Artykuł metodologiczny

Automatyczne operantne przerywane picie alkoholu u myszy mieszkających społecznie za pomocą systemu testowania inteligencji

142 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71345

⸱

5 czerwca 2026

 ,  ,  , 
1Section on Neurobiology of Compulsive Behaviors, National Institute on Mental Health, Intramural Research Program, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten przedstawia metody wysokiej przepustowości, zautomatyzowanej oceny zachowań związanych z piciem alkoholu u myszy mieszkających społecznie, przeprowadzane za pomocą systemu testowego IntelliCage. Przedstawiono szczegółową metodologię dla paradygmatu picia alkoholu działającego, przerywanego, wraz z plikami eksperymentalnymi i kodem do analizy uzyskanych danych.

Streszczenie

Pomimo znanych czynników zakłóceń izolacji społecznej dla zachowań gryzoni, wielu badaczy polega na indywidualnym trzymaniu myszy do oceny preferencji alkoholowych w przedklinicznych modelach zaburzeń używania alkoholu (AUD). Protokół ten opisuje społeczne zadanie picia alkoholu, które pozwala na wysokowydajną, zautomatyzowaną ocenę zachowań związanych z piciem alkoholu u myszy bez zakłócających skutków stresu wywołanego izolacją społeczną. System testowania IntelliCage umożliwia badaczom jednoczesną ocenę operującego zachowania picia alkoholu u nawet 16 myszy tej samej płci, z których każda jest unikalnie zidentyfikowana za pomocą podskórnie wszczepionego transpondera RFID (radiowe identyfikacji). Dostęp do butelek do sączenia jest sterowany programowo i można go dostosować indywidualnie dla każdej myszy. W tym przewlekłym, przerywanym paradygmacie picia alkoholu myszy dobrowolnie wykonują operantne nosepoke, aby przez sześć kolejnych tygodni sięgnąć do butelek zawierających 20% alkoholu. Butelki alkoholu są dostępne tylko co drugi dzień przez 24 godziny i mogą być opcjonalnie zafałszowane chininą, aby ocenić niewrażliwość na karę. Wizyty w każdym operującym rogu, nosepokes i dane lizania są automatycznie rejestrowane dla każdej myszy. Szczegółowe metody eksperymentalne oraz kod open source do analizy zarejestrowanych danych pozwolą badaczom ocenić zachowania związane z alkoholem istotne dla AUD w coraz bardziej efektywny i etologicznie istotny sposób.

Wprowadzenie

Badania na modelach przedklinicznych są kluczowe dla pogłębienia zrozumienia mechanizmów neurobiologicznych leżących u podstaw zachowań przypominających zaburzenia związane z używaniem alkoholu (AUD). Jednak wiele tradycyjnych metod pomiaru spożycia alkoholu u gryzoni, takich jak testy wyboru między dwiema butelkami1,2 oraz testy picia w ciemności3,4,5, wymagają ręcznego pomiaru objętości cieczy u gryzoni utrzymywanych w pojedynczych klatkach, co jest metodą mało wydajną i podatną na błędy. Niedawne wdrożenie systemów lickometrów typu open-source, wykorzystujących technologię pojemnościową6,7,8,9,10 lub fotoelektryczną11,12 do automatycznego zliczania lizań, stanowi znaczący postęp w zakresie wydajności, dokładności i czułości technicznej metodologii badania spożycia alkoholu. Jednak większość systemów lickometrów do klatek domowych nadal wymaga utrzymywania gryzoni w pojedynczych klatkach, co wywołuje stres izolacyjny13,14. Choć raportowane wyniki są bardzo zróżnicowane15,16, gryzonie zazwyczaj przejawiają silniejszą preferencję do alkoholu, gdy są utrzymywane w izolacji17,18,19,20. Niemniej jednak wpływ izolacji społecznej na spożycie alkoholu różni się w zależności od wieku zwierzęcia, płci, środowiska bytowania oraz wcześniejszej ekspozycji na stres20,21,22. Izolacja społeczna może znacząco oddziaływać na manipulacje eksperymentalne, ograniczając tym samym trafność ocenianych efektów behawioralnych przypominających AUD.

