Wspólna klasa wariantów genetycznych związanych z zapaleniem naczyń w interferonopatiach typu I w populacji dziecięcej

Podsumowanie

Sekwencjonowanie eksozomów u 1204 pacjentów pediatrycznych z podejrzeniem autoprzeciwzapalnej choroby wykryło warianty związane z interferonopatią w 132 przypadkach, w tym 79 nowych mutacji. Większość była heterozygotyczna i związana z fenotypami zapalenia naczyń. Te odkrycia podkreślają wartość diagnostyczną testów genetycznych oraz centralną rolę dysregulowanego sygnałowania interferonu typu I w pediatrycznym zapaleniu naczyń.

Streszczenie

Przewlekła zapalenie naczyń u dzieci jest tradycyjnie diagnozowana poprzez ocenę histopatologiczną; jednak coraz częściej w praktyce klinicznej stosuje się mniej inwazyjne podejścia oparte na obrazowaniu. Mimo tych postępów, identyfikacja etiologii monogennej pozostaje niezbędna dla zrozumienia mechanizmów chorobowych, przewidywania rokowania i wyznaczania ukierunkowanych strategii terapeutycznych. Interferonopatie typu I obejmują niejednorodną grupę zaburzeń immunologicznych charakteryzujących się składowym przekaźnictwem interferonowym i częstymi objawami zapalenia naczyń lub naczyniopatii. Trwała aktywacja ścieżek wykrywających kwasy nukleinowe i upośledzona homeostaza wewnątrzkomórkowa przyczyniają się do dysfunkcji śródbłonka i przewlekłego zapalenia naczyń.

To badanie przedstawia kompleksowy przepływ analizy genetycznej w celu wykrycia wariantów związanych z zapaleniem naczyń w genach związanych z interferonopatią w ramach dziecięcej kohorty chorób autozapalennych. Sekwencjonowanie eksozomu przeprowadzono u 1204 pacjentów z podejrzeniem chorób autozapalennych. Warianty wpływające na regiony kodujące i miejsca splajsowania analizowano za pomocą bioinformatycznego potoku opartego na wytycznych American College of Medical Genetics and Genomics, integrując filtrację statystyczną i techniki przetwarzania sygnału inspirowane dyskretnymi transformacjami Fouriera (DFT) oraz rozkładami statystycznymi w celu poprawy priorytetyzacji i interpretacji wariantów.

Warianty związane z interferonopatią zidentyfikowano u 132 pacjentów pediatrycznych ocenianych na podstawie bazy danych kliniki reumatologicznej. Ogólnie wykryto 92 unikalne warianty, w tym 13 wcześniej zgłaszanych patogennych lub prawdopodobnie patogennych wariantów oraz 79 nowych wariantów, które nie były obecne w publicznych bazach danych do lutego 2026 roku. Objawy kliniczne obejmowały głównie nawracającą gorączkę, objawy zapalenia naczyń i złożone objawy autozapaleniowe.

Warianty dotyczyły genów związanych z dysregulowanym przekaźnictwem interferonowym i aktywacją odporności wrodzonej, w tym ścieżek związanych z aktywacją STING, metabolizmem kwasów nukleinowych i dysfunkcją transportu wewnątrzkomórkowego. Ten interdyscyplinarny przepływ pokazuje potencjalną przydatność analizy genomowej w dziecięcym zapaleniu naczyń i podkreśla znaczenie trwałego przekaźnictwa interferonowego w patogenezie uszkodzenia naczyń i chorób autozapalennych.

Wprowadzenie

Pediatryczna zapalczyna naczyń była tradycyjnie diagnozowana poprzez ocenę histopatologiczną, która nadal jest standardem złotym. Jednak ostatnie strategie diagnostyczne coraz częściej preferują mniej inwazyjne podejścia, szczególnie modalności oparte na obrazowaniu. Mimo tych postępów, zidentyfikowanie etiologii monogenicznej jest o ogromnym znaczeniu w dziecięcej zapalczynie naczyń, ponieważ zapewnia krytyczne informacje o mechanizmach choroby, rokowaniu i możliwościach leczenia ukierunkowanego^1,2.

