Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

W czasie rzeczywistym, nieinwazyjna ocena funkcji mitochondrialnych za pomocą spektroskopii rezonansowego rozpraszania Ramana

96 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71290

⸱

7 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Hospital for Children, 3Pendar Technologies

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy nieinwazyjną, czasu rzeczywistego metodę monitorowania zdrowia mitochondriów za pomocą Spektroskopi Rezonansowo-Ramanowskiej (RRS). Wykorzystaliśmy RRS do ilościowego określania stanów redoks mitochondriów i opracowaliśmy wskaźnik zdrowia mitochondriów, Redukowany Rezonansowo-Ramanowski Wskaźnik Mitochondriów (3RMR), który wykazuje szybszą reakcję na zmiany w tlenowania niż tradycyjne analityki gazów we krwi.

Streszczenie

Mimo że mitochondria są centralne dla patogenezy i postępu choroby, mechanistyczne wglądy w dynamikę zdrowia mitochondrialnego pozostają kosztowne i niedostępne. Aby wypełnić tę lukę, w niniejszym badaniu zastosowano Spektroskopio Rezonansu Ramana (RRS) do oceny funkcji mitochondrialnych, wykorzystując przenośny system, który dostarcza czasowych, nieinwazyjnych i ilościowych pomiarów stanów redoks cytochromów mitochondrialnych w wątrobach szczurów. W tym protokole demonstrujemy zastosowanie tej technologii, w tym konfigurację, zbieranie danych i przetwarzanie danych. Niniejsze badanie przedstawia eksperyment udowadniający koncepcję, który podkreśla zdolność RRS do pomiaru zmian w czasie rzeczywistym w stanie redoks mitochondrialnym - a przez rozszerzenie, funkcji mitochondrialnej. W skrócie, urządzenie RRS zostało podłączone do pompy laserowej oraz komputera do zbierania danych i umieszczone 1 cm od wątroby szczura.  Parametry zbierania danych zostały wybrane zgodnie z protokołem dotyczącym wątroby szczura; stany redoks zostały zmierzone w warunkach natlenionych i niedotlenionych przy użyciu testu stresu tlenowego. Zmiany w stanach redoks mitochondrialnych były śledzone podczas całego testu stresu tlenowego.

Wprowadzenie

Mitochondria odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu komórek i homeostazie. Mitochondria są głównymi napędami metabolizmu komórkowego, regulując produkcję ATP poprzez fosforylację utleniającą. Służą również jako organella sygnałowe, które dyktując los komórki, regulują szlaki apoptotyczne, a także sygnał ROS i Ca+21. Tym samym, dysfunkcja mitochondriów może prowadzić do różnych chorób neurodegeneracyjnych, mięśniowych i układu krążenia2,3. Mimo że mitochondria odgrywają kluczową rolę w progresji chorób, ocena funkcji mitochondriów może być inwazyjna, kosztowna i ograniczona.

Kluczowe wskaźniki funkcji mitochondriów, takie jak wskaźnik zużycia tlenu, fosforylacja utleniająca i aktywność różnych kompleksów w łańcuchu transportu elektronowym (ETC), są mierzone za pomocą respirometrii. ETC składa się z czterech kompleksów (I–IV) osadzone w wewnętrznej błonie mitochondrialnej (IMM). Te kompleksy, z pomocą innych koenzymów, przenoszą elektrony z zredukowanych substratów, takich jak NADH i FADH2, do końcowego akceptora elektronów, O2, który jest następnie zredukowany do wody. Większość współczesnych testów respirometrii, takich jak Seahorse i Orobros O2k, wymaga przetwarzania tkanki, co ogranicza ich zastosowanie do badań translacyjnych4,5. Pomiar potencjału membran mitochondriów (MMP) to kolejna metoda oceny dysfunkcji mitochondriów, która wykorzystuje kationiczne lipofilowe fluorofory, takie jak JC-1, wraz z obrazowaniem mikroskopowym, gdzie sprzężone (zdrowe) i nie sprzężone (uszkodzone) mitochondria fluoreskują na różnych długościach fal6. Jednak te testy mogą mieć niską czułość5. Sam barwnik może również mieć wysoką cytotoksyczność w wysokich stężeniach5. Ostatnio, podobnie jak pomiary respirometrii, ta technika również wymaga przetwarzania tkanki. Techniki oparte na spektroskopii zostały ostatnio wykorzystane jako nieinwazyjne metody oceny zdrowia mitochondriów. Na przykład, Spektroskopia Rezonansu Magnetycznego Fosforu (P-MRS), metoda oceny metabolizmu komórkowego przez pomiar stężeń metabolitów zawierających fosfor, została wykorzystana do charakteryzacji inżynieryjnych tkanek adypogennych poddanych różnicowaniu7. Jednak ta technika również wymaga specjalistycznego sprzętu i szkolenia.

Nasza grupa niedawno zademonstrowała technikę czasu rzeczywistego, nieinwazyjną i wysoce specyficzną do pomiaru stanu redoks mitochondriów jako markera żywotności narządów przy użyciu Spektroskopii Rezonansu Ramana (RRS). RRS wykorzystuje nieelastyczne rozpraszanie fotonów do ilościowego określania stanów redoks cytochromów mitochondrialnych. Pierścienie porfiryny w hemowych częściach cząsteczek, takich jak cytochromy mitochondrialne, hemoglobina i mioglobina, wytwarzają charakterystyczne widmo Ramana w zależności od ich stopnia utlenienia po pobudzeniu laserem o długości fali 441 nm8. Chociaż system RRS wykorzystuje długość fali 441 nm, można również zastosować lasery o długości fali 420 nm i 405 nm, z których każdy preferencyjnie wzmacnia inny kompleks cytochromowy. Spektrum uzyskane z nieznanej próbki interesującej jest skontrastowane z wcześniej nagranym księgozbiorem w pełni utlenionych lub zredukowanych, nieuszkodzonych mitochondriów, dając stosunek zredukowanych do całkowitych mitochondriów lub średni stan redoks in situ cytochromów ETC. Stosunek ten jest definiowany jako Rezonansowy Raman Redukowany Stosunek Mitochondriów (3RMR).