Nowoczesne, w pełni zautomatyzowane systemy monitorowania w klatkach domowych, takie jak system testowy IntelliCage (TSE Systems23,24,25) lub alternatywy open-source, LIQ PARTI20 i FARESHARE26, rozwiązują ten problem poprzez połączenie lickometrii z identyfikacją za pomocą fal radiowych (RFID) wielu zwierząt przebywających w grupach. Systemy monitorowania w klatkach domowych umożliwiają bardziej efektywną i powtarzalną kwantyfikację zachowań związanych z spożyciem alkoholu, bez czynników zakłócających w postaci stresu wywołanego izolacją społeczną. Są one zatem idealne do wysokoprzepustowych, potwierdzających badań nad manipulacjami eksperymentalnymi wpływającymi na podatność na zachowania typu AUD. Wśród nich system testowy IntelliCage wyróżnia się zastosowaniem programowalnych, operantnych narożników kontrolujących dostęp do butelek z poidłem, co pozwala badaczom oceniać zachowania poszukiwania w sytuacji braku dostępu do substancji, modulować współczynniki operantne dla poszczególnych zwierząt i nie tylko.

Autorzy przedstawiają tutaj paradygmat operacyjnego przerywanego spożywania alkoholu realizowany za pomocą systemu testowego IntelliCage u myszy utrzymywanych w grupach społecznych27,28. Paradygmat ten umożliwia długoterminową, zautomatyzowaną ocenę spożycia alkoholu u maksymalnie 16 myszy tej samej płci, z których każda jest jednoznacznie zidentyfikowana za pomocą podskórnie wszczepionych transponderów RFID. Jak opisano poniżej, myszy są trenowane do operacyjnego wkładania nosa w otwór (nosepoke) w schemacie stałego stosunku (FR)-3, aby uzyskać dostęp do butelek z poidłem. Po krótkim okresie treningu butelki w dwóch z czterech narożników operacyjnych są zastąpione 20% roztworem alkoholu (95% etanol [190 proof] w wodzie z kranu, v/v). Myszy mają stały dostęp do wody, ale przerywany dostęp do alkoholu co drugi dzień przez okresy 24-godzinne (od 12:30 do 12:30). Liczba liznięć alkoholu jest kwantyfikowana w ciągu sześciu tygodni, a w połowie eksperymentu przeprowadzany jest dwudniowy test z domieszką chininy (0.5 mM, 1.0 mM) w celu oceny picia niepodatnego na karę. Dane dotyczące wizyt, wkładania nosa w otwór oraz liznięć są rejestrowane dla każdej myszy (Rysunek 1), wyodrębniane przy użyciu zastrzeżonego oprogramowania TSE, a następnie analizowane z wykorzystaniem otwartoźródłowego potoku przetwarzania danych29 w celu uzyskania informacji na temat zachowań przypominających AUD.

Niniejszy protokół uzupełnia inne opublikowane zastosowania systemu testowego IntelliCage do oceny zachowań przypominających AUD30,31,32,33,34,35,36,37,38,39, a także innych zachowań przypominających zaburzenia związane z używaniem substancji40,41,42. Zgodnie z doniesieniami sugerującymi, że przerywane schematy dostępu zwiększają dobrowolne spożycie alkoholu u gryzoni1,43,44,45,46,47, protokół ten pozwala na uzyskanie wysokiego poziomu dobrowolnego spożycia alkoholu u większości myszy. Niemniej jednak, jak zaznaczają autorzy w całym protokole, parametry eksperymentalne można łatwo zmodyfikować w celu odpowiedzi na konkretne pytania badawcze. Podsumowując, metodologia ta stanowi wydajne i elastyczne rozwiązanie dla badaczy analizujących mechanizmy leżące u podstaw AUD.

Schemat implantacji transponderów RFID u myszy: identyfikacja, dostęp operacyjny, pojemnościowy lickometr.
Rycina 1: W pełni zautomatyzowane śledzenie wizyt myszy, wkładania nosa i lizania za pomocą unikalnej identyfikacji RFID. (A) Schemat implantacji transpondera RFID u myszy. Transpondery RFID są implantowane podskórnie w regionie grzbietowo-szyjnym, aby umożliwić indywidualne śledzenie w zautomatyzowanym systemie monitorowania klatek domowych. (B) Schemat faz zbierania danych podczas zautomatyzowanego, operacyjnego paradygmatu przerywanego podawania alkoholu. Tożsamość zwierzęcia jest odczytywana, a wizyta w narożniku jest rejestrowana za pomocą podwójnej pierścieniowej anteny RFID i odczytów czujnika temperatury; oba sygnały muszą być dodatnie, aby wizyta została zarejestrowana (lewo). Następnie myszy są trenowane do wkładania nosa zgodnie z harmonogramem FR-3 w celu uzyskania dostępu do butelek z poidełkiem (środek). Skuteczne włożenie nosa zapewnia 5 s dostępu do butelki z poidełkiem, podczas gdy lizanie myszy jest rejestrowane za pomocą pojemnościowego lickometru (prawo). Schematy wykonane na podstawie zmodyfikowanych szablonów BioRender przez Lucy Anderson, na licencji CC BY 4.0 (https://BioRender.com/ko79xuy). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) NIH i były zgodne z polityką Public Health Service dotyczącą humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.

