Ten protokół zapewnia ramy do oceny zmian zachowania wywołanych stresem u Drosophila melanogaster. Łączenie uzupełniających się testów umożliwia ilościową ocenę aktywności, eksploracji i podejmowania decyzji dla poszczególnych much. Podejście to jest elastyczne i może być dostosowane do szerokiej gamy badań dotyczących biologii stresu, metabolizmu i funkcji neurobehawioralnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Multimodalowe fenotypowanie behawioralne stanów przypominających depresję indukowanych stresem u Drosophila melanogaster
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zaburzenia metaboliczne, zwyrodnieniowe i związane ze stresem często towarzyszą zmienionej aktywności lokomocyjnej, upośledzonemu podejmowaniu decyzji i zmniejszonej elastyczności zachowań. Jednakże dostępne multimodalne ramy behawioralne do ilościowego określania tych fenotypów w Drosophila melanogaster są ograniczone. Prezentowany jest tutaj protokół integrujący narażenie na przymusowy pływ, zachowanie się w labiryncie Y polegające na obracaniu się i preferencji bocznych, fototaksję oraz ocenę aktywności w systemie FlyVac, eksplorację w otwartym polu oraz długoterminowe monitorowanie aktywności lokomocyjnej za pomocą monitora aktywności Drosophila. Te uzupełniające się testy uchwytują wiele wymiarów zachowania, włączając w to wyjścia motoryczne, motywację, strukturę decyzyjną i zmienność behawioralną, jako funkcjonalne odczyty stanów nerwowych i metabolicznych. Metoda jest skalowalna, powtarzalna i przystosowana do manipulacji farmakologicznych, genetycznych i środowiskowych, zapewniając wszechstronną ramę wykrywania fenotypów behawioralnych związanych ze stresem, metabolizmem i neurodegeneracją w Drosophila.
Wprowadzenie
Zmiany zachowań, takie jak zmiany w ruchach, podejmowaniu decyzji i aktywności eksploracyjnej, są szeroko stosowane jako wskaźniki na poziomie organizmu stanu neuronowego i fizjologicznego. W różnych taksonach dysfunkcja neuronowa często przejawia się jako zmieniona struktura ruchu, zmniejszona motywacja eksploracyjna, upośledzone zachowanie decyzyjne prowadzone przez zmysły oraz zmiany w przewidywalności zachowań. Ponieważ te wyjścia na poziomie organizmu integrują stan neuronowy, metaboliczny i fizjologiczny, zapewniają skalowalne odczyty do wykrywania fenotypów istotnych dla choroby. Jednak, mimo szerokiego wykorzystania Drosophila melanogaster w genetyce molekularnej i neurologii, standaryzowane multimodalne ramy behawioralne, które jednocześnie rejestrują wydajność lokomocyjną, strukturę decyzji i zmienność zachowań, pozostają ograniczone.
Organizmy modelowe są niezbędne do badania mechanizmów leżących u podstaw fenotypów związanych ze stresem i neuropsychiatrycznych, ponieważ kontrolowane manipulacje eksperymentalne są często niemożliwe u ludzi. Zespoły zachowań związanych ze stresem występują w wielu taksonach, w tym wśród owadów, i obejmują zachowane układy neuromodulacyjne, takie jak serotonina i dopaminy, a także szlaki sygnalizacyjne metaboliczne. Mucha owocówka wyłoniła się zatem jako potężny system do łączenia dysfunkcji molekularnych z wynikami zachowań na poziomie organizmu ze względu na krótki czas generacji, łatwość manipulacji genetycznych i zachowanie istotnych dla choroby szlaków1,2.
W tym samym czasie wiele badań behawioralnych na Drosophila jest zazwyczaj stosowanych w izolacji, co utrudnia rozróżnienie między ogólnymi efektami chorobowymi, upośledzeniem ruchowym, zmianami motywacyjnymi i zmianami zachowań na poziomie decyzyjnym. Co więcej, średnie miary behawioralne same w sobie mogą ukrywać biologicznie istotne fenotypy, ponieważ zaburzenia neuromodulacyjne i rozwojowe często zmieniają zmienność zachowań, a nie średni wynik behawioralny. Multimodalne podejście behawioralne łączące badania lokomocyjne, eksploracyjne, sensoryczne i decyzyjne jest zatem konieczne, aby wygenerować solidne fenotypy na poziomie organizmu3.
