Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza metabolomowa rezonansu magnetycznego zużytych pojemników z ludzkimi zarodkami: Walidacja metody i zagadnienia techniczne

94 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71285

⸱

31 lipca 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Reproductive Medicine and Gynaecological Endocrinology, University Medical Centre Maribor, 2Faculty of Medicine, University of Ljubljana, 3National Institute of Chemistry, 4EN-FIST Centre of Excellence, 5Faculty of Chemistry and Chemical Technology, University of Ljubljana, 6Department of Reproductive Science, Manipal Academy of Higher Education

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący pobierania, przygotowywania i analizowania wykorzystanego pożywki do hodowli ludzkich zarodków z wykorzystaniem spektroskopii rezonansu magnetycznego jąder (NMR), umożliwiającej powtarzalne wykrywanie metabolitów o niskiej masie cząsteczkowej z próbek w skali mikrolitra w rutynowych warunkach kultury klinicznej.

Streszczenie

Ścieki po hodowli ludzkiego zarodka zawierają metabolity o niskiej masie cząsteczkowej, które mogą dostarczyć nieinwazyjnego odczytu fizjologii zarodka przedimplantacyjnego. Jednak analiza metabolomiki oparta na rezonansie magnetycznym jąder (NMR) tych próbek jest technicznie wymagająca, ponieważ rutynowe warunki hodowli zarodków obejmują objętości mikrolityrowe, suplementację białkową oraz nakładanie warstwy oleju parafinowego, które generują sygnały tła i zmniejszają jakość widma. Przedstawiamy tu zoptymalizowaną metodę NMR metabolomiki dla ścieków po hodowli zarodków, uwzględniającą kontrolowaną kolekcję kropel, aby zminimalizować zanieczyszczenie olejem, wkładki z fluorowanych polietylenów (FEP), aby chemicznie odizolować próbkę od zewnętrznego odniesienia (TMSP) przy jednoczesnym dostosowaniu do objętości mikrolityrowych, oraz nabywanie danych za pomocą sekwencji impulsów Carr-Purcell-Meiboom-Gill w celu stłumienia makromolekularnych sygnałów tła. Protokół umożliwia spójne wykrywanie i ilościowe oznaczanie metabolitów o niskiej masie cząsteczkowej z indywidualnie hodowlanych ludzkich zarodków i wspiera reproduktybilną analizę w rutynowych warunkach laboratoryjnych. Ze względu na liczne wyzwania techniczne, metoda musi być odpowiednio zweryfikowana przed zastosowaniem w celach badawczych lub klinicznych.

Wprowadzenie

W trakcie rozwoju przedimplantacyjnego in vitro. zarodki ciągle zużywają i uwalniają metabolity o niskiej masie cząsteczkowej do otoczenia środowiska. Skład wykorzystanego środowiska kulturowego zarodków (SECM) odzwierciedla zatem aktywność metaboliczną zarodków i zapewnia nieinwazyjny funkcjonalny odczyt fizjologii i kompetencji rozwojowej zarodków1,2. Analiza tego śladu metabolicznego może uzupełnić konwencjonalne metody oceny i poprawić strategie selekcji zarodków w asystowanych technikach rozrodczych3,4. W szczególności zmiany w przemianie aminokwasów i węglowodanów zostały powiązane z potencjałem rozwojowym i żywotnością zarodków5,6,7.

Spektroskopia rezonansu magnetycznego jąder (NMR) jest szeroko stosowana do nieukierunkowanego profilowania metabolitów różnorodnych próbek biologicznych, w tym wykorzystanego środowiska kulturowego zarodków8,9,10. Jednak analiza tych próbek nadal jest analitycznie wymagająca11. W rutynowej praktyce klinicznej zarodki są kultywowane w zdefiniowanych mikrośrodowiskach zaprojektowanych tak, by naśladować warunki fizjologiczne. Środowiska kulturowe są wzbogacane o białka, zazwyczaj albuminę, aby ustabilizować ciśnienie osmotyczne, wiążą toksyczne związki i dostarczają cząsteczki nośników dla lipidów i czynników wzrostu, które wspierają normalny rozwój12. Aby zapobiec parowaniu i utrzymać stałe stężenia substancji rozpuszczonych, krople kultury pokrywane są sterylnym olejem parafinowym13.

