Test Protoperithecia służy do ilościowego określania reakcji fotoperiodycznych w Neurospora crassa poprzez pomiar formowania się protoperitecjum w określonych cyklach światło-cień. Ta metoda oparta na płytkach zapewnia prosty i skalowalny sposób porównywania fotoperiodycznie uzależnionych reakcji rozwojowych w różnych warunkach eksperymentalnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test obrazowania oparty na płytkach do ilościowego określania reakcji fotoperiodycznych w Neurospora crassa przy użyciu rozwoju protoperitecjum
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neurospora crassa to dobrze ugruntowany organizm modelowy do badania biologicznego timingu i rozwoju regulowanego przez światło. Protoperitecjalny Test (PPA) to metoda oparta na obrazowaniu na płytkach do ilościowego określania reakcji fotoperiodicznych poprzez pomiar formowania się protoperitecjów jako wyniku rozwojowego. Celem tego protokołu jest zapewnienie powtarzalnego i skalowalnego procesu oceny, jak określone cykle światło-ciemność wpływają na rozwój płciowy grzybów. W tym teście kultury grzybów są hodowane na syntetycznym podłożu krzyżowania w kontrolowanych warunkach fotoperiodycznych, po czym następuje standaryzowane usuwanie zarodników powierzchniowych w celu poprawy wizualizacji. Protoperitecje są ilościowo określane poprzez ręczne liczenie oparte na obrazie, a średnie liczby na płytce są używane do porównań statystycznych między warunkami fotoperiodycznymi. W odróżnieniu od wcześniejszych podejść, PPA integruje standaryzowane warunki hodowli, kontrolowane narażenie na fotoperiody i kwardranową obrazowanie, aby umożliwić powtarzalne ilościowe porównania między szczepami. Ten proces wykracza poza podstawowy protokół, ustanawiając spójną i skalowalną ramę do pomiaru fotoperiodycznie uzależnionego wyjścia rozwojowego w określonych warunkach eksperymentalnych. Metoda wymaga około tygodnia od inokulacji do analizy i może być zastosowana w wielu szczepach w określonych warunkach środowiskowych. PPA zapewnia prostą i dostępną platformę do porównawczej analizy rozwoju zależnego od fotoperiodu u grzybów w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.
Wprowadzenie
Test protoperytecji (PPA) ilościowo ocenia reakcje fotoperiodyczne u grzyba Neurospora crassa. Wiele organizmów mierzy długość dnia i nocy, aby koordynować procesy biologiczne w zjawisku znanym jako fotoperiodyzm1,2,3,4,5,6,7,8. W tym teście, rozwój żeńskiej struktury seksualnej, protoperytecji, służy jako mierzalny, zależny od światła surogat reakcji fotoperiodycznej. Chociaż fotoperiodyzm jest....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Sprzęt, odczynniki i programy użyte w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie mediów i materiałów
(Estymowana czas: 1–1,5 h aktywnego czasu; chłodzenie przez noc opcjonalne)
- Przygotowanie medium syntetycznego (SC)
- Przygotuj medium SC: 0,2% sacharozy, 5 µg/L biotyny, 1,5% agaru i soli Westergaarda (pH 6,5 z 1 N NaOH)15.
- Autoklawuj medium. Pozostaw do schłodzenia do 50–55 °C, aż osiągnie stan, w którym można je rozlać.