Istnieją 3 odrębne obliczenia/typy 3RMR: mitochondrialny 3RMR (mito-3RMR), 3RMR kompleksu III (cIII-3RMR) i 3RMR kompleksu IV (cIV-3RMR). Każdy z tych indeksów jest obliczany przez ułamek zredukowany do liczby wszystkich danych składników. Na przykład 3RMR cIII byłby stosunkiem zredukowanego cIII do całkowitej liczby cIII w tkankach (cIII-R/(cIII-O+CIII-R). Ten sam wzorzec dotyczy cIV. Tym samym, 3RMR-cIII odnosiłby się do stosunku zredukowanego cIII do całkowitej ilości cIII, a 3RMR-cIV odnosiłby się do stosunku zredukowanego cIV do całkowitej ilości cIV. Poprzez analizę regresji, albo mitochondrialne stany redoks (mito-3RMR) są obliczane za pomocą bibliotek spektralnych nieuszkodzonych mitochondriów, albo pojedyncze stany redoks kompleksów (cIII-3RMR i cIV-3RMR) są obliczane za pomocą bibliotek spektralnych cIII i cIV. Niedawny artykuł9 wykazał, że mito-3RMR jest reprezentatywny dla ważonej średniej stanów redoks cIII i cIV (lub cIII-3RMR i cIV-3RMR). Ważne jest, aby zauważyć, że cI i cII nie są aktywne Ramanem ani resonantnie wzmacniane przez długość fali 441 nm. W konsekwencji nie są obliczane podczas obliczania mito-3RMR.

Wykorzystując te typy 3RMR, określiliśmy optymalny zakres 3RMR. W "zdrowych" narządach mitochondria są nietknięte i mają

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zwierzęta wykorzystane w eksperymentach były utrzymywane zgodnie z wytycznymi National Research Council, a protokoły zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w Massachusetts General Hospital (Boston, MA, USA).

1. Konfiguracja i wykorzystanie RRS

  1. Opis urządzenia:
    UWAGA: Przenośny system RRS (Pendar Technologies; produkt przeznaczony wyłącznie do celów badawczych) wykorzystuje laser o długości fali 441 nm ze względu na rezonansowe wzmocnienie widma Ramana cytochromów mitochondrialnych przy tej długości fali. Laser pracuje w zakresie od 4 mW do 8 mW.
    1. Podłącz źródło wzbudzenia laserowego do specjalnie zbudowanej sondy za pomocą kabla światłowodowego. Sonda kieruje plamkę laserową o średnicy 2 mm na tkankę, a jednocześnie zbiera emitowane widmo. Widmo przechodzi następnie przez filtr pasmowy i jest rejestrowane przez matrycę urządzenia sprzężonego ładunkowo (CCD). Widmo jest zbierane co sekundę w ciągu 180 s i uśredniane w celu utworzenia surowego, zredukowanego pod kątem szumów widma do analizy.
    2. Oprogramowanie porównuje uzyskane widmo z wcześniej zmierzonymi bibliotekami spektralnymi za pomocą analizy regresyjnej.
  2. Procedura wstępnego rejestrowania bibliotek
    UWAGA: W eksperymentach przedstawionych w niniejszej pracy utworzono i wykorzystano biblioteki dla form zredukowanych i utlenionych mitochondriów, kompleksu III i kompleksu IV, hemoglobiny oraz mioglobiny. Sygnały RRS wszystkich bibliotek pobrano w czarnej skrzynce w temperaturze pokojowej (21 °C). Pliki tych bibliotek są dostarczane oddzielnie wraz z oprogramowaniem analitycznym. Jednak w zależności od badanej tkanki i obecności innych cząsteczek aktywnych w spektroskopii Ramana, można utworzyć inne biblioteki, odpowiednio adaptując poniższy protokół. Surowe widma RRS bibliotek hemoglobiny, mioglobiny oraz utlenionego/zredukowanego kompleksu III/IV przedstawiono na Supplementary Figure 1.
    1. Biblioteki hemoglobiny (Supplementary Figure 1C):
      1. Pobierz świeżą krew gryzoni poprzez upuszczenie krwi zwierzęcia. Natlenij pobraną krew za pomocą 100% tlenu lub odtlenij ją za pomocą 100% azotu w kuwecie szklanej, dodając ditionian sodu.
      2. Zmierz RRS każdego stanu przez ściankę szklanej kuwety przez 10 min, z sondą RRS ustawioną w odległości 9 mm od kuwety.
      3. Użyj pików spektralnych przy 1356 cm-1 , aby zweryfikować stan odtleniony, oraz pików przy 1376 cm-1 , aby potwierdzić stan natleniony.
    2. Biblioteki mitochondrialne zredukowane/utlenione (Figure 1)
      1. Wyizoluj mitochondria z homogenizowanych i oczyszczonych serc gryzoni w kuwecie szklanej. Umieść sondę Ramana w odległości 9 mm od szklanej kuwety i zmierz widma tych mitochondriów przez szklaną ściankę.
      2. Stwórz w pełni utleniające warunki, dostarczając do mitochondriów strumień 100% tlenu. Zweryfikuj stan utleniony poprzez brak zredukowanego piku RR przy 1357 cm-1.
      3. Stwórz w pełni redukujące warunki, eksponując mitochondria na 100% azotu z niewielkimi ilościami siarkowodoru. Zweryfikuj warunki redukujące poprzez brak utlenionego piku markerowego RR przy 1371 cm-1.
    3. Utleniony/zredukowany kompleks III/IV (Supplementary Figure 1A,B):
      1. Wyizoluj Kompleks III i IV zgodnie z opisem w innych publikacjach9,15,16,17. W skrócie, jako materiał wyjściowy użyj próbki zapasowej wyizolowanych mitochondriów (odpowiadającej 200 nanomoli cytochromu a).
      2. Rozcieńcz mitochondria do stężenia 10 nmol cytochromu A/mL w lodowatym buforze C (50 mM Tris, 1 mM MgSO4, pH 8.45). Następnie dodawaj kroplami 10% w/v n-β-D-dodecyl maltosyd (DM) do stężenia końcowego 1%, delikatnie mieszając na lodzie.
      3. Wirowarkuj ekstrakt przy 40,000 × g przez 40 min w 4 °C. Nałóż nadsącz na szklaną kolumnę o wymiarach 2,5 cm × 20 cm, która została wcześniej wypełniona żywicą wymienną równoważoną 5 objętościami kolumny buforu C (zawierającego 0,02% w/v DM).
      4. Po przemyciu 2 objętościami kolumny buforu C, eluj kompleksy mitochondrialne, stosując liniowy gradient NaCl 0–400 mM w tym samym buforze i zbieraj eluat w frakcjach 4 mL.
      5. Zielone frakcje zawierające Kompleks IV eluią się blisko środka gradientu (~180 mL NaCl), przed czerwonawymi frakcjami zawierającymi Kompleks III. Skoncentruj połączone frakcje zawierające każdy kompleks do 20–30 nmoles cytochromu a/mL.
      6. Po wyizolowaniu poszczególnych kompleksów, poddaj każdy z nich warunkom utleniającym i redukującym. Zredukuj próbkę Kompleksu III o stężeniu 11 mM w buforze Tris, używając 2 mL askorbianu (1 M), aby zredukować cytochrom c1, oraz 2 mL HS (hydrosiarczynu), aby w pełni zredukować cytochromy bL i bH.
      7. Zredukuj próbkę Kompleksu IV o stężeniu 18,67 mM w buforze Tris w wielu etapach, ponieważ Kompleks IV przechodzi wieloetapowy proces utleniania katalitycznego. Aby w pełni zredukować Kompleks IV, dodaj dwie porcje po 2 mL H2O2 (10 mM), a następnie 2 mL HS.
      8. Zbieraj widma biblioteczne po każdym dodaniu, aby uchwycić każdy etap cyklu. Dodaj widma w pełni utlenione i zredukowane do końcowej biblioteki referencyjnej, aby reprezentowały stany stacjonarne kompleksu IV.
      9. Przygotuj wszystkie próbki w szklanej fiolce 1 mL i utrzymaj je w stałej pozycji w odległości 9 mm od soczewki sondy, a następnie umieść je w czarnej skrzynce, aby zapobiec zanieczyszczeniu światłem. Zbieraj widma RRS przez 600 s dla każdego kompleksu i stanu utlenienia.
      10. Zwaliduj czystość wyizolowanych cIII i cIV zgodnie z wcześniejszym opisem17 oraz zwaliduj adekwatność bibliotek spektralnych wyizolowanych cIII i cIV w wyjaśnianiu pełnych widm mitochondrialnych, zgodnie z opisem w niedawnej pracy9.
    4. Biblioteki mioglobiny (Supplementary Figure 1D):
      1. Używając podobnych strumieni tlenu i azotu (z rozpuszczonym ditionianem sodu), zmieniaj nasycenie oksyhemoglobiną ekstraktu mioglobiny mięśnia sercowego w zakresie od 0% do 100%. Zweryfikuj widma Ramana za pomocą pików markerowych przy 1355 cm-1 i 1376 cm-1.