Lipidy pochodzące z oleju pokrywającego i składników białkowych generują szerokie sygnały tła, które zasłaniają wąskie rezonanse z metabolitów o niskiej masie cząsteczkowej, takich jak glukoza, pirogronianu i aminokwasów. Ponadto analiza objętości próbek o objętości mikrolitra w standardowych 5 mm rurach NMR wymaga znacznego rozcieńczenia, aby osiągnąć aktywną objętość cewki RF. To zmniejszenie stężenia analitów poważnie obniża stosunek sygnału do szumu (S/N), maskując metabolity o niskiej obfitości i utrudniając reproduktywne ilościowanie. Chociaż liczne badania zastosowali NMR-opartą metabolomikę do wykorzystanego środowiska kulturowego ludzkich zarodków, brak znormalizowanych i powtarzalnych protokołów pobierania i przygotowania ograniczył powtarzalność i porównywalność między badaniami8,9,11.

Przedstawiamy tutaj przepływ metabolomiki opartej na NMR (Rysunek 1) zaprojektowany tak, aby przezwyciężyć trudności techniczne związane z pobieraniem i analizowaniem środowiska kulturowego zarodków ludzkich. Podejście to łączy kontrolowane pobieranie kropel w celu zmniejszenia przenoszenia oleju, pobranie objętości mikrolitrów przy użyciu wyściółek z fluorowanego propylenu etylenowego (FEP) w celu uniknięcia artefaktów rozcieńczenia oraz tłumienie sygnałów makrocząsteczek za pomocą sekwencji impulsowej Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie to przeprowadzono w okresie od stycznia do kwietnia 2023 roku w Zakładzie Medycyny Reprodukcyjnej i Endokrynologii Ginekologicznej, Uniwersyteckim Centrum Medycznym Maribor, Słowenia. Analizy NMR wykonano w Narodowym Instytucie Chemii w Lublanie, Słowenia. Pisemna zgoda świadoma została uzyskana od wszystkich uczestników. Badanie otrzymało aprobatę Zarządu Komitetu Etycznego Instytucji (nr: UKC-MB-KME-1/21) oraz Narodowego Komitetu Etyki Medycznej (nr: 0120-37/2021/15).

1. Projekt badania

UWAGA: Badanie analizowało ludzkie zużyte media kulturowe zarodków za pomocą metabolomiki opartej na NMR.

  1. Zbierz próbki po przedłużonej kulturze zarodków po wstrzyknięciu plemnika do cytoplazmy (ICSI). Zbierz równą liczbę niezużytych kontrolnych próbek inkubowanych.