Przedstawiono tutaj multimodalne piwo behawioralne integrujące wystawienie na zmuszonym pływaniu4,5, zachowanie skręcania w labiryncie Y i lewo-prawostronność6,7,8,9, fototaksję i ocenę aktywności przy użyciu systemu FlyVac10,11, eksplorację na otwartym polu12 i długotrwałą monitorowanie lokomocji przy użyciu Drosophila Activity Monitor5,13 (Rysunek 1). Każde badanie w tym ramach rejestruje odrębny wymiar behawioralny istotny dla fenotypów związanych ze stresem. Test pływania zmuszonego mierzy pasywne zachowanie radzenia sobie, gdzie wcześniejszy przejściowy stan nieruchomości odzwierciedla zmniejszoną motywację do utrzymania reakcji ucieczki. Badania na otwartym polu i DAM mierzą ogólną aktywność lokomocyjną i strukturę okołodobową, dostarczając bazowych miar wyjścia motorycznego i pobudzenia. Badanie labiryntu Y rejestruje strukturę decyzyjną poprzez sekwencje wyborów lewo-prawo, pozwalając na estymację zarówno skłonności do skręcania (lateralizacji), jak i zmienności zachowań jako miary przewidywalności. Wreszcie, badanie FlyVac ocenia decyzje prowadzone przez zmysły i zachowanie unikania poprzez wielokrotne wybory fototaktyczne. Wszystkie te badania dostarczają uzupełniających odczytów, które rozróżniają zmiany w aktywności, motywacji i zachowaniach na poziomie decyzyjnym.
Ten protokół rejestruje uzupełniające aspekty wyjścia motorycznego, motywacji, struktury decyzji i zmienności zachowań, zapewniając skalowalne ramy do wykrywania fenotypów behawioralnych związanych ze stresem, metabolizmem i neurodegeneracją w D. melanogaster14. Głównym celem tego badania jest ustanowienie multimodalnego phenotypingu behawioralnego, który integruje uzupełniające badania, aby uchwycić wiele wymiarów zmian zachowań indukowanych stresem. Paradygmat stresu jest tutaj stosowany jako standaryzowane zaburzenie, aby wykazać czułość i zastosowanie ram.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Test wymuszonego pływania przeprowadzono zgodnie z zasadami 3R (Zastępowanie, Redukcja i Udoskonalenie). Zastępowanie osiągnięto poprzez zastosowanie Drosophila melanogaster jako modelu bezkręgowców, unikając w ten sposób wymuszonego pływania kręgowców, które są coraz bardziej ograniczone ze względów etycznych. Redukcję wsparła wysoka wydajność testu, która umożliwia uzyskanie solidnych wniosków behawioralnych na podstawie stosunkowo małych grup, minimalizując przy tym użycie zwierząt. Udoskonalenie polegało na ograniczeniu czasu ekspozycji na wodę do 2 min, czyli takiej długości, która zapobiega wyczerpaniu lub utonięciu i pozwala na pełne odzyskanie normalnej aktywności ruchowej bezpośrednio po zakończeniu testu. Te wszystkie zagadnienia zapewniają, że test dostarcza znaczących danych behawioralnych, minimalizując potencjalne niepokoje i maksymalizując akceptację etyczną, w tym w środowiskach edukacyjnych.
1. Wywołanie stanu podobnego do depresji w Drosophila (protokół stresu wibracyjnego)
- Zbierz samce D. melanogaster w ciągu 24 godzin od wylęgu pod wpływem lekkiego znieczulenia CO₂. Wszystkie szczegóły są wymienione w Tabeli Materiałów.
- Umieść muchy w grupach po 10 sztuk w polipropylenowych lub akrylowych probówkach (95 mm długości × 25 mm średnicy wewnętrznej) zamkniętych wacikami.
- Nastąpi ekspozycja na wibracje mechaniczne (300 Hz) za pomocą platformy wibracyjnej.
- Zastosuj wielokrotne cykle składające się z 45 minut wibracji, po których następuje 15 minut rekuperacji w probówkach zawierających standardową żywność.
- Kontynuuj cykle wibracji przez łącznie 6 godzin dziennie.
- Powtórz protokół stresu przez 3 kolejne dni.
- Utrzymuj muchy kontrolne w identycznych warunkach trzymania bez ekspozycji na wibracje.
