Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

W czasie rzeczywistym, nieinwazyjna ocena funkcji mitochondrialnych za pomocą spektroskopii rezonansowego rozpraszania Ramana

183 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71290

⸱

7 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Hospital for Children, 3Pendar Technologies

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy nieinwazyjną, czasu rzeczywistego metodę monitorowania zdrowia mitochondriów za pomocą Spektroskopi Rezonansowo-Ramanowskiej (RRS). Wykorzystaliśmy RRS do ilościowego określania stanów redoks mitochondriów i opracowaliśmy wskaźnik zdrowia mitochondriów, Redukowany Rezonansowo-Ramanowski Wskaźnik Mitochondriów (3RMR), który wykazuje szybszą reakcję na zmiany w tlenowania niż tradycyjne analityki gazów we krwi.

Streszczenie

Mimo że mitochondria są centralne dla patogenezy i postępu choroby, mechanistyczne wglądy w dynamikę zdrowia mitochondrialnego pozostają kosztowne i niedostępne. Aby wypełnić tę lukę, w niniejszym badaniu zastosowano Spektroskopio Rezonansu Ramana (RRS) do oceny funkcji mitochondrialnych, wykorzystując przenośny system, który dostarcza czasowych, nieinwazyjnych i ilościowych pomiarów stanów redoks cytochromów mitochondrialnych w wątrobach szczurów. W tym protokole demonstrujemy zastosowanie tej technologii, w tym konfigurację, zbieranie danych i przetwarzanie danych. Niniejsze badanie przedstawia eksperyment udowadniający koncepcję, który podkreśla zdolność RRS do pomiaru zmian w czasie rzeczywistym w stanie redoks mitochondrialnym - a przez rozszerzenie, funkcji mitochondrialnej. W skrócie, urządzenie RRS zostało podłączone do pompy laserowej oraz komputera do zbierania danych i umieszczone 1 cm od wątroby szczura.  Parametry zbierania danych zostały wybrane zgodnie z protokołem dotyczącym wątroby szczura; stany redoks zostały zmierzone w warunkach natlenionych i niedotlenionych przy użyciu testu stresu tlenowego. Zmiany w stanach redoks mitochondrialnych były śledzone podczas całego testu stresu tlenowego.

Wprowadzenie

Mitochondria odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu komórek i homeostazie. Mitochondria są głównymi napędami metabolizmu komórkowego, regulując produkcję ATP poprzez fosforylację utleniającą. Służą również jako organella sygnałowe, które dyktując los komórki, regulują szlaki apoptotyczne, a także sygnał ROS i Ca+21. Tym samym, dysfunkcja mitochondriów może prowadzić do różnych chorób neurodegeneracyjnych, mięśniowych i układu krążenia2,3. Mimo że mitochondria odgrywają kluczową rolę w progresji chorób, ocena funkcji mitochondriów może być inwazyjna, kosztowna i ograniczona.

Kluczowe wskaźniki funkcji mitochondriów, takie jak wskaźnik zużycia tlenu, fosforylacja utleniająca i aktywność różnych kompleksów w łańcuchu transportu elektronowym (ETC), są mierzone za pomocą respirometrii. ETC składa się z czterech kompleksów (I–IV) osadzone w wewnętrznej błonie mitochondrialnej (IMM). Te kompleksy, z pomocą innych koenzymów, przenoszą elektrony z zredukowanych substratów, takich jak NADH i FADH2, do końcowego akceptora elektronów, O2, który jest następnie zredukowany do wody. Większość współczesnych testów respirometrii, takich jak Seahorse i Orobros O2k, wymaga przetwarzania tkanki, co ogranicza ich zastosowanie do badań translacyjnych4,5. Pomiar potencjału membran mitochondriów (MMP) to kolejna metoda oceny dysfunkcji mitochondriów, która wykorzystuje kationiczne lipofilowe fluorofory, takie jak JC-1, wraz z obrazowaniem mikroskopowym, gdzie sprzężone (zdrowe) i nie sprzężone (uszkodzone) mitochondria fluoreskują na różnych długościach fal6. Jednak te testy mogą mieć niską czułość5. Sam barwnik może również mieć wysoką cytotoksyczność w wysokich stężeniach5. Ostatnio, podobnie jak pomiary respirometrii, ta technika również wymaga przetwarzania tkanki. Techniki oparte na spektroskopii zostały ostatnio wykorzystane jako nieinwazyjne metody oceny zdrowia mitochondriów. Na przykład, Spektroskopia Rezonansu Magnetycznego Fosforu (P-MRS), metoda oceny metabolizmu komórkowego przez pomiar stężeń metabolitów zawierających fosfor, została wykorzystana do charakteryzacji inżynieryjnych tkanek adypogennych poddanych różnicowaniu7. Jednak ta technika również wymaga specjalistycznego sprzętu i szkolenia.

Nasza grupa niedawno zademonstrowała technikę czasu rzeczywistego, nieinwazyjną i wysoce specyficzną do pomiaru stanu redoks mitochondriów jako markera żywotności narządów przy użyciu Spektroskopii Rezonansu Ramana (RRS). RRS wykorzystuje nieelastyczne rozpraszanie fotonów do ilościowego określania stanów redoks cytochromów mitochondrialnych. Pierścienie porfiryny w hemowych częściach cząsteczek, takich jak cytochromy mitochondrialne, hemoglobina i mioglobina, wytwarzają charakterystyczne widmo Ramana w zależności od ich stopnia utlenienia po pobudzeniu laserem o długości fali 441 nm8. Chociaż system RRS wykorzystuje długość fali 441 nm, można również zastosować lasery o długości fali 420 nm i 405 nm, z których każdy preferencyjnie wzmacnia inny kompleks cytochromowy. Spektrum uzyskane z nieznanej próbki interesującej jest skontrastowane z wcześniej nagranym księgozbiorem w pełni utlenionych lub zredukowanych, nieuszkodzonych mitochondriów, dając stosunek zredukowanych do całkowitych mitochondriów lub średni stan redoks in situ cytochromów ETC. Stosunek ten jest definiowany jako Rezonansowy Raman Redukowany Stosunek Mitochondriów (3RMR).

