Ilościowe obrazowanie żywych komórek kształtu jądra i dynamiki chromatyny podczas rozwoju oraz stresu środowiskowego u korzenia Arabidopsis thaliana

Summary

Proces ten wykorzystuje mikroskopię konfokalną w połączeniu z fluorescencjonalnie oznakowaną linią markerową jądra i chromatyny w Arabidopsis thaliana , aby jednocześnie rejestrować dynamikę jądra i chromatyny w korzeniach Arabidopsis oraz badać zmiany w tych dynamikach w odpowiedzi na sygnały rozwojowe i środowiskowe.

Abstract

Jądro jest charakterystycznym organellem organizmów eukariotycznych. W przeciwieństwie do klasycznego podręcznikowego spojrzenia na jądra statyczne, kształt jądra jest dynamiczny w komórkach żywych. Zmieniony lub zdeformowany kształt jądra jest cechą charakterystyczną raka w komórkach zwierzęcych oraz stresu środowiskowego u roślin. Białka otoczki jądrowej oddziałują z chromatyną, regulując ekspresję genów. Niestety, niewiele wiadomo o wpływie stresu abiotycznego na kształt, ruch i dynamikę chromatyny jądrowej. Aby stawić czoła temu problemowi, opracowaliśmy pipeline wykorzystujący mikroskopię konfokalną i oprogramowanie do śledzenia cząstek do ilościowego określania dynamiki jądrowej i chromatyny w korzeniach Arabidopsis pod kontrolą i warunkami stresu abiotycznego. Ta metoda obrazowania konfokalnego wykorzystuje podwójną fluorescencyjną linię markerową – białko otoczki jądrowej i chromatynę – do przeprowadzenia obrazowania żywych komórek korzenia w modelowej roślinie Arabidopsis thaliana w warunkach kontrolowanych i pod stresem solnym. Te nagrane filmy są analizowane w celu ilościowego określenia dynamiki jądrowej i chromatynowej za pomocą otwartoźródłowego oprogramowania do przetwarzania obrazu Fiji/ImageJ przy pomocy wtyczki TrackMate. Aby zweryfikować tę metodę, zobrazowaliśmy i zmierzyliśmy ruch chromatyny w korzeniach kontrolnych i pod stresem solnym, ujawniając spadek prędkości chromatyny w warunkach stresu solnego. Metoda ta umożliwia ilościowe obrazowanie kształtu jąder korzenia i dynamiki chromatyny w żywych komórkach podczas rozwoju roślin oraz stresu środowiskowego, umożliwiając analizę zmian w dynamice jądrowej i chromatyny spowodowanych stresorami abiotycznymi.

Introduction

Kształt jądra różni się między typami komórek i podczas rozwoju w korzeniach Arabidopsis thaliana ^1,2. Na przykład kształt jądra jest kulisty w aktywnie dzielących się obszarach meristematycznych. W przeciwieństwie do regionu merstematycznego, jądra w strefie przejścia korzenia i wydłużenia są mniej kuliste. Ponadto jądra w komórkach zróżnicowanych, takie jak włoski korzeniowe, przechodzą przez zwartą podstawę włosków korzeniowych i są aktywnie przekształcane w wydłużone jądra ^3,4,5. Dynamiczne zmiany kształtu i ruchu jądra są kluczowe dla funkcjonowania komórki ^6,7. Defekty w kształcie jądra prowadzą do upośledzenia funkcjonalnego, takiego jak zmniejszony ruch jądrowy ^1,3. W komórkach ssaków zmiany kształtu komórek i jąder są bezpośrednio powiązane ze zmianami w ekspresji genów i syntezie białek⁸.

Podczas interfazy DNA komórki jest organizowane jako chromatyna. DNA w chromatynie skupia się wokół histonów, które mogą zaciskać i rozluźniać DNA, zmieniając ekspresję. Podobnie, pozycjonowanie chromatyny względem otoczki jądrowej oraz bliskość obwodu jądrowego są również istotne dla ekspresji genów⁹. Stres środowiskowy, taki jak stres osmotyczny, zmienia kształt jądra, a w konsekwencji zmienia ekspresję zestawu genów wrażliwych na dotyk w korzeniach A. thaliana ¹⁰. W tym kontekście ważne jest badanie kształtu jądra i dynamiki chromatyny za pomocą obrazowania poklatkowego na żywych komórkach. Jednym z głównych aspektów dynamiki jądrowej jest szybkość, z jaką poruszają się jądra, ponieważ pozycja jądra w komórce napędza ekspresję genów, a przemianowanie jądra wymaga ruchu jądrowego¹¹. Szybkość ruchu chromatyny w jądrze jest równie istotna, ponieważ rozmieszczenie genów w jądrze jest kluczowe dla określenia ekspresji^{genów 12}.

Wcześniej kształt jądra i dynamika chromatyny były obrazowane i ilościowo określane osobno; W rezultacie związek między kształtem jądrowym a dynamiką chromatyny pozostał niezbadany. Obrazując jednocześnie jądra i chromatynę, można obserwować ich położenie względem siebie, co może ujawnić ruchy takie jak rotacja jądrowa i wewnątrzjądrowa chromatyna, które w innym przypadku byłyby trudne lub niemożliwe do wykazania. W tej metodzie prezentujemy technikę obrazowania żywych komórek, umożliwiającą wizualizację i ilościową identyfikację kształtu jądra za pomocą fluorescencyjnie oznakowanego zewnętrznego białka otoczki jądrowej WPP (WIP1⁾¹³ oraz chromatyny za pomocą centromerowej dynamiki histonu H3 (CENH3)¹⁴ jednocześnie pod kontrolą i w warunkach stresu solnego, z celem umożliwienia analizy zmian w dynamice jądrowej i chromatynowej spowodowanych stresorami abiotycznymi. Aby umożliwić tę metodę, wygenerowaliśmy linię WIP1-GFP/CENH3-mRFP A. thaliana. Dodatkowo badaliśmy dynamikę chromatyny ilościowo, korzystając z wtyczki TrackMate otwartoźródłowego oprogramowania ImageJ/Fiji. Przetestowaliśmy podwójną linię fluorescencyjną i techniki dynamiki chromatyny przedstawione tutaj w warunkach naprężeń solnych i odkryliśmy zmiany w morfologii i dynamice ognisk centromerowych spowodowane warunkami naprężenia. Ta prosta i powtarzalna metoda jest idealna do wysokoprzepustowego śledzenia dynamiki jądrowej i chromatynowej u korzeni Arabidopsis w różnych warunkach stresu abiotycznego.

Protocol

1. Uprawa sadzonek A. thaliana

1. Przygotowanie podłoża wzrostu
   1. Włóż 800 ml czystej wody do zlewki o pojemności 1 L na talerzu do mieszania. Dodaj do zlewki baton mieszanki.
   2. Włącz mieszankę na 600 obr./min.
   3. Dodaj 10 g sacharozy do zlewki.
   4. Dodaj do zlewki 2,16 g podłoża do wzrostu Murashige i Skoog (MS).
   5. Dodaj 5 mg agaru do każdej z dwóch butelek po 1 L.
   6. Jedną butelkę oznacz jako "1/2 MS", a drugą "100 mM NaCl".
   7. Oznacz obie nakrętki taśmą autoklawową.
   8. Dodaj 5,84 g NaCl do butelki oznaczonej "100 mM NaCl".
   9. Napełnij zlewkę 1 litrem czystej wody.
   10. Wróć zlewkę do talerza do mieszania i poczekaj, aż sacharoza i SM się rozpuszczą.
   11. Wlej zawartość zlewki do cylindra o pojemności 1 L.
   12. Do każdej butelki nalej 500 ml zawartości cylindra stopniowanego.
   13. Medium wzrostu w autoklawie oraz 250 mL czystej wody z 60-minutowym cyklem ciekłym w temperaturze 121 °C.
       UWAGA: Podczas autoklawowania mediów i wody upewnij się, że pokrywy są luźne, aby uniknąć potencjalnych wybuchów.
   14. Ponownie przykręć pokrywki podłoża wzrostowego.
   15. Odwróć butelki medium wzrostowego 7 razy, aby zapewnić dokładne rozprowadzenie agaru.
   16. Przechowuj podłoże do wzrostu w lodówce o temperaturze 4°C do momentu potrzeby, a następnie podgrzej w mikrofalówce do upłynnienia.
2. Osadzanie płytek wzrostu i nasion
   1. W okapie przepływowym użyj pipety do pipety 50 mL medium wzrostu do każdej z dziesięciu płyt (rysunek 1A).
   2. Podczas zastygania nośnika czyść nasiona WIP1-GFP x CENH3-mRFP, zalewając je w rurce mikrowirówki 1 mL etanolu 70% przez 10 minut (Rysunek 1B).
      UWAGA: Podczas obsługi etanolu upewnij się, że w pobliżu nie ma otwartych płomieni.
   3. Po 10 minutach w okapie wyjmij etanol i dwukrotnie przepłucz nasiona 1 mL wody z autoklawu (Rysunek 1C).
   4. Gdy podłoże się zastygnie, użyj pipety o pojemności 1000 μL, aby umieścić oczyszczone nasiona na płytkach wzrostu w dwóch rzędach po 14 nasion na płytce (Rysunek 1D).
   5. Oznacz płytki markerem permanentnym i zabezpiecz taśmą mikroporową przed opuszczeniem okapu (Rysunek 1E).
3. Kiełkujące siewki
   1. Owiń płytki wzrostowe folią aluminiową i zimno warstwuj je w lodówce o temperaturze 4°C przez co najmniej 2 dni (rysunek 1F).
   2. Po zimnej stratyfikacji wyjmij talerze z lodówki i połóż je pionowo pod lampami wzrostowymi (~80 μmol/m²/s) przez co najmniej 4 dni (rysunek 1G).
   3. Przenieś połowę płyt do medium wzrostu NaCl o pojemności 100 mM w okapie przepływowym, następnie uszczelnij i oznacz płytki (rysunek 1H).
   4. Płyty uprawne pod lampami uprawniowymi przez 2 dni przed obrazowaniem (rysunek 1I).

2. Obrazowanie żywych komórek jąder korzeniowych i chromatyny A. thaliana

1. Przygotowanie preparatów
   1. Pipeta 60 μL czystej wody na szklaną szkiełkę (Rysunek 2A).
   2. Połóż do wody 3 6-dniowe siewki A. thaliana (Rysunek 2B).
   3. Na korzenie załóż osłonę o średnicy 22 mm × 22 mm #1.5, nie zakrywając liści (rysunek 2C).
2. Ustawienia mikroskopu konfokalnego
   1. Ustaw czas naświetlania lasera na 1000 ms (1 s).
   2. W łączniku laserowym ustaw laser 488 nm na 50% dla zielonego białka fluorescencyjnego (GFP), a 561 nm na 50% dla czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP) (rysunek 2D). Obraz z obiektywem 20× bez zoomu optycznego. Jeśli nagrywasz dłużej niż 10 minut, zmniejsz intensywność, aby ograniczyć fotobielenie.
   3. Ustaw wielkość kroku Z-slice na 0,3 μm.
   4. Ustaw interwał na 1 minutę, a całkowity czas trwania na 10 minut.
3. Obrazowanie
   1. Znajdź korzenie i wybierz do 20 fragmentów z, aby przechwycić obrazy 16-bitowe.
   2. Rozpocznij timelapse.
   3. Zapisz timelapse jako plik TIFF za pomocą kompresji bezstratnej.
   4. Przenieś dane do komputera do analizy.

3. Śledzenie i analiza danych

UWAGA: Potrzebna będzie wersja Fiji otwartego oprogramowania ImageJ (zalecana wersja 1.54), która zawiera preinstalowany TrackMate.

1. Inicjalizacja
   1. Otwórz ImageJ/Fiji.
   2. Kliknij i przeciągnij plik .vsi do głównego okna aplikacji ImageJ/Fiji (Rysunek 3A).
   3. Pojawi się komunikat zatytułowany Bio-Formats Import Options ; kliknij Ok w prawym dolnym rogu (Rysunek 3B).
   4. Pojawi się prompt zatytułowany Opcje serii Bio-Formats . Upewnij się, że Seria 1 jest wybrana i kliknij Ok w lewym dolnym rogu (Rysunek 3C).
      UWAGA: Plik może zająć minutę na załadowanie, zwłaszcza jeśli ma wiele warstw Z lub punktów czasowych.
   5. Po otwarciu obrazu (Rysunek 3D) rozdziel sygnały, przechodząc przez główne okno ImageJ, aby > obraz > rozdzielone kanały (Rysunek 3E). To utworzy dwa oddzielne okna: jedno dla jąder oznaczonych GFP, a drugie dla chromatyny oznaczonej RFP (Rysunek 3F).
2. Wstępne przetwarzanie chromatyny
   1. Określ, które z tych dwóch okien odpowiada chromatynie.
   2. Kliknij na okno chromatyny (Rysunek 3F) i zastosuj operację projektu Z, przechodząc przez główne okno ImageJ , aby obrazować > stosów > projektu Z (Rysunek 4A).
   3. Zmień typ projekcji na Maksymalną Intensywność i upewnij się, że Wszystkie ramki czasowe są aktywne, a następnie kliknij OK (Rysunek 4B).
   4. Otwórz menu kontrastu, naciskając Ctrl+Shift+C lub przechodząc po głównym oknie ImageJ, aby wyświetlić obraz > dostosować > jasność/kontrast (rysunek 4C).
   5. Przesuń drugi pasek (oznaczony Maximum) w lewo, aż chromatyna stanie się łatwo widoczna (rysunek 4D).
3. Chromatyna śledząca
   1. Przejdź do wtyczek (Rysunek 5A).
   2. Kliknij strzałkę w dół w menu wtyczek, aby przewinąć do opcji śledzenia (rysunek 5A).
   3. Kliknij śledzenie, a potem TrackMate.
   4. Pojawią się początkowe ustawienia. Potwierdź, że ustawienia kalibracji są poprawne, a następnie kliknij Dalej (Rysunek 5B).
   5. Wybierz Detektor progu i kliknij Dalej (Rysunek 5C).
   6. W oknie obrazu przejdź do ostatniej klatki timelapse (rysunek 5D).
   7. Obok progu intensywności kliknij Auto, a następnie kliknij Podgląd.
   8. Dostosuj próg intensywności i kliknij Podgląd. Wielokrotnie reguluj i podglądaj próg, aż podgląd obejmie całą chromatynę i minimalny szum, a następnie kliknij Dalej (Rysunek 5D).
   9. Początkowe wykrywanie progu nastąpi; kliknij Dalej (Rysunek 5E).
   10. Ręcznie zlokalizuj prog, aż będzie widoczna tylko chromatyna, a następnie kliknij Dalej (rysunek 5F).
   11. Ta strona umożliwia filtrowanie miejsc. Zignoruj to i kliknij Dalej (Rysunek 6A).
   12. Wybierz Prosty LAP tracker i kliknij Dalej (Rysunek 6B). Tracker LAP jest stosowalny, gdy śledzone obiekty nie łączą się ani nie rozdzielają.
   13. Ustaw maksymalną odległość łączącą na 5 mikronów, maksymalną odległość zamykania luki na 15 mikronów, a maksymalną odległość klatki zamykającej na 1. Kliknij "Następne" (rysunek 6C).
   14. Będzie śledzenie. Utwory pojawią się w oryginalnym oknie obrazu. Kliknij dalej (rysunek 6D).
   15. Ta strona umożliwia filtrowanie ścieżek. Naciśnij zielony przycisk + w lewym dolnym rogu, aby utworzyć filtr, następnie wybierz liczbę miejsc w trybie toru i naciśnij Auto (rysunek 6E).
   16. Upewnij się, że tryb jest ustawiony na Powyżej. To eliminuje plamy, które szybko pojawiają się i znikają.
   17. Kliknij dalej (rysunek 6E).
   18. Strona opcji wyświetlania pozwala eksportować dane jako plik csv. Na dole strony kliknij przycisk Tracks , a następnie Eksport do CSV (Rysunek 7A).
   19. Ta strona umożliwia wbudowane wykresy; zignoruj to i kliknij Dalej.
   20. Na ostatniej stronie zapisz wideo za pomocą nakładki Capture i naciśnij wykonaj. Kliknij go, a następnie przejdź do pliku > zapisz jako > GIF (Rysunek 7B).
4. Podstawowa analiza prędkości
   1. Otwórz CSV ścieżki w oprogramowaniu kalkulacyjnym.
   2. Usuń wszystkie kolumny oprócz TRACK_ID, POSITION_X, POSITION_Y, POSITION_T, FRAME i RADIUS.
   3. Miejsca na każdym utworze będą w nieodpowiedniej kolejności. Aby je uporządkować, najpierw zamroź cztery górne wiersze, a następnie utwórz nową kolumnę zatytułowaną TRACK_FRAME i skopiuj oraz wklej ten wzór do kolumny: =concatenate(A4, "_", if(E4>9, E4, concatenate("0", E4))).
   4. Wybierz kolumnę TRACK_FRAME , kliknij prawą myszy, a następnie kliknij Sortuj arkusz A–Z. Miejsca w każdym torze powinny być teraz w kolejności.
   5. Aby potwierdzić, że nie brakuje żadnych plam pośrodku ścieżek, stwórz nową kolumnę i użyj następującego wzoru: =if(E4>E3, E4-E3, "NA"). Upewnij się, że pierwsze miejsce każdego utworu zwraca "NA", a pozostałe 1.
   6. Utwórz kolumnę dla Speed (mikron/klatka) i wklej do niej następujący wzór: =if(H4="NA", "NA", sqrt((B4-B3)^2 + (C4-C3)^2)). Do obliczenia odległości między dwoma punktami wykorzystamy twierdzenie Pitagorasa.
   7. Aby przetłumaczyć to na prędkość (mikron/sekundę), stwórz nową kolumnę i wklej do niej następujący wzór: =IF(I5="NA", "NA", I5/(D5/E5)). To znajdzie sekundy/klatkę i odpowiednio przetransluje mikrony/klatkę.

Results

Obrazowanie żywych komórek otoczki jądrowej i dynamiki chromatyny
Wygenerowaliśmy podwójną linię markerów fluorescencyjną, która obejmuje zewnętrzne białko otoczki jądrowej WIP1-GFP oraz chromatynę centromerową CENH3-mRFP (Rysunek 8). Sadzonki 4-dniowe były przenoszone na płytę kontrolną lub 100 mM zawierające NaCl na 2 dni. Po 2 dniach inkubacji zaobserwowano wyraźne hamowanie wzrostu korzeni przy leczeniu solą, jak wcześniej zgłaszano,¹⁵. Zarów...

Discussion

Przedstawiona tutaj metoda jest idealna do śledzenia dynamiki chromatyny. W porównaniu z wcześniejszymi metodami obrazowania żywych komórek z osobnym obrazowaniem, jednoczesne obrazowanie jąder i chromatyny pozwala na badanie związku między dynamiką jądra i chromatyny. Może to ujawniać ruchy takie jak rotacja jądrowa czy wewnątrzjądrowa chromatyna, które w innym przypadku byłyby trudne do wykazania.

Jako metoda obrazowania żywych komórek najważniejsze jest posiadanie linii fluorescencyjnej z s...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
½ Media Murashige i Skoog (MS)	bioWorld	30630058
Taśmy mikroporowe 3M	Amazon	A-1530-0
Oprogramowanie do przejęcia	Olympus/Evident	CellSens
Agar	bioWorld	40100072
CENH3-mRFP	ABRC	CS799459
Slip pokrywkowy	Genesee	29-116
Szklana zlewka	Genesee	29-101
Image/Fiji	Open-source	https://imagej.net/software/fiji/downloads
Mikroskop	Olympus/Evident	IX83
Chlorek sodu	Fisher Scientific	BP358-212
Obracający się dysk	Yokogawa	CSU-W1
Kwadratowe szalki Petriego	Simport	26-275
Sacharoza	bioWorld	41900152
WIP1-GFP	ABRC	CS39987