UWAGA: Większość opisanych powyżej komponentów widmowych, takich jak hemoglobina czy utlenione/zredukowane mitochondria, to cząsteczki zawierające hem i są wzbudzane przez tę samą długość fali. System RRS zapobiega nakładaniu się sygnałów poprzez tworzenie biblioteki regresyjnej dla każdej cząsteczki w oparciu o jej unikalny sygnał widmowy. Uzyskane widma rozproszone są poddawane algorytmowi regresji względem wybranych bibliotek. Algorytm regresji wyznacza współczynnik dla każdego widma bibliotecznego, który reprezentuje najlepsze dopasowanie szacunkowe jego względnego udziału w zarejestrowanym widmie, a tym samym jego względne stężenie w tkance. Ponieważ algorytm wykorzystuje najlepsze dopasowanie w zakresie liczb falowych, niewielkie różnice w położeniu lub intensywności pików widmowych różnych komponentów bibliotecznych pozwalają regresji rozróżnić nawet blisko spokrewnione chromofory. Dzięki algorytmowi regresji i bibliotekom widmowym system RRS może rozłożyć całkowity sygnał rozproszony na różne komponenty w zależności od ich unikalnych pików widmowych, unikając nakładania się sygnałów cząsteczek zawierających hem. Aby pokazać związek między hemoglobiną a mitochondriami, dołączono Rysunek uzupełniający 2, który przedstawia obrazy widm pobranych z perfuzji wątroby, rozbite na sygnał pomiarowy, linię najlepszego dopasowania oraz niewyjaśnioną resztę wynikającą z różnic w poszczególnych pikach widmowych. W panelu A wybrano biblioteki regresyjne dla hemoglobiny zredukowanej i utlenionej oraz mitochondriów zredukowanych i utlenionych. Linia najlepszego dopasowania opracowana na podstawie bibliotek i analizy regresji ściśle pokrywa się z sygnałem pomiarowym, a niewyjaśniona reszta jest niewielka. W panelu B wybrano jedynie biblioteki mitochondriów utlenionych i zredukowanych. Ponieważ występuje duża struktura niewyjaśnionej reszty, pik widmowy mitochondriów jest przesunięty o kilka liczb falowych względem piku hemoglobiny, która nie została uwzględniona w analizie regresji. Co więcej, w rysunkach uzupełniających pracy Nguyen et al.9 autorzy wyjaśniają związek między mitochondriami a poszczególnymi kompleksami (cIII i cIV), a także relacje między poszczególnymi kompleksami16, gdzie kompleks III wykazuje ostrzejsze piki o niższej częstotliwości, podczas gdy kompleks IV wykazuje szersze, przesunięte w górę pasma. Ponadto autorzy wykazują, że biblioteki zredukowanego Kompleksu III i Kompleksu IV w pełni wyjaśniają zmierzone widmo zredukowanych mitochondriów całkowitych, co skutkuje minimalną niewyjaśnioną resztą.