2. Zbieranie próbek

  1. Zbierz próbki zużytego media kulturowego zarodków (SECM) po inkubacji zarodków, jak pokazano na Rysunku 2.
  2. Po usunięciu zarodka z kropelki kultury, ostrożnie zasysaj nadmiar oleju pokrywającego z powierzchni naczynia hodowlowego bez zakłócania pokarmu (Rysunek 2, krok 1).
  3. Używając sterylnej pipety, zasysaj około 35 μL pokarmu kulturowego z oryginalnej kropelki, pozostawiając około 5 μL, aby uniknąć zasysania resztkowego oleju z powierzchni. Przenieś tę objętość do sterylnego naczynia Petriego, aby utworzyć nową kropelkę (Rysunek 2, krok 2).
  4. Pod stereomikroskopem wizualnie sprawdź nowo utworzoną kropelkę. Ostrożnie zasysaj około 30 μL z tej kropelki, znowu pozostawiając około 5 μL, aby zminimalizować przenoszenie oleju. Przenieś tę objętość do drugiego sterylnego miejsca, aby utworzyć czystszą kropelkę (Rysunek 2, krok 3).
  5. Wizualnie sprawdź drugą kropelkę pod powiększeniem. Zidentyfikuj obszary, gdzie kropelki oleju są najmniej wyraźne. Wsuń końcówkę pipety do tego regionu i zasysaj około 25 μL pokarmu, znowu pozostawiając około 5 μL, aby zminimalizować przenoszenie oleju (Rysunek 2, krok 4).
  6. Natychmiast przenieś zebrane 25 μL do sterylnej, wolnej od RNazy mikrocentrifugowej probówki. Unikaj dotykania wewnętrznych ścianek probówki podczas rozdzielania próbki, aby zapobiec zanieczyszczeniu i utracie próbki. Natychmiast zamroź wszystkie zebrane próbki w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do analizy NMR (Rysunek 2, krok 5).
  7. Zbierz dopasowane niezużyte kontrolne kropelki inkubowane (medium inkubowane bez zarodków) przygotowane, inkubowane i przetworzone w identycznych warunkach hodowli, używając tych samych naczyń kulturowych, oleju pokrywającego, czasu inkubacji, środowiska inkubatora i procedury obsługi opisanych powyżej, aby zminimalizować zmienność środowiskową i potencjalne systematyczne zniekształcenie.
    UWAGA: Ściśle przestrzeganie sekwencyjnego transferu kropelki i wizualnej inspekcji znacznie zmniejsza zanieczyszczenie olejem. Na tym etapie eksperyment można przerwać i wznowić przed dalszym przetwarzaniem próbek na potrzeby akwizycji NMR.

3. Przygotowanie próbki do analizy NMR

  1. Roztapiaj próbki w temperaturze pokojowej przez około 10 minut.
  2. Przygotuj mieszaninę NMR:
    1. Przenieś 25 μL SECM do mikroprobówki 1,5 mL. Dodaj 200 μL D2O. Wymieszaj przez 10 s, a następnie wyśrodkuj w temperaturze pokojowej przez 10 s przy 1000 x g.
  3. Ładuj wkład: Przenieś 225 μL mieszanki do wkładki FEP.
  4. Przygotuj zewnętrzną rurkę referencyjną.
    1. Napraw 5 mm rurkę NMR z 150 μL D2O zawierającą 1 mM 3-(trimetylosil)propionian-2,2,3,3-d4 sodu (TMSP-d4).
  5. Zbierz próbkę: Włóż wkładkę FEP do rurki NMR i uszczelnij folią parafilmową.

4. Akwizycja NMR i przetwarzanie widma

  1. Zdobądź 1H-CPMG akwizycję za pomocą sekwencji impulsowej Bruker cpmgpr1d z: 64 skanów; 65 536 punktów danych; Opóźnienie relaksacyjne: 8 s; Szerokość widma: 11,9 kHz; Czas echo: 400 μs x 80 pętli (efektywne filtry T2 32 ms); Całkowity czas akwizycji: ~15 min.
    UWAGA: Efektywny czas filtracji T2 CPMG równy 64 ms został wybrany na podstawie uznanych protokołów metabolomiki dla próbek biologicznych zawierających białka, gdzie ta wartość zapewnia efektywne tłumienie sygnałów makrocząsteczek, zachowując rezonanse metabolitów o niskiej masie cząsteczkowej14.
  2. P

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przepływ analityczny dla niecelowanego profilowania metabolomicznego zużytej pożywki do hodowli embrionów za pomocą NMR przedstawiono na Rysunku 1.

Usuwanie zanieczyszczeń olejowych podczas pobierania próbek
Rycina 2 przedstawia procedurę sekwencyjnego przenoszenia kropli, stosowaną w celu zredukowania przeniesienia oleju z warstwy wierzchniej. Próbki pobrane bez dokładnego pipetowania wykazywały szerokie rezonanse węglowodorowe obejmujące obs...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym badaniu rozwiązaliśmy kluczowe wyzwania analityczne związane z identyfikacją i ilościową ocenę niskocząsteczkowych metabolitów w wykorzystanym po kulturowań zarodków pośrednim za pomocą nieukierunkowanej metabolomiki NMR. Nasze wyniki pokazują, że zoptymalizowany przebieg umożliwia pozyskanie wysokiej jakości, bogatych w informacje widm, nadających się do wiarygodnego wykrywania niskocząsteczkowych metabolitów.

