Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

W czasie rzeczywistym, nieinwazyjna ocena funkcji mitochondrialnych za pomocą spektroskopii rezonansowego rozpraszania Ramana

273 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71290

⸱

7 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Hospital for Children, 3Pendar Technologies

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy nieinwazyjną, czasu rzeczywistego metodę monitorowania zdrowia mitochondriów za pomocą Spektroskopi Rezonansowo-Ramanowskiej (RRS). Wykorzystaliśmy RRS do ilościowego określania stanów redoks mitochondriów i opracowaliśmy wskaźnik zdrowia mitochondriów, Redukowany Rezonansowo-Ramanowski Wskaźnik Mitochondriów (3RMR), który wykazuje szybszą reakcję na zmiany w tlenowania niż tradycyjne analityki gazów we krwi.

Streszczenie

Mimo że mitochondria są centralne dla patogenezy i postępu choroby, mechanistyczne wglądy w dynamikę zdrowia mitochondrialnego pozostają kosztowne i niedostępne. Aby wypełnić tę lukę, w niniejszym badaniu zastosowano Spektroskopio Rezonansu Ramana (RRS) do oceny funkcji mitochondrialnych, wykorzystując przenośny system, który dostarcza czasowych, nieinwazyjnych i ilościowych pomiarów stanów redoks cytochromów mitochondrialnych w wątrobach szczurów. W tym protokole demonstrujemy zastosowanie tej technologii, w tym konfigurację, zbieranie danych i przetwarzanie danych. Niniejsze badanie przedstawia eksperyment udowadniający koncepcję, który podkreśla zdolność RRS do pomiaru zmian w czasie rzeczywistym w stanie redoks mitochondrialnym - a przez rozszerzenie, funkcji mitochondrialnej. W skrócie, urządzenie RRS zostało podłączone do pompy laserowej oraz komputera do zbierania danych i umieszczone 1 cm od wątroby szczura.  Parametry zbierania danych zostały wybrane zgodnie z protokołem dotyczącym wątroby szczura; stany redoks zostały zmierzone w warunkach natlenionych i niedotlenionych przy użyciu testu stresu tlenowego. Zmiany w stanach redoks mitochondrialnych były śledzone podczas całego testu stresu tlenowego.

Wprowadzenie

Mitochondria odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu komórek i homeostazie. Mitochondria są głównymi napędami metabolizmu komórkowego, regulując produkcję ATP poprzez fosforylację utleniającą. Służą również jako organella sygnałowe, które dyktując los komórki, regulują szlaki apoptotyczne, a także sygnał ROS i Ca+21. Tym samym, dysfunkcja mitochondriów może prowadzić do różnych chorób neurodegeneracyjnych, mięśniowych i układu krążenia2,3. Mimo że mitochondria odgrywają kluczową rolę w progresji chorób, ocena funkcji mitochondriów może być inwazyjna, kosztowna i ograniczona.

Kluczowe wskaźniki funkcji mitochondriów, takie jak wskaźnik zużycia tlenu, fosforylacja utleniająca i aktywność różnych kompleksów w łańcuchu transportu elektronowym (ETC), są mierzone za pomocą respirometrii. ETC składa się z czterech kompleksów (I–IV) osadzone w wewnętrznej błonie mitochondrialnej (IMM). Te kompleksy, z pomocą innych koenzymów, przenoszą elektrony z zredukowanych substratów, takich jak NADH i FADH2, do końcowego akceptora elektronów, O2, który jest następnie zredukowany do wody. Większość współczesnych testów respirometrii, takich jak Seahorse i Orobros O2k, wymaga przetwarzania tkanki, co ogranicza ich zastosowanie do badań translacyjnych4,5. Pomiar potencjału membran mitochondriów (MMP) to kolejna metoda oceny dysfunkcji mitochondriów, która wykorzystuje kationiczne lipofilowe fluorofory, takie jak JC-1, wraz z obrazowaniem mikroskopowym, gdzie sprzężone (zdrowe) i nie sprzężone (uszkodzone) mitochondria fluoreskują na różnych długościach fal6. Jednak te testy mogą mieć niską czułość5. Sam barwnik może również mieć wysoką cytotoksyczność w wysokich stężeniach5. Ostatnio, podobnie jak pomiary respirometrii, ta technika również wymaga przetwarzania tkanki. Techniki oparte na spektroskopii zostały ostatnio wykorzystane jako nieinwazyjne metody oceny zdrowia mitochondriów. Na przykład, Spektroskopia Rezonansu Magnetycznego Fosforu (P-MRS), metoda oceny metabolizmu komórkowego przez pomiar stężeń metabolitów zawierających fosfor, została wykorzystana do charakteryzacji inżynieryjnych tkanek adypogennych poddanych różnicowaniu7. Jednak ta technika również wymaga specjalistycznego sprzętu i szkolenia.

Nasza grupa niedawno zademonstrowała technikę czasu rzeczywistego, nieinwazyjną i wysoce specyficzną do pomiaru stanu redoks mitochondriów jako markera żywotności narządów przy użyciu Spektroskopii Rezonansu Ramana (RRS). RRS wykorzystuje nieelastyczne rozpraszanie fotonów do ilościowego określania stanów redoks cytochromów mitochondrialnych. Pierścienie porfiryny w hemowych częściach cząsteczek, takich jak cytochromy mitochondrialne, hemoglobina i mioglobina, wytwarzają charakterystyczne widmo Ramana w zależności od ich stopnia utlenienia po pobudzeniu laserem o długości fali 441 nm8. Chociaż system RRS wykorzystuje długość fali 441 nm, można również zastosować lasery o długości fali 420 nm i 405 nm, z których każdy preferencyjnie wzmacnia inny kompleks cytochromowy. Spektrum uzyskane z nieznanej próbki interesującej jest skontrastowane z wcześniej nagranym księgozbiorem w pełni utlenionych lub zredukowanych, nieuszkodzonych mitochondriów, dając stosunek zredukowanych do całkowitych mitochondriów lub średni stan redoks in situ cytochromów ETC. Stosunek ten jest definiowany jako Rezonansowy Raman Redukowany Stosunek Mitochondriów (3RMR).

