W czasie rzeczywistym, nieinwazyjna ocena funkcji mitochondrialnych za pomocą spektroskopii rezonansowego rozpraszania Ramana

Podsumowanie

Prezentujemy nieinwazyjną, czasu rzeczywistego metodę monitorowania zdrowia mitochondriów za pomocą Spektroskopi Rezonansowo-Ramanowskiej (RRS). Wykorzystaliśmy RRS do ilościowego określania stanów redoks mitochondriów i opracowaliśmy wskaźnik zdrowia mitochondriów, Redukowany Rezonansowo-Ramanowski Wskaźnik Mitochondriów (3RMR), który wykazuje szybszą reakcję na zmiany w tlenowania niż tradycyjne analityki gazów we krwi.

Streszczenie

Mimo że mitochondria są centralne dla patogenezy i postępu choroby, mechanistyczne wglądy w dynamikę zdrowia mitochondrialnego pozostają kosztowne i niedostępne. Aby wypełnić tę lukę, w niniejszym badaniu zastosowano Spektroskopio Rezonansu Ramana (RRS) do oceny funkcji mitochondrialnych, wykorzystując przenośny system, który dostarcza czasowych, nieinwazyjnych i ilościowych pomiarów stanów redoks cytochromów mitochondrialnych w wątrobach szczurów. W tym protokole demonstrujemy zastosowanie tej technologii, w tym konfigurację, zbieranie danych i przetwarzanie danych. Niniejsze badanie przedstawia eksperyment udowadniający koncepcję, który podkreśla zdolność RRS do pomiaru zmian w czasie rzeczywistym w stanie redoks mitochondrialnym - a przez rozszerzenie, funkcji mitochondrialnej. W skrócie, urządzenie RRS zostało podłączone do pompy laserowej oraz komputera do zbierania danych i umieszczone 1 cm od wątroby szczura.  Parametry zbierania danych zostały wybrane zgodnie z protokołem dotyczącym wątroby szczura; stany redoks zostały zmierzone w warunkach natlenionych i niedotlenionych przy użyciu testu stresu tlenowego. Zmiany w stanach redoks mitochondrialnych były śledzone podczas całego testu stresu tlenowego.

Wprowadzenie

Mitochondria odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu komórek i homeostazie. Mitochondria są głównymi napędami metabolizmu komórkowego, regulując produkcję ATP poprzez fosforylację utleniającą. Służą również jako organella sygnałowe, które dyktując los komórki, regulują szlaki apoptotyczne, a także sygnał ROS i Ca⁺²¹. Tym samym, dysfunkcja mitochondriów może prowadzić do różnych chorób neurodegeneracyjnych, mięśniowych i układu krążenia^2,3. Mimo że mitochondria odgrywają kluczową rolę w progresji chorób, ocena funkcji mitochondriów może być inwazyjna, kosztowna i ograniczona.

Kluczowe wskaźniki funkcji mitochondriów, takie jak wskaźnik zużycia tlenu, fosforylacja utleniająca i aktywność różnych kompleksów w łańcuchu transportu elektronowym (ETC), są mierzone za pomocą respirometrii. ETC składa się z czterech kompleksów (I–IV) osadzone w wewnętrznej błonie mitochondrialnej (IMM). Te kompleksy, z pomocą innych koenzymów, przenoszą elektrony z zredukowanych substratów, takich jak NADH i FADH2, do końcowego akceptora elektronów, O₂, który jest następnie zredukowany do wody. Większość współczesnych testów respirometrii, takich jak Seahorse i Orobros O2k, wymaga przetwarzania tkanki, co ogranicza ich zastosowanie do badań translacyjnych^4,5. Pomiar potencjału membran mitochondriów (MMP) to kolejna metoda oceny dysfunkcji mitochondriów, która wykorzystuje kationiczne lipofilowe fluorofory, takie jak JC-1, wraz z obrazowaniem mikroskopowym, gdzie sprzężone (zdrowe) i nie sprzężone (uszkodzone) mitochondria fluoreskują na różnych długościach fal⁶. Jednak te testy mogą mieć niską czułość⁵. Sam barwnik może również mieć wysoką cytotoksyczność w wysokich stężeniach⁵. Ostatnio, podobnie jak pomiary respirometrii, ta technika również wymaga przetwarzania tkanki. Techniki oparte na spektroskopii zostały ostatnio wykorzystane jako nieinwazyjne metody oceny zdrowia mitochondriów. Na przykład, Spektroskopia Rezonansu Magnetycznego Fosforu (P-MRS), metoda oceny metabolizmu komórkowego przez pomiar stężeń metabolitów zawierających fosfor, została wykorzystana do charakteryzacji inżynieryjnych tkanek adypogennych poddanych różnicowaniu⁷. Jednak ta technika również wymaga specjalistycznego sprzętu i szkolenia.