Zapalczyna naczyń u dzieci powinna być podejrzewana u dzieci przedstawiających objawy ogólnoustrojowego zapalenia i zajęcia wielonarządowego. Do ustalenia diagnozy i wykluczenia chorób imitacyjnych wymagane jest dokładne wywiadywanie, kompleksowe badanie fizykalne, badania laboratoryjne, badania obrazowe, a w niektórych przypadkach biopsje tkanek. Wczesne wykrycie i leczenie są istotne, ponieważ nieleczona choroba może prowadzić do groźnych powikłań lub długotrwałych skutków wtórnych¹.

Interferonopatie typu I obejmują zróżnicowane spektrum monogenicznych i złożonych chorób immunologicznych oznaczanych przez utrzymującą się aktywację szlaku interferonu typu I oraz nawracające cechy zapalczyny naczyń lub vaskulopatii^3,4. Dysregulacja wykrywania kwasów nukleinowych i upośledzone homeostazy komórkowe są centralnymi mechanizmami patogenezy łączącymi utrzymującą się nadprodukcję interferonu z zapaleniem i uszkodzeniem naczyń. Mutacje zyskujące funkcję w genie TMEM173 (STING1) powodują vaskulopatię związaną ze STING o początku w niemowlęctwie (SAVI), podczas gdy autosomalnie dominujące mutacje COPA zakłócają transport przez siateczkę śródplazmatyczną i aparat Golgiego, prowadząc do nieprawidłowej aktywacji STING i fenotypu zapalczyny naczyń^3-5. Dodatkowe interferonopatie spowodowane defektami genów metabolizujących kwasy nukleinowe (TREX1, RNASEH2A/B/C, SAMHD1, ADAR1 i IFIH1) dodatkowo podkreślają mechanizmy powiązania dysregulacji interferonu z patologią naczyń³ (patrz Rycina 1).

Rycina 1. Szczegółowa architektura patogenna interferonopatii typu I napędzających dysfunkcję endotelialną i uszkodzenie mikrokrążenia w pediatrycznych kohortach. (Lewo) Układowe konteksty pediatrycznej interferonopatii typu I: defektowna dyskryminacja samo-nie-samo i nieprawidłowe wykrywanie kwasów nukleinowych przez gospodarza wywołuje ogólnoustrojowe zapalenie autoimmunologiczne. Fenotyp kliniczny charakteryzuje się przede wszystkim wczesnym występowaniem skurczu naczyń skóry i zajęciami ogólnoustrojowymi, często objawiającymi się jako zmiany skórne przypominające odmrożenia. (Środek) Mechanizm szlaku od defektu genetycznego do ogólnoustrojowej dysregulacji: mutacje z ograniczoną funkcją w enzymach usuwających kwasy nukleinowe (np. DNASE1, TREX1) prowadzą do nieprawidłowego gromadzenia się endogennego DNA i RNA w cytoplazmie. Jednocześnie mutacje zyskujące funkcję w czujnikach takich jak STING1 napędzają konstytutywną aktywację szlaku cGAS-STING niezależną od wirusowych bodźców. Ta patogenna wewnątrzkomórkowa aktywność czujników hiperaktywuje czynniki regulacyjne interferonu, prowadząc do ciągłej syntezy interferonu typu I (IFN-α/β). Przewlekły wydajność cytokin prowadzi do samodzielnego wzmacniania systemowego pętli poprzez receptory IFNAR1/2, pogarszanego przez upośledzone mechanizmy usuwania i mechanizmy sprzężenia zwrotnego. (Prawo) Wynik patologiczny: trwałe wiązanie krążącego IFN-α/β do kompleksu receptorów komórek śródbłonka indukuje utrzymującą się aktywację JAK-STAT. Ta ciągła perturbacja homeostazy prowokuje trwające obciążenie endotelialne i upośledza fizjologiczne mechanizmy rozkurczu naczyń. Na poziomie włośniczek krwionośnych ten hiperinflamatoryjny stan powoduje bezpośrednie uszkodzenie komórek śródbłonka, znaczne pogrubienie ściany naczynia i mikrozakrzepicę śródnaczyniową, prowadząc do ciężkiej niedokrwienia tkanek i martwiczej mikroangiopatii bez autoprzeciwciałowych ścieżek autoimmunologicznych. Skróty: cGAS-STING = cykliczny syntetaza GMP-AMP-stymulator genów interferonowych; DNASE1 = deoksyrybonukleaza 1; GoF = zysk funkcji; IFN = interferon; IFNAR = receptor interferonu alfa/beta; IRF = czynnik regulacyjny interferonu; JAK-STAT = białko Janus kinaza-przekazujące sygnał i aktywujące białko transkrypcyjne; STING1 = stymulator odpowiedzi interferonowej związany z cGAMP; TREX1 = trójkońcowy eksonukleazy 1. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.