Istnieją 3 odrębne obliczenia/typy 3RMR: mitochondrialny 3RMR (mito-3RMR), 3RMR kompleksu III (cIII-3RMR) i 3RMR kompleksu IV (cIV-3RMR). Każdy z tych indeksów jest obliczany przez ułamek zredukowany do liczby wszystkich danych składników. Na przykład 3RMR cIII byłby stosunkiem zredukowanego cIII do całkowitej liczby cIII w tkankach (cIII-R/(cIII-O+CIII-R). Ten sam wzorzec dotyczy cIV. Tym samym, 3RMR-cIII odnosiłby się do stosunku zredukowanego cIII do całkowitej ilości cIII, a 3RMR-cIV odnosiłby się do stosunku zredukowanego cIV do całkowitej ilości cIV. Poprzez analizę regresji, albo mitochondrialne stany redoks (mito-3RMR) są obliczane za pomocą bibliotek spektralnych nieuszkodzonych mitochondriów, albo pojedyncze stany redoks kompleksów (cIII-3RMR i cIV-3RMR) są obliczane za pomocą bibliotek spektralnych cIII i cIV. Niedawny artykuł9 wykazał, że mito-3RMR jest reprezentatywny dla ważonej średniej stanów redoks cIII i cIV (lub cIII-3RMR i cIV-3RMR). Ważne jest, aby zauważyć, że cI i cII nie są aktywne Ramanem ani resonantnie wzmacniane przez długość fali 441 nm. W konsekwencji nie są obliczane podczas obliczania mito-3RMR.

Wykorzystując te typy 3RMR, określiliśmy optymalny zakres 3RMR. W "zdrowych" narządach mitochondria są nietknięte i mają

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zwierzęta wykorzystane w eksperymentach były utrzymywane zgodnie z wytycznymi National Research Council i uzyskały zatwierdzenie Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w Massachusetts General Hospital (Boston, MA, USA).

1. Konfiguracja i wykorzystanie RRS

  1. Opis urządzenia:
    UWAGA: Przenośny system RRS (Pendar Technologies; produkt przeznaczony wyłącznie do celów badawczych) wykorzystuje laser o długości fali 441 nm ze względu na rezonansowe wzmocnienie widma Ramana cytochromów mitochondrialnych przy tej długości fali. Laser pracuje w zakresie od 4 mW do 8 mW.
    1. Należy połączyć źródło wzbudzenia laserowego z niestandardową sondą za pomocą kabla światłowodowego. Sonda kieruje plamkę lasera o średnicy 2 mm na tkankę, a jednocześnie zbiera emitowane widmo. Widmo przechodzi następnie przez filtr pasmowy i jest rejestrowane przez matrycę urządzenia ładunkowo-sprzężonego (CCD). Widmo jest zbierane w każdej sekundzie w odstępie 180 s i uśredniane w celu utworzenia surowego widma z zredukowanym szumem do analizy.
    2. Oprogramowanie porównuje uzyskane widmo z wcześniej zmierzonymi bibliotekami widm za pomocą analizy regresji.
  2. Procedura wstępnego rejestrowania bibliotek
    UWAGA: W eksperymentach przedstawionych w niniejszej pracy utworzono i wykorzystano biblioteki dla form zredukowanych i utlenionych mitochondriów, kompleksu III, kompleksu IV, hemoglobiny oraz mioglobiny. Sygnały RRS wszystkich bibliotek zarejestrowano w czarnej skrzynce w temperaturze pokojowej (21 °C). Pliki tych bibliotek są dostarczane osobno wraz z oprogramowaniem analitycznym. Jednakże, w zależności od badanego rodzaju tkanki i obecności innych cząsteczek aktywnych w rozpraszaniu Ramana, można utworzyć inne biblioteki, odpowiednio adaptując poniższy protokół. Surowe widma RRS bibliotek hemoglobiny, mioglobiny oraz utlenionego/zredukowanego kompleksu III/IV przedstawiono na Ryc. uzupełniającej 1.
    1. Biblioteki hemoglobiny (Ryc. uzupełniająca 1C):
      1. Należy pobrać świeżą krew gryzoni poprzez upuszczenie krwi z zwierzęcia. Pobraną krew należy natlenić za pomocą 100% tlenu lub odtlenić za pomocą 100% azotu w kuwecie szklanej, dodając ditionian sodu.
      2. Należy mierzyć RRS każdego stanu przez ściankę szklanej kuwety przez 10 min, pozycjonując sondę RRS w odległości 9 mm od szklanej kuwety.
      3. Do weryfikacji stanu odtlenionego należy użyć pików widmowych przy 1356 cm-1 , a do potwierdzenia stanu natlenionego pików przy 1376 cm-1 .
    2. Biblioteki mitochondrialne zredukowane/utlenione (Ryc. 1)
      1. Należy wyizolować mitochondria z homogenizowanych i oczyszczonych serc gryzoni w szklanej kuwecie. SONDĘ Ramana należy umieścić 9 mm od szklanej kuwety i zmierzyć widma tych mitochondriów przez szklaną ściankę.
      2. Warunki pełnego utlenienia należy uzyskać poprzez podanie strumienia 100% tlenu do mitochondriów. Stan utleniony należy zweryfikować poprzez brak zredukowanego piku RR przy 1357 cm-1.
      3. Warunki pełnego zredukowania należy uzyskać poprzez wystawienie mitochondriów na działanie 100% azotu z niewielką ilością siarkowodoru. Warunki zredukowane należy zweryfikować poprzez brak piku markera utlenionego RR przy 1371 cm-1.
    3. Utleniony/zredukowany kompleks III/IV (Ryc. uzupełniająca 1A,B):
      1. Kompleks III i IV należy wyizolować zgodnie z opisem w innych publikacjach9,15,16,17. W skrócie, jako materiał wyjściowy należy wykorzystać roztwór stokowy wyizolowanych mitochondriów (odpowiadający 200 nanomolom cytochromu a).
      2. Mitochondria należy rozcieńczyć do stężenia 10 nmol cytochromu A/mL w lodowatym buforze C (50 mM Tris, 1 mM MgSO4, pH 8.45). Następnie należy dodawać kroplami n-β-D-dodecyl maltosyd (DM) 10% w/v do stężenia końcowego 1%, delikatnie mieszając na lodzie.
      3. Ekstrakt należy wirować przy 40 000 × g przez 40 min w temperaturze 4 °C. Nadosad należy nanieść na szklaną kolumnę o wymiarach 2,5 cm × 20 cm, która została wcześniej wypełniona żywicą wymienną równoważoną 5 objętościami kolumny buforu C (zawierającego 0,02% w/v DM).
      4. Po przemyciu 2 objętościami kolumny buforu C, kompleksy mitochondrialne należy eluować, stosując liniowy gradient NaCl 0–400 mM w tym samym buforze, a eluat zbierać w frakcjach po 4 mL.
      5. Zielone frakcje zawierające kompleks IV eluowały się blisko środka gradientu (~180 mL NaCl), przed czerwonawymi frakcjami zawierającymi kompleks III. Połączone frakcje zawierające każdy kompleks należy zagęścić do 20–30 nmoli cytochromu a/mL.
      6. Po wyizolowaniu poszczególnych kompleksów należy wystawić każdy z nich na warunki utleniające i redukujące. Próbkę kompleksu III o stężeniu 11 mM w buforze Tris należy zredukować, używając 2 mL askorbinianu (1 M) w celu zredukowania cytochromu c1 oraz 2 mL HS (hydrosiarczynu) w celu pełnego zredukowania cytochromów bL i bH.
      7. Próbkę kompleksu IV o stężeniu 18,67 mM w buforze Tris należy redukować w kilku etapach, ponieważ kompleks IV przechodzi wieloetapowy proces utleniania katalitycznego. Aby całkowicie zredukować kompleks IV, należy dodać dwie porcje po 2 mL H2O2 (10 mM), a następnie 2 mL HS.
      8. Widma biblioteczne należy zbierać po każdym dodaniu, aby zarejestrować każdy etap cyklu. Widma pełnie utlenione i zredukowane należy dodać do końcowej biblioteki referencyjnej, aby reprezentowały stany stacjonarne kompleksu IV.
      9. Wszystkie próbki należy przygotować w szklanych fiolkach o pojemności 1 mL, utrzymać je w stałej pozycji w odległości 9 mm od soczewki sondy i zamknąć w czarnej skrzynce, aby zapobiec zanieczyszczeniu światłem. Widma RRS należy zbierać przez 600 s dla każdego kompleksu i stanu utlenienia.
      10. Czystość wyizolowanych cIII i cIV należy zwalidować zgodnie z wcześniejszym opisem17, a adekwatność bibliotek widmowych wyizolowanych cIII i cIV w wyjaśnianiu pełnych widm mitochondrialnych należy potwierdzić zgodnie z opisem w niedawnej publikacji9.
    4. Biblioteki mioglobiny (Ryc. uzupełniająca 1D):
      1. Stosując podobne przepływy tlenu i azotu (z rozpuszczonym ditionianem sodu), należy zmieniać nasycenie oksyhemoglobiną ekstraktu mioglobiny mięśnia sercowego w zakresie od 0% do 100%. Widma Ramana należy weryfikować za pomocą pików markerów przy 1355 cm-1 i 1376 cm-1.