Staranne sekwencyjne przenoszenie kropli okazało się niezbędne do zmni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

To dzieło było wspierane przez Słoweńską Agencję Badań i Innowacji (ARIS) [numer projektu P3-0327].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5 mm FEP tube linerSP Wilmad-LabGlass4682701Wewnętrzna wkładka do koaksjalnego NMR
5 mm NMR tubeSP Wilmad-LabGlass535-PP-7-SBZewnętrzna rura
6-well culture plateOosafeOOPW-SW02Nczynka do hodowli zarodków
Cryogenic liquid nitrogenMesserSkontaktuj się z producentemNagłe zamrażanie próbek
Deuterium oxide (D2O)EurisotopD214LRozpuszczalnik NMR
Micropipette (10–100 µL)Eppendorf4924000053Pipeta o regulowanym objętości
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL, RNase-freeEppendorfN216966NPobranie i przechowywanie próbek
Mineral oilVitrolifeVTL-10029Nadkładanie kropel hodowli
NMR spectrometer, 600 MHzBrukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.htmlRejestracja spektralna
Pasteur pipetteFalconFAL-357575Przenoszenie kropel
Pipette, single-channel mechanicalSartorius728060Obsługa próbek
Pipette tips, sterileEppendorf22491148Kompatybilne z mikropipetą
Pipette tips, sterile filterSartorius790201FBariera przeciw aerozolowi
Sequential G-series culture mediaVitrolifeVTL-10143Środek do hodowli zarodków
TMSP-d4 (sodium 3-trimethylsilylpropionate-d4)Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-48-1Odniesienie przesunięcia chemicznego
Tubes, Safe-LockEppendorf0030121589Rury do przechowywania