To podejście zostało opracowane w celu wykrycia wariantów genów związanych z interferonopatiem w pediatrycznych kohortach zapalczyny autoimmunologicznej, ponieważ konwencjonalne metody mogą napotykać wyzwania analityczne w wczesnym prioryteto

Protokół

Protokół ten został zatwierdzony przez Komisję Etyczną Wydziału Medycznego Uniwersytetu Ege. Wszystkie próbki krwi obwodowej pobrane były po uzyskaniu pisemnej zgody pacjentów lub ich opiekunów prawnych, zgodnie z Deklaracją Helsińską. Niniejsze retrospektywne, jednocentrowe badanie zostało zaprojektowane w celu oceny częstości występowania wariantów związanych z interferonopatią u pacjentów poddawanych analizie genetycznej podejrzewanej o autoprzeciwzapalnej choroby oraz badania ich związku z zapaleniem naczyń. W latach 2022–2025 włączono próbki krwi obwodowej wysłane do Laboratorium Medycyny Molekularnej Uniwersytetu Ege z wstępną diagnozą autoprzeciwzapalnej choroby. Łącznie 1204 próbki przeszły analizę genetyczną. CES/WES zostały zastosowane jako podejście sekwencjonowania nowej generacji (NGS) ukierunkowane na egzony i sąsiednie sekwencje intronowe. Warianty zostały sklasyfikowane z wykorzystaniem kryteriów ACMG i analizy bioinformatycznej. Warianty łagodne i potencjalnie łagodne zostały wykluczone. Wśród tych pacjentów, 132 przypadki pediatryczne z zidentyfikowanymi wariantami związanymi z interferonopatią, które spełniały kryteria włączenia, zostały włączone do ostatecznej kohorty badawczej.

Wśród tej pediatrycznej kohorty, dane kliniczne zostały pozyskane z bazy danych kliniki reumatologicznej. Ogólnie, 92 unikalne warianty genetyczne zostały zidentyfikowane wśród 132 pacjentów, w tym 13 poprzednio zgłoszonych patogennych lub prawdopodobnie patogennych wariantów udokumentowanych w publicznych bazach danych wariantów (np. ClinVar) oraz 79 nowych wariantów, które nie były obecne w publicznych bazach danych do lutego 2026 roku. Większość wariantów była heterozygotyczna i była związana z fenotypami podobnymi do CAPS lub złożonymi przebiegami zapalenia naczyń autoprzeciwzapalnego. WES wykorzystywała podejście NGS ukierunkowane na regiony kodujące białka (egzony) i sąsiednie sekwencje intronowe w celu wykrycia wariantów miejsc splajsowania i regulatorowych. Chociaż WES obejmuje około 1–2% ludzkiego genomu, uchwytuje prawie 85% znanych mutacji wywołujących choroby, co czyni go bardzo skutecznym narzędziem do wykrywania rzadkich wariantów.

Proces laboratoryjny obejmował ekstrakcję DNA genomowego z krwi obwodowej, fragmentację DNA, przygotowanie bibliotek z ligowanymi adapterami i wzbogacanie eksomu za pomocą sond hybrydyzacyjnych z wykorzystaniem sond do uchwytywania opartych na hybrydyzacji poprzez pulldown biotin-streprawidyna. Sekwencjonowanie parzystej końcówki o wysokiej wydajności zostało wykonane na platformie sekwencjonowania nanokulek DNA, osiągając średnią głębokość pokrycia 100–200x w celu zapewnienia niezawodnego wykrywania wariantów. Analiza bioinformatyczna obejmowała dopasowanie do genomu referencyjnego, wywoływanie wariantów i adnotację z wykorzystaniem skonsolidowanych baz danych wariantów, przy czym klasyfikacja wariantów była przeprowadzana zgodnie z wytycznymi American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Warianty zostały sklasyfikowane jako wcześniej zgłoszone lub nowe. Wybrane warianty zostały zweryfikowane za pomocą sekwencjonowania Sangera.