UWAGA: Większość opisanych powyżej komponentów widmowych, takich jak hemoglobina czy utlenione/zredukowane mitochondria, to cząsteczki zawierające hem, które są wzbudzane tą samą długością fali. System RRS zapobiega nakładaniu się sygnałów poprzez tworzenie biblioteki regresyjnej dla każdej cząsteczki na podstawie jej unikalnego sygnału widmowego. Uzyskane widma rozproszone są przetwarzane przez algorytm regresji w odniesieniu do wybranych bibliotek. Algorytm regresji wyznacza współczynnik dla każdego widma z biblioteki, który reprezentuje najlepsze dopasowanie szacunkowe jego względnego wkładu w zapisanym widmie, a tym samym jego względne stężenie w tkance. Ponieważ algorytm wykorzystuje najlepsze dopasowanie w zakresie liczb falowych, niewielkie różnice w położeniu lub intensywności pików widmowych poszczególnych komponentów biblioteki pozwalają regresji rozróżnić nawet blisko spokrewnione chromofory. Dzięki algorytmowi regresji i bibliotekom widmowym system RRS może rozłożyć całkowity sygnał rozproszony na poszczególne komponenty w zależności od ich unikalnych pików widmowych, unikając nakładania się sygnałów z cząsteczek zawierających hem. Aby wykazać zależność między hemoglobiną a mitochondriami, dołączono Rysunek Uzupełniający 2, który przedstawia obrazy widm pobranych z perfuzji wątroby, rozbite na sygnał pomiarowy, linię najlepszego dopasowania oraz niewyjaśnioną resztę wynikającą z różnic w poszczególnych pikach widmowych. W panelu A wybrano biblioteki regresyjne dla hemoglobiny zredukowanej i utlenionej oraz mitochondriów zredukowanych i utlenionych. Linia najlepszego dopasowania opracowana na podstawie bibliotek i analizy regresji dokładnie pokrywa się z sygnałem pomiarowym, a niewyjaśniona reszta jest niewielka. W panelu B wybrano jedynie biblioteki mitochondriów utlenionych i zredukowanych. Ponieważ występuje duża struktura niewyjaśnionej reszty, pik widmowy mitochondriów jest przesunięty o kilka liczb falowych w stosunku do hemoglobiny, która nie została uwzględniona w analizie regresji. Co więcej, w rysunkach uzupełniających pracy Nguyen et al.9, autorzy wyjaśniają relację między mitochondriami a poszczególnymi kompleksami (cIII i cIV), a także relację między poszczególnymi kompleksami16, przy czym kompleks III wykazuje ostrzejsze piki o niższej częstotliwości, podczas gdy kompleks IV wykazuje szersze, przesunięte w górę pasma. Ponadto autorzy wykazują, że biblioteki zredukowanego Kompleksu III i Kompleksu IV w pełni wyjaśniają zmierzone widmo zredukowanych całych mitochondriów, co skutkuje minimalną niewyjaśnioną resztą.