Nasza grupa niedawno zademonstrowała technikę czasu rzeczywistego, nieinwazyjną i wysoce specyficzną do pomiaru stanu redoks mitochondriów jako markera żywotności narządów przy użyciu Spektroskopii Rezonansu Ramana (RRS). RRS wykorzystuje nieelastyczne rozpraszanie fotonów do ilościowego określania stanów redoks cytochromów mitochondrialnych. Pierścienie porfiryny w hemowych częściach cząsteczek, takich jak cytochromy mitochondrialne, hemoglobina i mioglobina, wytwarzają charakterystyczne widmo Ramana w zależności od ich stopnia utlenienia po pobudzeniu laserem o długości fali 441 nm⁸. Chociaż system RRS wykorzystuje długość fali 441 nm, można również zastosować lasery o długości fali 420 nm i 405 nm, z których każdy preferencyjnie wzmacnia inny kompleks cytochromowy. Spektrum uzyskane z nieznanej próbki interesującej jest skontrastowane z wcześniej nagranym księgozbiorem w pełni utlenionych lub zredukowanych, nieuszkodzonych mitochondriów, dając stosunek zredukowanych do całkowitych mitochondriów lub średni stan redoks in situ cytochromów ETC. Stosunek ten jest definiowany jako Rezonansowy Raman Redukowany Stosunek Mitochondriów (3RMR).

Istnieją 3 odrębne obliczenia/typy 3RMR: mitochondrialny 3RMR (mito-3RMR), 3RMR kompleksu III (cIII-3RMR) i 3RMR kompleksu IV (cIV-3RMR). Każdy z tych indeksów jest obliczany przez ułamek zredukowany do liczby wszystkich danych składników. Na przykład 3RMR cIII byłby stosunkiem zredukowanego cIII do całkowitej liczby cIII w tkankach (cIII-R/(cIII-O+CIII-R). Ten sam wzorzec dotyczy cIV. Tym samym, 3RMR-cIII odnosiłby się do stosunku zredukowanego cIII do całkowitej ilości cIII, a 3RMR-cIV odnosiłby się do stosunku zredukowanego cIV do całkowitej ilości cIV. Poprzez analizę regresji, albo mitochondrialne stany redoks (mito-3RMR) są obliczane za pomocą bibliotek spektralnych nieuszkodzonych mitochondriów, albo pojedyncze stany redoks kompleksów (cIII-3RMR i cIV-3RMR) są obliczane za pomocą bibliotek spektralnych cIII i cIV. Niedawny artykuł⁹ wykazał, że mito-3RMR jest reprezentatywny dla ważonej średniej stanów redoks cIII i cIV (lub cIII-3RMR i cIV-3RMR). Ważne jest, aby zauważyć, że cI i cII nie są aktywne Ramanem ani resonantnie wzmacniane przez długość fali 441 nm. W konsekwencji nie są obliczane podczas obliczania mito-3RMR.

Wykorzystując te typy 3RMR, określiliśmy optymalny zakres 3RMR. W "zdrowych" narządach mitochondria są nietknięte i mają

Protokół

Wszystkie zwierzęta użyte do eksperymentów były utrzymywane zgodnie z wytycznymi National Research Council i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Użytkowania (IACUC) w Massachusetts General Hospital (Boston, MA, USA).