UWAGA: W niniejszym protokole użyto wyłącznie samców w celu zmniejszenia zmienności związanej z różnicami fizjologicznymi i behawioralnymi między płciami, w tym stanem rozrodczym i wpływami hormonalnymi. Ta standaryzacja ułatwia wykrywanie efektów behawioralnych indukowanych stresem w kontrolowanych warunkach. Jednakże protokół jest w pełni przystosowany do samic, a reakcje związane z płcią stanowią ważny obszar na przyszłe badania. Biorąc pod uwagę, że wrażliwość na fenotypy związane ze stresem i podobne do depresji może różnić się w zależności od płci i wieku w różnych taksonach, w tym Drosophila, rozszerzenie tego ujęcia na różne grupy demograficzne może dostarczyć dodatkowych biologicznych informacji. Ten paradygmat został przystosowany z uznanych modeli niekontrolowanego stresu wibracyjnego, które indukują zmiany motywacyjne i aktywności u much.
2. Test wymuszonego pływania w Drosophila melanogaster
UWAGA: Siarczan sodu (SDS) jest środkiem drażniącym. Podczas przygotowywania i obsługi roztworów zawierających SDS należy używać odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (np. rękawic i ochrony oczu). Unikaj kontaktu ze skórą i oczami. Zużyte odpady zawierające SDS należy usuwać zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa chemicznego.
- Zbierz dorosłe muchy w ciągu 24 godzin od wylęgu i utrzymuj je w ciągłym świetle i kontrolowanych warunkach środowiskowych.
- Przygotuj wielopozycyjne przesuwne szklankę i wypełnij każdą pozycję około 2 ml 0,08% roztworu SDS w temperaturze pokojowej.
- Przeniesz jedną muchę do każdej pozycji natychmiast przed nagranie. Nie jest wymagane znieczulenie.
- Zapisz zachowanie za pomocą kamery od góry przez 2 min, aby zmierzyć opóźnienie do pierwszej nieruchomości.
- Zmierzyć opóźnienie do pierwszej nieruchomości.
- Po nagraniu usuń muchy i umieść je na papierze absorpcyjnym, aby potwierdzić odzyskanie normalnej aktywności ruchowej.
UWAGA: Nieruchomość definiuje się jako zaprzestanie aktywnych ruchów ucieczki przy zachowaniu pozycji na powierzchni. Aby zarejestrować dodatkowe parametry, takie jak łączna długość nieruchomości i liczba epizodów nieruchomości, potrzebne są dłuższe nagrania (np. 3 min). Ten test odzwierciedla pasywne zachowanie radzenia sobie; zmniejszone opóźnienie do nieruchomości jest interpretowane jako zmniejszona motywacja do utrzymania reakcji ucieczki. Zmienność opóźnienia do nieruchomości / całkowitej nieruchomości między muchami. Ten test może powodować przejściowy stres lub zmęczenie. Podczas stosowania w długotrwałych projektach, przeprowadź go przed innymi testami i pozwól na wystarczającą rekuperację (np. ≥24 h) przed kolejnymi testami.
3. Długotrwała obserwacja aktywności ruchowej za pomocą Drosophila Activity Monitor (DAM)
- Krótkotrwale (5 s) znieczulić owoce much za pomocą CO₂ do sortowania.
- Umieść pojedyncze muchy w szklanych probówkach DAM zawierających żywność i waciki17.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zastosowanie protokołu stresu wibracyjnego spowodowało mierzalne zmiany behawioralne w wielu testach (Rysunek 1), zaprojektowanych w celu oceny aktywności, zachowań adaptacyjnych oraz procesów podejmowania decyzji u D. melanogaster.