Wykresy spektroskopii Ramana pokazujące utlenione i zredukowane piki spektralne mitochondriów, intensywność względem przesunięcia.
Rysunek 1: Biblioteki spektralne całkowicie utlenionych i zredukowanych mitochondriów. Widma z biblioteki RRS uzyskano po dostarczeniu do izolowanych mitochondriów (A) 100% tlenu lub 100% azotu (B), aby odpowiednio osiągnąć stan utleniony i zredukowany. Stany te potwierdzono obecnością markerowych pików RR utlenionego (C) i zredukowanego (D). Przesunięcie tych pików odpowiada zmianom w molekularnych modach wibracyjnych w obecności tlenu. Intensywność każdego piku została znormalizowana do 1 dowolnej jednostki intensywności (AU), ponieważ wzmocnienie stanu zredukowanego jest większe przy zastosowaniu tej długości fali wzbudzenia 441 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

2. Gromadzenie danych przy użyciu RRS

  1. Urządzenie konfiguracja:
    1. Podłącz jednostkę spektrometru (umieszczoną w kompaktowej obudowie) do zasilacza prądu stałego (DC) oraz do adaptera zasilania za pomocą dołączonych kabli. Jednostka spektrometru posiada jedną okrągłą wtyczkę z wypustkami pozycjonującymi.
    2. Dopasuj wypustki okrągłej wtyczki do wypustek kabla podłączanego do adaptera zasilającego. Przed połączeniem portów nie jest wymagane czyszczenie (Rycina 2). 
    3. Podłącz komputer wykonujący analizę do tego samego zasilacza, do którego podłączone są spektrometr i źródło zasilania, używając dołączonych kabli.
    4. Umieść sondę laserową w uchwycie sondy. Dostosuj położenie sondy przed rozpoczęciem eksperymentu.
    5. Uruchom oprogramowanie sterujące spektrometrem (Cellular Energetics Software).
  2. Konfiguracja oprogramowania:
    UWAGA: Wraz z systemem dostarczone zostają pliki ustawień oraz biblioteki regresji dla różnych typów tkanek. Pliki te zawierają informacje o tym, jakie biblioteki system RRS powinien uwzględnić w regresji, ile widm znajduje się w oknie regresji, a także inne parametry, takie jak moc lasera. Ustawienia domyślne można zmienić i zapisać nowy plik ustawień do wykorzystania w przyszłych eksperymentach. Zrzuty ekranu oprogramowania, opisane poniżej, przedstawiono w Rycina uzupełniająca 3.
    1. Po otwarciu oprogramowania sterującego spektrometrem pojawi się wykres przedstawiający procentowy poziom 3RMR, wysycenie tlenem (StO2) oraz pojawi się saturacja mioglobiny. Na tym ekranie będą wyświetlane te parametry, jeśli zostaną wybrane, w czasie rzeczywistym podczas pomiarów. Kliknij w Ustawienia zakładka w lewym dolnym rogu strony.
    2. Pod Informacje zakładka, wprowadź informacje o sesji w sekcji Nazwa sesjior wszelkie niezbędne szczegóły w sekcji Opis sesji tab.
    3. Istnieją dwa tryby zbierania danych. Należy użyć Kontrola wyrywkowa tryb akumulacji widm do momentu spełnienia określonych parametrów jakościowych (np. docelowej wartości sigma lub okna regresji/liczby widm), a następnie zatrzymanie rejestracji. Użyj Tryb ciągły aby rejestrować widma do momentu naciśnięcia przycisku stop. W obu trybach wszystkie dane, zarówno wyniki 3RMR, jak i poszczególne widma, są zapisywane automatycznie. W tym doświadczeniu wykorzystuje się Tryb ciągły.
    4. Po wprowadzeniu wszystkich informacji o sesji należy kliknąć przycisk System tab.
    5. Pod Plik ustawieńwybierz protokół odpowiedni dla projektu (w przypadku perfuzji wątroby szczura w układzie bezkomórkowym wybierz protokół Acomórkowa wątroba szczura protokół). Spowoduje to automatyczne dostosowanie typu pomiaru, średniej długości pomiaru (okna regresji) oraz docelowej wartości sigma.
      1. Aby utworzyć nowy plik ustawień, należy dostosować dowolny z wymienionych powyżej komponentów, a następnie kliknąć Zapisz przycisk. Powinno to zapisać te parametry jako oddzielny plik ustawień, który następnie można zaimportować do systemu.
      2. Aby zaimportować nowy plik ustawień, należy kliknąć menu rozwijane obok Domyślny (Mod) oraz wybierz Importuj nowy plik ustawieńKliknij nową Plik ustawień do importu.
    6. Pod Biblioteki regresyjnewybierz i potwierdź kombinację bibliotek, które zostaną wykorzystane do akwizycji i analizy danych. W tym eksperymencie wybrano biblioteki dla mitochondriów w stanie zredukowanym i utlenionym [Mito Only]. Inni użytkownicy mogą zdecydować się na użycie bibliotek, które obejmują również hemoglobinę, mioglobinę lub inne kompleksy występujące w Zaawansowana biblioteka. 
    7. Wybierz i potwierdź preferowane Tryb szerokości okna.
      1. Tryb adaptacyjnej szerokości: użyj szerokość adaptacyjna tryb dodawania poszczególnych widm do widma uśrednionego, aż do osiągnięcia maksymalnej docelowej wartości sigma. Jeśli docelowa wartość sigma nie zostanie osiągnięta, rejestracja zostanie zatrzymana po przekroczeniu górnej granicy ustawionego okna regresji (tj. maksymalnej liczby widm, którą wskazano do zarejestrowania). Wyniki pomiaru zostaną wyświetlone na ekranie po osiągnięciu minimalnej docelowej wartości sigma.
      2. Tryb stałej szerokości: Użyj stała szerokość tryb dodawania poszczególnych widm do widma uśrednionego, aż do osiągnięcia docelowej liczby widm (ustalonej w parametrze average length).
    8. Po zakończeniu konfiguracji systemu kliknij przycisk Wykres tab.
    9. Pod Seria głównawybierz komponenty, które mają zostać wykreślone i wyświetlone na ekranie podczas pomiarów.
    10. Należy potwierdzić, że wszystkie wybrane komponenty pomiarowe są zgodne z właściwym protokołem.
  3. Pozyskiwanie danych:
    UWAGA: Pomiary Ramanowskie należy przeprowadzać w ciemnym pomieszczeniu. Przed rozpoczęciem akwizycji danych należy upewnić się, że przestrzeń robocza jest w maksymalnym stopniu osłonięta przed światłem. Jeśli nie ma możliwości całkowitego zaciemnienia pomieszczenia, system RRS jest wyposażony w czarną osłonę z prostokątnym otworem w centrum (pokazaną w Rycina 2), przez które można wprowadzić sondę laserową. Pudełko może zakrywać próbkę lub odcinek organu, z którego pobierane są pomiary RRS. Podczas pracy z laserem RRS należy unikać bezpośredniego lub przedłużonego narażenia oczu. Nie należy kierować wiązki lasera bezpośrednio w oczy ani na powierzchnie refleksyjne. Laser należy aktywować wyłącznie wtedy, gdy znajduje się on bezpośrednio na badanej tkance. Laser RRS jest laserem klasy 3R przy mocy 4 mW oraz klasy 3B przy mocy 10 mW. Laser jest bezpieczny w kontakcie z tkanką.
    1. Wybierz odpowiednie, wcześniej zapisane ustawienia, parametry rejestracji oraz pliki biblioteczne.
    2. Umieść sondę laserową bezpośrednio nad badaną tkanką lub organem. Ustaw sondę jak najbardziej prostopadle i w odległości 1 cm od tkanki. Użyj linijki, aby precyzyjnie odmierzyć 1 cm od powierzchni organu. Jeśli sygnał nie jest wyraźny, przesuń sondę bliżej niż na 1 cm. Należy jednak dopilnować, aby sonda nigdy nie dotykała tkanki.
      UWAGA: Sonda może być trzymana w ręce, jednak zaleca się stosowanie regulowanego i stabilnego uchwytu lub statywu do sondy. Sonda powinna być ustawiona jak najbardziej prostopadle, w odległości 1 cm od tkanki. Do dokładnego odmierzenia 1 cm od powierzchni narządu można użyć linijki. W przypadku niewyraźnego sygnału dopuszczalne jest przybliżenie sondy na odległość mniejszą niż 1 cm. Sonda nie może jednak dotykać tkanki.
    3. Należy potwierdzić, że plamka laserowa znajduje się na lewym płacie bocznym, jak najbliżej żyły wrotnej.
    4. Należy potwierdzić, czy wszystkie wybrane biblioteki, ustawienia regresji, docelowa wartość sigma, okno regresji oraz tryby akwizycji są poprawne i zgodne z oczekiwaniami.
      1. Upewnij się, że w pomieszczeniu jest jak najciemniej. Sprawdź, czy okno sondy nie jest zanieczyszczone, w szczególności krwią. W przypadku zanieczyszczenia oczyść okno kwarcowe za pomocą niecierpiącej się, nieściernej ściereczki nasączonej 70% alkoholem izopropylowym, a następnie przed kontynuacją procedury dokładnie osusz je suchą ściereczką.
      2. W przypadku silnego zanieczyszczenia należy przetrzeć sondę tak dokładnie, jak to możliwe, zgodnie z powyższym opisem. Następnie należy skalibrować urządzenie, umieszczając laser w ciemnej obudowie wyłożonej czarną taśmą i naciskając Wykonaj pomiar ciemny przycisk. Kalibracja trwa około 5–10 min. Niezależnie od stopnia zanieczyszczenia, należy kalibrować urządzenie raz w miesiącu; urządzenie będzie wysyłać automatyczne powiadomienia o konieczności wykonania tej czynności.
        UWAGA: Wyjaśnienia dotyczące każdego parametru kontroli jakości, przykłady takich parametrów QC oraz surowy sygnał widmowy uzyskany z nagrań optymalnych i suboptymalnych (Plik uzupełniający 1, Rycina 3, Rysunek uzupełniający 3). Kryteria kontroli jakości te zostały zoptymalizowane dla całych wątrób w modelu szczurzym. Każdy nowo opracowany protokół z wykorzystaniem innego organu lub modelu zwierzęcego powinien odpowiednio doprecyzować i dostosować te parametry.
    5. Na stronie głównej kliknij Start przycisk rozpoczynający akwizycję danych. W zależności od wybranych ustawień oprogramowanie będzie rejestrować dane do momentu osiągnięcia docelowej wartości błędu (sigma) lub upływu 180 s. Akwizycja danych została zakończona.
      1. Na podstawie tych wykresów i wartości należy ocenić jakość sygnału RRS, aby umożliwić korektę pozycji sondy lub warunków pomiaru (Rysunek 3). Jeśli uzyskany sygnał RRS nie spełnia tych kryteriów kontroli jakości, należy ustawić sondę tak, aby była jak najbardziej prostopadła do powierzchni i znajdowała się w odległości około 9 mm od powierzchni do okna sondy.
    6. Po zakończeniu akwizycji danych/protokołu eksperymentalnego należy wyrzucić całą wątrobę/tkankę do pojemnika na odpady biologiczne. Wszelkie systemy lub powierzchnie, które miały kontakt z organem/tkanką, należy oczyścić 70% etanolem.
      1. W przypadku pracy z systemem perfuzyjnym, przepuścić wodę dejonizowaną (DI) z dodatkiem detergentu enzymatycznego (7,8 ml rozcieńczone w 1 l wody dejonizowanej [DI]), a następnie czystą wodę DI.
        UWAGA: Każdy pomiar zostanie zapisany jako osobny plik analizy w ramach nowego pliku sesji. Wyniki dla 3RMR oraz natężenia sygnału mitochondrialnego (r3RMR) są przedstawione na wykresie w głównym oknie. Można również wyświetlić widmo surowe. Pozostałe parametry kontroli jakości, takie jak natężenie sygnału resztkowego oraz całkowite natężenie sygnału, będą wyświetlane w sekcji Spektrum tab.
  4. Analiza danych:
    1. Po zakończeniu akwizycji danych kliknij Przegląd folder na dole ekranu, aby otworzyć plik eksperymentalny i zapoznać się z wynikami.
    2. Alternatywnie można otworzyć plik tekstowy zawierający wyniki. Należy wybrać interesujący plik sesji. Otworzy się plik analizy zawierający wszystkie uzyskane pomiary. Każdy parametr oraz odpowiadająca mu wartość sigma będą znajdować się w osobnej kolumnie. Na przykład wartości 3RMR uzyskiwane w każdej sekundzie będą wymienione w kolumnie „3RMR”, a ich wartość sigma w kolumnie „sigma_3RMR”.
    3. Ostatni wiersz każdej kolumny będzie zawierał wartości końcowe dla każdego parametru z danego pliku sesji. Wartości te należy wykorzystać do sporządzenia wykresu.
    4. Powtórz kroki dla każdego pliku sesji/każdego nagrania. Przedstaw uzyskane wartości na wykresie w wybrany sposób.