1. Skonfigurowanie i korzystanie z RRS

1. Opis urządzenia:
   UWAGA: Przenośny system RRS (Pendar Technologies; produkt jest przeznaczony wyłącznie do celów badawczych) wykorzystuje laser o długości fali 441 nm z powodu rezonansowego wzmocnienia widma Ramana cytochromów mitochondrialnych o tej długości fali. Moc lasera waha się między 4 mW a 8 mW.
   1. Podłącz źródło wzbudzania laserowego do niestandardowego pręta za pomocą kabla światłowodowego. Pręt rzuca 2-milimetrowy laserowy plamę na tkankę, a także zbiera emitowany spektrum. Następnie spektrum przechodzi przez filtr przepustowy i jest zbierane przez matrycę CCD. Spektrum jest zbierane co sekundę w ciągu 180 s i średniowane, aby utworzyć surowe spektrum o zmniejszonym poziomie szumów do analizy.
   2. Oprogramowanie porównuje to uzyskane spektrum z wstępnie zmierzonymi bibliotekami spektralnymi za pomocą analizy regresji.
2. Procedura wstępnego nagrywania bibliotek
   UWAGA: W eksperymentach przedstawionych w tej pracy stworzone i wykorzystane zostały zmniejszone i utlenione formy mitochondria, kompleksu III i IV, hemoglobiny oraz biblioteki mięśnioglobiny. Sygnały RRS wszystkich bibliotek zostały wzięte w czarnej skrzynce w temperaturze pokojowej (21 °C). Te pliki biblioteki są dostarczane razem z oprogramowaniem analitycznym oddzielnie. Jednak w zależności od zainteresowanej tkanki i obecności innych cząstek aktywnych Ramana, inne biblioteki mogą zostać stworzone poprzez odpowiednie dostosowanie poniższego protokołu. Surowe widma RRS biblioteki hemoglobiny, mięśnioglobiny oraz utlenionego/zmniejszonego kompleksu III/IV są dostarczane w Dodatkowym Rysunku 1.
   1. Biblioteki hemoglobiny (Dodatkowy Rysunek 1C):
      1. Zbierz świeżą krew od gryzoni poprzez wykrwawienie zwierzęcia. Oksygenuj zebraną krew za pomocą 100% tlenu lub odtleń ją za pomocą 100% azotu w szklanym kuwetcie, dodając ditionian sodu.
      2. Zmierz RRS każdego stanu przez ściankę kuwety szklanej przez 10 min, przy czym sonda RRS jest ustawiona 9 mm od szklanej kuwety.
      3. Użyj szczytów spektralnych przy 1356 cm^-1 aby zweryfikować stan odtleniony, a szczytów przy 1376 cm^-1 aby potwierdzić stan utleniony.
   2. Zmniejszone/utlenione mitochondrialne biblioteki (Rysunek 1)
      1. Izoluj mitochondria z homogenizowanych i oczyszczonych serc gryzoni w szklanym kuwecie. Umieść sondę Ramana 9 mm od szklanej kuwety i zmierzyj widma tych mitochondria przez ściankę szklaną.
      2. Stwórz warunki całkowicie utlenione, dostarczając mitochondriatom 100% przepływu tlenu. Zweryfikuj stan utleniony poprzez brak zmniejszonego szczytu RR przy 1357 cm^-1.
      3. Stwórz warunki całkowicie zmniejszone, narażając mitochondria na 100% azot z niewielkimi ilościami siarkowodoru. Zweryfikuj warunki zmniejszone poprzez brak utlenionego szczytu wskaźnika RR przy 1371 cm^-1.
   3. Utleniony/zmniejszony kompleks III/IV (Dodatkowy Rysunek 1A,B):
      1. Izoluj kompleks III i IV, jak opisano wcześniej^9,15,16,17. Krótko mówiąc, użyj próbki macierzystej izolowanej mitochondria (odpowiadającej 200 nanomolom cytochromu a) jako wyjściowego materiału.
      2. Rozcieńcz mitochondria do 10 nmol cytochromu A/mL w lodowatej buforze C (50 mM Tris, 1 mM MgSO_4, pH 8,45). Następnie dodaj 10% w/v n-β-D-dodecyl maltoside (DM) kroplą po kropli do końcowej koncentracji 1%, delikatnie mieszając na lodzie.
      3. Centryfuguj ekstrakt przy 40 000 × g przez 40 min w 4 °C. Zastosuj nadstan do kolumny szkła 2,5 cm × 20 cm, która została wcześniej wypełniona żywicą wymiany zrównoważoną z 5 objętościami kolumny buforu C (zawierającego 0,02% w/v DM).
      4. Po przepłukaniu 2 objętościami buforu C, eluuj kompleksy mitochondrialne, stosując liniowy gradient NaCl od 0 do 400 mM w tym samym buforze i zbierz eluat w frakcjach po 4 mL.
      5. Zielone frakcje zawierające Kompleks IV eluowały się w pobliżu środka gradientu (~180 mL NaCl), przed czerwonymi frakcjami zawierającymi Kompleks III. Skoncentruj połączone frakcje zawierające każdy kompleks do 20–30 nmol cytochromu a/mL.
      6. Po izolowaniu pojedynczych kompleksów, wystawiaj każdy na warunki utleniające i zmniejszające. Zmniejsz 11 mM próbki Kompleksu III w buforze Tris za pomocą 2 mL askorbinianu (1 M)

Wyniki

Świeże wątroby były poddawane okresowym niedokrwieniom i reperfuzji z wykorzystaniem testu stresu tlenowego. Następnie porównano zmiany w czasie rzeczywistym 3RMR podczas testu stresu z prędkością zużycia tlenu, stężeniem laktanu w przepływie i potasem uzyskanym z analizy perfusatu w czasach T₀, T₅, T₁₀, T₁₅. W zdrowym stanie wartości 3RMR powinny wynosić od 10% do 30% (Rysunek 5A). Jak się spodziewano, wartości 3RMR w czasach T₀ i T₅ mieszczą się w tym zakresie, ponieważ wątroba była ciągle dostarczana perfuzytem natlenionym między tymi punktami czasowymi (Rysunek 5A). Jednakże wartość 3RMR pod koniec okresu niedokrwienia (T₁₀) wykracza poza optymalny zakres (Rysunek 5A). Ten wzrost wskazuje na przejście mitochondriów w ich zmniejszone stany, ponieważ elektrony gromadzą się w całym łańcuchu transportu z powodu odtlenienia. W czasie T₁₀ przepływ natleniony zostaje wznowiony; zaczyna się okres reperfuzji. Pod koniec okresu reperfuzji (T₁₅) wartości 3RMR wracają do optymalnych poziomów (Rysunek 5A), ponieważ aktywność ŁT jest przywracana poprzez ponowne wprowadzenie tlenu jako końcowego akceptora elektronu. Te zmiany w przepływie tlenu są widoczne również w surowych widmach. Surowe widma RRS w czasach T₀ i T₁₅ mają charakterystyczne widma podobne do utlenionych mitochondriów (Rysunek 6A,C), takie jak szczyt markera widmowego na 1371 cm^-1 (Rysunek 6D,F). Podobnie, surowe widma Ramana w czasie T₁₀ (Rysunek 6B) pokazują zmniejszone markery RR, takie jak szczyt markera widmowego na 1357 cm^-1 (Rysunek 6E). Podsumowując, RRS identyfikuje zmiany w stanach redoksowych mitochondriów w czasie rzeczywistym, co jest pokazane zarówno w surowym sygnale widmowym, jak i jako wskaźnik zdrowia mitochondriów (3RMR).

RRS może również obliczać wartości 3RMR na podstawie stanów redoksowych cIII i cIV. Podobny wzór obserwowano w wartościach 3RMR cIII i cIV (Rysunek 5B). W czasie T₀ zaobserwowano pełne utlenione wartości 3RMR dla cIV i wartości 3RMR w optymalnym zakresie dla cIII. Ta równowaga redoksowa między kompleksami jest fizjologiczna, ponieważ elektrony przepływają z cIII do cIV, aby zostać szybko utlenione. Po rozpoczęciu niedokrwienia zaobserwowano wzrost poziomów 3RMR dla każdego kompleksu. Podczas okresu niedokrwienia, gromadzenie elektronów przez ŁT zwiększa stres redukcyjny na cIII i cIV, co konsekwentnie zwiększa cIII-3RMR i cIV-3RMR. Jednakże po ponownym wprowadzeniu tlenu, wartości 3RMR obu kompleksów maleją z powrotem do optymalnych poziomów: całkowicie utlenione cIV i fizjologicznie zmniejszone cIII (Rysunek 5B). Trendy 3RMR w obu kompleksach pokazują, że zaprzestanie dostarczania tlenu odbija się na całym ŁT, a żaden z pojedynczych kompleksów nie jest szczególnie podatny na niedokrwienie bez przepływu.

