepami. Kluczowe postępy metodologiczne obejmują standaryzowane warunki hodowli na płytkach, zdefiniowane parametry ekspozycji na fotoperiody, obrazowanie oparte na kwardranach i reprodukowalny proces ilościowej analizy.
Ten protokół ilościowo ocenia reakcje fotoperiodyczne u N. crassa poprzez pomiar formowania się protoperytecji po ekspozycji na określone cykle światło-ciemność. Dla każdego warunku fotoperiodycznego używa się czterech powtórzeń biologicznych, z których każde składa się z jednej niezależnie inokulowanej syntetycznej płytki skrzyżowania (SC). Cztery obrazy są zbierane na płycie i uśredniane, aby wygenerować pojedynczą wartość na powtórzenie biologiczne do analizy statystycznej. Płyty są inkubowane przez siedem dni w kalibrowanych fotoperiodach (np. cykle 12 h:12 h lub 8 h:16 h światło-ciemność).
Rejest
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Sprzęt, odczynniki i programy użyte w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie mediów i materiałów
(Estymowana czas: 1–1,5 h aktywnego czasu; chłodzenie przez noc opcjonalne)
- Przygotowanie medium syntetycznego (SC)
- Przygotuj medium SC: 0,2% sacharozy, 5 µg/L biotyny, 1,5% agaru i soli Westergaarda (pH 6,5 z 1 N NaOH)15.
- Autoklawuj medium. Pozostaw do schłodzenia do 50–55 °C, aż osiągnie stan, w którym można je rozlać.
OSTROŻNOŚĆ: Podczas wyjmowania kolb z autoklawu używaj rękawic odpornych na wysoką temperaturę.
- Wylanie płytek
- Wylej 10 mL stopionego medium do 60 mm naczyń Petriego za pomocą jednorazowej pipety.
- Pozwól płytkom zestalić się w temperaturze pokojowej przez 30–45 min.
- Przechowuj płytki do góry nogami w 4 °C do 4 tygodni.
UWAGA: Utrzymuj nawilżenie płytek. Nie przechowuj płytek dłużej niż 4 tygodnie w 4 °C.
- Przygotowanie szczepów grzybów
- Wyhoduj każdy szczep w małych szklanych probówkach zawierających pełne lub minimalne medium przygotowane zgodnie z instrukcjami z podręcznika laboratoryjnego15.
- Inkubauj probówki w ciągłej ciemności (DD) w 30 °C, aż pojawi się widoczny pokrywający powierzchnię rurek mycelium (zwykle 2–3 dni).
OSTROŻNOŚĆ: Obsługuj kultury grzybów zgodnie ze standardowymi praktykami mikrobiologicznymi i pracuj w kabinie biobezpieczeństwa, aby zminimalizować zakażenia.
2. Inokulacja płytek
(Estymowana czas: 15–30 min na zestaw płytek)
- Przenoszenie zarodników grzybowych
- Zainokuluj każdą płytkę SC stosując sterylną technikę i pętelkę inokulacyjną.
- Umieść zarodniki w centrum płytki, aby zapewnić jednolite wzrost (Rysunek 1A). Zarodniki wyglądają jak proszkowe, jasne zarodki pokrywające powierzchnię kolonii.
- Naładuj około 1–2 µL skoncentrowanej zawiesiny zarodników (lub równoważną ilość pętelką) aby standaryzować inokulację na płytkach.
- Przygotowanie płytek do inkubacji
- Zabezpiecz płytki, aby zapobiec zanieczyszczeniu, jednocześnie umożliwiając wymianę gazów.
- Znacz każdą płytkę z nazwą szczepu, datą i warunkiem fotoperiodycznym.
3. Konfiguracja eksperymentu fotoperiodycznego
(Estymowana czas: 10 min konfiguracji + 7-dniowa inkubacja)
- Kalibracja komory wzrostowej
- Ustaw temperaturę komory na 25 °C.
- Ustaw wilgotność na 50% (akceptowalny zakres: 40%–60%) aby zapobiec wysychaniu płytek.
- Zaprogramuj cykle fotoperiodyczne: Równodzień (EQ): 12 h światła / 12 h ciemności i Krótki Dzień (SDP): 8 h światła / 16 h ciemności
- Ustaw intensywność światła na >1000 luksów na poziomie płytki używając skalibrowanego miernika światła. Unikaj intensywności, która podnosi temperaturę komory powyżej 25 °C.