Oprócz standardowych pipelineów bioinformatycznych, zastosowano zasady przetwarzania sygnałów oparte na fizyce i uproszczone modelowanie obliczeniowe w celu oceny głębokości sekwencjonowania, jednorodności pokrycia i charakterystyk sygnał-szum, zapewniając w ten sposób eksploracyjną, uzupełniającą warstwę analizy surowej głębokości sekwencjonowania i regionalnego pokrycia. Ponadto zastosowano koncepcje modelowania biofizycznego do oceny skumulowanych wpływów wariantów genetycznych związanych z zapaleniem naczyń.

To interdyscyplinarne ramy służą jako wstępny model laboratoryjny do badania cech filtrowania wariantów w kontekście eksploracyjnego badania, szczególnie w celu kierowania strategiami terapeutycznymi przeciwko interferonom. Ograniczenia obejmują zmniejszoną czułość dla wariantów mozaikowych o niskiej zawartości oraz wymóg funkcjonalnej walidacji nowych odkryć. Potencjalne zastosowania obejmują wczesną diagnozę pediatrycznego zapalenia naczyń, spersonalizowane podejmowanie decyzji terapeutycznych oraz rozszerzenie baz danych wariantów dotyczących immunologii, reumatologii i medycyny naczyniowej.

Fragmentacja DNA

Dwudziestu mikrolitrów rozcieńczonego DNA przeniesiono do nowych sterylnych probówek PCR. Do każdej probówki dodano 2 μL buforu fragmentacji/adenylacji i 3 μL mieszaniny enzymów fragmentacji/adenylacji; całkowita objętość reakcji wynosiła 25 μL. Mieszaninę delikatnie wymieszano, krótko scentrumowano, a program fragmentacji działał na cyklu termicznym. Zaraz po zakończeniu, probówki krótko scentrumowano i umieszczono na lodzie. Oczekiwanym wynikiem był średni rozmiar fragmentu DNA wynoszący 200–300 bp.

Ligacja adapterów

Do każdego produktu fragmentacji dodano 2,5 μL adaptera sekwencjonowania, a następnie 10 μL mieszaniny masterowej ligacji (bez mieszania). Mieszaninę delikatnie wypipowano, aby zapewnić jednorodność, krótko scentrumowano i inkubowano w temperaturze 20 °C przez 15 min z otwartą pokry

Wyniki

W tej kohorcie 132 pacjentów z zidentyfikowanymi wariantami związanymi z interferonopatią, zidentyfikowano szerokie spektrum wariantów genetycznych (Tabela 1). Wśród pacjentów 53 (40,2%) było kobiet, a 79 (59,8%) mężczyzn. Średnia wieku wynosiła 10,2 lat (zakres: 0–18 lat). Dane na poziomie pacjenta odpowiadające ostatecznej kohorcie są dostępne w Tabeli uzupełniającej S1.

Tabela 1: Rozkład i klasyfikacja związanych z genetycznymi wariantami interferonopatii typu I zidentyfikowanych w pediatrycznej kohorcie zapalenia autoimmunologicznego (n = 132). Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę

Najczęściej dotkniętymi genami były ADAR (25 pacjentów, 18,94%) i DNASE1 (24 pacjentów, 18,18%). Warianty DNASE1 były wyłącznie klasy 3 (100% w obrębie genu; 18,18% całej kohorty). Podobnie, większość wariantów ADAR była klasy 3 (24 pacjentów, 96,00%; 18,18% całej kohorty), z tylko jednym wariantem klasy 2 (4,00% w obrębie genu; 0,76% całej kohorty) (Tabela 2).

Tabela 2: Warianty zidentyfikowane w panelu NGS rzadkich chorób. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę

Warianty w STING1 (20 pacjentów, 15,15%) i RNASEH2B (14 pacjentów, 10,61%) również były powszechne. Wszystkie warianty STING1 były klasy 3 (100%). Dla RNASEH2B, 10 pacjentów (71,43%) miało warianty klasy 3 (7,58% całej kohorty), podczas gdy 4 pacjentów (28,57%) miało warianty klasy 2 (3,03% całej kohorty).

Mutacje RNASEH2A zidentyfikowano u 13 pacjentów (9,85%), wszyscy z nich mieli warianty klasy 3 (100%). Mutacje TREX1 występowały u 10 pacjentów (7,58%), w tym 8 wariantów klasy 3 (80,00%; 6,06% całej kohorty) i 2 wariantów klasy 2 (20,00%; 1,52% całej kohorty).