Wykresy spektroskopii Ramana przedstawiające analizę utlenionych i zredukowanych pików widmowych mitochondriów.
Rycina 1: Biblioteki widmowe w pełni utlenionych i zredukowanych mitochondriów. Widma biblioteki RRS uzyskano po dostarczeniu izolowanym mitochondriom (A) 100% tlenu lub 100% azotu (B) w celu osiągnięcia odpowiednio stanu utlenionego i zredukowanego. Stany te potwierdzono obecnością markerowych pików utlenionych (C) i zredukowanych (D) RR. Przesunięcie tych pików odpowiada zmianom w molekularnych modach wibracyjnych w obecności tlenu. Intensywność każdego piku została znormalizowana do 1 jednostki intensywności umownej (AU), ponieważ wzmocnienie stanu zredukowanego jest większe przy użyciu tej długości fali wzbudzenia 441 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Gromadzenie danych przy użyciu RRS

  1. Urządzenie konfiguracja:
    1. Podłącz jednostkę spektrometru (umieszczoną w kompaktowej obudowie) do zasilacza prądu stałego (DC) oraz do adaptera zasilania, używając dołączonych kabli. Jednostka spektrometru posiada jedną okrągłą wtyczkę z nacięciami pozycjonującymi.
    2. Dopasuj wypusty okrągłej wtyczki do wypustów kabla podłączanego do zasilacza. Przed połączeniem portów nie jest wymagane czyszczenie (Rysunek 2). 
    3. Podłącz komputer wykonujący analizę do tego samego zasilacza, do którego podłączone są spektrometr i źródło zasilania, używając dołączonych przewodów.
    4. Umieść sondę laserową w uchwycie sondy. Przed rozpoczęciem eksperymentu dostosuj położenie tej sondy.
    5. Otwórz oprogramowanie sterujące spektrometrem (Cellular Energetics Software).
  2. Konfiguracja oprogramowania:
    UWAGA: Wraz z systemem dostarczone zostały pliki ustawień oraz biblioteki regresji dla różnych rodzajów tkanek. Pliki te zawierają informacje o tym, jakie biblioteki system RRS powinien uwzględnić w regresji, ile widm znajduje się w oknie regresji, a także inne parametry, takie jak moc lasera. Ustawienia domyślne mogą zostać zmienione, a nowy plik ustawień zapisany do wykorzystania w przyszłych eksperymentach. Zrzuty ekranu oprogramowania, opisanego szczegółowo poniżej, przedstawiono w Rysunek uzupełniający 3.
    1. Po uruchomieniu oprogramowania sterującego spektrometrem wyświetla się wykres przedstawiający procentową wartość 3RMR, saturację tlenową (StO2) i pojawi się nasycenie mioglobiną. Na tym ekranie wyświetlane będą te parametry, jeśli zostaną wybrane, w czasie rzeczywistym podczas pomiarów. Kliknij w Ustawienia karta w lewym dolnym rogu strony.
    2. Pod Informacje karta, wprowadź informacje o sesji w sekcji Nazwa sesji, oraz wszelkie niezbędne szczegóły w ramach Opis sesji tab.
    3. Dostępne są dwa tryby zbierania danych. Należy użyć Kontrola wyrywkowa tryb gromadzenia widm do momentu spełnienia określonych wskaźników jakości (np. docelowej wartości sigma lub okna regresji/liczby widm), a następnie zatrzymanie rejestracji. Użyj Tryb ciągły do rejestrowania widm aż do naciśnięcia przycisku stop. W obu trybach wszystkie dane, zarówno wyniki 3RMR, jak i poszczególne widma, są zapisywane automatycznie. W tym doświadczeniu wykorzystuje się Tryb ciągły.
    4. Po wprowadzeniu wszystkich informacji o sesji kliknij przycisk System tab.
    5. Pod Plik ustawień, wybierz protokół odpowiedni dla projektu (w przypadku perfuzji wątroby szczura bezkomórkowej wybierz Acellularna wątroba szczura protokół). Spowoduje to automatyczne dostosowanie typu pomiaru, średniej długości pomiaru (okno regresji), a także docelowej wartości sigma.
      1. Aby utworzyć nowy plik ustawień, należy dostosować dowolny z wymienionych powyżej komponentów, a następnie kliknąć Zapisz przycisk. Spowoduje to zapisanie tych parametrów w osobnym pliku ustawień, który można następnie zaimportować do systemu.
      2. Aby zaimportować nowy plik ustawień, należy kliknąć menu rozwijane obok Domyślny (Mod) i wybierz Importuj nowy plik ustawieńKliknij nową Plik ustawień do zaimportowania.
    6. Pod Biblioteki do regresjiwybierz i potwierdź kombinację bibliotek, które zostaną użyte do akwizycji danych i analiz. Do tego eksperymentu wybrano biblioteki dla mitochondriów zredukowanych i utlenionych [Mito Only]. Inni użytkownicy mogą zdecydować się na użycie bibliotek, które obejmują również hemoglobinę, mioglobinę lub inne kompleksy występujące w Zaawansowana biblioteka. 
    7. Wybierz i potwierdź preferowaną opcję Tryb szerokości okna.
      1. Tryb adaptacyjnej szerokości: Użyj adaptacyjna szerokość tryb dodawania poszczególnych widm do widma uśrednionego aż do osiągnięcia maksymalnej wartości docelowej sigma. Jeśli wartość docelowa sigma nie zostanie osiągnięta, rejestracja zostanie zakończona po dotarciu do górnej granicy ustawionego okna regresji (tj. po zarejestrowaniu maksymalnej określonej liczby widm). Wyniki pomiaru zostaną wyświetlone na ekranie po osiągnięciu minimalnej wartości docelowej sigma.
      2. Tryb stałej szerokości: Użyj stała szerokość tryb dodawania poszczególnych widm do widma uśrednionego, aż do osiągnięcia docelowej liczby widm (określonej w parametrze average length).
    8. Po zakończeniu konfiguracji systemu kliknij przycisk Wykres tab.
    9. Pod Seria głównawybierz komponenty, które mają zostać wykreślone i wyświetlone na ekranie podczas pomiarów.
    10. Należy potwierdzić, że wszystkie wybrane komponenty pomiarowe są zgodne z właściwym protokołem.
  3. Pozyskiwanie danych:
    UWAGA: Pomiary ramanowskie należy przeprowadzać w ciemnym pomieszczeniu. Przed rozpoczęciem akwizycji danych należy upewnić się, że miejsce pracy jest w maksymalnym stopniu osłonięte przed światłem. Jeśli nie ma możliwości całkowitego zaciemnienia pomieszczenia, system RRS jest wyposażony w czarną osłonę z prostokątnym otworem w centrum (pokazaną w Rysunek 2), przez którą można wprowadzić sondę laserową. Pudełko może zakrywać próbkę lub odcinek narządu, z którego pobierane są pomiary RRS. Podczas pracy z laserem RRS należy unikać bezpośredniej lub przedłużonej ekspozycji oczu. Nie należy kierować wiązki lasera bezpośrednio w oczy ani na powierzchnie refleksyjne. Laser należy aktywować wyłącznie wtedy, gdy jest on skierowany bezpośrednio na badaną tkankę. Laser RRS należy zaklasyfikować jako laser klasy 3R przy mocy 4 mW oraz klasy 3B przy mocy 10 mW. Laser jest bezpieczny w kontakcie z tkanką.
    1. Wybierz odpowiednie, wcześniej zapisane ustawienia, parametry rejestracji oraz pliki bibliotek.
    2. Umieść sondę laserową bezpośrednio nad badaną tkanką lub organem. Ustaw sondę jak najbardziej prostopadle do tkanki, w odległości 1 cm. Użyj linijki, aby dokładnie odmierzyć 1 cm od powierzchni organu. Jeśli sygnał jest niewyraźny, ustaw sondę w odległości mniejszej niż 1 cm. Należy jednak dopilnować, aby sonda nigdy nie dotykała tkanki.
      UWAGA: Sondę można trzymać w dłoni, jednak zaleca się stosowanie regulowanego i stabilnego uchwytu lub statywu do sondy. Należy ustawić sondę możliwie prostopadle do tkanki, w odległości 1 cm od niej. Do dokładnego odmierzenia 1 cm od powierzchni narządu można użyć linijki. Jeśli sygnał nie jest wyraźny, można ustawić sondę w odległości mniejszej niż 1 cm. Sonda nie może jednak dotykać tkanki.
    3. Należy potwierdzić, że plamka lasera znajduje się w lewym płacie bocznym, jak najbliżej żyły wrotnej.
    4. Należy potwierdzić, że wszystkie wybrane biblioteki, ustawienia regresji, docelowa wartość sigma, okno regresji oraz tryby akwizycji są poprawne i zgodne z oczekiwaniami.
      1. Należy upewnić się, że w pomieszczeniu panuje maksymalne zaciemnienie. Należy sprawdzić, czy okno sondy nie jest zanieczyszczone, w szczególności krwią. W przypadku wystąpienia zanieczyszczeń należy oczyścić okno kwarcowe za pomocą bezpyłowej, nieściernej chusteczki nasączonej 70% alkoholem izopropylowym, a następnie dokładnie osuszyć je suchą chusteczką przed kontynuowaniem procedury.
      2. W przypadku silnego zanieczyszczenia należy przetrzeć sondę tak dokładnie, jak to możliwe, zgodnie z powyższym opisem. Następnie należy skalibrować urządzenie, umieszczając laser w ciemnej obudowie wyłożonej czarną taśmą i naciskając Wykonaj pomiar ciemny przycisk. Kalibracja trwa około 5–10 min. Niezależnie od poziomu zanieczyszczenia, należy kalibrować urządzenie raz w miesiącu; urządzenie będzie wysyłać automatyczne powiadomienia o konieczności wykonania tej czynności.
        UWAGA: Wyjaśnienia dotyczące każdego parametru kontroli jakości, przykłady takich parametrów QC oraz surowy sygnał widmowy uzyskany z optymalnych i suboptymalnych pomiarów (Plik uzupełniający 1, Rysunek 3, Rysunek uzupełniający 3). Kryteria kontroli jakości te zostały zoptymalizowane dla całych wątrób w modelu szczura. Każdy nowo opracowany protokół wykorzystujący inny organ lub model zwierzęcy powinien odpowiednio doprecyzować i dostosować te parametry.
    5. Na stronie głównej kliknij przycisk Start przycisk rozpoczynający akwizycję danych. W zależności od wybranych ustawień oprogramowanie będzie rejestrować dane do momentu osiągnięcia docelowej wartości błędu (sigma) lub upływu 180 s. Akwizycja danych została zakończona.
      1. Wnioskuj o jakości sygnału RRS na podstawie tych wykresów i wartości, aby umożliwić dostosowanie położenia sondy lub warunków pomiarowych (Rycina 3). Jeśli uzyskany sygnał RRS nie spełnia tych kryteriów kontroli jakości, należy ustawić sondę tak, aby była ona jak najbardziej prostopadła do powierzchni, w odległości około 9 mm od powierzchni do okna sondy.
    6. Po zakończeniu akwizycji danych/protokołu eksperymentalnego należy wyrzucić całą wątrobę/tkankę do pojemnika na odpady biologiczne. Wszelkie systemy lub powierzchnie, które miały kontakt z organem/tkanką, należy oczyścić 70% etanolem.
      1. W przypadku korzystania z systemu perfuzyjnego, należy przepuścić wodę dejonizowaną (DI) z dodatkiem detergentu enzymatycznego (7,8 ml rozcieńczone w 1 l wody dejonizowanej [DI]), a następnie czystą wodę DI.
        UWAGA: Każdy pomiar zostanie zapisany jako oddzielny plik analizy w nowym pliku sesji. Wyniki dla 3RMR oraz natężenia sygnału mitochondrialnego (r3RMR) są przedstawione na wykresie w głównym oknie. Możliwe jest również wyświetlenie widma surowego. Inne wskaźniki kontroli jakości, takie jak natężenie sygnału resztkowego i całkowite natężenie sygnału, będą wyświetlane w sekcji Widmo tab.
  4. Analiza danych:
    1. Po zakończeniu akwizycji danych kliknij Przegląd folder na dole ekranu, aby otworzyć plik eksperymentalny i zapoznać się z wynikami.
    2. Alternatywnie można otworzyć plik tekstowy zawierający wyniki. Należy wybrać interesujący plik sesji. Otworzy się plik analizy zawierający wszystkie uzyskane pomiary. Każdy parametr oraz odpowiadająca mu wartość sigma będą znajdować się w osobnej kolumnie. Na przykład wartości 3RMR uzyskane w każdej sekundzie zostaną wymienione w kolumnie „3RMR”, a ich wartość sigma w kolumnie „sigma_3RMR”.
    3. Ostatni wiersz każdej kolumny będzie zawierał wartości końcowe dla każdego parametru z tego pliku sesji. Wartości te należy wykorzystać do wykreślenia wykresu.
    4. Powtórz powyższe kroki dla każdego pliku sesji/każdego nagrania. Przedstaw uzyskane wartości na wykresach w wybrany sposób.

