Budowa organoidów raka piersi człowieka i ocena ilościowa uszkodzeń DNA wywołanych doksorubicyną oparta na metodzie Comet Assay

Podsumowanie

Ten protokół ustanawia model ludzkich organoidów raka piersi (BCO) i ilościowo ocenia uszkodzenie DNA wywołane przez doksorubicynę za pomocą testu kometowego. Wykazano wykonalność stosowania testu kometowego do BCOs oraz zapewniono możliwość reprodukcji, skalowalności i operacyjnego przepływu pracy w celu wykrycia uszkodzenia DNA wywołanego przez DOX w BCOs.

Streszczenie

Rak piersi jest najczęstszą złośliwą chorobą wśród kobiet na całym świecie i wykazuje znaczną heterogeniczność. Doksorubicyna (DOX) jest szeroko stosowana w leczeniu raka piersi, a jej główny mechanizm działania polega na indukcji podwójnych łamań DNA i wywoływaniu śmierci komórkowej. W tym protokole ustanowiono ludzki model BCO w celu ilościowej oceny uszkodzenia DNA indukowanego przez DOX. Pierwotne komórki raka piersi zostały izolowane z tkanek nowotworowych pochodzących od pacjentów poprzez mechaniczne i enzymatyczne dysocjację, a następnie hodowane w trójwymiarowym macierzy w celu wygenerowania BCO. Organoidy zostały następnie poddane obróbce 8 μM DOX przez 2 godziny. Uszkodzenie DNA oceniono po 2 godzinach leczenia. Po leczeniu, organoidalne zostały oddzielone na pojedyncze komórki, zatopione w niskowrzejącej agarowie i poddane elektroforezie w warunkach zasadowych. Po elektroforezie, wzorce migracji DNA były widoczne jako struktury kometowe pod mikroskopem fluorescencyjnym i ilościowo analizowane za pomocą oprogramowania OpenComet, aby określić procent DNA ogona (% DNA ogonu). Test kometa pomyślnie wykrył uszkodzenie DNA w BCO. W porównaniu z grupą kontrolną, BCO eksponowane na 8 μM DOX przez 2 godziny wykazywały wydłużone ogony komet po dysocjacji organoidów i elektroforezie. Analiza ilościowa wykazała, że procent DNA ogona był znacznie wyższy w grupie leczonych, co wskazuje na indukcję uszkodzenia DNA. Ta bardzo wrażliwa metoda wspiera badania toksykologiczne i farmakodynamiczne DOX i zapewnia solidną platformę techniczną do oceny uszkodzenia DNA w systemach BCO pochodzących od pacjentów.

Wprowadzenie

Rak piersi jest złośliwym nowotworem, który powstaje z tkanek nabłonkowych piersi z powodu zmian genetycznych, dysfunkcji hormonalnej i innych czynników patogennych. Jest to najczęstsza nowotwór złośliwy u kobiet na całym świecie i wykazuje unikalne wzorce epidemiologiczne oraz znaczną heterogeniczność wewnątrz guzów^1,2. DOX, pierwszoliniowy środek chemioterapeutyczny, wnika między łańcuchy DNA, hamuje aktywność topoizomerazy II i indukuje pojedyncze uszkodzenia DNA, co ostatecznie prowadzi do apoptozy komórek nowotworowych³. Tradycyjne dwuwymiarowe układy hodowli komórkowej są ograniczone w ich zdolności do odtworzenia złożonej organizacji komórkowej i heterogeniczności guzów piersi. W przeciwieństwie do nich, BCOs są trójwymiarowymi strukturami pochodzącymi z tkanek nowotworowych pacjentów, które zachowują kluczowe cechy oryginalnego guza, w tym skład komórkowy, strukturę tkankową i fenotypy molekularne. Co ważne, modele BCO wykazują wysoką zgodność z klinicznymi odpowiedziami na leki; dla danego środka terapeutycznego, zgodność negatywnej odpowiedzi osiąga 100%, a zgodność pozytywnej odpowiedzi osiąga 98% między BCOs a odpowiednim pacjentem⁴.

BCO służą jako zaawansowany model in vitro, który odtwarza kluczowe cechy strukturalne i funkcjonalne pierwotnych guzów i były szeroko stosowane do badania onkogenezy, progresji choroby i oporności na terapię⁵. Inicjacja guza piersi zazwyczaj polega na współpracy wielu genów supresorowych, takich jak TP53, PTEN, RB1 i NF1, ponieważ zmiany w pojedynczym genie nie są wystarczające do wywołania złośliwej transformacji normalnego nabłonka piersi. Proces ten jest towarzyszony utratą polaryzacji komórkowej, dezorganizacją architektoniczną i niekontrolowanym namnażaniem się^6,7,8.

Test kometowy (także zwany elektroforezą jednokomórkową w żelu, SCGE) jest klasyczną metodą oceny uszkodzeń DNA na poziomie pojedynczej komórki. Technikę tę po raz pierwszy wprowadzili Rydberg i Johanson w 1978 roku, a następnie udoskonalili Ostling i Johanson, którzy ustanowili neutralny test kometowy do wykrywania podwójnych uszkodzeń DNA. W 1988 roku Singh i jego współpracownicy wprowadzili warunki elektroforetyczne w środowisku zasadowym, umożliwiając wykrywanie pojedynczych uszkodzeń DNA, miejsc bez zasady i miejsc wrażliwych na zasady, co znacznie poszerzyło zastosowanie testu⁹. Podstawową zasadą testu kometowego jest to, że ruchliwość elektroforetyczna DNA zależy od integralności DNA. Po osadzniu w żelu agarozy i lizie w celu usunięcia błon komórkowych i białek, uszkodzone fragmenty DNA migrują w kierunku anody podczas elektroforezy, tworząc „ogon komety”, podczas gdy nienaruszony DNA pozostaje w pobliżu miejsca załadunku, tworząc „głowę komety”¹⁰. Parametry takie jak długość ogona, procentowa zawartość DNA w ogonie (% DNA w ogonie) i moment ogonowy Olive pozwalają na półilościową lub ilościową ocenę uszkodzeń DNA, a projekty eksperymentów przeprowadzanych w różnych odstępach czasowych mogą być wykorzystane do oceny zdolności naprawy DNA. Ze względu na wysoką wrażliwość, niskie wymagania dotyczące wielkości próbek i stosunkowo prostą procedurę, test kometa został szeroko wykorzystany w toksykologii genetycznej, biologii raka i badaniach nad reakcją na leki, szczególnie w ocenie uszkodzeń DNA wywołanych przez środki chemioterapeutyczne i radioterapię, a także mechanizmach odporności komórek nowotworowych. Test jest bardzo wrażliwy na warunki eksperymentalne i zmienność proceduralną, a odtwarzalność i porównywalność między laboratoriami zależą od standaryzowanych przepływów pracy i zautomatyzowanej analizy obrazów¹¹. W ostatnich latach włączenie oprogramowania do obrazowania wysokowydajnego, modeli organoidalnych i systemów edycji genów jeszcze bardziej zwiększyło przydatność testu kometowego w badaniach nad uszkodzeniami i naprawą DNA oraz w ocenie odpowiedzi na leczenie nowotworów.

W porównaniu z tradycyjnymi testami uszkodzeń DNA, takimi jak immunofluorescencyjne barwienie γ-H2AX czy cytometria przepływowa, test kometa zapewnia bezpośredni sposób ilościowej oceny fizycznych uszkodzeń łańcuchów DNA na poziomie pojedynczej komórki. Ponieważ ta metoda działa niezależnie od specyficznego ekspresji białek czy specyficzności przeciwciał, skutecznie eliminuje fałszywie negatywne wyniki wynikające z różnic w stanach cyklu komórkowego lub aberacji w szlakach odpowiedzi na uszkodzenia DNA¹². Co więcej, w przeciwieństwie do konwencjonalnych dwuwymiarowych kultur monowarstwowych, trójwymiarowy model organoidalny stosowany w tym badaniu wierniej odtwarza złożoną przestrzenną architekturę, interakcje z macierzą pozakomórkową i gradienty przenikania leków guzów in vivo. Podczas gdy tradycyjne modele linii komórkowych często nadmiernie przeceniają genotoksyczność z powodu sztucznego nadmiernego narażenia na leki, platforma organoidowa ocenia uszkodzenia DNA wywołane przez DOX w mikrośrodowisku, które bardzo dobrze odbija war

Protokół

Badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyczny Szpitala Ludowego Suzhou Wuzhong (Numer zgody 20251w03) i przeprowadzone zgodnie z normami etycznymi medycyny. Wszystkie osoby biorące udział w badaniu wyraziły pisemną zgodę na uczestnictwo po zapoznaniu się z pełnymi informacjami.

1. Budowa ludzkich BCOs

1. Transport i przechowywanie tkanki nowotworu piersi
   1. Nawcześnie umieść świeżo usuniętą ludzką tkankę nowotworu piersi w uprzednio schłodzonej substancji do konserwacji tkanki (4 °C).
      UWAGA: Upewnij się, że tkanka pozostaje w całości zanurzona podczas transportu.
2. MECHANICZNE rozdzielania tkanki nowotworu piersi
   1. Przeprowadź wszystkie procedury w szafie biobezpieczeństwa. Umieść tkankę nowotworu piersi w 6 cm naczyniu hodowlanym i usuń widoczny tkankę tłuszczową za pomocą sterylnych skalpeli i kleszczy.
   2. Dodaj 3 ml PBS do 6 cm naczynia hodowlanym i przemyj tkankę trzykrotnie.
   3. Zasysz i wyrzuć fosforanowanego buforu sólowego (PBS).
   4. Powtórz kroki 1.2.2 i 1.2.3 dwie dodatkowe razy.
   5. Przenieś tkankę nowotworu piersi do 1,5 ml mikrocentryfugowego probówki za pomocą sterylnych chirurgicznych nożyczek i pokrój tkankę na małe fragmenty o wielkości około 2 x 5 mm.
3. ENZYMATYCZNE trawienie tkanki nowotworu piersi
   1. Dodaj 1 ml substancji do rozdzielania organoidalnego do 1,5 ml mikrocentryfugowego probówki i przenieś zawiesinę do 15 ml probówki do wirowania.
   2. Dodaj dodatkowe 8 ml substancji do rozdzielania organoidalnego do 15 ml probówki do wirowania.
   3. Inkubuj 15 ml probówkę do wirowania w 37 °C przez 40 min.
   4. Agituj probówkę na szekerze przez 1 min co 10 min podczas trawienia.
   5. Po 40 min dodaj 6 ml PBS do 15 ml probówki do wirowania aby zakończyć trawienie.
      UWAGA: Dodaj PBS bezpośrednio do mieszaniny trawiennej aby zatrzymać aktywność enzymatyczną.
4. Izolacja pierwotnych komórek nowotworu piersi i osadzanie organoidalne
   1. Umieść 100 μm sitko komórkowe na 50 ml probówce do wirowania.
   2. Dodaj 1 ml pełnego medium do hodowli komórek na sitko komórkowe.
      UWAGA: Przygotuj pełne medium do hodowli komórek za pomocą 500 ml śródkultury podstawowej, 50 ml surowicy wołowej płodowej i 5 ml penicyliny-streptomycyny.
   3. Zasysz 1 ml strawionej zawiesiny tkankowej z 15 ml probówki do wirowania i nałóż ją na sitko komórkowe.
   4. Powtórz krok 1.4.3 do momentu, gdy cała zawiesina przejdzie przez sitko.
   5. Spłucz sitko komórkowe dodatkowym 1 ml pełnego medium do hodowli komórek.
   6. Wiruj 50 ml probówkę do wirowania w 350 x g przez 3 min w 4 °C.
   7. Zasysz i wyrzuć nadstan.
   8. Resuspenduj złogi komórek w 1 ml pełnego medium do hodowli komórek i przenieś je do 1,5 ml mikrocentryfugowego probówki.
   9. Wiruj zawiesinę w 370 x g przez 5 min w 4 °C.
   10. Zasysz i wyrzuć nadstan.
   11. Dodaj 100 μl macierzy podstawowej błony do 1,5 ml mikrocentryfugowego probówki i dokładnie wymieszaj.
       UWAGA: Utrzymaj gęstość siewu 15 000-20 000 pierwotnych komórek nowotworu piersi na 100 μl macierzy podstawowej błony (200 komórek/1 μl). To utrzymuje parakrynowe sygnałowanie międzykomórkowe dla mocnego tworzenia się sfer i zapobiega centralnej martwicy.
   12. Rozdaj 25 μl zawiesiny z macierzą podstawową błony-komórki do każdego otworu 24-otworowego naczynia.
   13. Odwróć 24-otworowe naczynie i inkubuj je w 37 °C przez 10 min aby pozwolić na polimeryzację macierzy podstawowej błony.
   14. Dodaj 500 μl medium do hodowli BCO do każdego otworu 24-otworowego naczynia.
       UWAGA: Hoduj BCO przy użyciu komercyjnego gotowego do użycia medium o własnym składzie.
   15. Inkubuj naczynie w wilgotnym inkubatorze w 37 °C z 5% CO2.
       UWAGA: Po osadzenie w macierzy pozakomórkowej, BCO były hodowane przez 7-10 dni aby pozwolić na właściwy rozwój struktury 3D. Organoidy uważano za w pełni ustabilizowane i gotowe do leczenia lekami, gdy wykazywały gęste, sferyczne morfologię 3D i osiągnęły średnicę około 50-100 μm, bez oznak centralnej martwicy. Gdy spełnione zostały te kryteria końcowe, BCO były następnie leczone DOX.

2. Wykrywanie uszkodzeń DNA wywołanych przez DOX w BCOs za pomocą testu kometowego

Eksperymentalny protokół został przystosowany z ustalonych wytycznych i dalej zoptymalizowany aby pasować do konkretnych warunków laboratoryjnych¹⁴.

Wyniki

Tworzenie BCO

W niniejszym badaniu pomyślnie wytworzono organoidy raka piersi z próbek pierwotnej tkanki nowotworowej. Na początkowym etapie hodowli wyraźnie zaobserwowano liczne pojedyncze komórki lub małe skupiska komórek, które były rozmieszczone w sposób stosunkowo rozproszony i nie wykazywały wyraźnej trójwymiarowej organizacji sferycznej. Niektóre komórki prezentowały morfologię okrągłą lub prawie okrągłą, co wskazuje, że komórki pochodzące z nowotworu przeżyły i przysto...

Dyskusja

Test komety reprezentuje znaczący postęp w metodach oceny genotoksyczności. Dzięki swojej rozdzielczości na skalę pojedynczych komórek i bezpośredniej wizualizacji wzorców uszkodzeń DNA na podstawie migracji elektroforetycznej, ta technika oferuje wyraźne zalety w porównaniu z konwencjonalnymi testami genotoksyczności¹⁵.

Kilka kluczowych etapów podczas procedury eksperymentalnej wpływa na odtwarzalność i interpretację danych. Po pierwsze, warunki lizy i czas trwania liz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
100 μm cell strainer	BIOLOGIX	15-1100
15 mL centrifuge tubes	BIOFIL	None	15 mL centrifuge tubes
1 mL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808633
200 μL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808214
24-well plates	Corning Incorporated	3524
50 mL centrifuge tubes	BIOFIL	None	50 mL centrifuge tubes
Breast Cancer Organoid Kit Plus	Mogenel Biotechnology	MA-0807T011LP	BCO culture medium
Comet Slide	R&D SYSTEMS	4250-050-03
Dry-bulb thermostat	Hangzhou Ruiyi Science and Technology Trading Co., Ltd.	DH100-2	Heating block
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	gibco	C11995500BT	Complete cell culture medium
EDTA	TREVIGEN	4250-050-04
Electric Constant-Temperature Water Bath	Shanghai Mulang Instrument Manufacturing Co., Ltd.	MSY-24	Water bath
Electrophoresis apparatus	BIO-RAD	1645052
Fetal bovine serum	EallBio	03.U16001DC
Fluorescence microscope	WEIDA	IM-300LD4
Forceps	Beyotime	FS019
GelRed	Beyotime	D0140
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		Statistical analysis software
ImageJ	National Institutes of Health, NIH	1.54p	Image processing software / image
LMA garose	R&D SYSTEMS	4250-050-02	Low-melting-point agarose
Low-temperature high-speed centrifuge	Anhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTD	KDC-40	Centrifuge
Lysis Solution	TREVIGEN	4250-050-01	Lysis solution
Matrigel	Mogenel Biotechnology	82755	The basement membrane matrix
NaOH	DAMAO	1588
OpenComet software	Open-source ImageJ plugin, National University of Singapore, Singapore	v1.3.1
Organoid Dissociation Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L01L
Penicillin – Streptomycin	Beyotime	CO22
Phosphate-buffered saline (1x PBS)	Fdbio Science Biotech Co.,Ltd	FD7032	PBS
Pipettes	Rainin	Pipet-Lite XLS
Scissors	Beyotime	FS001
Tissue Digestion Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L06L/MB-0818L06S	Organoid dissociation solution