Warianty SAMHD1 wykryto u 9 pacjentów (6,82%), przy czym 7 pacjentów miało warianty klasy 3 (77,78%; 5,30% całej kohorty), 1 pacjent wariant klasy 1 (11,11%; 0,76%), i 1 pacjent wariant klasy 2 (11,11%; 0,76%).

Mutacje RNASEH2C znaleziono u 8 pacjentów (6,06%), wszyscy z nich byli klasy 3. Mutacje DNASE1L3 zidentyfikowano u 6 pacjentów (4,55%), w tym 5 wariantów klasy 3 (83,33%; 3,79% całej kohorty) i 1 wariant klasy 2 (16,67%; 0,76%). Mutacje PSMB8 i COPA wykryto u 5 pacjentów (3,79%), ze wszystkimi wariantami klasy 3 (100%). Mutacje DNASE2 i STAT4 były obecne u 3 pacjentów (2,27%), ze wszystkimi wariantami klasy 3.

Ogólnie rzecz biorąc, warianty klasy 3 stanowiły dominującą klasę wariantów we wszystkich genach w kohorcie. Określone miejsca wariantów, w tym szczegółowe zastępstwa nukleotydów i odpowiadające im zmiany aminokwasów w docelowych genach, są skatalogowane w Tabeli 3.

Analiza eksploracyjna wydajności przetwarzania sygnałów

Aby zbadać odporność i czułość przepływu przetwarzania sygnałów opartego na DFT, przeprowadzono porównawczą analizę wskaźników wydajności w stosunku do standardowego przepływu pracy dotyczącego wykrywania wariantów tylko GATK, skupiając się szczególnie na obszarach genomu o niskiej pokryciu (głębokość < 30x). W wstępnej analizie wskaźników wydajności, zintegrowana struktura filtrowania DFT wykazała potencjalny trend do poprawy priorytetyzacji w wybranych obszarach o niskiej głębokości, sugerując eksploracyjną estymację odzysku do 96,8% w tych określonych warunkach kontroli laboratoryjnej. Co ważne, te parametry i wskaźniki wydajności numerycznej reprezentują wstępne, eksploracyjne wyniki skalibrowane w kontekście konkretnej kohorty instytucjonalnej, a nie uniwersalnie zweryfikowany przepływ kliniczny. Przepływ również odzyskał wcześniej odrzucone prawdziwe pozytywne warianty w regionach o wysokim poziomie szumów. Ponadto FDR zostało zmniejszone z 6,4% do 1,2%, co podkreśla potencjalną odporność niskiego filtru pasmowego na eliminowanie częstotliwości artefaktów sekwencjonowania. Wśród nowych wariantów zidentyfikowanych w kohorcie, 14 warian

Dyskusja

Kluczowe kroki w protokole obejmują fragmentację DNA, ligowanie adapterów, amplifikację PCR oraz kołową strukturę DNA (ssDNA). W trakcie tych etapów konieczne jest staranne wykonanie, aby zminimalizować ryzyko skażenia. Precyzyjne płukanie etanolem i odpowiednie czasy inkubacji na stojaku magnetycznym podczas oczyszczania opartego na kulkach są obowiązkowe, gdyż odchylenia mogą skutkować zmniejszeniem wydajności produktu lub pominięciem wykrycia wariantów. Podczas przygotowania zbiorczych bibliotek wymagane jest dokładne obliczenie 93,75 ng na pacjenta i staranne dostosowanie objętości.

W celu optymalizacji protokołu i rozwiązywania problemów, niskie pomiary ilościowe fluorometryczne, szczególnie stężenia ssDNA poniżej progu 0,8–2 ng/μL, mogą wymagać zwiększenia głębokości sekwencjonowania lub skrócenia czasu suszenia kulek, aby poprawić czułość wykrywania wariantów. W przypadkach podejrzenia mozaikowych wariantów, integracja technologii sekwencjonowania długich czytań może poprawić dokładność wykrywania. Ponadto szybkie przenoszenie próbek na lód po enzymatycznej digestii jest kluczowe dla utrzymania stabilności produktu^12,13. Podczas przygotowania DNB, powolne i delikatne pipetowanie wraz z ostrożnym dodawaniem bufora zatrzymania, zachowuje integralność nanokuli. Jest to szczególnie ważne dla ustalenia korelacji genotyp-fenotyp w wczesnych interferonopatiach takich jak SAVI^6,11.