OSTROŻNOŚĆ: Podczas wyjmowania kolb z autoklawu używaj....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po inokulacji szczepem typu dzikiego, konidia pokryły powierzchnię SC w ciągu 36–48 h. Po 7 dniach ekspozycji na fotoperiod utworzyła się gęsta warstwa konidiów, którą usunięto za pomocą zwilżonego ręcznika papierowego nasączonego 70% ethanol (Rysunek 1). Krok ten odsłonił znajdujące się pod spodem protoperitecja, nie naruszając ich struktury. W badaniu mikroskopowym protoperitecja pojawiły się jako ciemne, okrągłe struktury rozmieszczone na powierzchni płytki. Struktury te wykazywały morfol.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Celem PPA jest wykorzystanie rozwoju seksualnego u grzybów jako zastępczego wskaźnika do określenia, czy organizm postrzega określony fotoperiod. Poprzez ilościową ocenę średniej liczby protoperitecj wytwarzanych w różnych cyklach świetlnych, można oceniać i porównywać reakcje fotoperiodyczne w różnych warunkach. Zgodnie z poprzednimi obserwacjami4,16, N. crassa wykazuje wyższą produkcję protoperitecj w warunkach przypominających równonoc, podczas gdy kr.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują Cathyrn Maienza, Myo Thinzar Htin Aung, Aye Thinzar Htin Aung oraz Morgan Bartleson za wsparcie, pomoc i wkład w ten projekt. Autorzy wyrażają również wdzięczność Departamentowi Biologii na Rutgers University–Camden oraz Centrum Biologii Obliczeniowej i Integracyjnej (CCIB) za zapewnienie wsparcia instytucjonalnego, zaplecza badawczego i zasobów.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agar | BD | 90000-786 | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
| Alcohol burner flame | Wards | 470346-104 | Do sterylizacji pętli inokulacyjnej |
| Ammonium iron sulfate hexahydrate | Supelco | FX0245-1 | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
| Ammonium nitrate (NH4NO3) | BeanTown Chemical | BT134170-250G | Do minimalnego pożywki |
| Autoclave | VWR International | 76683-456 | Do sterylizacji szklańców i mediów |
| Biological Safety Cabinet | ThermoFischer Scientific | 1323TS | Do redukcji skażenia płytek i laboratorium. |
| Biotin | VWR | 97061-444 | Do syntetycznych mediów krzyżowych |
| Boric acid (H3BO3) | Electron Microscopy Sciences | 100503-696 | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
| Calcium chloride (CaCl2) | AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC | JT1311-1 | Do syntetycznych mediów krzyżowych |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 223506-25G | Do minimalnego pożywki |
| Citric acid monohydrate (C6H8O7·H2O) | Sigma-Aldrich | 1002440500 | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
| Copper sulfate pentahydrate (CuSO4·5H2O H2O) | BeanTown Chemical | BT121245-1KG | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
| Ethanol | Decon Labs | 71001-754 | Stosowany do usuwania zarodników z powierzchni płytki i sterylizacji pętli inokulacyjnej |
| FIJI/ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Do analizy obrazów/liczenia |
| Rękawiczki | SW Safety Solutions | 76382-944 | Dla bezpieczeństwa |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | N/A | Do wykonywania testów statystycznych i tworzenia figur |
| Growth Chamber | Caron Products & Services | 6320 & 6340 Series | Programowalny dla cykli fotoperiodu |
| HOBO Data Logger | Onset Computer Corporation | MX2202 | Do logowania intensywności światła i temperatury |
| Pętla inokulacyjna | VWR International | 10806-354 | Do przenoszenia materiału grzybowego do miseczek Petriego |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | BeanTown Chemical | BT145380-1KG | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
| Manganese sulfate monohydrate (MnSO4·H2O H2O) | Sigma-Aldrich | 1059410250 | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
| Mikroskop (Leica S6 D Greenough Stereo Microscope) | Leica Microsystems | 10446297 | Do przeglądania |
| Neurospora crassa FGSC 2489 | Fungal Genetics Stock Center | 74-OR23-1VA, JCM19069 | Odmianka grzyba |
| Ręczniki papierowe | Kimberly-Clark Professional, Scott and Kleenex | 6666114 | Do polewania pożywki |
| Marker permanentny | Sharpie | 30072 | Do oznaczania płytek |
| Petri Dishes | VWR International | 25384-164 | Do platerowania syntetycznych mediów krzyżowych |
| Pipettes | VWR International | 75816-090 | Do polewania pożywki |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | BeanTown Chemical | BT225070-500G | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
| Potassium nitrate (KNO3) | Sigma-Aldrich | 221295-100G | Do syntetycznych mediów krzyżowych |
| Małe jednorazowe szklane probówki | VWR International | 470211-698 | Do początkowego wzrostu odmiany grzyba |
| Sodium chloride (NaCl) | VWR International | BDH9286-500G | Do syntetycznych mediów krzyżowych |
| Sodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7·2H2O) | VWR | 97061-008 | Do minimalnego pożywki |
| Sodium hydroxide (NaOH) | AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC | JT5635-2 | Do syntetycznych mediów krzyżowych |
| Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O) | Supelco | 1.06524.1000 | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
| Sucrose | VWR International | BDH9308-500G | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O) | BeanTown Chemical | BT122545-500G | Do syntetycznych mediów krzyżowych/minimalnych mediów |
Bibliografia
- Wood SH et al. Circadian clock mechanism driving mammalian photoperiodism. Nat Commun. 2020;11:4291.
- Wikelski M et al. Avian circannual clocks: adaptive significance and possible involvement of energy turnover in their proximate control. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008;363:411-23.
- Wang Q et al. Plants distinguish different photoperiods to independently control seasonal flowering and growth. Science. 2024;383:eadg9196.
- Tan Y, Merrow M, Roenneberg T. Photoperiodism in Neurospora crassa. J Biol Rhythms. 2004;19:135-43.
- Kumar V. Photoperiodism in higher vertebrates: an adaptive strategy in temporal environment. Indian J Exp Biol....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