Indukcja stanów depresyjnych
Muchy poddane powtarzającym się wibracjom mechanicznym (Rycina 1A) wykazywały obniżoną aktywność eksploracyjną oraz zmieni...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejszy protokół demonstruje multimodalne podejście do indukcji i ilościowego określania stanów behawioralnych podobnych do depresji u D. melanogaster. Stosując paradygmat stresu oparty na wibracjach w połączeniu z uzupełniającymi testami behawioralnymi, niniejsze badanie pokazuje, że indukcję podobną do depresji można wykryć na podstawie miar zachowania radzenia sobie, aktywności lokomocyjnej, dynamiki eksploracyjnej, podejmowania decyzji i zmienności behawioralnej16. Zastosowany w tym...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Fulbright US Student Program, Latvian Fulbright Post i US Department of State. Ten projekt był wspierany przez grant (lzp-2024/1-0437) Łotewskiej Rady Nauki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Anesthesia equipment: e.g., Benchtop Flowbuddy, Complete System w/ Ultimate Flypad | Genesis Scientific, El Cajon, CA, USA | 59-122BCU | |
| BioSan MSV-3500 multispeed vortex | Biosan SIA, Riga, Latvia | BS-010210-TAH | Z wszystkimi platformami |
| Cotton closures for narrow vials | Flystuff by Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020 USA | Numer katalogowy: 51-101 | |
| Drosophila Activity Monitor (DAM2) | TriKinetics Inc, Waltham, MA, USA | DAM2; RRID: niedostępny | 32 rury |
| Drosophila melanogaster (Oregon-R-modENCODE) | Drosophila melanogaster (Oregon-R-modENCODE) | BDSC:25211; RRID:BDSC_25211 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Boston, MA, USA; | Nazwa katalogowa: GraphPad Prism, RRID:SCR_002798 | Wersja 11.0.1 |
| Logitech C920 HD Pro Webcam, HD 1080p lensNazwa katalogowa: HD Pro Webcam C920 | Logitech Europe S.A., Lausanne, Switzerland | RRID: niedostępny | Kamera rejestrująca używana do FST |
| Narrow Fly Vial, Polypropylene | Flystuff by Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020 USA | Numer katalogowy: 32-120BF | |
| Noldus EthoVision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | RRID: SCR_000441 | v. 15.0 |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS, ≥99%) | Merck KGaA (Sigma-Aldrich), Darmstadt, Germany | Nazwa katalogowa: Sodium dodecyl sulfate (ACS reagent, ≥99% purity); RRID: niedostępny | |
| ZEISS Stemi 508 Stereomicroscope | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Baden-Württemberg, Germany | 15634448 |
Bibliografia
- Chan HY, Bonini NM. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death & Differentiation. 2000 Nov;7(11):1075-80.
- McGurk L, Berson A, Bonini NM. Drosophila. as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 2015 Oct 1;201(2):377-402.
- Honegger KS, Smith MA, Churgin MA, Turner GC, de Bivort BL. Idiosyncratic neural coding and neuromodulation of olfactory individuality in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2020 Sep 22;117(38):23292-7.
- Neckameyer WS, R. Nieto-Romero A. Response to stress in Drosophila. is mediated by gender, age and stress paradigm. Stress. 2015 Mar 4;18(2):254-66.
- Hibicke M, Nichols CD. Validation of the forced swim test in Drosophila., and its use to demonstrate psilocybin has long-lasting antidepressant-like effects in flies. Scientific Reports. 2022 Jun 15;12(1):10019.
- Kain JS, Stokes C, de Bivort BL. Phototactic personality in fruit flies and its suppression by serotonin and white. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2012 Nov 27;109(48):19834-9.
- Ayroles JF et al. Behavioral idiosyncrasy reveals genetic control of phenotypic variability. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2015 May 26;112(21):6706-11.
- Buchanan SM, Kain JS, De Bivort BL. Neuronal control of locomotor handedness in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2015 May 26;112(21):6700-5.
- Krama T et al. Development under predation risk increases serotonin-signaling, variability of turning behavior and survival in adult fruit flies Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 2023 May 25;17:1189301.
- Kain JS et al. Variability in thermal and phototactic preferences in Drosophila. may reflect an adaptive bet-hedging strategy. Evolution. 2015 Dec 1;69(12):3171-85.
- Krams IA et al. Serotoninergic modulation of phototactic variability underpins a bet-hedging strategy in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 2021 Apr 16;15:659331.
- Popovs S et al. Explaining the survival of the sickest: altered walking patterns are linked with improved adult survival in Drosophila melanogaster. grown with predators during larval development. Behaviour. 2024 Jan 2;161(2):133-48.
- Neckameyer WS, Bhatt P. Protocols to study behavior in Drosophila. Drosophila.: Methods and Protocols. 2016 Oct 12:303-20.
- Ali YO, Escala W, Ruan K, Zhai RG. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila. models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 2011 Mar 11(49):2504.
- Krama T et al. A diabetes-like biochemical and behavioural phenotype of Drosophila. induced by predator stress. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 2023 Jul 1;290(2002).
- Ries AS, Hermanns T, Poeck B, Strauss R. Serotonin modulates a depression-like state in Drosophila. responsive to lithium treatment. Nature Communications. 2017 Jun 6;8(1):15738.
- Rozato E, Kyriacou CP. Analysis of locomotor activity rhythms in Drosophila. Nature Protocols. 2006. Jul 6;1(2):559-568
- Yankelevitch-Yahav R, Franko M, Huly A, Doron R. The forced swim test as a model of depressive-like behavior. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 2015 Mar 2(97):52587.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