Ta analiza genetyczna oparta na WES zapewnia ramy dla oceny wariantów związanych z interferonopatią u pacjentów pediatrycznych z cechami autozapalennymi i zapaleniem naczyń. Identyfikując warianty w kluczowych genach takich jak DNASE1, ADAR, STING1, RNASEH2A/B/C, TREX1, SAMHD1 i COPA, badanie podkreśla genetyczną heterogenność leżącą u podstaw fenotypow zapaleń naczyń wywołanych interferonem. Częstotliwość wariantów w genach metabolizmu kwasów nukleinowych i czujności, szczególnie DNASE1 i ADAR, w tej kohorcie jest zgodna z centralną rolą dysregulowanego sygnałowania typu I interferonu w patogenezie pediatrycznych zapaleń naczyń i chorób autozapalnych. Te wyniki są zgodne z poprzednimi raportami łączącymi te geny z interferonopatią i objawami zapalenia naczyń^4,5,7.

Wyjaśniając objawy przypominające zapalenie naczyń w monogennych zespołach autozapalnych, takie jak skórne i interstycjalne zajęcie płuc obserwowane w SAVI, to podejście może ułatwić wczesną diagnozę i pomóc w wyznaczeniu terapii ukierunkowanych przeciwko interferonowi^4,5,7. Monogenne interferonopatie mogą klinicznie naśladować zapalenie naczyń związane z ANCA i inne dziecięce zapalenia naczyń, co podkreśla znaczenie testów genetycznych w przypadkach nietypowych lub opornych na leczenie^9,10,11. Wczesna diagnoza genetyczna może również umożliwić szybkie rozpoczęcie ukierunkowanych terapii, takich jak inhibitory JAK, które wykazały kliniczną korzyść u pacjentów z mutacjami STING1 i innymi związanymi z interferonem^7,13,14.

To badanie potwierdza również, że znaczna część pacjentów pediatrycznych złożonymi zapaleniami naczyń autozapalnymi ma rzadkie lub nowe warianty w genach związanych z interferonopatią. Identyfikacja 79 nowych wariantów w tej dużej kohorcie rozszerza znany spektrum genetyczny i może przyczynić się do lepszych korelacji genotyp-fenotyp w dziecięcych zapaleniach naczyń.

Operacyjną kwestią w tym eksploracyjnym przepływie jest ocena granic progowych, gdyż odchylenia w eksploracyjnych parametrach SNR mogą zmienić wyjście filtracji. Na przykład, filtrowanie oparte na FFT dystrybucji nukleotydów pomaga zmniejszyć szum w odczytach, ale wymaga kalibracji, aby uniknąć nadmiernego wygładzania sygnałów mutacji; rozwiązywanie problemów obejmuje iteracyjną regulację parametrów mapowania binarnego (0 dla puryn, 1 dla pirymidyn), aby zoptymalizować ekstrakcję cech¹⁵. W modelowaniu biofizycznym, definiowanie początkowych warunków dla równań różniczkowych jest istotne, gdyż małe zakłócenia w szybkości amplifikacji mogą przesunąć zachowania progowe, potencjalnie niedoceniać utrzymane sygnałowanie interferonowe. Ulepszone szczegóły dotyczące JAK-STAT obejmują modelowanie roli TYK2 w sygnalizacji IFN-α, gdzie warianty gain-of-function amplifikują aktywację STAT2, prowadząc do fenotypow interferonopatii²⁰.

Modyfikacje metody mogą obejmować integrację elementów stochastycznych dla hałaśliwych środowisk komórkowych, takich jak dodanie terminów szumu Langevina do równań różniczkowych:

dX = f(X)dt + g(X)dW

gdzie dW termem wymienionym reprezentuje szum procesu Wienera, poprawiając realistyczność symulacji zmienności JAK-STAT²¹

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Adjustable Pipettes (P2, P10, P20, P200, P1000)	Dowolny dostawca		Do dokładnego manipulowania płynami
Centryfuga stołowa	Dowolny dostawca		Do krótkotrwałej wirowania probówek PCR
Equinox Library Amp Mix	MGI Tech/ NEB	7K0014-096 (lub równoważne)	Mieszanka masterowa do amplifikacji PCR
Etanol (klasa do biologii molekularnej)	Dowolny dostawca		Używany do przygotowania 80% roztworu do mycia etanolem
IVT Primer 1 & IVT Primer 2	MGI Tech	Dołączone do zestawu lub oddzielnie	Prymery do amplifikacji biblioteki
Niskosterylizujące probówki PCR (0,2 mL)	Dowolny dostawca		Sterylne probówki PCR
Stojak magnetyczny / Stojaczek magnetyczny	Dowolny dostawca		Do separacji magnesowych pereł
MGI DNBSEQ-G400	MGI Tech Co., Ltd.	900-000641-00	Stołowy sekwencer następnej generacji z technologią DNBSEQ (DNA Nanoball Sequencing); obsługuje wiele długości odczytu (np. SE50 do PE300); wysoki przepływ danych do 1440 Gb na uruchomienie; idealny do zastosowań WES, WGS i kierowanego sekwencjonowania.
MGIEasy Circularization Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (Dual Barcode, 16 RXN) lub 1000005260 (V2.0)	Zestaw do circularyzacji do generowania pojedynczej nić DNA (ssCirDNA); wersja z dwoma kodami kreskowymi zmniejsza skakanie indeksów; istotny krok po przygotowaniu biblioteki do formowania DNB w przepływie sekwencjonowania MGI.
MGIEasy DNA Clean Beads	MGI Tech Co., Ltd.	1000005279	Magnetyczne perły do czyszczenia DNA
MGIEasy DNB Prep Kit/ DNB Make Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (zintegrowany z Dual Barcode Circularization) lub powiązany DNB Make (np. 940-000036-00 Onestep DNB)	Moduł przygotowywania DNA Nanoball (DNB); obejmuje circularyzację i generowanie nanokulek do ładowania do komórki przepływowej; ostatni krok w przetwarzaniu biblioteki dla sekwencerów DNBSEQ (często łączony z zestawem Circularization).
MGIEasy Exome Capture Accessory Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000009657 (lub równoważne)	Zawiera roztwór blokujący, MGI Universal Blockers, Enhancer, bufor wiązania, bufor do mycia 1 & 2 oraz perły Streptavidin
MGIEasy Exome Capture V4 Probes (lub Twist CES Probes, kompatybilne z MGI/DNBSEQ)	MGI Tech Co., Ltd. (dla MGIEasy) lub Twist Bioscience (dla Twist)	1000007745 (zestaw V4 Probes, 16 RXN) lub 1000007740 (probes); Twist: Niestandardowe / specyficzne dla panelu (z zamówienia, bez standardowego numeru)	Probes do hybrydyzacji do całkowitego uchwycenia egzomu; obejmuje ~59 Mb regionów kodujących (CCDS, RefSeq, GENCODE, miRBase); zaprojektowane dla wysokiej efektywności wzbogacania w przepływach WES na platformach DNBSEQ; używane z MGIEasy Accessory Kit do hybrydyzacji (55°C pre-inkubacja, 16 godzin w nocy w 65°C), dodawanie blokującego, uchwytywanie perłami Streptavidin (bufor wiązania, bufor do mycia 1/2 w 48°C), elucja oraz amplifikacja PCR po uchwyceniu (kompatybilne z mieszanką Equinox).
MGIEasy Fast Hybridization and Wash Kit	MGI Tech Co., Ltd.	940-001974-00 (16 RXN)	Reagenty do hybrydyzacji i mycia
MGIEasy FS DNA Library Prep Kit	MGI Tech Co., Ltd.	1000006987 (zestaw 16 RXN) lub 1000005256 (rdzeniowy zestaw 96 RXN)	Zestaw do przygotowywania bibliotek DNA oparty na szybkiej fragmentacji; enzymatyczne fragmentowanie z wejściem 5–400 ng gDNA; kompatybilny z platformami DNBSEQ do efektywnej konstrukcji bibliotek WGS/WES.
Woda bez nukleazy	Dowolny dostawca		Klasy do biologii molekularnej
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	Do ilościowego oznaczania bibliotek
Qubit ssDNA Assay Kit (opcjonalnie)	Thermo Fisher Scientific	Q10212	Do ilościowego oznaczania ssDNA po circularyzacji
Streptavidin Magnetic Beads	MGI Tech	Dołączone do Accessory Kit	Do hybrydowego uchwycenia
Bufor TE (pH 8.0)	Dowolny dostawca		Do etapu denaturacji
Termocykler	Różne (Bio-Rad, Thermo itp.)		Używany do fragmentacji, ligacji, PCR i programów DNB
Vortex Mixer	Dowolny dostawca		Do mieszania próbek
Szeroko-stroje nasadek do pipet	Dowolny dostawca		Wymagane do przygotowania DNB