Z drugiej strony, zmiany w dynamice utlenienia nie odzwierciedlały biomarkerów uszkodzeń i analiz gazów we krwi uzyskanych z analizy perfusatu. Po rozpoczęciu niedokrwienia, oczekuje się wzrostu poziomu laktanu i K⁺, ponieważ komórka zaczyna polegać na oddychaniu tlenowym i powoli degraduje się, aby uwolnić K⁺ wewnątrzkomórkowy. Oczekujemy również spadku OCR, ponieważ komórki nie produkują wystarczającej ilości energii, aby kontynuować oddychanie komórkowe. Nawet po okresie niedokrwienia bez przepływu, współczynniki zużycia tlenu nie wykazywały oznak uszkodzenia. Poziom laktanu i K⁺ w przepływie wydzielniczym pozostawał stosunkowo jednolity podczas testu stresu, mimo zmian w dynamice utlenienia (Rysunek 5D–E).

Rysunek 5: Zmiany w 3RMR i biomarkerach uszkodzeń podczas testu stresu tlenowego. Początek okresów niedokrwienia i reperfuzji są przedstawione przez kreskowane linie w minutach 5 i 10 odpowiednio. Dodatkowo, okresy przepływu natlenionego są przedstawione za pomocą niebieskich linii, a okresy niedokrwienia są przedstawione za pomocą czerwonej linii. (A) Wartości 3RMR podczas całego badania mitochondrialnego. Wartości 3RMR wzrosły, gdy przepływ natleniony został wstrzymany i spadły z powrotem do optymalnych poziomów, gdy przepływ został wznowiony. (B) Wartości 3RMR kompleksu

Dyskusja

Niniejsze badanie wskazuje na nieinwazyjną, czasowo rzeczywistą i wysoce czułą metodę ilościowego określania stanu zdrowia mitochondriów, wykorzystującą przenośny system spektroskopii rezonansowej Ramana, który składa się z lasera w kompaktowej sondzie, połączonej za pomocą kabla światłowodowego z pompą laserową. Metoda ta wykorzystuje laser o długości fali 441 nm do pobudzania mitochondriów, które wytwarzają unikalne sygnały spektralne w zależności od ich stopnia utlenienia. Tym samym, spektroskopia rezonansowa Ramana jest w stanie ilościowo określić każdy stan mitochondriów poprzez ich spektralne podpisy i porównać emitowane widma z wstępnie zmierzonymi bibliotekami widm za pomocą analizy regresji. Następnie stworzono wskaźnik zdrowia mitochondriów na podstawie proporcji zredukowanych do łącznych mitochondriów: Reduced Resonance Raman Mitochondrial Ratio (3RMR).

Niniejszy artykuł koncentruje się na demonstrowaniu zmian w czasie rzeczywistym 3RMR jako funkcji utleniania z tkanką rodzimą bez konieczności przetwarzania próbki. Osiągnięto to poprzez test stresu tlenowego: po 5 minutach ciągłej perfuzyjnej dostarczania tlenu, przepływ perfuzyjny zostaje wstrzymany na 5 minut, a następnie wznowiony na kolejne 5 minut. Pomiary 3RMR są wykonywane w trakcie trwania testu stresu. Model testu stresu, w którym przełączamy się między okresami niedotlenienia a dotlenienia, pozwala nam na śledzenie ciągłych zmian w stanach redoksowych mitochondriów – a zatem i funkcji mitochondriów. Innymi słowy, test stresu tlenowego pozwala nam na śledzenie trendów w 3RMR jako funkcji utleniania. Nasza grupa przypisuje rosnące wartości 3RMR warunkom niedotlenienia, zakłócającym przepływ perfuzji, co powoduje nagromadzanie się elektronów przepływających przez łańcuch oddechowy, ponieważ O₂ nie jest dostępny jako końcowy akceptor elektronów. To nagromadzenie elektronów powoduje stan zredukowany, co przekłada się na wzrost wartości 3RMR. Jednak po ponownym wprowadzeniu O₂, zdrowe mitochondria powinny wznowić aktywność łańcucha oddechowego i wrócić do fizjologicznych stanów redoksowych, ponieważ ich strukturalne i funkcjonalne elementy są zachowane.

Zgodnie z oczekiwaniami, w niniejszym artykule zaobserwowano ciągły, czasowo rzeczywisty wzrost 3RMR w trakcie okresu niedotlenienia (Rysunek 5A). Podobnie, 3RMR stopniowo wraca do optymalnych wartości w trakcie okresu reperfuzji (Rysunek 5A). Ta czasowo rzeczywista zmiana w stanach redoksowych mitochondriów jest również widoczna na wykresie spektralnym, ponieważ szczyt mitochondriów przesuwa się z utlenionego (1371 cm^-1) do zredukowanego (1357 cm^-1) stanu w trakcie okresu niedotlenienia, a następnie powraca do stanu utlenionego pod koniec reperfuzji (Rysunek 6). Inne zredukowane szczyty markera RR pojawiają się również w trakcie okresu niedotlenienia. W przeciwieństwie do tradycyjnych badań zdrowia mitochondriów, spektroskopia rezonansowa Ramana jest wystarczająco czuła, aby ilościowo określić stany redoksowe kompleksu III i kompleksu IV, co zapewniło i zapewnia mechanistyczne wgląd w konkretny wpływ uszkodzeń wywołanych niedotlenieniem-reperfuzją na łańcuch oddechowy. W zdrowych mitochondriach, elektrony są przekazywane przez różne kompleksy w łańcuchu oddechowym, zaczynając od kompleksu I, aż do osiągnięcia O₂ jako końcowego akceptora elektronów. Przerwa w przepływie tlenu może przesunąć każdy kompleks w stan zredukowany, ponieważ elektrony zaczynają się gromadzić wzdłuż łańcucha oddechowego. Zgodnie z oczekiwaniami, zaobserwowano czasowo rzeczywisty wzrost wartości 3RMR dla cIII i cIV podczas wystąpienia niedotlenienia. To wskazuje, że brak O₂ ma wpływ na cały łańcuch oddechowy, a nie na konkretny kompleks (Rysunek 5B). Jak omówimy poniżej, czułość spektroskopii rezonansowej Ramana umożliwia szczegółowe badania mechanistyczne i informuje o rozwoju ukierunkowanych terapii dla IRI.

Tradcyjnie oczekuje się również podwyższonego poziomu mleczanów w narządach niedotlenych, ponieważ opierają się one na metabolizmie beztlenowym w przypadku braku tlenu, aby wytwarzać ATP. Podobnie, oczekiwano wzrostu poziomów K⁺ w uszkodzonych narządach, ponieważ integralność błony komórkowej jest zaburzona, co pozwala na wypływ K⁺ z komórek. Ostatecznie, poważnie uszkodzone komórki mogą mieć niższy metabolizm, ponieważ ich szlaki metaboliczne są otoczone przez produkty przemiany materii wywołane niedotlenieniem i ROS, co prowadzi do zmniejszonego zużycia tlenu. Jednakże, nie obserwuje się żadnych zmian w poziomach mleczanów, K⁺ lub zużyciu tlenu podczas lub po okresie niedotlenienia. W rzeczywistości, wartości nie wskazują na żadne zahamowanie przepływu tlenu, ponieważ pozostają stosunkowo jednolite w trakcie testu stresu (Rysunek 5B–D). W istocie, za pomocą testu stresu tlenowego, niniejsze badanie pokazuje, że wartości 3RMR

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
16 G Catheter	BD Insyte Authoguard	381454	Używane do nakłucia żyły wrotnej
Activated Charcoral	Vet Equip Vapor Guard Activated Charcoal	931401	Używane do filtrowania nadmiaru pary podczas anestezji
BSA	Sigma-Aldrich	A7906	Skład perfuzyjnego roztworu
Bubble Trap	Radnoti	130149
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	Skład perfuzyjnego roztworu
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061	Skład perfuzyjnego roztworu
Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G)	Fisher Scientific	13-200-292	Używane do przepływu perfuzyjnego roztworu przez wątrobę
Masterflex peristaltic pumps	Cole Parmer, Vernon Hill, IL	7528-30	Używane do przepływu perfuzyjnego roztworu przez wątrobę
Membrane Oxygenator	Radnoti	130144	Używane do utleniania perfuzyjnego roztworu.
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Skład perfuzyjnego roztworu
RAPIDPoint 500 Blood Gas System	Siemens Healthineers	41115805	Do analizy gazów krwi
Resonance Raman System	Pendar Technologies	A4D441	Skontaktuj się z Pendar Technologies w sprawie zapytań dotyczących tego produktu