Istnieją 3 odrębne obliczenia/typy 3RMR: mitochondrialny 3RMR (mito-3RMR), 3RMR kompleksu III (cIII-3RMR) i 3RMR kompleksu IV (cIV-3RMR). Każdy z tych indeksów jest obliczany przez ułamek zredukowany do liczby wszystkich danych składników. Na przykład 3RMR cIII byłby stosunkiem zredukowanego cIII do całkowitej liczby cIII w tkankach (cIII-R/(cIII-O+CIII-R). Ten sam wzorzec dotyczy cIV. Tym samym, 3RMR-cIII odnosiłby się do stosunku zredukowanego cIII do całkowitej ilości cIII, a 3RMR-cIV odnosiłby się do stosunku zredukowanego cIV do całkowitej ilości cIV. Poprzez analizę regresji, albo mitochondrialne stany redoks (mito-3RMR) są obliczane za pomocą bibliotek spektralnych nieuszkodzonych mitochondriów, albo pojedyncze stany redoks kompleksów (cIII-3RMR i cIV-3RMR) są obliczane za pomocą bibliotek spektralnych cIII i cIV. Niedawny artykuł9 wykazał, że mito-3RMR jest reprezentatywny dla ważonej średniej stanów redoks cIII i cIV (lub cIII-3RMR i cIV-3RMR). Ważne jest, aby zauważyć, że cI i cII nie są aktywne Ramanem ani resonantnie wzmacniane przez długość fali 441 nm. W konsekwencji nie są obliczane podczas obliczania mito-3RMR.

Wykorzystując te typy 3RMR, określiliśmy optymalny zakres 3RMR. W "zdrowych" narządach mitochondria są nietknięte i mają

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zwierzęta wykorzystane w eksperymentach były utrzymywane zgodnie z wytycznymi National Research Council i zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w Massachusetts General Hospital (Boston, MA, USA).

1. Konfiguracja i wykorzystanie RRS

  1. Opis urządzenia:
    UWAGA: Przenośny system RRS (Pendar Technologies; produkt przeznaczony wyłącznie do celów badawczych) wykorzystuje laser o długości fali 441 nm ze względu na rezonansowe wzmocnienie widma Ramana cytochromów mitochondrialnych przy tej długości fali. Laser pracuje w zakresie od 4 mW do 8 mW.
    1. Podłącz źródło wzbudzenia laserowego do specjalnie zbudowanej sondy za pomocą kabla światłowodowego. Sonda rzuca plamkę laserową o średnicy 2 mm na tkankę, a jednocześnie zbiera emitowane widmo. Widmo przechodzi następnie przez filtr pasmowy i jest rejestrowane przez matrycę CCD (charge-coupled device). Widmo jest zbierane w każdej sekundzie w czasie 180 s i uśredniane w celu utworzenia surowego widma o zredukowanym szumie do analizy.
    2. Oprogramowanie porównuje tak otrzymane widmo z wcześniej zmierzonymi bibliotekami widmowymi za pomocą analizy regresyjnej.
  2. Procedura wstępnego rejestrowania bibliotek
    UWAGA: W eksperymentach przedstawionych w niniejszej pracy utworzono i wykorzystano biblioteki dla zredukowanych i utlenionych form mitochondriów, kompleksu III i kompleksu IV, hemoglobiny oraz mioglobiny. Sygnały RRS dla wszystkich bibliotek były rejestrowane w czarnej skrzynce w temperaturze pokojowej (21 °C). Pliki tych bibliotek są dostarczane oddzielnie wraz z oprogramowaniem analitycznym. Jednak w zależności od badanej tkanki i obecności innych cząsteczek aktywnych w rozproszeniu Ramana, można stworzyć inne biblioteki, odpowiednio adaptując poniższy protokół. Surowe widma RRS bibliotek hemoglobiny, mioglobiny oraz utlenionego/zredukowanego kompleksu III/IV przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 1.
    1. Biblioteki hemoglobiny (Rysunek uzupełniający 1C):
      1. Pobierz świeżą krew gryzonia poprzez upuszczanie krwi z zwierzęcia. Natlenuj pobraną krew za pomocą 100% tlenu lub odtlenij ją za pomocą 100% azotu w kuwecie szklanej, dodając ditionian sodu.
      2. Zmierz RRS dla każdego stanu przez ściankę szklanej kuwety przez 10 min, pozycjonując sondę RRS w odległości 9 mm od szklanej kuwety.
      3. Użyj piku widmowego przy 1356 cm-1 , aby zweryfikować stan odtleniony, oraz pików przy 1376 cm-1 , aby potwierdzić stan natleniony.
    2. Biblioteki mitochondrialne zredukowane/utlenione (Rysunek 1)
      1. Wyizoluj mitochondria z homogenizowanych i oczyszczonych serc gryzoni w kuwecie szklanej. Umieść sondę Ramana w odległości 9 mm od szklanej kuwety i zmierz widma tych mitochondriów przez szklaną ściankę.
      2. Stwórz w pełni utlenione warunki, dostarczając 100% strumień tlenu do mitochondriów. Zweryfikuj stan utleniony poprzez brak zredukowanego piku RR przy 1357 cm-1.
      3. Stwórz w pełni zredukowane warunki, wystawiając mitochondria na działanie 100% azotu z niewielkimi ilościami siarkowodoru. Zweryfikuj warunki zredukowane poprzez brak utlenionego piku markera RR przy 1371 cm-1.
    3. Utleniony/zredukowany kompleks III/IV (Rysunek uzupełniający 1A,B):
      1. Wyizoluj Kompleks III i IV zgodnie z opisem w innych pracach9,15,16,17. W skrócie, jako materiał wyjściowy użyj próbki zapasowej wyizolowanych mitochondriów (odpowiadającej 200 nanomolum cytochromu a).
      2. Rozcieńcz mitochondria do stężenia 10 nmol cytochromu A/mL w lodowatym buforze C (50 mM Tris, 1 mM MgSO4, pH 8.45). Następnie dodawaj kroplami 10% w/v n-β-D-dodecyl maltozyd (DM) do końcowego stężenia 1%, delikatnie mieszając na lodzie.
      3. Odwiruj ekstrakt przy 40,000 × g przez 40 min w temperaturze 4 °C. Nałóż supernatant na szklaną kolumnę o wymiarach 2,5 cm × 20 cm, która została wcześniej wypełniona żywicą wymienną i równoważona 5 objętościami kolumny buforu C (zawierającego 0,02% w/v DM).
      4. Po przemyciu 2 objętościami kolumny buforu C, eluuj kompleksy mitochondrialne, stosując liniowy gradient NaCl 0–400 mM w tym samym buforze i zbieraj eluat w frakcjach po 4 mL.
      5. Zielone frakcje zawierające Kompleks IV eluoły się blisko środka gradientu (~180 mL NaCl), przed czerwonawymi frakcjami zawierającymi Kompleks III. Skoncentruj połączone frakcje zawierające każdy kompleks do poziomu 20–30 nmoli cytochromu a/mL.
      6. Po wyizolowaniu poszczególnych kompleksów poddaj każdy z nich warunkom utleniającym i redukującym. Zredukuj próbkę Kompleksu III o stężeniu 11 mM w buforze Tris, używając 2 mL askorbinianu (1 M) w celu redukcji cytochromu c1 oraz 2 mL HS (hydrosiarczynu) w celu pełnej redukcji cytochromów bL i bH.
      7. Zredukuj próbkę Kompleksu IV o stężeniu 18,67 mM w buforze Tris w wielu etapach, ponieważ Kompleks IV przechodzi wieloetapowy proces utleniania katalitycznego. Aby w pełni zredukować Kompleks IV, dodaj dwie porcje po 2 mL H2O2 (10 mM), a następnie 2 mL HS.
      8. Zbieraj widma biblioteczne po każdym dodatku, aby uchwycić każdy etap cyklu. Dodaj widma w pełni utlenione i zredukowane do końcowej biblioteki referencyjnej, aby reprezentowały stany stacjonarne kompleksu IV.
      9. Przygotuj wszystkie próbki w szklanych fiolkach o pojemności 1 mL i utrzymuj je w stałej pozycji w odległości 9 mm od soczewki sondy, a następnie umieść je w czarnej skrzynce, aby zapobiec zanieczyszczeniu światłem. Zbieraj widma RRS przez 600 s dla każdego kompleksu i stanu utlenienia.
      10. Zwaliduj czystość wyizolowanych cIII i cIV zgodnie z wcześniejszym opisem17, a następnie zwaliduj adekwatność bibliotek widmowych wyizolowanych cIII i cIV w wyjaśnianiu pełnych widm mitochondrialnych zgodnie z opisem w niedawnej pracy9.
    4. Biblioteki mioglobiny (Rysunek uzupełniający 1D):
      1. Stosując podobne strumienie tlenu i azotu (z rozpuszczonym ditionianem sodu), zmieniaj nasycenie oksy-mioglobiną ekstraktu mioglobiny mięśnia sercowego w zakresie od 0% do 100%. Weryfikuj widma Ramana za pomocą pików markerowych przy 1355 cm-1 i 1376 cm-1.