Układ spektroskopii laserowej; sonda ręczna, laser 441 nm, analiza danych; schemat absorpcji przejściowej.
Rycina 2: Konfiguracja urządzenia RRS. Schemat konfiguracji systemu RRS. Sonda jest połączona za pomocą światłowodu z systemem RRS, który zawiera laserowe źródło wzbudzenia oraz spektrometr. Układ ten jest następnie podłączony do dowolnego laptopa z zainstalowaną aplikacją sterującą spektrometrem do zbierania i analizy danych. Zarówno komputer, jak i jednostka spektrometru są podłączone do gniazda zasilania. Pomiary RRS należy przeprowadzać w ciemności. Jeśli pomieszczenia nie można całkowicie odizolować od światła, system RRS jest wyposażony w czarną osłonę z prostokątnym otworem w centrum, w którym można umieścić sondę laserową. Osłona przykrywa próbkę/odcinek narządu, z którego pobierane są pomiary RRS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres spektroskopii Ramanowskiej analizujący sygnał mitochondrialny z linią dopasowania i residuami.
Rysunek 3: Przykładowe ślady i wskaźniki kontroli jakości dla śladów o jakości suboptymalnej i optymalnej. Sygnał resztkowy (szum) zaznaczono pomarańczowym nawiasem, a sygnał mitochondrialny zielonym nawiasem. (A>) Przykładowy ślad z suboptymalnego sygnału Ramanowskiego. Sygnał resztkowy jest zbyt duży, aby odróżnić go od sygnału mitochondrialnego. Piki spektralne są nierozpoznawalne w całym zmierzonym sygnale. (B>) Przykładowy ślad z optymalnego sygnału Ramanowskiego. Sygnał mitochondrialny jest wyraźnie większy i odróżnialny od sygnału resztkowego. Piki spektralne z uzyskanego pomiaru są rozpoznawalne. (C>) Wskaźniki QC uzyskane dla każdego sygnału. Ogólnie całkowity sygnał uzyskany w odczycie suboptymalnym jest mniejszy niż w odczycie optymalnym. W optymalnym pomiarze zmierzono więcej sygnału mitochondrialnego w porównaniu do pomiaru suboptymalnego, przy czym sygnał mitochondrialny stanowi odpowiednio 17% i 14% całkowitego sygnału. Sygnał zmierzono z błędem 4,3% w odczycie optymalnym, w przeciwieństwie do błędu 18,5% w odczycie suboptymalnym. Podobnie, niewyjaśniony sygnał resztkowy stanowi 11% całkowitego sygnału w pomiarze suboptymalnym, podczas gdy w optymalnym stanowi on 3,6%. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

3. Ocena stanu zdrowia mitochondriów z wykorzystaniem RRS

UWAGA: Technologia rezonansowej spektroskopii Ramana (RRS) została wykorzystana do opracowania wskaźnika żywotności mitochondrialnej (3RMR), który określa żywotność organów do przeszczepu. Celem niniejszego badania jest wykazanie, w jaki sposób zmiany w natlenieniu – a co za tym idzie, w oddychaniu komórkowym – odzwierciedlone są w trendach 3RMR w porównaniu z tradycyjnymi biomarkerami uszkodzeń, takimi jak mleczan i K+. Zastosowano tutaj test stresu tlenowego, w którym po 5 min ciągłej perfuzji przepływ utlenowanego perfuzatu zostaje wstrzymany na 5 min, a następnie wznowiony na kolejne 5 min. W trakcie testu stresowego wykonywane są pomiary RRS oraz pobierane próbki perfuzatu z dopływu i odpływu.

