Artykuł metodologiczny

Multimodalne fenotypyzacja behawioralna stanów przypominających depresję wywołaną stresem u Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/71280

⸱

22 czerwca 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Latvian Biomedical Research and Study Center, 2Department of Biodiversity, Institute of Life Sciences and Technology, Daugavpils University, 3Institute of Ecology and Earth Sciences, University of Tartu, 4Institute of Food Safety, Animal Health and Environment "BIOR", 5Department of Psychology, University of Michigan, Ann Arbor, 6Department of Biology, University of Turku, 7Institute of Biosciences, Life Sciences Center, Vilnius University, 8Institute of Molecular and Cell Biology, University of Tartu, 9Department of Organismic and Evolutionary Biology and Center for Brain Science, Harvard University, 10Department of Ecology, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Latvia

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zapewnia ramy do oceny zmian zachowania wywołanych stresem u Drosophila melanogaster. Łączenie uzupełniających się testów umożliwia ilościową ocenę aktywności, eksploracji i podejmowania decyzji dla poszczególnych much. Podejście to jest elastyczne i może być dostosowane do szerokiej gamy badań dotyczących biologii stresu, metabolizmu i funkcji neurobehawioralnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaburzenia metaboliczne, zwyrodnieniowe i związane ze stresem często towarzyszą zmienionej aktywności lokomocyjnej, upośledzonemu podejmowaniu decyzji i zmniejszonej elastyczności zachowań. Jednakże dostępne multimodalne ramy behawioralne do ilościowego określania tych fenotypów w Drosophila melanogaster są ograniczone. Prezentowany jest tutaj protokół integrujący narażenie na przymusowy pływ, zachowanie się w labiryncie Y polegające na obracaniu się i preferencji bocznych, fototaksję oraz ocenę aktywności w systemie FlyVac, eksplorację w otwartym polu oraz długoterminowe monitorowanie aktywności lokomocyjnej za pomocą monitora aktywności Drosophila. Te uzupełniające się testy uchwytują wiele wymiarów zachowania, włączając w to wyjścia motoryczne, motywację, strukturę decyzyjną i zmienność behawioralną, jako funkcjonalne odczyty stanów nerwowych i metabolicznych. Metoda jest skalowalna, powtarzalna i przystosowana do manipulacji farmakologicznych, genetycznych i środowiskowych, zapewniając wszechstronną ramę wykrywania fenotypów behawioralnych związanych ze stresem, metabolizmem i neurodegeneracją w Drosophila.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmiany zachowań, takie jak zmiany w ruchach, podejmowaniu decyzji i aktywności eksploracyjnej, są szeroko stosowane jako wskaźniki na poziomie organizmu stanu neuronowego i fizjologicznego. W różnych taksonach dysfunkcja neuronowa często przejawia się jako zmieniona struktura ruchu, zmniejszona motywacja eksploracyjna, upośledzone zachowanie decyzyjne prowadzone przez zmysły oraz zmiany w przewidywalności zachowań. Ponieważ te wyjścia na poziomie organizmu integrują stan neuronowy, metaboliczny i fizjologiczny, zapewniają skalowalne odczyty do wykrywania fenotypów istotnych dla choroby. Jednak, mimo szerokiego wykorzystania Drosophila melanogaster w genetyce molekularnej i neurologii, standaryzowane multimodalne ramy behawioralne, które jednocześnie rejestrują wydajność lokomocyjną, strukturę decyzji i zmienność zachowań, pozostają ograniczone.

Organizmy modelowe są niezbędne do badania mechanizmów leżących u podstaw fenotypów związanych ze stresem i neuropsychiatrycznych, ponieważ kontrolowane manipulacje eksperymentalne są często niemożliwe u ludzi. Zespoły zachowań związanych ze stresem występują w wielu taksonach, w tym wśród owadów, i obejmują zachowane układy neuromodulacyjne, takie jak serotonina i dopaminy, a także szlaki sygnalizacyjne metaboliczne. Mucha owocówka wyłoniła się zatem jako potężny system do łączenia dysfunkcji molekularnych z wynikami zachowań na poziomie organizmu ze względu na krótki czas generacji, łatwość manipulacji genetycznych i zachowanie istotnych dla choroby szlaków1,2.