1. Przygotowanie aparatury

UWAGA: Każdy aparat systemu testowego IntelliCage składa się z dużej plastikowej klatki domowej (39 cm x 58 cm x 21 cm), w której może przebywać do 16 myszy tej samej płci. Poprzednie kohorty liczyły od 8 do 16 myszy na klatkę. Aparat wyposażony jest w cztery narożniki operantowe, z których wszystkie są połączone z centralnym mikroprocesorem znajdującym się na górnej pokrywie. Karma dla gryzoni jest dostępna z dużego metalowego zasobnika umieszczonego w centrum pokrywy. Wewnątrz klatki myszy swobodnie przemieszczają się między narożnikami operantowymi a centralną przestrzenią życiową, która jest wyposażona w ściółkę i materiały wzbogacające środowisko. Każdy narożnik operantowy posiada małe okrągłe wejście, które fizycznie umożliwia wejście tylko jednej myszy naraz. Tożsamość myszy jest odczytywana i rejestrowana na podstawie odczytów z podwójnej anteny pierścieniowej RFID oraz czujnika temperatury; oba parametry muszą być dodatnie, aby wizyta została zarejestrowana. W każdym narożniku operantowym myszy mają do dyspozycji dwa porty do wkładania nosa (nosepoke), z których każdy steruje dostępem do jednych z dwóch zmotoryzowanych drzwi. Te programowalne, zmotoryzowane drzwi zapewniają dostęp do jednej z dwóch butelek z poidłem. Badacze ręcznie programują warunki dostępu do butelek z poidłem, a także czułość lickometrów opartych na pomiarze pojemności. Dane dotyczące wizyt, wkładania nosa i lizania są rejestrowane indywidualnie dla każdej myszy i przesyłane za pomocą centralnego mikroprocesora do komputera, na którym zainstalowany jest zastrzeżony system oprogramowania firmy TSE. Choć nie zostanie to omówione w niniejszym protokole, każda komora operantowa zawiera również programowalny zawór do podawania podmuchów powietrza, wykorzystywany w warunkowaniu awersyjnym.

  1. Wyposażyć plastikową klatkę domową w pięć sprężonych podkładek z włókien bawełnianych (15.24 x 25.4 cm), dwa małe kwadraty z bawełny (5.08 x 5.08 cm) oraz cztery plastikowe struktury do kopania w celu zapewnienia ściółki i wzbogacenia środowiska.
    UWAGA: Stosowanie sprężonych podkładek z włókien bawełnianych jest zalecane z dwóch powodów: (1) aby uniknąć potencjalnego wpływu kurzu lub płatków powszechnie stosowanych materiałów ściółkowych na mechanizmy drzwi oraz (2) aby ułatwić identyfikację walk między zwierzętami.
  2. Umieścić górną pokrywę z narożnikami operacyjnymi w plastikowej klatce domowej.
  3. Jeśli nie są połączone, podłączyć wszystkie narożniki operacyjne do centralnego mikroprocesora za pomocą dołączonych kabli, a następnie podłączyć centralny mikroprocesor do komputera z zainstalowanym oprogramowaniem TSE za pomocą kabli CAN.
    1. W przypadku użycia wielu aparatów, podłączyć wszystkie klatki szeregowo do tego samego komputera.
  4. Podłączyć mikroprocesor do źródła zasilania i upewnić się, że diody LED w każdym narożniku zapalają się, a wszystkie osiem zmotoryzowanych drzwi się porusza.
  5. Napełnić osiem butelek z poidłami, wlewając do każdej ok. 250 mL wody z kranu (lub innego płynu), mocno docisnąć nakrętki, aby zapewnić szczelność, a następnie delikatnie wkręcić je w otwory likometru, zapewniając ciasne połączenie z likometrem.
    UWAGA: Czułość czujników wizyt, wkładania nosa i lizania można opcjonalnie zoptymalizować podczas eksperymentu pilotażowego. Aby dostosować czułość każdego narożnika, należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta opisanymi w pliku „Help” programu „Controller”. We wszystkich badaniach stosowano następujące ustawienia: wizyta- 816 ON/768 OFF; wkładanie nosa- 21 ON/26 OFF; likometr- 69 ON/80 OFF/15 time-out.
  6. Napełnić zasobnik na karmę pokarmem dla gryzoni.
  7. Włączyć komputer, otworzyć aplikację „Controller” i wczytać wybrany plik eksperymentu.

2. Przygotowanie zwierząt

UWAGA: Zwierzęta powinny zostać wyposażone w transpondery RFID co najmniej tydzień przed rozpoczęciem testów behawioralnych, aby zapewnić odpowiedni czas na rekonwalescencję. Należy używać myszy w wieku co najmniej ~50 dni, o masie ciała przekraczającej 15 g. Implantacja u mniejszych myszy zwiększa ryzyko obrażeń zwierzęcia podczas iniekcji. W zależności od linii myszy, problemem w warunkach utrzymywania w grupach może stać się agresja, zwłaszcza wśród samców. Ryzyko to można zminimalizować, utrzymując wszystkie myszy razem w okresie dojrzewania. Autorzy nie zaobserwowali istotnej agresji w badaniach z dorosłymi (~PND 80–150) myszami typu dzikiego C57BL/6, jednak nie gwarantuje to możliwości zastosowania tego protokołu w odniesieniu do innych genotypów, grup wiekowych lub sposobów utrzymania zwierząt.

  1. Implantuj myszom podskórnie transpondery RFID w obszarze grzbietowo-szyjnym w celu unikalnej identyfikacji.
    1. Wydrukuj tabelę danych zawierającą listę wszystkich zwierząt doświadczalnych z wolnym miejscem obok identyfikatora każdego zwierzęcia na naklejkę z kodem kreskowym zawierającym kod RFID.
    2. Przygotuj wszystkie zwierzęta i niezbędne materiały: transpondery RFID, wielorazowy injektor transponderów RFID oraz zestaw do indukcji izofluranem.
    3. Umieść pierwszą mysz w komorze indukcyjnej i znieczul za pomocą odparowanego izofluranu (przepływomierz tlenu: 1.5 mL/min, izofluran: 1.5–3.5%) do momentu, aż mysz zacznie oddychać głębokimi, przerywanymi oddechami i przestanie reagować na uciśnięcie palca u stopy.
      1. Oczekując na znieczulenie myszy, załaduj transponder RFID do injektora, przykręcając załadowaną igłę do podstawy injektora, a następnie powoli wysuwając strzykawkę, aż pojawi się mikrochip.
      2. Przyklej kod kreskowy z kodem RFID do wydrukowanej tabeli danych obok odpowiedniego identyfikatora zwierzęcia.
    4. Wyjmij mysz z komory indukcyjnej i implantuj załadowany transponder RFID podskórnie w obszarze grzbietowo-szyjnym.
      1. Po uprzednim potwierdzeniu, że mysz nie reaguje na uciśnięcie palca u stopy, chwyć kark myszy bezpośrednio nad łopatkami za pomocą kciuka i palca wskazującego niedominującej ręki.
      2. Używając dominującej ręki, wprowadź igłę injektora podskórnie w tylną część karku myszy, dbając o to, aby igła znajdowała się powyżej kręgosłupa i równolegle do niego, aby uniknąć zranienia zwierzęcia.
      3. Przy końcówce strzykawki znajdującej się w karku myszy i stabilnie unieruchomionej między kciukiem a palcem wskazującym, ostrożnie przesuń dominującą rękę tak, aby móc nacisnąć tłok injektora.
      4. Wstrzyknij transponder RFID, utrzymując kark myszy ściśnięty palcami niedominującej ręki, tak aby poczuć moment opuszczenia mikrochipu z końcówki strzykawki.
      5. Trzymając kark ściśnięty, powoli wyjmij injektor. Puść kark dopiero po całkowitym usunięciu injektora, aby zapobiec wypadnięciu transpondera.
        UWAGA: Opcjonalnie można zawiązać pojedynczy szew, aby zamknąć skórę podczas znieczulenia myszy.
    5. Przenieś mysz do klatki macierzystej i monitoruj wybudzanie z narkozy do czasu pełnej sprawności ruchowej.
    6. Monitoruj mysz pod kątem wszelkich oznak upośledzenia fizycznego, w tym częściowego paraliżu, utykania lub krążenia w kółko, co może wskazywać na wstrzyknięcie poza docelowy obszar. Jeśli upośledzenia utrzymują się dłużej niż 24 h lub poważnie wpływają na dobrostan zwierzęcia, przeprowadź humanitarną eutanazję.
      1. Skieruj czytnik transponderów RFID nad obszar grzbietowo-szyjny myszy i zeskanuj go, aby potwierdzić prawidłowe umiejscowienie.
    7. Opcjonalnie pobierz próbkę tkanki do genotypowania.
      1. Powtórz procedurę dla wszystkich myszy doświadczalnych.
  2. Jeden dzień po początkowej implantacji transponderów RFID użyj czytnika transponderów RFID, aby zweryfikować, czy żadna z myszy nie utraciła transpondera. W przypadku utraty transpondera przez jakąkolwiek mysz, powtórz procedurę z nowym transponderem i odpowiednio zaktualizuj dokumentację.
    UWAGA: Zazwyczaj, jeśli transponder RFID ma wypaść, dzieje się to w ciągu 24 h od implantacji. Może to być spowodowane nieprawidłowym umieszczeniem transpondera RFID i/lub pielęgnacją lub drapaniem przez mysz w miejscu wstrzyknięcia. Unikaj ponownego wstrzykiwania w miejsca poprzednich ran po iniekcji i wyklucz myszy po trzech nieudanych próbach implantacji transpondera RFID.
  3. Przed przeniesieniem myszy do aparatury IntelliCage zweryfikuj, czy wszystkie transpondery RFID są poprawnie odczytywane. Zważ i zapisz masę ciała wszystkich myszy.