UWAGA: Upewnij się, że światła komory nie przegrzeją wnętrza.
OSTROŻNOŚĆ: Nie używaj Parafilmu lub plastikowych toreb do utrzymania wilgotności, ponieważ ograniczają one wymianę gazów i zaburzają wzrost grzybów. Jeśli kontrola wilgotności jest niedostępna, umieść zbiornik wodny wewnątrz komory.
- Umieść płytki w komorze
- Ułóż płytki równomiernie na półkach, aby zapewnić jednolite naświetlenie.
- Umieść logger danych wewnątrz komory, aby ciągle monitorować temperaturę i wilgotność oraz zweryfikować stabilne warunki środowiskowe.
- Rozpocznij badanie
- Inkubuje płytki w zaprogramowanym fotoperiodzie przez 7 dni bez zakłóceń.
4. Monitorowanie i przygotowanie płytek do obrazowania
(Estymowana czas: 15–20 min na płytkę)
- Wyjmowanie płytek z komory
- Wyjmuj płytki po 7 dniach inkubacji.
- Sprawdź płytki pod kątem wzrostu zarodników i formowania się protoperitecjum.
- Oczyszczanie pły
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po inokulacji szczepem typu dzikiego, konidia pokryły powierzchnię SC w ciągu 36–48 h. Po 7 dniach ekspozycji na fotoperiod utworzyła się gęsta warstwa konidiów, którą usunięto za pomocą zwilżonego ręcznika papierowego nasączonego 70% ethanol (Rysunek 1). Krok ten odsłonił znajdujące się pod spodem protoperitecja, nie naruszając ich struktury. W badaniu mikroskopowym protoperitecja pojawiły się jako ciemne, okrągłe struktury rozmieszczone na powierzchni płytki. Struktury te wykazywały morfol...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Celem PPA jest wykorzystanie rozwoju seksualnego u grzybów jako zastępczego wskaźnika do określenia, czy organizm postrzega określony fotoperiod. Poprzez ilościową ocenę średniej liczby protoperitecj wytwarzanych w różnych cyklach świetlnych, można oceniać i porównywać reakcje fotoperiodyczne w różnych warunkach. Zgodnie z poprzednimi obserwacjami4,16, N. crassa wykazuje wyższą produkcję protoperitecj w warunkach przypominających równonoc, podczas gdy kr...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują Cathyrn Maienza, Myo Thinzar Htin Aung, Aye Thinzar Htin Aung oraz Morgan Bartleson za wsparcie, pomoc i wkład w ten projekt. Autorzy wyrażają również wdzięczność Departamentowi Biologii na Rutgers University–Camden oraz Centrum Biologii Obliczeniowej i Integracyjnej (CCIB) za zapewnienie wsparcia instytucjonalnego, zaplecza badawczego i zasobów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agar | BD | 90000-786 | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
| Alcohol burner flame | Wards | 470346-104 | Do sterylizacji pętli inokulacyjnej |
| Ammonium iron sulfate hexahydrate | Supelco | FX0245-1 | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
| Ammonium nitrate (NH4NO3) | BeanTown Chemical | BT134170-250G | Do minimalnego pożywki |
| Autoclave | VWR International | 76683-456 | Do sterylizacji szklańców i mediów |
| Biological Safety Cabinet | ThermoFischer Scientific | 1323TS | Do redukcji skażenia płytek i laboratorium. |
| Biotin | VWR | 97061-444 | Do syntetycznych mediów krzyżowych |
| Boric acid (H3BO3) | Electron Microscopy Sciences | 100503-696 | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
| Calcium chloride (CaCl2) | AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC | JT1311-1 | Do syntetycznych mediów krzyżowych |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 223506-25G | Do minimalnego pożywki |
| Citric acid monohydrate (C6H8O7·H2O) | Sigma-Aldrich | 1002440500 | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
| Copper sulfate pentahydrate (CuSO4·5H2O H2O) | BeanTown Chemical | BT121245-1KG | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
| Ethanol | Decon Labs | 71001-754 | Stosowany do usuwania zarodników z powierzchni płytki i sterylizacji pętli inokulacyjnej |
| FIJI/ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Do analizy obrazów/liczenia |
| Rękawiczki | SW Safety Solutions | 76382-944 | Dla bezpieczeństwa |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | N/A | Do wykonywania testów statystycznych i tworzenia figur |
| Growth Chamber | Caron Products & Services | 6320 & 6340 Series | Programowalny dla cykli fotoperiodu |
| HOBO Data Logger | Onset Computer Corporation | MX2202 | Do logowania intensywności światła i temperatury |
| Pętla inokulacyjna | VWR International | 10806-354 | Do przenoszenia materiału grzybowego do miseczek Petriego |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | BeanTown Chemical | BT145380-1KG | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
| Manganese sulfate monohydrate (MnSO4·H2O H2O) | Sigma-Aldrich | 1059410250 | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
| Mikroskop (Leica S6 D Greenough Stereo Microscope) | Leica Microsystems | 10446297 | Do przeglądania |
| Neurospora crassa FGSC 2489 | Fungal Genetics Stock Center | 74-OR23-1VA, JCM19069 | Odmianka grzyba |
| Ręczniki papierowe | Kimberly-Clark Professional, Scott and Kleenex | 6666114 | Do polewania pożywki |
| Marker permanentny | Sharpie | 30072 | Do oznaczania płytek |
| Petri Dishes | VWR International | 25384-164 | Do platerowania syntetycznych mediów krzyżowych |
| Pipettes | VWR International | 75816-090 | Do polewania pożywki |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | BeanTown Chemical | BT225070-500G | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
| Potassium nitrate (KNO3) | Sigma-Aldrich | 221295-100G | Do syntetycznych mediów krzyżowych |
| Małe jednorazowe szklane probówki | VWR International | 470211-698 | Do początkowego wzrostu odmiany grzyba |
| Sodium chloride (NaCl) | VWR International | BDH9286-500G | Do syntetycznych mediów krzyżowych |
| Sodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7·2H2O) | VWR | 97061-008 | Do minimalnego pożywki |
| Sodium hydroxide (NaOH) | AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC | JT5635-2 | Do syntetycznych mediów krzyżowych |
| Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O) | Supelco | 1.06524.1000 | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
| Sucrose | VWR International | BDH9308-500G | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O) | BeanTown Chemical | BT122545-500G | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
Bibliografia
- Wood SH et al. Circadian clock mechanism driving mammalian photoperiodism. Nat Commun. 2020;11:4291.
- Wikelski M et al. Avian circannual clocks: adaptive significance and possible involvement of energy turnover in their proximate control. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008;363:411-23.
- Wang Q et al. Plants distinguish different photoperiods to independently control seasonal flowering and growth. Science. 2024;383:eadg9196.
- Tan Y, Merrow M, Roenneberg T. Photoperiodism in Neurospora crassa. J Biol Rhythms. 2004;19:135-43.
- Kumar V. Photoperiodism in higher vertebrates: an adaptive strategy in temporal environment. Indian J Exp Biol. 1997;35:427-37.
- Jabbur ML et al. Bacteria can anticipate the seasons: photoperiodism in cyanobacteria. Science. 2024;385:1105-11.
- Ikeno T et al. Photoperiodic diapause under the control of circadian clock genes in an insect. BMC Biol. 2010;8:116.
- Arendt J. Melatonin and the pineal gland: influence on mammalian seasonal and circadian physiology. Rev Reprod. 1998;3:13-22.
- Kronstad JW, Staben C. Mating type in filamentous fungi. Annu Rev Genet. 1997;31:245-76.
- Innocenti FD, Pohl U, Russo VE. Photoinduction of protoperithecia in Neurospora crassa by blue light. Photochem Photobiol. 1983;37:49-51.
- Carrillo AJ et al. Functional profiling of transcription factor genes in Neurospora crassa. G3 (Bethesda). 2017;7:2945-56.
- Belden WJ et al. The band mutation in Neurospora crassa is a dominant allele of ras-1 implicating RAS signaling in circadian output. Genes Dev. 2007;21:1494-05.
- Colot HV et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103:10352-7.
- Galagan JE et al. The genome sequence of the filamentous fungus Neurospora crassa. Nature. 2003;422:859-68.
- Perkins DD. How to choose and prepare media. Available from: https://www.fgsc.net/neurosporaprotocols/How%20to%20choose%20and%20prepare%20media.pdf. Accessed April 10, 2026.
- Corrochano LM. Fungal photobiology: a synopsis. IMA Fungus. 2011;2:25-8.
- Corrochano LM. Light in the fungal world: from photoreception to gene transcription and beyond. Annu Rev Genet. 2019;53:149-70.
- Roenneberg T, Merrow M. Seasonality and photoperiodism in fungi. J Biol Rhythms. 2001;16:403-14.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