W tym samym czasie wiele badań behawioralnych na Drosophila jest zazwyczaj stosowanych w izolacji, co utrudnia rozróżnienie między ogólnymi efektami chorobowymi, upośledzeniem ruchowym, zmianami motywacyjnymi i zmianami zachowań na poziomie decyzyjnym. Co więcej, średnie miary behawioralne same w sobie mogą ukrywać biologicznie istotne fenotypy, ponieważ zaburzenia neuromodulacyjne i rozwojowe często zmieniają zmienność zachowań, a nie średni wynik behawioralny. Multimodalne podejście behawioralne łączące badania lokomocyjne, eksploracyjne, sensoryczne i decyzyjne jest zatem konieczne, aby wygenerować solidne fenotypy na poziomie organizmu3.

Przedstawiono tutaj multimodalne piwo behawioralne integrujące wystawienie na zmuszonym pływaniu4,5, zachowanie skręcania w labiryncie Y i lewo-prawostronność6,7,8,9, fototaksję i ocenę aktywności przy użyciu systemu FlyVac10,11, eksplorację na otwartym polu12 i długotrwałą monitorowanie lokomocji przy użyciu Drosophila Activity Monitor5,13 (Rysunek 1). Każde badanie w tym ramach rejestruje odrębny wymiar behawioralny istotny dla fenotypów związanych ze stresem. Test pływania zmuszonego mierzy pasywne zachowanie radzenia sobie, gdzie wcześniejszy przejściowy stan nieruchomości odzwierciedla zmniejszoną motywację do utrzymania reakcji ucieczki. Badania na otwartym polu i DAM mierzą ogólną aktywność lokomocyjną i strukturę okołodobową, dostarczając bazowych miar wyjścia motorycznego i pobudzenia. Badanie labiryntu Y rejestruje strukturę decyzyjną poprzez sekwencje wyborów lewo-prawo, pozwalając na estymację zarówno skłonności do skręcania (lateralizacji), jak i zmienności zachowań jako miary przewidywalności. Wreszcie, badanie FlyVac ocenia decyzje prowadzone przez zmysły i zachowanie unikania poprzez wielokrotne wybory fototaktyczne. Wszystkie te badania dostarczają uzupełniających odczytów, które rozróżniają zmiany w aktywności, motywacji i zachowaniach na poziomie decyzyjnym.

Ten protokół rejestruje uzupełniające aspekty wyjścia motorycznego, motywacji, struktury decyzji i zmienności zachowań, zapewniając skalowalne ramy do wykrywania fenotypów behawioralnych związanych ze stresem, metabolizmem i neurodegeneracją w D. melanogaster14. Głównym celem tego badania jest ustanowienie multimodalnego phenotypingu behawioralnego, który integruje uzupełniające badania, aby uchwycić wiele wymiarów zmian zachowań indukowanych stresem. Paradygmat stresu jest tutaj stosowany jako standaryzowane zaburzenie, aby wykazać czułość i zastosowanie ram.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test wymuszonego pływania przeprowadzono zgodnie z zasadami 3R (Zastępowanie, Redukcja i Udoskonalenie). Zastępowanie osiągnięto poprzez zastosowanie Drosophila melanogaster jako modelu bezkręgowców, unikając w ten sposób wymuszonego pływania kręgowców, które są coraz bardziej ograniczone ze względów etycznych. Redukcję wsparła wysoka wydajność testu, która umożliwia uzyskanie solidnych wniosków behawioralnych na podstawie stosunkowo małych grup, minimalizując przy tym użycie zwierząt. Udoskonalenie polegało na ograniczeniu czasu ekspozycji na wodę do 2 min, czyli takiej długości, która zapobiega wyczerpaniu lub utonięciu i pozwala na pełne odzyskanie normalnej aktywności ruchowej bezpośrednio po zakończeniu testu. Te wszystkie zagadnienia zapewniają, że test dostarcza znaczących danych behawioralnych, minimalizując potencjalne niepokoje i maksymalizując akceptację etyczną, w tym w środowiskach edukacyjnych.