  1. Pobieranie wątroby:
    1. Uśpij zwierzęta w komorze indukcyjnej, stosując 3%–5% izofluranu. Nadmiar par odfiltruj za pomocą węgla aktywnego.
    2. Wykonaj całkowitą hepatektomię u samców szczurów linii Lewis (150 g). Podwiąż odgałęzienia żyły wrotnej. Wstrzyknij 50 j. heparyny sodowej do żyły głównej dolnej. Podczas operacji wprowadź kaniulę z cewnikiem 16 G do żyły wrotnej i przepłucz wątrobę 50 ml soli fizjologicznej.
    3. Umieść pobrane wątroby w naczyniu Petri z 30 ml roztworu University of Wisconsin (UW), a następnie pozostaw je w warunkach chłodzenia na lodzie.
  2. Subnormotermiczne konfiguracja maszyny do perfuzji (SNMP) i pomiary rezonansowego rozpraszania Ramanowskiego:
    1. Przygotuj urządzenie RRS zgodnie z wcześniejszym opisem. Ustaw Protokół otrzymywania acelularnej wątroby szczura w oprogramowaniu sterującym spektrometrem, które automatycznie ustawia tryb szerokości do adaptacyjna szerokość, średnią długość do 180 oraz docelowe sigma do 1,5. Wybiera ono również 3RMR i Fluorescencja jako parametry pomiarowe, a także Tylko mito jako bibliotekę regresji. Ustaw tryb akwizycji na tryb ciągły.
    2. Skonfiguruj system SNMP zgodnie z opisem zawartym w innej sekcji18.
      1. Krótko mówiąc, należy upewnić się, że układ perfuzyjny składał się z komory perfuzyjnej, pompy perystaltycznej, membranowego oksygenatora oraz pułapki pęcherzykowej.
      2. Podawaj tlen w mieszaninie atmosferycznej (95% O2 oraz 5% CO22); Utrzymać pO2 w zakresie 400–500 mmHg. Monitorować ciśnienie wewnątrz wątroby za pomocą czujnika ciśnienia i utrzymywać je w zakresie 3–5 mmHg. Pobierać próbki przez porty pobiercze.
    3. Po skonfigurowaniu oprogramowania i systemu perfuzji, należy połączyć kaniulę wprowadzoną do żyły wrotnej (PV) z rurką doprowadzającą perfuzatora. Organ, perfuzat oraz cały układ perfuzyjny należy utrzymać w temperaturze pokojowej (21 °C), bez użycia łaźni wodnej.
    4. Podawać perfuzat do narządu przez kaniulę w żyle wrotnej (PV) za pomocą pompy perystaltycznej.
      1. Aby przygotować perfuzat, zmieszać 500 ml pożywki Williams' Medium bez czerwieni fenolowej z 5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 12 mg rozpuszczalnego w wodzie deksametazonu, 5 ml penicyliny-streptomycyny, 5 ml L-glutaminy, 2.5 µL insuliny oraz 1000 j. heparyny.
      2. Mieszać wszystkie składniki na mieszadle magnetycznym przez około 20 min lub do czasu całkowitego rozpuszczenia wszystkich komponentów. Zwiększyć przepływy perfuzyjne, aby uzyskać ciśnienie rzędu 3–5 mmHg.
    5. Następnie umieść źródło laserowe RRS w uchwycie sondy i ustaw je 1 cm nad największym płatem wątroby, jak najbliżej żyły wrotnej (PV). W 5. minucie (T) wstrzymaj przepływ perfuzyjny.5) i wznowić go w 10. minucie (T10). Przeprowadzić test obciążeniowy w 15. minucie (T15).
    6. Wykonywać pomiary RRS przez cały czas trwania próby wysiłkowej; pomiary przepływu dopływającego i odpływającego przeprowadzać co 5 min, zaczynając od momentu T00 (Rycina 4). Nanieś na wykres wartości 3RMR oraz K odpływu+ poziomy oraz poziomy mleczanów dla T0, T5, T10, T15 (n = 3) (Rycina 5).
    7. Oblicz szybkość zużycia tlenu (OCR) w czasie T0, T5, T10, T15 poprzez pomnożenie ciśnienia parcjalnego tlenu na dopływie/odpływie (pO2) z współczynnikiem rozpuszczalności tlenu w osoczu (0,00314). Wykreśl OCR dla T0, T5, T10, T15 (Rycina 5).
      UWAGA: Przykładowe widma rezonansowego rozpraszania Ramanowskiego dla tkanek perfundowanych (T5), niedokrwienny (T10), a następnie poddano reperfuzji (T15stany z jednej wątroby przedstawiono (Rycina 6)

Proces perfuzji wątroby szczura z użyciem maszyny natleniającej, zestaw do perfuzji, etapy niedokrwienia i reperfuzji.
Rycina 4: Schemat przedstawiający przebieg eksperymentu. U samic szczurów szczepu Lewis wykonano całkowitą hepatektomię. Pobraną wątrobę umieszczono w systemie subnormotermicznej perfuzji maszynowej i zasilano natlenionym perfuzatem przez pierwsze 5 min. Perfuzat wpływa do wątroby przez żyłę wrotną i krąży w obiegu dzięki pompie perystaltycznej (przepływ perfuzji zaznaczono niebieskimi strzałkami). Perfuzję natlenioną wstrzymano na kolejne 5 min w punkcie T5 i wznowiono na kolejne 5 min w T10. Pomiary 3RMR przeprowadzano w trakcie całego testu stresowego (przedstawionego jako laser). Próbki perfuzatu pobierano w punktach T0, T5, T10 i T15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Świeże wątroby poddano okresom niedokrwienia i reperfuzji z wykorzystaniem testu stresu tlenowego. Następnie zmiany 3RMR w czasie rzeczywistym podczas testu stresowego porównano z szybkością zużycia tlenu, poziomem mleczanu w odpływie oraz potasem uzyskanymi z analizy perfuzatu w punktach T0, T5, T10, T15. W warunkach prawidłowych oczekuje się, że wartości 3RMR będą mieścić się w przedziale od 10% do 30% (Rycina 5A). Zgodnie z przewidywaniami, wart...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejsze badanie wskazuje na nieinwazyjną, czasowo rzeczywistą i wysoce czułą metodę ilościowego określania stanu zdrowia mitochondriów, wykorzystującą przenośny system spektroskopii rezonansowej Ramana, który składa się z lasera w kompaktowej sondzie, połączonej za pomocą kabla światłowodowego z pompą laserową. Metoda ta wykorzystuje laser o długości fali 441 nm do pobudzania mitochondriów, które wytwarzają unikalne sygnały spektralne w zależności od ich stopnia utlenienia. Tym samym, spektroskopia rezonansowa Ramana j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują konflikt interesów. S.N.T i P.R. mają wnioski patentowe dotyczące niniejszego badania. P.R. jest pracownikiem i udziałowcem Pendar Technologies. Interesy S.N.T są zarządzane przez MGH i Partners HealthCare zgodnie z ich polityką konfliktu interesów. Interesy J.N.K są zarządzane zgodnie z polityką konfliktu interesów BCH. W niniejszym badaniu wykorzystano następujące opatentowane technologie: US2020/0281474A1 In vivo monitoring of cellular energetics with Raman spectroscopy (application). Złożono dodatkowe wnioski patentowe dotyczące zastosowania spektroskopii Resonance Raman w okulistyce, ocenie żywotności tkanek i ocenie obrażeń poparzeniowych, gdzie R.J. jest również wynalazcą.  