Bibliografia

  1. Seli E, Botros L, Sakkas D, Burns DH. Non-invasive metabolomic profiling of embryo culture media using proton nuclear magnetic resonance correlates with reproductive potential of embryos in women undergoing in vitro fertilization. Fertil Steril. 2008;90(6):2183-2189.
  2. Vergouw CG et al. Metabolomic profiling by near-infrared spectroscopy as a tool to assess embryo viability: a novel, non-invasive method for embryo selection. Hum Reprod. 2008;23(7):1499-1504.
  3. Eldarov C et al. LC-MS analysis revealed significantly different metabolic profiles in spent culture media of human embryos with distinct morphology, karyotype and implantation outcomes. Int J Mol Sci. 2022;23(5):2706.
  4. Simopoulou M et al. Editorial: The role of metabolomics in ART: from diagnosis to treatment. Front Endocrinol (Lausanne). 2025;16:1558561.
  5. Gardner DK et al. Human and mouse embryonic development, metabolism and gene expression are altered by an ammonium gradient in vitro. Reproduction. 2013;146:49-61.
  6. Sturmey RG, Hawkhead JA, Barker EA, Leese HJ. DNA damage and metabolic activity in the preimplantation embryo. Hum Reprod. 2009;24:81-91.
  7. Sturmey RG, Brison DR, Leese HJ. Assessing embryo viability by measurement of amino acid turnover. Reprod Biomed Online. 2008;17:27-33.
  8. Nadal-Desbarats L et al. Is NMR metabolic profiling of spent embryo culture media useful to assist in vitro human embryo selection? Magn Reson Mater Phy. 2013;26:193-202.
  9. Wallace M et al. 1H NMR-based metabolic profiling of Day 2 spent embryo media correlates with implantation potential. J Assist Reprod Genet. 2014;31:58-63.
  10. Salmerón AM et al. Solution NMR in human embryo culture media as an option for assessment of embryo implantation potential. NMR Biomed. 2021;34:e4536.
  11. Kirkegaard K et al. NMR metabolomic profiling of Day 3 and 5 embryo culture medium does not predict pregnancy outcome in good prognosis patients. Hum Reprod. 2014;29(11):2413-2420.
  12. Otsuki J, Nagai Y, Chiba K. Damage of embryo development caused by peroxidized mineral oil and its association with albumin in culture. Fertil Steril. 2009;91(5):1745-1749.
  13. Martinez CA et al. The overlaying oil type influences in vitro embryo production: differences in composition and compound transfer into incubation medium between oils. Sci Rep. 2017;7:10505.
  14. Beckonert O et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat Protoc. 2007;2:2692-2703.
  15. Helmus JJ, Jaroniec CP. Nmrglue: an open-source Python package for the analysis of multidimensional NMR data. J Biomol NMR. 2013;55:355-367.
  16. Siristatidis C et al. Why has metabolomics so far not managed to efficiently contribute to the improvement of assisted reproduction outcomes? Diagnostics (Basel). 2021;11(9):1602.
  17. Miao SB et al. Glutamine as a potential non-invasive biomarker for human embryo selection. Reprod Sci. 2022;29(6):1721-1729.
  18. Ferrick L, Lee YSL, Gardner DK. Metabolic activity of human blastocysts correlates with their morphokinetics, morphological grade, KIDScore and artificial intelligence ranking. Hum Reprod. 2020;35(9):2004-2016.
  19. Boyama BA et al. Homocysteine in embryo culture media as a predictor of pregnancy outcome in assisted reproductive technology. Gynecol Endocrinol. 2016;32(3):193-195.
  20. Yazdani A, Halvaei I, Boniface C, Esfandiari N. Effect of cytoplasmic fragmentation on embryo development, quality, and pregnancy outcome: a systematic review of the literature. Reprod Biol Endocrinol. 2024;22:1-40.
  21. Scott R et al. Non-invasive metabolomic profiling of human embryo culture media using Raman spectroscopy predicts embryonic reproductive potential: a prospective blinded pilot study. Fertil Steril. 2008;90:77-83.
  22. Vergouw CG et al. Day 3 embryo selection by metabolomic profiling of culture medium with near-infrared spectroscopy as an adjunct to morphology: a randomized controlled trial. Hum Reprod. 2012;27(8):2304-2311.
  23. Figoli CB et al. A robust metabolomics approach for the evaluation of human embryos from in vitro fertilization. Sci Rep. 2024;14(1):17447.
  24. Olcay IO et al. Non-invasive amino acid turnover predicts human embryo aneuploidy. Gynecol Endocrinol. 2022;38(8):461-466.
  25. Tesarik J. Non-invasive biomarkers of human embryo developmental potential. Int J Mol Sci. 2025;26(10):4928.
  26. Alizadeh Moghadam Masouleh A et al. Embryo metabolism as a novel non-invasive preimplantation test: nutrients turn over and metabolomic analysis of human spent embryo culture media (SECM). Hum Reprod Update. 2025;31(5):405-444.
  27. Hajnajafi K, Iqbal MA. Mass-spectrometry based metabolomics: an overview of workflows, strategies, data analysis and applications. Proteome Sci. 2025;23:5.
  28. Emwas AH et al. NMR spectroscopy for metabolomics research. Metabolites. 2019;9(7):123.
  29. Giera M, Yanes O, Siuzdak G. Metabolite discovery: biochemistry's scientific driver. Cell Metab. 2022;34(1):21-34.
  30. Lippi G et al. Influence of hemolysis on routine clinical chemistry testing. Clin Chem Lab Med. 2006;44:311-316.
  31. An Z, Shi C, Li P, Liu L. Stability of amino acids and related amines in human serum under different preprocessing and pre-storage conditions based on iTRAQ®-LC-MS/MS. Biol Open. 2021;10(2):bio055020.
  32. Fomenko MV, Yanshole LV, Tsentalovich YP. Stability of metabolomic content during sample preparation: blood and brain tissues. Metabolites. 2022;12(9):811.
  33. Wishart DS et al. HMDB 5.0: The Human Metabolome Database for 2022. Nucleic Acids Res. 2022;50(D1):D622-D631.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

MedycynaWydanie 233Wydanie 233Wartość pustaWydanieSpektroskopia NMRMetabolomikaZanieczyszczenie olejemCPMG
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.