1. Wywołanie stanu podobnego do depresji w Drosophila (protokół stresu wibracyjnego)

  1. Zbierz samce D. melanogaster w ciągu 24 godzin od wylęgu pod wpływem lekkiego znieczulenia CO₂. Wszystkie szczegóły są wymienione w Tabeli Materiałów.
  2. Umieść muchy w grupach po 10 sztuk w polipropylenowych lub akrylowych probówkach (95 mm długości × 25 mm średnicy wewnętrznej) zamkniętych wacikami.
  3. Nastąpi ekspozycja na wibracje mechaniczne (300 Hz) za pomocą platformy wibracyjnej.
  4. Zastosuj wielokrotne cykle składające się z 45 minut wibracji, po których następuje 15 minut rekuperacji w probówkach zawierających standardową żywność.
  5. Kontynuuj cykle wibracji przez łącznie 6 godzin dziennie.
  6. Powtórz protokół stresu przez 3 kolejne dni.
  7. Utrzymuj muchy kontrolne w identycznych warunkach trzymania bez ekspozycji na wibracje.
    UWAGA: W niniejszym protokole użyto wyłącznie samców w celu zmniejszenia zmienności związanej z różnicami fizjologicznymi i behawioralnymi między płciami, w tym stanem rozrodczym i wpływami hormonalnymi. Ta standaryzacja ułatwia wykrywanie efektów behawioralnych indukowanych stresem w kontrolowanych warunkach. Jednakże protokół jest w pełni przystosowany do samic, a reakcje związane z płcią stanowią ważny obszar na przyszłe badania. Biorąc pod uwagę, że wrażliwość na fenotypy związane ze stresem i podobne do depresji może różnić się w zależności od płci i wieku w różnych taksonach, w tym Drosophila, rozszerzenie tego ujęcia na różne grupy demograficzne może dostarczyć dodatkowych biologicznych informacji. Ten paradygmat został przystosowany z uznanych modeli niekontrolowanego stresu wibracyjnego, które indukują zmiany motywacyjne i aktywności u much.

2. Test wymuszonego pływania w Drosophila melanogaster

UWAGA: Siarczan sodu (SDS) jest środkiem drażniącym. Podczas przygotowywania i obsługi roztworów zawierających SDS należy używać odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (np. rękawic i ochrony oczu). Unikaj kontaktu ze skórą i oczami. Zużyte odpady zawierające SDS należy usuwać zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa chemicznego.

  1. Zbierz dorosłe muchy w ciągu 24 godzin od wylęgu i utrzymuj je w ciągłym świetle i kontrolowanych warunkach środowiskowych.
  2. Przygotuj wielopozycyjne przesuwne szklankę i wypełnij każdą pozycję około 2 ml 0,08% roztworu SDS w temperaturze pokojowej.
  3. Przeniesz jedną muchę do każdej pozycji natychmiast przed nagranie. Nie jest wymagane znieczulenie.
  4. Zapisz zachowanie za pomocą kamery od góry przez 2 min, aby zmierzyć opóźnienie do pierwszej nieruchomości.
  5. Zmierzyć opóźnienie do pierwszej nieruchomości.
  6. Po nagraniu usuń muchy i umieść je na papierze absorpcyjnym, aby potwierdzić odzyskanie normalnej aktywności ruchowej.
    UWAGA: Nieruchomość definiuje się jako zaprzestanie aktywnych ruchów ucieczki przy zachowaniu pozycji na powierzchni. Aby zarejestrować dodatkowe parametry, takie jak łączna długość nieruchomości i liczba epizodów nieruchomości, potrzebne są dłuższe nagrania (np. 3 min). Ten test odzwierciedla pasywne zachowanie radzenia sobie; zmniejszone opóźnienie do nieruchomości jest interpretowane jako zmniejszona motywacja do utrzymania reakcji ucieczki. Zmienność opóźnienia do nieruchomości / całkowitej nieruchomości między muchami. Ten test może powodować przejściowy stres lub zmęczenie. Podczas stosowania w długotrwałych projektach, przeprowadź go przed innymi testami i pozwól na wystarczającą rekuperację (np. ≥24 h) przed kolejnymi testami.