UWAGA: Większość opisanych powyżej komponentów widmowych, takich jak hemoglobina lub utlenione/zredukowane mitochondria, to cząsteczki zawierające hem i są one wzbudzane przez tę samą długość fali. System RRS unika nakładania się sygnałów poprzez tworzenie biblioteki regresyjnej dla każdej cząsteczki na podstawie jej unikalnego sygnału widmowego. Uzyskane widma rozproszone są przetwarzane przez algorytm regresyjny w odniesieniu do wybranych bibliotek. Algorytm regresji wyznacza współczynnik dla każdego widma bibliotecznego, który reprezentuje najlepsze dopasowanie szacunkowe jego relatywnego wkładu w zarejestrowanym widmie, a tym samym jego względne stężenie w tkance. Ponieważ algorytm wykorzystuje najlepsze dopasowanie w zakresie liczb falowych, niewielkie różnice w położeniu lub intensywności piku widmowego poszczególnych komponentów bibliotecznych pozwalają regresji rozpoznać nawet blisko spokrewnione chromofory. Dzięki algorytmowi regresyjnemu i bibliotekom widmowym system RRS może rozdzielić całkowity sygnał rozproszony na różne komponenty w zależności od ich unikalnych pików widmowych, unikając nakładania się sygnałów z cząsteczek zawierających hem. Aby wykazać zależność między hemoglobiną a mitochondriami, dołączono Rycina uzupełniająca 2, która przedstawia obrazy widm uzyskanych z perfuzji wątroby, rozbite na zmierzony sygnał, linię najlepszego dopasowania oraz niewyjaśnioną resztę wynikającą z różnic w poszczególnych pikach widmowych. W panelu A wybrano biblioteki regresyjne dla hemoglobiny zredukowanej i utlenionej oraz mitochondriów zredukowanych i utlenionych. Linia najlepszego dopasowania opracowana na podstawie bibliotek i analizy regresyjnej ściśle pokrywa się z pomierzonym sygnałem, a niewyjaśniona reszta jest niewielka. W panelu B wybrano jedynie biblioteki dla mitochondriów utlenionych i zredukowanych. Ponieważ występuje duża struktura niewyjaśnionej reszty, pik widmowy mitochondriów jest przesunięty o kilka liczb falowych w stosunku do piku hemoglobiny, której nie uwzględniono w analizie regresyjnej. Ponadto, na rycinach uzupełniających pracy Nguyen i wsp.9, autorzy wyjaśniają zależność między mitochondriami a poszczególnymi kompleksami (cIII i cIV), a także zależność między poszczególnymi kompleksami16, przy czym kompleks III wykazuje ostrzejsze piki o niższej częstotliwości, podczas gdy kompleks IV wykazuje szersze, przesunięte w górę pasma. Co więcej, autorzy wykazują, że biblioteki dla zredukowanego Kompleksu III i Kompleksu IV w pełni wyjaśniają zmierzone widmo zredukowanych mitochondriów całkowitych, co skutkuje minimalną niewyjaśnioną resztą.

Wykres spektroskopii Ramanowskiej przedstawiający analizę utlenionych i zredukowanych szczytów widmowych mitochondriów.
Rysunek 1: Biblioteki widmowe w pełni utlenionych i zredukowanych mitochondriów. Widma biblioteki RRS uzyskano po dostarczeniu do izolowanych mitochondriów (A) 100% tlenu lub 100% azotu (B) w celu uzyskania odpowiednio stanu utlenionego i zredukowanego. Stany te potwierdzono obecnością markerowych szczytów RR utlenionego (C) i zredukowanego (D). Przesunięcie tych szczytów odpowiada zmianom w drganiach molekularnych w obecności tlenu. Intensywność każdego szczytu została znormalizowana do 1 dowolnej jednostki intensywności (AU), ponieważ wzmocnienie stanu zredukowanego jest większe przy zastosowaniu tej długości fali wzbudzenia 441 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Gromadzenie danych przy użyciu RRS

  1. Urządzenie konfiguracja:
    1. Podłącz jednostkę spektrometru (umieszczoną w kompaktowej obudowie) do zasilacza prądu stałego (DC) oraz do adaptera zasilającego za pomocą dołączonych kabli. Jednostka spektrometru posiada jedną okrągłą wtyczkę z wypustkami pozycjonującymi.
    2. Dopasuj wcięcia okrągłej wtyczki do wcięć kabla podłączanego do zasilacza. Przed połączeniem portów nie jest wymagane czyszczenie (Rysunek 2). 
    3. Podłącz komputer przeprowadzający analizę do tego samego zasilacza, do którego podłączone są spektrometr i źródło zasilania, używając dostarczonych przewodów.
    4. Umieść sondę laserową w uchwycie sondy. Dostosuj pozycję sondy przed rozpoczęciem eksperymentu.
    5. Otwórz oprogramowanie sterujące spektrometrem (Cellular Energetics Software).
  2. Konfiguracja oprogramowania:
    UWAGA: Wraz z systemem dostarczone zostają pliki ustawień oraz biblioteki regresji dla różnych rodzajów tkanek. Pliki te zawierają informacje o tym, jakie biblioteki system RRS powinien uwzględnić w regresji, ile widm znajduje się w oknie regresji oraz inne parametry, takie jak moc lasera. Ustawienia domyślne można zmienić, a następnie zapisać nowy plik ustawień do wykorzystania w przyszłych eksperymentach. Zrzuty ekranu oprogramowania, opisane poniżej, przedstawiono w Rycina uzupełniająca 3.
    1. Po uruchomieniu oprogramowania sterującego spektrometrem wyświetla się wykres przedstawiający procentową wartość 3RMR, nasycenie tlenem (StO2) i pojawi się nasycenie mioglobiną. Na tym ekranie będą wyświetlane te parametry, jeśli zostaną wybrane, w czasie rzeczywistym podczas pomiarów. Kliknij w Ustawienia karta w lewym dolnym rogu strony.
    2. Pod Informacje karta, wprowadź informacje o sesji w sekcji Nazwa sesji, oraz wszelkie niezbędne szczegóły pod Opis sesji tab.
    3. Istnieją dwa tryby zbierania danych. Należy użyć Kontrolna weryfikacja tryb akumulacji widm aż do spełnienia określonych kryteriów jakościowych (np. docelowej wartości sigma lub okna regresji/liczby widm), a następnie zatrzymanie rejestracji. Użyj Tryb ciągły do rejestracji widm aż do momentu naciśnięcia przycisku stop. W obu trybach wszystkie dane, zarówno wyniki 3RMR, jak i poszczególne widma, są zapisywane automatycznie. W tym doświadczeniu wykorzystuje się Tryb ciągły.
    4. Po wprowadzeniu wszystkich informacji o sesji należy kliknąć przycisk System tab.
    5. Pod Plik ustawieńwybierz protokół odpowiedni dla projektu (w przypadku perfuzjiy wątroby szczura w stanie acelularnym wybierz) Acellularna wątroba szczura protokół). Pozwoli to na automatyczne dostosowanie typu pomiaru, średniej długości pomiaru (okno regresji) oraz docelowej wartości sigma.
      1. Aby utworzyć nowy plik ustawień, należy dostosować dowolny z wymienionych powyżej komponentów, a następnie kliknąć Zapisz przycisk. Powinno to zapisać te parametry jako osobny plik ustawień, który można następnie zaimportować do systemu.
      2. Aby zaimportować nowy plik ustawień, należy kliknąć menu rozwijane obok Domyślny (Mod) i wybierz Importuj nowy plik ustawieńKliknij nową Plik ustawień do importu.
    6. Pod Biblioteki do regresjiwybierz i potwierdź kombinację bibliotek, które zostaną użyte do akwizycji i analizy danych. W tym doświadczeniu wybrano biblioteki dla mitochondriów zredukowanych i utlenionych [Mito Only]. Inni użytkownicy mogą zdecydować się na użycie bibliotek obejmujących również hemoglobinę, mioglobinę lub inne kompleksy występujące w Zaawansowana biblioteka. 
    7. Wybierz i potwierdź preferowane Tryb szerokości okna.
      1. Tryb szerokości adaptacyjnej: użyj adaptacyjna szerokość tryb dodawania poszczególnych widm do widma uśrednionego aż do osiągnięcia maksymalnej docelowej wartości sigma. Jeśli docelowa wartość sigma nie zostanie osiągnięta, rejestracja zostanie zakończona po przekroczeniu górnej granicy ustawionego okna regresji (tj. maksymalnej liczby widm przeznaczonej do zarejestrowania). Wyniki pomiaru zostaną wyświetlone na ekranie po osiągnięciu minimalnej docelowej wartości sigma.
      2. Tryb stałej szerokości: Użyj stała szerokość tryb dodawania poszczególnych widm do widma uśrednionego, aż do osiągnięcia docelowej liczby widm (ustalonej w parametrze średniej długości).
    8. Po zakończeniu konfiguracji systemu kliknij Wykres tab.
    9. Pod Seria Głównawybierz komponenty, które mają zostać wykreślone i wyświetlone na ekranie podczas pomiarów.
    10. Należy potwierdzić, że wszystkie wybrane komponenty pomiarowe są zgodne z właściwym protokołem.
  3. Pozyskiwanie danych:
    UWAGA: Pomiary Ramana należy przeprowadzać w zaciemnionym pomieszczeniu. Przed rozpoczęciem akwizycji danych należy upewnić się, że przestrzeń robocza jest w maksymalnym stopniu osłonięta przed światłem. Jeśli nie ma możliwości całkowitego zaciemnienia pomieszczenia, system RRS jest wyposażony w czarną osłonę z prostokątnym otworem w centrum (przedstawioną w Rycina 2), przez którą można wprowadzić sondę laserową. Pudełko może zakrywać próbkę lub odcinek narządu, z którego pobierane są pomiary RRS. Podczas pracy z laserem RRS należy unikać bezpośredniego lub przedłużonego kontaktu oczu z wiązką. Nie należy kierować lasera bezpośrednio w oczy ani na powierzchnie refleksyjne. Laser należy aktywować wyłącznie wtedy, gdy jest on umieszczony bezpośrednio na badanej tkance. Laser RRS jest laserem klasy 3R przy mocy 4 mW oraz klasy 3B przy mocy 10 mW. Laser jest bezpieczny w kontakcie z tkanką.
    1. Wybierz odpowiednie, wcześniej zapisane ustawienia, parametry rejestracji oraz pliki biblioteki.
    2. Umieść sondę laserową bezpośrednio nad badaną tkanką lub narządem. Ustaw sondę jak najbardziej prostopadle, w odległości 1 cm od tkanki. Użyj linijki, aby precyzyjnie odmierzyć 1 cm od powierzchni narządu. Jeśli sygnał nie jest wyraźny, przesuń sondę na odległość mniejszą niż 1 cm. Należy jednak dopilnować, aby sonda nigdy nie dotykała tkanki.
      UWAGA: Sonda może być trzymana w ręku, jednak zaleca się stosowanie regulowanego i stabilnego uchwytu/statywu do sondy. Należy ustawić sondę jak najbardziej prostopadle, w odległości 1 cm od tkanki. Do dokładnego odmierzenia 1 cm od powierzchni narządu można użyć linijki. Jeśli sygnał nie jest wyraźny, można ustawić sondę w odległości mniejszej niż 1 cm. Sonda nie może jednak dotykać tkanki.
    3. Potwierdź, że plamka lasera znajduje się na lewym płacie bocznym, jak najbliżej żyły wrotnej.
    4. Potwierdź, że wszystkie wybrane biblioteki, ustawienia regresji, docelowe sigma, okno regresji oraz tryby akwizycji są poprawne i zgodne z oczekiwaniami.
      1. Upewnij się, że w pomieszczeniu panuje jak największy mrok. Sprawdź, czy okno sondy nie jest zanieczyszczone, w szczególności krwią. W przypadku zanieczyszczenia użyj beztkaninowej, nieściernej ściereczki nasączonej 70-procentowym alkoholem izopropylowym, aby oczyścić okno kwarcowe, a następnie przed kontynuowaniem pracy dokładnie osusz je suchą ściereczką.
      2. W przypadku silnego zanieczyszczenia należy przetrzeć sondę tak dokładnie, jak to możliwe, zgodnie z powyższym opisem. Następnie należy skalibrować urządzenie, umieszczając laser w ciemnej obudowie wyłożonej czarną taśmą i naciskając Pobierz ciemną klatkę przycisk. Kalibracja trwa około 5–10 min. Niezależnie od stopnia zanieczyszczenia, należy kalibrować urządzenie raz w miesiącu; urządzenie będzie wysyłać automatyczne przypomnienia.
        UWAGA: Wyjaśnienia dotyczące każdego wskaźnika kontroli jakości, przykłady takich wskaźników QC oraz surowy sygnał widmowy uzyskany z optymalnych i suboptymalnych pomiarów (Plik uzupełniający 1, Rycina 3, Rycina uzupełniająca 3). Kryteria kontroli jakości te zostały zoptymalizowane dla całych wątrób w modelu szczurzym. Każdy nowo opracowany protokół wykorzystujący inny organ lub model zwierzęcy powinien odpowiednio dopracować i dostosować te parametry.
    5. Na stronie głównej kliknij przycisk Start przycisk rozpoczynający zbieranie danych. W zależności od wybranych ustawień oprogramowanie będzie rejestrować dane do momentu osiągnięcia docelowej wartości błędu (sigma) lub upływu 180 s. Proces zbierania danych został zakończony.
      1. Na podstawie tych wykresów i wartości należy ocenić jakość sygnału RRS, aby umożliwić korektę położenia sondy lub warunków pomiaru (Rycina 3). Jeśli uzyskany sygnał RRS nie spełnia tych kryteriów kontroli jakości, należy ustawić sondę tak, aby była jak najbardziej prostopadła i znajdowała się w odległości około 9 mm od powierzchni do okna sondy.
    6. Po zakończeniu akwizycji danych/protokołu eksperymentalnego należy wyrzucić całą wątrobę/tkankę do pojemnika na odpady biologiczne. Należy oczyścić 70% etanolm każdy system lub powierzchnię, która miała kontakt z organem/tkanką.
      1. W przypadku pracy z systemem perfuzyjnym, przepuścić wodę dejonizowaną (DI) z dodatkiem środka czyszczącego enzymatycznego (7,8 ml rozcieńczonego w 1 l wody dejonizowanej [DI]), a następnie czystą wodę DI.
        UWAGA: Każdy pomiar zostanie zapisany jako oddzielny plik analizy w ramach nowego pliku sesji. Wyniki dla 3RMR oraz natężenia sygnału mitochondrialnego (r3RMR) są wykreślone w głównym oknie. Możliwe jest również wyświetlenie widma surowego. Pozostałe wskaźniki kontroli jakości, takie jak natężenie sygnału resztkowego i całkowite natężenie sygnału, zostaną wyświetlone w sekcji Widmo tab.
  4. Analiza danych:
    1. Po zakończeniu akwizycji danych kliknij Przegląd folder na dole ekranu, aby otworzyć plik eksperymentalny i zobaczyć wyniki.
    2. Alternatywnie można otworzyć plik tekstowy zawierający wyniki. Należy wybrać interesujący plik sesji. Otwarty zostanie plik analizy zawierający wszystkie uzyskane pomiary. Każdy parametr i odpowiadająca mu wartość sigma będą znajdować się w osobnej kolumnie. Na przykład wartości 3RMR uzyskane w każdej sekundzie będą wymienione w kolumnie „3RMR”, a ich wartość sigma w kolumnie „sigma_3RMR”.
    3. Ostatni wiersz każdej kolumny będzie zawierał wartości końcowe dla każdego parametru z tego pliku sesji. Wartości te należy wykorzystać do wykreślenia wykresu.
    4. Powtórz kroki dla każdego pliku sesji/każdego nagrania. Przedstaw otrzymane wartości na wykresie w wybrany sposób.

Układ spektroskopii laserowej z sondą ręczną, laserem 441 nm, analiza danych na laptopie; badanie wzbudzenia.
Rysunek 2: Konfiguracja urządzenia RRS. Schemat konfiguracji systemu RRS. Sonda jest połączona za pomocą światłowodu z systemem RRS, który zawiera źródło wzbudzenia laserowego oraz spektrometr. Ten układ jest następnie podłączony do dowolnego laptopa z zainstalowaną aplikacją sterującą spektrometrem do zbierania i analizy danych. Zarówno komputer, jak i jednostka spektrometru są podłączone do gniazda zasilania. Pomiary RRS należy przeprowadzać w ciemności. Jeśli pomieszczenia nie można całkowicie odizolować od światła, system RRS jest wyposażony w czarną osłonę z prostokątnym otworem w centrum, w którym można umieścić sondę laserową. Obudowa zakrywa próbkę/przekrój organu, z którego pobierane są pomiary RRS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wykres spektroskopii Ramana porównujący optymalne i suboptymalne sygnały mitochondrialne wraz z tabelą danych.
Rysunek 3: Przykładowe przebiegi i wskaźniki kontroli jakości dla sygnałów o jakości suboptymalnej oraz optymalnej. Sygnał szczątkowy (szum) oznaczono pomarańczowym nawiasem, a sygnał mitochondrialny zielonym nawiasem. (A>) Przykładowy przebieg suboptymalnego sygnału Ramana. Sygnał szczątkowy jest zbyt duży, aby odróżnić go od sygnału mitochondrialnego. Piki widmowe są nierozpoznawalne w całym zmierzonym sygnale. (B>) Przykładowy przebieg optymalnego sygnału Ramana. Sygnał mitochondrialny jest wyraźnie większy i odróżnialny od sygnału szczątkowego. Piki widmowe z uzyskanego pomiaru są rozróżnialne. (C>) Wskaźniki QC uzyskane dla każdego sygnału. Ogólnie całkowity sygnał uzyskany w odczycie suboptymalnym jest mniejszy niż w odczycie optymalnym. W optymalnym zapisie zmierzono więcej sygnału mitochondrialnego w porównaniu do zapisu suboptymalnego, przy czym sygnał mitochondrialny stanowił odpowiednio 17% i 14% sygnału całkowitego. Sygnał w odczycie optymalnym zmierzono z błędem 4,3%, w przeciwieństwie do błędu 18,5% w odczycie suboptymalnym. Podobnie niewyjaśniony sygnał szczątkowy stanowi 11% sygnału całkowitego w zapisie suboptymalnym, podczas gdy w zapisie optymalnym stanowi on 3,6%. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Ocena stanu mitochondriów z wykorzystaniem RRS

UWAGA: Technologię rezonansowej spektroskopii Ramana (RRS) wykorzystano do opracowania wskaźnika żywotności mitochondriów (3RMR), który określa żywotność przeszczepianych narządów. Celem niniejszego badania jest wykazanie, w jaki sposób zmiany w natlenieniu – a co za tym idzie, w oddychaniu komórkowym – odzwierciedlają się w trendach 3RMR w porównaniu z tradycyjnymi biomarkerami uszkodzeń, takimi jak mleczan i K+. Zastosowano tutaj test stresu tlenowego, w którym po 5 min ciągłej perfuzji przepływ utlenionego perfuzatu zostaje wstrzymany na 5 min, a następnie wznowiony na kolejne 5 min. W trakcie testu stresowego pobierane są pomiary RRS oraz próbki perfuzatu z dopływu i odpływu.

  1. Pobieranie wątroby:
    1. Uśpić zwierzęta w komorze indukcyjnej, stosując izofluran w stężeniu 3%–5%. Nadmiar par przefiltrować przez węgiel aktywny.
    2. Wykonaj całkowitą hepatektomię u samców szczurów linii Lewis (150 g). Przewiąż odgałęzienia żyły wrotnej. Wstrzyknij 50 J heparyny sodowej przez żyłę główną dolną (IVC). Podczas operacji wprowadź kaniulę z cewnikiem 16 G do żyły wrotnej i przepłucz wątrobę 50 ml soli fizjologicznej.
    3. Umieścić pobrane wątroby w naczyniu Petri z 30 ml roztworu University of Wisconsin (UW) i przechowywać w warunkach chłodzenia (na lodzie).
  2. Subnormotermiczny konfiguracja maszyny do perfuzji (SNMP) i pomiary rezonansowego rozpraszania Ramanowskiego:
    1. Przygotuj urządzenie RRS zgodnie z wcześniejszym opisem. Ustaw Protokół otrzymywania akomórkowej wątroby szczura w oprogramowaniu sterującym spektrometrem, które automatycznie ustawia tryb szerokości do szerokość adaptacyjna, średnia długość do 180 oraz docelowe sigma do 1,5. Wybiera ono również 3RMR i Fluorescencja jako parametry pomiarowe, a także Tylko mitochondria jako bibliotekę regresyjną. Ustaw tryb akwizycji na tryb ciągły.
    2. Skonfiguruj system SNMP zgodnie z opisem zamieszczonym w innym miejscu18.
      1. W skrócie, upewniono się, że układ perfuzyjny składał się z komory perfuzyjnej, pompy perystaltycznej, membranowegotlenatora oraz pułapki pęcherzykowej.
      2. Podawaj tlen w mieszaninie atmosferycznej (95% O22 oraz 5% CO22); utrzymać pO₂2 między 400 a 500 mmHg. Monitorować ciśnienie wewnątrzwątrobowe za pomocą czujnika ciśnienia i utrzymywać je w zakresie 3–5 mmHg. Pobierać próbki przez porty pobiercze.
    3. Po skonfigurowaniu oprogramowania i systemu perfuzji należy połączyć kaniulę wprowadzoną do żyły wrotnej (PV) z rurką doprowadzającą perfuzatora. Organ, perfuzat oraz układ perfuzyjny należy utrzymać w temperaturze pokojowej (21 °C), bez użycia łaźni wodnej.
    4. Podawać perfuzat do narządu przez kaniulę w żyle wrotnej (PV) przy użyciu pompy perystaltycznej.
      1. Aby przygotować perfuzat, wymieszać 500 ml pożywki Williams' Medium bez czerwieni fenolowej z 5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 12 mg rozpuszczalnego w wodzie deksametLzonu, 5 ml penicyliny-streptomycyny, 5 ml L-glutaminy, 2.5 µL insuliny oraz 1000 J heparyny.
      2. Mieszać wszystkie składniki na mieszalce magnetycznej przez około 20 minut lub do czasu całkowitego rozpuszczenia wszystkich komponentów. Zwiększyć przepływy perfuzyjne, aby uzyskać ciśnienie w zakresie 3–5 mmHg.
    5. Następnie umieść źródło laserowe RRS w uchwycie sondy i ustaw je 1 cm nad największym płatem wątroby, jak najbliżej żyły wrotnej (PV). Wstrzymaj przepływ perfuzyjny w 5. minucie (T5) i wznowić po 10 min (T10). Przeprowadzić test obciążeniowy w 15. minucie (T15).
    6. Wykonuj pomiary RRS przez cały czas trwania testu wysiłkowego; mierz przepływ wlotowy i wylotowy co 5 min, zaczynając od T00 (Rysunek 4). Wykreśl wartości 3RMR oraz K odpływu+ poziomy i poziomy mleczanu dla T0, T5, T10, T15 (n = 3) (Rysunek 5).
    7. Oblicz tempo zużycia tlenu (OCR) w czasie T0, T5, T10, T15 poprzez pomnożenie ciśnienia parcjalnego tlenu na wlocie/wylocie (pO2) z współczynnikiem rozpuszczalności tlenu w plazmie (0,00314). Wykreśl OCR dla T0, T5, T10, T15 (Rysunek 5).
      UWAGA: Przykładowe widma rezonansowego rozpraszania Ramanowskiego dla perfundowanych (T5), niedokrwienny (T10), i poddano reperfuzji (T15) stany z jednej wątroby przedstawiono (Rycina 6)

Schemat procesu perfuzji wątroby przedstawiający konfigurację urządzenia dla okresów niedokrwienia i reperfuzji.
Rysunek 4: Schemat przedstawiający przebieg eksperymentu. U samic szczurów rasy Lewis wykonano całkowitą hepatektomię. Pobraną wątrobę poddano subnormotermicznej perfuzji maszynowej, dostarczając utleniony perfuzat przez pierwsze 5 min. Perfuzat wpływa do wątroby przez żyłę wrotną i krąży w obiegu dzięki pompie perystaltycznej (przepływ perfuzji zaznaczony niebieskimi strzałkami). Utlenioną perfuzję zatrzymano na kolejne 5 min w punkcie T5 i wznowiono na kolejne 5 min w punkcie T10. Pomiary 3RMR wykonywano podczas całego testu obciążeniowego (przedstawionego jako laser). Próbki perfuzatu pobierano w punktach T0, T5, T10 i T15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Świeże wątroby poddano okresom niedokrwienia i reperfuzji z wykorzystaniem testu stresu tlenowego. Następnie zmiany 3RMR w czasie rzeczywistym podczas testu stresowego porównano z szybkością zużycia tlenu, poziomem mleczanu oraz potasu w odpływie, uzyskanymi z analizy perfuzatu w punktach T0, T5, T10, T15. W warunkach prawidłowych wartości 3RMR powinny mieścić się w przedziale od 10% do 30% (Rysunek 5A). Zgodnie z oczekiwaniami, wartości 3RMR w pun...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejsze badanie wskazuje na nieinwazyjną, czasowo rzeczywistą i wysoce czułą metodę ilościowego określania stanu zdrowia mitochondriów, wykorzystującą przenośny system spektroskopii rezonansowej Ramana, który składa się z lasera w kompaktowej sondzie, połączonej za pomocą kabla światłowodowego z pompą laserową. Metoda ta wykorzystuje laser o długości fali 441 nm do pobudzania mitochondriów, które wytwarzają unikalne sygnały spektralne w zależności od ich stopnia utlenienia. Tym samym, spektroskopia rezonansowa Ramana j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują konflikt interesów. S.N.T i P.R. mają wnioski patentowe dotyczące niniejszego badania. P.R. jest pracownikiem i udziałowcem Pendar Technologies. Interesy S.N.T są zarządzane przez MGH i Partners HealthCare zgodnie z ich polityką konfliktu interesów. Interesy J.N.K są zarządzane zgodnie z polityką konfliktu interesów BCH. W niniejszym badaniu wykorzystano następujące opatentowane technologie: US2020/0281474A1 In vivo monitoring of cellular energetics with Raman spectroscopy (application). Złożono dodatkowe wnioski patentowe dotyczące zastosowania spektroskopii Resonance Raman w okulistyce, ocenie żywotności tkanek i ocenie obrażeń poparzeniowych, gdzie R.J. jest również wynalazcą.  

Podziękowania

To dzieło zostało wsparte przez hojne fundusze przekazane S.N.T. przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (R01DK134590). Z wdzięcznością przypominamy również o finansowaniu S.N.T przez amerykański Narodowy Instytut Zdrowia (K99/R00 HL1431149; R01HL157803; R24OD034189), Narodową Fundację Nauki (EEC 1941543), Fundację Rodziny Polsky oraz Shriners Children’s Boston (Grant #BOS-85115). Ponadto z wdzięcznością przypominamy o finansowaniu dla R.J. przez Grant #LIFER23-263034 od Amerykańskiego Stowarzyszenia na rzecz Badań nad Chorobami Wątroby. Autorzy wyrażają głębokie wdzięczność za wsparcie ekspertów z Patologii Core na Harvard Medical School za badania histologiczne. Chcielibyśmy również podziękować dr Robertowi Balabanowi i dr Armel Femnou z Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi NIH za ich wiedzę w dziedzinie energetyki mitochondrialnej oraz za ważne wsparcie w opracowaniu biblioteki RRS pojedynczych kompleksów mitochondrialnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
16 G Catheter BD Insyte Authoguard381454Używane do nakłucia żyły wrotnej
Activated CharcoralVet Equip Vapor Guard Activated Charcoal931401Używane do filtrowania nadmiaru pary podczas anestezji
BSA Sigma-Aldrich A7906Skład perfuzyjnego roztworu
Bubble Trap Radnoti130149
DexamethasoneSigma-AldrichD2915Skład perfuzyjnego roztworu
Glutamax Thermo Fisher Scientific35050061Skład perfuzyjnego roztworu
Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G)Fisher Scientific 13-200-292Używane do przepływu perfuzyjnego roztworu przez wątrobę
Masterflex peristaltic pumps Cole Parmer, Vernon Hill, IL7528-30 Używane do przepływu perfuzyjnego roztworu przez wątrobę
Membrane Oxygenator Radnoti130144Używane do utleniania perfuzyjnego roztworu. 
Penicillin-streptomycinSigma-AldrichP4458Skład perfuzyjnego roztworu
RAPIDPoint 500 Blood Gas SystemSiemens Healthineers41115805Do analizy gazów krwi
Resonance Raman System  Pendar TechnologiesA4D441Skontaktuj się z Pendar Technologies w sprawie zapytań dotyczących tego produktu

Bibliografia

  1. San-Millán I. The key role of mitochondrial function in health and disease. Antioxidants (Basel). 2023;12(4):782.
  2. Rossmann MP, et al. Mitochondrial function in development and disease. Dis Model Mech. 2021;14(6):dmm048912.
  3. Chen W, Zhao H, Li Y. Mitochondrial dynamics in health and disease: mechanisms and potential targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:333.
  4. Acin-Perez R, et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. EMBO J. 2020;39(13):e104073.
  5. Sharma E, et al. Overview of methods that determine mitochondrial function in human disease. Metabolism. 2025;170:156300.
  6. Kowaltowski AJ, Abdulkader F. How and when to measure mitochondrial inner membrane potentials. Biophys J. 2024;123(24):4150-4157.
  7. Quinn KP, et al. Characterization of metabolic changes associated with the functional development of 3D engineered tissues by noninvasive, dynamic measurement of individual cell redox ratios. Biomaterials. 2012;33(21):5341-5348.
  8. Perry DA, et al. Responsive monitoring of mitochondrial redox states in heart muscle predicts impending cardiac arrest. Sci Transl Med. 2017;9(408):ean0117.
  9. Nguyen KT, et al. Mitochondrial hyperoxidation contributes to warm ischemia-reperfusion injury in rat and pig livers. Commun Med. 2026;6:307.
  10. de Vries RJ, et al. Noninvasive quantification of the mitochondrial redox state in livers during machine perfusion. PLoS One. 2021;16(10):e0258833.
  11. Ajenu EO, et al. Advancing assessment methods for human cardiac grafts during normothermic machine perfusion. Transplantation. 2025;110(2):e374-e384.
  12. Thomas AR, et al. Resonance Raman spectroscopy detects ischemia in experimental coarctation of the aorta in a rodent model. J Cardiovasc Transl Res. 2025;18:566-573.
  13. Cakir B, et al. In vivo noninvasive mitochondrial redox assessment of the optic nerve head to predict disease. PNAS Nexus. 2023;2(5):pgad148.
  14. Jain R, et al. Real-time monitoring of mitochondrial oxygenation during machine perfusion using resonance Raman spectroscopy predicts organ function. Sci Rep. 2024;14:7328.
  15. Covian R, Edwards LO, Balaban RS. Effect of the mitochondrial membrane potential on the absorbance of the reduced form of cytochrome c oxidase. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 2024;1865(3):149048.
  16. Ljungdahl PO, Pennoyer JD, Robertson DE, Trumpower BL. Purification of highly active cytochrome bc1 complexes from phylogenetically diverse species by a single chromatographic procedure. Biochim Biophys Acta. 1987;891(3):227-241.
  17. Covian R, Chess D, Balaban RS. Continuous monitoring of enzymatic activity within native electrophoresis gels: application to mitochondrial oxidative phosphorylation complexes. Anal Biochem. 2012;431(1):30-39.
  18. Haque O, et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology. 2020;8(1-2):27-36.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

MedycynaWydanie 234Wydanie 234Wartość pustaWydanieMitochondriażywotność organustan zdrowia mitochondriówPrzeszczep wątrobystany redoks mitochondriów
W czasie rzeczywistym, nieinwazyjna ocena funkcji mitochondrialnych za pomocą spektroskopii rezonansowego rozpraszania Ramana
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.