Podziękowania

To dzieło zostało wsparte przez hojne fundusze przekazane S.N.T. przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (R01DK134590). Z wdzięcznością przypominamy również o finansowaniu S.N.T przez amerykański Narodowy Instytut Zdrowia (K99/R00 HL1431149; R01HL157803; R24OD034189), Narodową Fundację Nauki (EEC 1941543), Fundację Rodziny Polsky oraz Shriners Children’s Boston (Grant #BOS-85115). Ponadto z wdzięcznością przypominamy o finansowaniu dla R.J. przez Grant #LIFER23-263034 od Amerykańskiego Stowarzyszenia na rzecz Badań nad Chorobami Wątroby. Autorzy wyrażają głębokie wdzięczność za wsparcie ekspertów z Patologii Core na Harvard Medical School za badania histologiczne. Chcielibyśmy również podziękować dr Robertowi Balabanowi i dr Armel Femnou z Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi NIH za ich wiedzę w dziedzinie energetyki mitochondrialnej oraz za ważne wsparcie w opracowaniu biblioteki RRS pojedynczych kompleksów mitochondrialnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
16 G Catheter BD Insyte Authoguard381454Używane do nakłucia żyły wrotnej
Activated CharcoralVet Equip Vapor Guard Activated Charcoal931401Używane do filtrowania nadmiaru pary podczas anestezji
BSA Sigma-Aldrich A7906Skład perfuzyjnego roztworu
Bubble Trap Radnoti130149
DexamethasoneSigma-AldrichD2915Skład perfuzyjnego roztworu
Glutamax Thermo Fisher Scientific35050061Skład perfuzyjnego roztworu
Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G)Fisher Scientific 13-200-292Używane do przepływu perfuzyjnego roztworu przez wątrobę
Masterflex peristaltic pumps Cole Parmer, Vernon Hill, IL7528-30 Używane do przepływu perfuzyjnego roztworu przez wątrobę
Membrane Oxygenator Radnoti130144Używane do utleniania perfuzyjnego roztworu. 
Penicillin-streptomycinSigma-AldrichP4458Skład perfuzyjnego roztworu
RAPIDPoint 500 Blood Gas SystemSiemens Healthineers41115805Do analizy gazów krwi
Resonance Raman System  Pendar TechnologiesA4D441Skontaktuj się z Pendar Technologies w sprawie zapytań dotyczących tego produktu

Bibliografia

  1. San-Millán I. The key role of mitochondrial function in health and disease. Antioxidants (Basel). 2023;12(4):782.
  2. Rossmann MP, et al. Mitochondrial function in development and disease. Dis Model Mech. 2021;14(6):dmm048912.
  3. Chen W, Zhao H, Li Y. Mitochondrial dynamics in health and disease: mechanisms and potential targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:333.
  4. Acin-Perez R, et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. EMBO J. 2020;39(13):e104073.
  5. Sharma E, et al. Overview of methods that determine mitochondrial function in human disease. Metabolism. 2025;170:156300.
  6. Kowaltowski AJ, Abdulkader F. How and when to measure mitochondrial inner membrane potentials. Biophys J. 2024;123(24):4150-4157.
  7. Quinn KP, et al. Characterization of metabolic changes associated with the functional development of 3D engineered tissues by noninvasive, dynamic measurement of individual cell redox ratios. Biomaterials. 2012;33(21):5341-5348.
  8. Perry DA, et al. Responsive monitoring of mitochondrial redox states in heart muscle predicts impending cardiac arrest. Sci Transl Med. 2017;9(408):ean0117.
  9. Nguyen KT, et al. Mitochondrial hyperoxidation contributes to warm ischemia-reperfusion injury in rat and pig livers. Commun Med. 2026;6:307.
  10. de Vries RJ, et al. Noninvasive quantification of the mitochondrial redox state in livers during machine perfusion. PLoS One. 2021;16(10):e0258833.
  11. Ajenu EO, et al. Advancing assessment methods for human cardiac grafts during normothermic machine perfusion. Transplantation. 2025;110(2):e374-e384.
  12. Thomas AR, et al. Resonance Raman spectroscopy detects ischemia in experimental coarctation of the aorta in a rodent model. J Cardiovasc Transl Res. 2025;18:566-573.
  13. Cakir B, et al. In vivo noninvasive mitochondrial redox assessment of the optic nerve head to predict disease. PNAS Nexus. 2023;2(5):pgad148.
  14. Jain R, et al. Real-time monitoring of mitochondrial oxygenation during machine perfusion using resonance Raman spectroscopy predicts organ function. Sci Rep. 2024;14:7328.
  15. Covian R, Edwards LO, Balaban RS. Effect of the mitochondrial membrane potential on the absorbance of the reduced form of cytochrome c oxidase. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 2024;1865(3):149048.
  16. Ljungdahl PO, Pennoyer JD, Robertson DE, Trumpower BL. Purification of highly active cytochrome bc1 complexes from phylogenetically diverse species by a single chromatographic procedure. Biochim Biophys Acta. 1987;891(3):227-241.
  17. Covian R, Chess D, Balaban RS. Continuous monitoring of enzymatic activity within native electrophoresis gels: application to mitochondrial oxidative phosphorylation complexes. Anal Biochem. 2012;431(1):30-39.
  18. Haque O, et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology. 2020;8(1-2):27-36.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

MedycynaWydanie 234Wydanie 234Warto pustaWydanieMitochondriaywotno organustan zdrowia mitochondri wPrzeszczep w trobystany redoks mitochondri w

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.