Analiza absorpcji laserowej z użyciem sondy ręcznej, konfiguracja spektrometru 441 nm, analiza danych na laptopie.
Rysunek 2: Konfiguracja urządzenia RRS. Schemat konfiguracji systemu RRS. Sonda jest połączona za pomocą światłowodu z systemem RRS, który zawiera laserowe źródło wzbudzenia oraz spektrometr. Konfiguracja ta jest następnie podłączona do dowolnego laptopa z zainstalowaną aplikacją sterującą spektrometrem do gromadzenia i analizy danych. Zarówno komputer, jak i jednostka spektrometru są podłączone do gniazda zasilania. Pomiary RRS należy wykonywać w ciemności. Jeśli pomieszczenia nie można całkowicie odizolować od światła, system RRS jest wyposażony w czarną osłonę z prostokątnym otworem w centrum, w którym można umieścić sondę laserową. Obudowa przykrywa próbkę lub fragment organu, z którego pobierane są pomiary RRS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres spektroskopii Ramana przedstawiający analizę sygnału mitochondrialnego; zawiera zestawienie danych optymalnych i suboptymalnych.
Rycina 3: Przykładowe ślady i wskaźniki kontroli jakości dla śladów o jakości suboptymalnej i optymalnej. Sygnał szczątkowy (szum) zaznaczono pomarańczowym nawiasem, a sygnał mitochondrialny zielonym nawiasem. (A) Przykładowy ślad z suboptymalnego sygnału Ramana. Sygnał szczątkowy jest zbyt duży, aby odróżnić go od sygnału mitochondrialnego. Piki widmowe są nierozróżnialne w całym zmierzonym sygnale. (B) Przykładowy ślad z optymalnego sygnału Ramana. Sygnał mitochondrialny jest wyraźnie większy i odrębny od sygnału szczątkowego. Piki widmowe z uzyskanego pomiaru są rozróżnialne. (C) Wskaźniki kontroli jakości uzyskane dla każdego sygnału. Ogólnie całkowity sygnał uzyskany w pomiarze suboptymalnym jest mniejszy niż w pomiarze optymalnym. W optymalnym zapisie zmierzono więcej sygnału mitochondrialnego w porównaniu do zapisu suboptymalnego, przy czym sygnał mitochondrialny stanowi odpowiednio 17% i 14% sygnału całkowitego. Sygnał w pomiarze optymalnym zmierzono z błędem 4,3%, w przeciwieństwie do błędu 18,5% w pomiarze suboptymalnym. Podobnie, niewyjaśniony sygnał szczątkowy stanowi 11% całkowitego sygnału w zapisie suboptymalnym, podczas gdy w optymalnym stanowi on 3,6%. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Ocena stanu mitochondriów z wykorzystaniem RRS

UWAGA: Technologia rezonansowej spektroskopii Ramanowskiej (RRS) została wykorzystana do opracowania wskaźnika żywotności mitochondriów (3RMR), który określa żywotność przeszczepianych organów. Celem niniejszego badania jest wykazanie, w jaki sposób zmiany w natlenieniu – a co za tym idzie, w oddychaniu komórkowym – odzwierciedlane są w trendach 3RMR w porównaniu z tradycyjnymi biomarkerami uszkodzeń, takimi jak mleczan i K+. Zastosowano tutaj test stresu tlenowego, w którym po 5 min ciągłej perfuzji przepływ natlenionego perfuzatu zostaje wstrzymany na 5 min, a następnie wznowiony na kolejne 5 min. W trakcie testu stresowego pobierane są pomiary RRS oraz próbki perfuzatu z dopływu i odpływu.

  1. Pobieranie wątroby:
    1. Znieczul zwierzęta w komorze indukcyjnej, stosując izofluran w stężeniu 3%–5%. Nadmiar oparów przefiltruj przez węgiel aktywny.
    2. Przeprowadź pełną hepatektomię u samców szczurów szczepu Lewis (150 g). Podwiąż odgałęzienia żyły wrotnej. Wstrzyknij 50 J heparyny sodowej przez żyłę główną dolną (IVC). Podczas operacji przeprowadź kanulację żyły wrotnej za pomocą cewnika 16 G i przepłucz wątrobę 50 ml soli fizjologicznej.
    3. Umieścić pobrane wątroby w naczyniu Petri z 30 ml roztworu University of Wisconsin (UW), w warunkach chłodzenia na lodzie.
  2. Subnormotermiczny konfiguracja perfuzji maszynowej (SNMP) i pomiary rezonansowego rozpraszania Ramanowskiego:
    1. Przygotuj urządzenie RRS zgodnie z wcześniejszym opisem. Ustaw Protokół przygotowania acelularnej wątroby szczura w oprogramowaniu sterującym spektrometrem, które automatycznie ustawia tryb szerokości do adaptacyjna szerokość, średnią długość do 180 oraz docelowe sigma do 1,5. Wybiera ono również 3RMR i Fluorescencja jako parametry pomiarowe, a także Wyłącznie mitochondria jako bibliotekę regresji. Ustaw tryb akwizycji na tryb ciągły.
    2. Skonfiguruj system SNMP zgodnie z opisem zawartym w innej części dokumentacji18.
      1. Krótko mówiąc, upewniono się, że układ perfuzyjny składał się z komory perfuzyjnej, pompy perystaltycznej, membranowego utleniacza i pułapki na pęcherzyki powietrza.
      2. Podawaj tlen w mieszance atmosferycznej (95% O22 oraz 5% CO22); Utrzymaj pO2 w zakresie 400–500 mmHg. Monitoruj ciśnienie wewnątrz wątroby za pomocą czujnika ciśnienia i utrzymuj je na poziomie 3–5 mmHg. Pobieraj próbki przez porty pobiercze.
    3. Po skonfigurowaniu oprogramowania i systemu perfuzji, należy połączyć kaniulę wprowadzoną do żyły wrotnej (PV) z rurką dopływową maszyny do perfuzji. Narząd, perfuzat oraz cały układ perfuzyjny należy utrzymać w temperaturze pokojowej (21 °C), bez użycia łaźni wodnej.
    4. Dostarczyć perfuzat do narządu poprzez kaniulę w żyle wrotnej (PV) za pomocą pompy perystaltycznej.
      1. Aby przygotować perfuzat, wymieszać 500 ml pożywki Williams' Medium bez czerwieni fenolowej z 5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 12 mg rozpuszczalnego w wodzie deksametazonu, 5 ml penicyliny-streptomycyny oraz 5 ml L-glutaminy, 2.5 µL insuliny oraz 1000 U heparyny.
      2. Mieszaj wszystkie składniki na mieszadle magnetycznym przez około 20 min lub do czasu całkowitego rozpuszczenia wszystkich komponentów. Zwiększ przepływy perfuzyjne, aby uzyskać ciśnienie w zakresie 3–5 mmHg.
    5. Następnie umieść źródło laserowe RRS w uchwycie sondy i ustaw je 1 cm powyżej największego płata wątroby, jak najbliżej żyły wrotnej (PV). Wstrzymaj przepływ perfuzyjny w 5. minucie (T5) i wznowić po 10 min (T10). Przeprowadzić test obciążeniowy w 15. minucie (T15).
    6. Wykonywać pomiary RRS przez cały czas trwania testu wysiłkowego; pomiary przepływu wlotowego i wylotowego przeprowadzać co 5 minut, zaczynając od czasu T0.0 (Rysunek 4). Wykreśl wartości 3RMR oraz współczynnik K odpływu+ poziomy i poziomy mleczanów dla T0, T5, T10, T15 (n = 3) (Rycina 5).
    7. Oblicz tempo zużycia tlenu (OCR) w czasie T0, T5, T10, T15 poprzez pomnożenie ciśnienia parcjalnego tlenu na wlocie i wylocie (pO2) z mnożnikiem współczynnika rozpuszczalności tlenu w osoczu (0,00314). Wykreśl OCR dla T0, T5, T10, T15 (Rycina 5).
      UWAGA: Przykładowe widma rezonansowego rozpraszania Ramanowskiego dla tkanek perfundowanych (T5), niedokrwienny (T10), i poddano reperfuzji (T15) stany z jednej wątroby przedstawiono (Rycina 6)

Schemat procesu perfuzji wątroby; zaznaczono sprzęt do perfuzji oraz okresy niedokrwienia i reperfuzji.
Rysunek 4: Schemat przedstawiający przebieg eksperymentu. U samic szczurów szczepu Lewis wykonano całkowitą hepatektomię. Pozyskaną wątrobę poddano subnormotermicznej perfuzji maszynowej, dostarczając natleniony perfuzat przez pierwsze 5 min. Perfuzat przepływa do wątroby przez żyłę wrotną i krąży w obiegu dzięki pompie perystaltycznej (przepływ perfuzji zaznaczono niebieskimi strzałkami). Natlenioną perfuzję wstrzymano na kolejne 5 min w punkcie T5 i wznowiono na kolejne 5 min w T10. Pomiary 3RMR wykonywano podczas całego testu obciążeniowego (przedstawionego jako laser). Próbki perfuzatu pobierano w punktach T0, T5, T10 i T15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Świeże wątroby poddano okresom niedokrwienia i reperfuzji z wykorzystaniem testu stresu tlenowego. Następnie zmiany 3RMR w czasie rzeczywistym podczas testu stresowego porównano z szybkością zużycia tlenu oraz poziomem mleczanu i potasu w odpływie, uzyskanymi z analizy perfuzatu w punktach T0, T5, T10, T15. W warunkach prawidłowych oczekuje się, że wartości 3RMR będą mieścić się w przedziale od 10% do 30% (Rycina 5A). Zgodnie z oczekiwaniami, warto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejsze badanie wskazuje na nieinwazyjną, czasowo rzeczywistą i wysoce czułą metodę ilościowego określania stanu zdrowia mitochondriów, wykorzystującą przenośny system spektroskopii rezonansowej Ramana, który składa się z lasera w kompaktowej sondzie, połączonej za pomocą kabla światłowodowego z pompą laserową. Metoda ta wykorzystuje laser o długości fali 441 nm do pobudzania mitochondriów, które wytwarzają unikalne sygnały spektralne w zależności od ich stopnia utlenienia. Tym samym, spektroskopia rezonansowa Ramana j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują konflikt interesów. S.N.T i P.R. mają wnioski patentowe dotyczące niniejszego badania. P.R. jest pracownikiem i udziałowcem Pendar Technologies. Interesy S.N.T są zarządzane przez MGH i Partners HealthCare zgodnie z ich polityką konfliktu interesów. Interesy J.N.K są zarządzane zgodnie z polityką konfliktu interesów BCH. W niniejszym badaniu wykorzystano następujące opatentowane technologie: US2020/0281474A1 In vivo monitoring of cellular energetics with Raman spectroscopy (application). Złożono dodatkowe wnioski patentowe dotyczące zastosowania spektroskopii Resonance Raman w okulistyce, ocenie żywotności tkanek i ocenie obrażeń poparzeniowych, gdzie R.J. jest również wynalazcą.  