3. Długotrwała obserwacja aktywności ruchowej za pomocą Drosophila Activity Monitor (DAM)

  1. Krótkotrwale (5 s) znieczulić owoce much za pomocą CO₂ do sortowania.
  2. Umieść pojedyncze muchy w szklanych probówkach DAM zawierających żywność i waciki17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowanie protokołu stresu wibracyjnego wywołało mierzalne zmiany behawioralne w wielu badaniach (Rycina 1), zaprojektowanych tak, aby uchwycić aktywność, zachowanie obronne i podejmowanie decyzji u D. melanogaster.

Indukcja przypominająca depresję

Muchy narażone na wielokrotne wibracje mechaniczne (Rycina 1A) wykazywały zmniejszoną aktywność eksploracyjną i zmienione reakcje be...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy protokół demonstruje multimodalne podejście do indukcji i ilościowego określania stanów behawioralnych podobnych do depresji u D. melanogaster. Stosując paradygmat stresu oparty na wibracjach w połączeniu z uzupełniającymi testami behawioralnymi, niniejsze badanie pokazuje, że indukcję podobną do depresji można wykryć na podstawie miar zachowania radzenia sobie, aktywności lokomocyjnej, dynamiki eksploracyjnej, podejmowania decyzji i zmienności behawioralnej16. Zastosowany w tym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Fulbright US Student Program, Latvian Fulbright Post i US Department of State. Ten projekt był wspierany przez grant (lzp-2024/1-0437) Łotewskiej Rady Nauki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anesthesia equipment: e.g., Benchtop Flowbuddy, Complete System w/ Ultimate FlypadGenesis Scientific, El Cajon, CA, USA59-122BCU
BioSan MSV-3500 multispeed vortexBiosan SIA, Riga, LatviaBS-010210-TAHZ wszystkimi platformami
Cotton closures for narrow vials Flystuff by Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020 USANumer katalogowy: 51-101
Drosophila Activity Monitor (DAM2)TriKinetics Inc, Waltham, MA, USADAM2; RRID: niedostępny 32 rury
Drosophila melanogaster (Oregon-R-modENCODE)Drosophila melanogaster (Oregon-R-modENCODE)BDSC:25211; RRID:BDSC_25211
GraphPad PrismGraphPad Software, Boston, MA, USA;Nazwa katalogowa: GraphPad Prism, RRID:SCR_002798Wersja 11.0.1
Logitech C920 HD Pro Webcam, HD 1080p lensNazwa katalogowa: HD Pro Webcam C920Logitech Europe S.A., Lausanne, SwitzerlandRRID: niedostępnyKamera rejestrująca używana do FST
Narrow Fly Vial, PolypropyleneFlystuff by Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020 USANumer katalogowy: 32-120BF
Noldus EthoVision XT Noldus Information Technology, Wageningen, The NetherlandsRRID: SCR_000441v. 15.0
Sodium dodecyl sulfate (SDS, ≥99%) Merck KGaA (Sigma-Aldrich), Darmstadt, GermanyNazwa katalogowa: Sodium dodecyl sulfate (ACS reagent, ≥99% purity); RRID: niedostępny
ZEISS Stemi 508 Stereomicroscope Carl Zeiss AG, Oberkochen, Baden-Württemberg, Germany15634448

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fenotypowanie behawioralne Drosophilawymuszona ekspozycja na p ywaniezachowanie w labiryncie Ytest fototaksjisystem FlyVaceksploracja w otwartym polumonitorowanie lokomocjielastyczno behawioralnapodejmowanie decyzji
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły