Ilościowa obrazowanie komórek Arabidopsis thaliana in vivo w czasie rzeczywistym w celu analizy kształtu jądra komórkowego oraz dynamiki chromatyny podczas rozwoju i stresu środowiskowego korzeni

Podsumowanie

Ten proces wykorzystuje mikroskopi konfokalną w połączeniu z fluorescencyjnie oznaczoną linią jądra i markerem chromatyny w Arabidopsis thaliana, aby jednocześnie rejestrować dynamikę jądra i chromatyny w korzeniach Arabidopsis oraz badać zmiany w tej dynamice w odpowiedzi na wskazówki rozwojowe i środowiskowe.

Streszczenie

Jądro jest charakterystyczną organellą organizmów eukariotycznych. W przeciwieństwie do klasycznego widoku z podręczników obrazującego statyczne jądro, kształt jądra jest dynamiczny w żywych komórkach. Zmieniony lub zdeformowany kształt jądra jest charakterystyczny dla raka w komórkach zwierząt i stresu środowiskowego u roślin. Białka otaczające jądro współpracują z chromatyną w regulowaniu ekspresji genów. Niestety, niewiele wiadomo na temat wpływu stresu abiotycznego na kształt jądra, jego ruch i dynamikę chromatyny. Aby stawić czoła temu problemowi, opracowałeśmy potok wykorzystujący mikroskopio konfokalny i oprogramowanie do śledzenia cząstek w celu ilościowego określenia dynamiki jądra i chromatyny w korzeniach Arabidopsis w warunkach kontrolnych i przy stresie abiotycznym. Ta metoda obrazowania konfokalnego wykorzystuje podwójną linię markera z dwoma fluorescencyjnymi znacznikami – białko otaczające jądro i chromatyna – do wykonywania obrazowania żywych komórek korzenia w modelowej roślinie Arabidopsis thaliana w warunkach kontrolnych i przy stresie solnym. Zdjęcia te są analizowane w celu ilościowego określenia dynamiki jądra i chromatyny za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym Fiji/ImageJ z pomocą wtyczki TrackMate. Aby zweryfikować tę metodę, obrazowałeśmy i ilościowo określiliśmy ruch chromatyny w korzeniach kontrolnych i przy stresie solnym, ujawniając zmniejszenie prędkości chromatyny w warunkach stresu solnego. Ta metoda pozwala na ilościowe obrazowanie żywych komórek kształtu jądra korzenia i dynamiki chromatyny podczas rozwoju roślin i stresu środowiskowego, umożliwiając w ten sposób analizę zmian w dynamice jądra i chromatyny wywołanych przez czynniki stresu abiotycznego.

Wprowadzenie

Kształt jądra komórkowego jest różny w różnych typach komórek i podczas rozwoju w korzeniach Arabidopsis thaliana^1,2. Na przykład kształt jądra jest sferyczny w aktywnie dzielących się regionach merystematycznych. W przeciwieństwie do regionu merystematycznego, jądra w strefie przejściowej i strefie wydłużania korzenia są mniej sferyczne. Co więcej, jądra w zróżnicowanych komórkach, takich jak włośniki korzeniowe, przechodzą przez ciasną podstawę włośnika korzeniowego i są aktywnie przekształcane w wydłużone jądra^3,4,5. Dynamiczne zmiany kształtu i ruchu jądra są kluczowe dla funkcjonowania komórki^6,7. Wady kształtu jądra prowadzą do upośledzenia funkcji, takich jak zmniejszony ruch jądra^1,3. W komórkach ssaków zmiany kształtu komórki i jądra są bezpośrednio skorelowane ze zmianami w ekspresji genów i syntezie białek⁸.

Podczas interfazy, DNA komórki jest zorganizowane jako chromatyna. DNA w chromatynie jest wiązane wokół histonów, które mogą ściągać i rozluźniać DNA, aby zmienić ekspresję. Podobnie, pozycjonowanie chromatyny względem osłonki jądrowej i bliskość peryferii jądra są również ważne dla ekspresji genów⁹. Stres środowiskowy, taki jak stres osmotyczny, zmienia kształt jądra i w konsekwencji zmienia ekspresję zestawu genów wrażliwych na dotyk w korzeniach A. thaliana¹⁰. W tym kontekście, badanie kształtu jądra i dynamiki chromatyny poprzez obrazowanie czasoprzestrzeni żywych komórek jest ważne. Jednym z głównych aspektów dynamiki jądra jest prędkość, z jaką jądra się poruszają, ponieważ pozycjonowanie jądra wewnątrz komórki napędza ekspresję genów, a przemieszczanie jądra wymaga jego ruchu¹¹. Prędkość ruchu chromatyny wewnątrz jądra jest również ważna, ponieważ pozycjonowanie genów wewnątrz jądra jest krytyczne dla określenia ekspresji genów¹².

Poprzednio kształt jądra i dynamika chromatyny były obrazowywane i ilościowo analizowane oddzielnie; w rezultacie, związek między kształtem jądra a dynamiką chromatyny pozostawał niezbadany. Obrazując jądra i chromatynę jednocześnie, można obserwować ich względne pozycje, co może ujawnić ruchy, takie jak rotacja jądra i ruch chromatyny wewnątrz jądra, które są inaczej trudne lub niemożliwe do wykazania. W tej metodzie przedstawiamy technikę obrazowania żywych komórek, aby wizualizować i ilościowo analizować kształt jądra za pomocą białka osłonki jądrowej oznakowanego fluorescencyjnie, białka WPP do interakcji 1 (WIP1)¹³ i chromatynę za pomocą chromatyny centromerowej H3 (CENH3)¹⁴ jednocześnie w warunkach kontrolnych i stresu solnego, z celem umożliwienia analizy zmian w dynamice jądra i chromatyny wywołanych czynnikami stresu abiotycznego. Aby umożliwić tę metodę, wygenerowaliśmy linię WIP1-GFP/CENH3-mRFP A. thaliana. Dodatkowo, badaliśmy dynamikę chromatyny w sposób ilościowy za pomocą wtyczki TrackMate oprogramowania ImageJ/Fiji. Przetestowaliśmy linię dwóch fluorescencji i technikę dynamiki chromatyny przedstawioną tutaj w warunkach stresu solnego i odkryliśmy zmianę w morfologii i dynamice ognisk centromerowych z powodu warunków stresu. Ta prosta i powtarzalna metoda jest idealna dla wysokowydajnego śledzenia dynamiki jądra i chromatyny w korzeniach Arabidopsis w różnych warunkach stresu abiotycznego.

Protokół

1. Uprawa sadzonek A. thaliana

1. Przygotowanie podłoża do wzrostu
   1. Umieść 800 mL czystej wody w 1 L becherce na płycie mieszającej. Dodaj szelkę do becherki.
   2. Włącz płytę mieszającą z prędkością 600 obr./min.
   3. Dodaj 10 g sacharozy do becherki.
   4. Dodaj 2,16 g podłoża do wzrostu Murashige i Skoog (MS) do becherki.
   5. Dodaj 5 mg agaru do każdej z dwóch 1 L butelek z podłożem.
   6. Etykietuj jedną butelkę jako "1/2 MS" a drugą "100 mM NaCl".
   7. Etykietuj oba wieczka butelki taśmą autoklawującą.
   8. Dodaj 5,84 g NaCl do butelki oznaczonej jako "100 mM NaCl".
   9. Napchnij becherkę 1 L czystą wodą.
   10. Wróć z becherką na płytę mieszającą i poczekaj, aż sacharoza i MS się rozpuścią.
   11. Wlej zawartość becherki do 1 L miarki.
   12. Wlej 500 mL zawartości miarki do każdej butelki.
   13. Autoklawuj podłoże do wzrostu i 250 mL czystej wody z 60-minutowym cyklem ciekłym w 121 °C.
       UWAGA: Podczas autoklawy podłoża i wody upewnij się, że wieczka są luźne, aby uniknąć potencjalnych eksplozji.
   14. Ponownie przykręć wieczka do butelek z podłożem do wzrostu.
   15. Odwróć butelki z podłożem do wzrostu 7 razy, aby upewnić się, że agar jest dobrze rozprowadzony.
   16. Przechowywaj podłoże do wzrostu w lodówce 4 °C do momentu potrzeby, a następnie podgrzej w mikrofalówce, aby je upłynić.
2. Ustawianie płyt do wzrostu i nasion
   1. W kapturze użyj pistoletu pipetowego do pipetowania 50 mL podłoża do wzrostu do każdej z dziesięciu płyt (Rysunek 1A).
   2. Podczas utrwalania się podłoża, oczyść nasiona WIP1-GFP x CENH3-mRFP zanurzając je w mikrocentryfugowej probówce z 1 mL 70% etanolu na 10 minut (Rysunek 1B).
      UWAGA: Podczas obsługi etanolu, upewnij się, że w okolicy nie ma otwartych płomieni.
   3. Po 10 minutach, w kapturze, usuń etanol i przepłucz nasiona dwa razy z 1 mL sterylnej wody (Rysunek 1C).
   4. Po zastygnięciu podłoża, użyj pipety 1000 μL, aby umieścić oczyszczone nasiona na płytach do wzrostu w dwóch rzędach po 14 nasion na płycie (Rysunek 1D).
   5. Etykietuj płyty permanentnym markerem i uszczelń je taśmą mikroporowaną przed opuszczeniem kaptura (Rysunek 1E).
3. Kiszenie sadzonek
   1. Owinąć płyty do wzrostu folią aluminiową i stratyfikować na zimno w lodówce 4 °C przez minimum 2 dni (Rysunek 1F).
   2. Po stratyfikacji na zimno, usuń płyty z lodówki i pozostaw je pionowo pod lampami do wzrostu (około 80 μmol/m²/s) przez minimum 4 dni (Rysunek 1G).
   3. Przenieś połowę płyt do podłoża do wzrostu 100 mM NaCl w kapturze, a następnie uszczelnij i oznakuj płyty (Rysunek 1H).
   4. Rośnij płyty pod lampami do wzrostu przez 2 dni przed obrazowaniem (Rysunek 1I).

2. Obrazowanie żywych komórek korzeni i chromatyny A. thaliana

1. Przygotowanie szlajfy
   1. Pipetą nałóż 60 μL czystej wody na szklaną szlajfę (Rysunek 2A).
   2. Ułóż 3 6-dniowe korzenie sadzonek A. thaliana w wodzie (Rysunek 2B).
   3. Pokłaść na korzeniach 22 mm x 22 mm szklaną krywkę nr 1,5 bez przykrywania liści (Rysunek 2C).
2. Ustawienia mikroskopu konfokalnego
   1. Ustaw czas ekspozycji lasera na 1000 ms (1 s).
   2. W kombinatorze laserowym, ustaw laser 488 nm na 50% dla białka zielonej fluorescencyjnej (GFP) i 561 nm na 50% dla czerwonej fluorescencyjnej (RFP) (Rysunek 2D). Obrazuj z obiektywem 20x bez zoomu optycznego. Jeśli nagrywasz dłużej niż 10 minut, zmniejsz intensywność, aby zmniejszyć blaknięcie.
   3. Ustaw grubość warstwy Z na 0,3 μm.
   4. Ustaw przedział czasowy na 1 min i łączną długość na 10 min.
3. Obrażanie
   1. Lokalizuj korzenie i wybierz do

Wyniki

Live cell imaging of nuclear envelope and chromatin dynamics
We generated a dual fluorescent marker line, which includes outer nuclear envelope protein WIP1-GFP and centromeric chromatin CENH3-mRFP (Rysunek 8). 4-day-old seedlings were transferred to the control plate or 100 mM NaCl-containing plates for 2 days. After 2 days of incubation, there is a clear root growth inhibition observed for salt treatment, as previously reported¹⁵. Both control...

Dyskusja

Prezentowana tu metoda jest idealna do śledzenia dynamiki chromatyny. W porównaniu z poprzednimi metodami obrazowania żywych komórek z oddzielnym obrazem, jednoczesne obrazy jąder i chromatyny pozwalają na zbadanie relacji między dynamiką jądra a chromatyną. Może to ujawniać ruchy takie jak rotacja jądra i ruch chromatyny wewnątrzjądrowej, które inaczej są trudne do wykazania.

Jako metoda obrazowania żywych komórek, najważniejsze jest posiadanie linii fluorescencyjnej z jednolitymi sygnałami p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
½ Murashige and Skoog (MS) media	bioWorld	30630058
3M micropore tapes	Amazon	A-1530-0
Acqusition software	Olympus/Evident	CellSens
Agar	bioWorld	40100072
CENH3-mRFP	ABRC	CS799459
Cover slip	Genesee	29-116
Glass slide	Genesee	29-101
Image/Fiji	Open-source	https://imagej.net/software/fiji/downloads
Microscope	Olympus/Evident	IX83
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Spinning disk	Yokogawa	CSU-W1
Square petri dishes	Simport	26-275
Sucrose	bioWorld	41900152
WIP1-GFP	ABRC	CS39987