Podziękowania

To dzieło zostało wsparte przez hojne fundusze przekazane S.N.T. przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (R01DK134590). Z wdzięcznością przypominamy również o finansowaniu S.N.T przez amerykański Narodowy Instytut Zdrowia (K99/R00 HL1431149; R01HL157803; R24OD034189), Narodową Fundację Nauki (EEC 1941543), Fundację Rodziny Polsky oraz Shriners Children’s Boston (Grant #BOS-85115). Ponadto z wdzięcznością przypominamy o finansowaniu dla R.J. przez Grant #LIFER23-263034 od Amerykańskiego Stowarzyszenia na rzecz Badań nad Chorobami Wątroby. Autorzy wyrażają głębokie wdzięczność za wsparcie ekspertów z Patologii Core na Harvard Medical School za badania histologiczne. Chcielibyśmy również podziękować dr Robertowi Balabanowi i dr Armel Femnou z Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi NIH za ich wiedzę w dziedzinie energetyki mitochondrialnej oraz za ważne wsparcie w opracowaniu biblioteki RRS pojedynczych kompleksów mitochondrialnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
16 G Catheter BD Insyte Authoguard381454Używane do nakłucia żyły wrotnej
Activated CharcoralVet Equip Vapor Guard Activated Charcoal931401Używane do filtrowania nadmiaru pary podczas anestezji
BSA Sigma-Aldrich A7906Skład perfuzyjnego roztworu
Bubble Trap Radnoti130149
DexamethasoneSigma-AldrichD2915Skład perfuzyjnego roztworu
Glutamax Thermo Fisher Scientific35050061Skład perfuzyjnego roztworu
Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G)Fisher Scientific 13-200-292Używane do przepływu perfuzyjnego roztworu przez wątrobę
Masterflex peristaltic pumps Cole Parmer, Vernon Hill, IL7528-30 Używane do przepływu perfuzyjnego roztworu przez wątrobę
Membrane Oxygenator Radnoti130144Używane do utleniania perfuzyjnego roztworu. 
Penicillin-streptomycinSigma-AldrichP4458Skład perfuzyjnego roztworu
RAPIDPoint 500 Blood Gas SystemSiemens Healthineers41115805Do analizy gazów krwi
Resonance Raman System  Pendar TechnologiesA4D441Skontaktuj się z Pendar Technologies w sprawie zapytań dotyczących tego produktu

Bibliografia

  1. San-Millán I. The key role of mitochondrial function in health and disease. Antioxidants (Basel). 2023;12(4):782.
  2. Rossmann MP, et al. Mitochondrial function in development and disease. Dis Model Mech. 2021;14(6):dmm048912.
  3. Chen W, Zhao H, Li Y. Mitochondrial dynamics in health and disease: mechanisms and potential targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:333.
  4. Acin-Perez R, et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. EMBO J. 2020;39(13):e104073.
  5. Sharma E, et al. Overview of methods that determine mitochondrial function in human disease. Metabolism. 2025;170:156300.
  6. Kowaltowski AJ, Abdulkader F. How and when to measure mitochondrial inner membrane potentials. Biophys J. 2024;123(24):4150-4157.
  7. Quinn KP, et al. Characterization of metabolic changes associated with the functional development of 3D engineered tissues by noninvasive, dynamic measurement of individual cell redox ratios. Biomaterials. 2012;33(21):5341-5348.
  8. Perry DA, et al. Responsive monitoring of mitochondrial redox states in heart muscle predicts impending cardiac arrest. Sci Transl Med. 2017;9(408):ean0117.
  9. Nguyen KT, et al. Mitochondrial hyperoxidation contributes to warm ischemia-reperfusion injury in rat and pig livers. Commun Med. 2026;6:307.
  10. de Vries RJ, et al. Noninvasive quantification of the mitochondrial redox state in livers during machine perfusion. PLoS One. 2021;16(10):e0258833.
  11. Ajenu EO, et al. Advancing assessment methods for human cardiac grafts during normothermic machine perfusion. Transplantation. 2025;110(2):e374-e384.
  12. Thomas AR, et al. Resonance Raman spectroscopy detects ischemia in experimental coarctation of the aorta in a rodent model. J Cardiovasc Transl Res. 2025;18:566-573.
  13. Cakir B, et al. In vivo noninvasive mitochondrial redox assessment of the optic nerve head to predict disease. PNAS Nexus. 2023;2(5):pgad148.
  14. Jain R, et al. Real-time monitoring of mitochondrial oxygenation during machine perfusion using resonance Raman spectroscopy predicts organ function. Sci Rep. 2024;14:7328.
  15. Covian R, Edwards LO, Balaban RS. Effect of the mitochondrial membrane potential on the absorbance of the reduced form of cytochrome c oxidase. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 2024;1865(3):149048.
  16. Ljungdahl PO, Pennoyer JD, Robertson DE, Trumpower BL. Purification of highly active cytochrome bc1 complexes from phylogenetically diverse species by a single chromatographic procedure. Biochim Biophys Acta. 1987;891(3):227-241.
  17. Covian R, Chess D, Balaban RS. Continuous monitoring of enzymatic activity within native electrophoresis gels: application to mitochondrial oxidative phosphorylation complexes. Anal Biochem. 2012;431(1):30-39.
  18. Haque O, et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology. 2020;8(1-2):27-36.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

MedycynaWydanie 234Wydanie 234Wartość pustaWydanieMitochondriażywotność organustan zdrowia mitochondriówPrzeszczep wątrobystany redoks mitochondriów
W czasie rzeczywistym, nieinwazyjna ocena funkcji mitochondrialnych za pomocą spektroskopii rezonansowego rozpraszania Ramana
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.