3. Przygotowanie plików eksperymentalnych

UWAGA: System testowy IntelliCage jest sterowany i obsługiwany za pomocą graficznych interfejsów użytkownika dostarczonych przez TSE. Do przeprowadzania eksperymentów w systemie IntelliCage używa się trzech aplikacji: „Designer”, „Controller” oraz „Analyzer”. Różne fazy eksperymentu są uruchamiane za pomocą odrębnych plików eksperymentu, które są projektowane w aplikacji „Designer”, a następnie uruchamiane w aplikacji „Controller”. Szczegółowe informacje na temat projektowania i dostosowywania plików eksperymentu zostały opisane wcześniej48,49. Aby ułatwić replikację protokołu, udostępniono szablony czterech plików eksperymentu użytych w badaniu (Habituation.experiment, Water Training.experiment, Intermittent Alcohol.experiment, Open Bar.experiment). W plikach tych zmiany faz następują o godzinie 12:30. Autorzy wybrali tę godzinę, ponieważ zwierzęta przebywały w cyklu światła od 6:00 do 18:00. Pozwoliło to na nieprzerwaną fazę ciemności w celu pomiaru zachowań związanych z piciem. Badacze mogą jednak chcieć zmienić ten czas, aby był on zgodny z innymi metodologiami spożywania alkoholu, takimi jak procedury „picia w ciemności” (drinking in the dark)50.

  1. Przygotuj pliki eksperymentalne w aplikacji „Designer”.
    UWAGA: W przypadku korzystania z plików szablonów, przed wprowadzeniem aktualnej kohorty należy usunąć cztery przykładowe zwierzęta. Należy również zmienić nazwy grup zgodnie z planem eksperymentalnym i dodać grupy w razie potrzeby. Należy upewnić się, że nowe grupy zaczynają się od tego samego klastra co grupy w szablonie.
    1. Otwórz plik Habituation.experiment w aplikacji „Designer” i uważnie wprowadź identyfikator zwierzęcia, kod transpondera RFID oraz grupę eksperymentalną/genotyp dla każdej myszy. Zapisz plik pod nową nazwą, aby zachować plik szablonu.
      UWAGA: W przypadku błędnego wpisania kodów transponderów RFID dane nie zostaną zapisane. Przypisanie zwierząt do odpowiednich grup eksperymentalnych ułatwi monitorowanie ich zachowania i ostateczną analizę danych.
    2. Wyeksportuj informacje o zwierzętach do pliku animals.
    3. Dla każdej fazy eksperymentu otwórz odpowiedni plik eksperymentalny i załaduj plik animals. Zapisz i odpowiednio nazwij pliki.
    4. W przypadku projektowania plików na oddzielnym komputerze, pobierz pliki eksperymentalne na przenośny dysk flash w celu transportu do pomieszczenia behawioralnego.
  2. Pobierz wszystkie pliki eksperymentalne na komputer podłączony do aparatury IntelliCage i otwórz pierwszy plik w aplikacji „Controller”. Zweryfikuj, czy wszystkie informacje zostały poprawnie załadowane.
  3. Stwórz, w formie papierowej lub elektronicznej, dziennik eksperymentalny, w którym odnotowuje się datę i godzinę rozpoczęcia/zakończenia poszczególnych faz eksperymentu. Będzie to znacznym ułatwieniem w analizie, ponieważ pewne warunki farmakologiczne (np. alkohol z dodatkiem chininy) nie są zapisywane w plikach archiwalnych IntelliCage.

Badanie spożycia alkoholu; schemat i harmonogram eksperymentu z przerywanym dostępem; fazy treningowe.
Rysunek 2: Harmonogram eksperymentalny dla operantowego paradygmatu przerywanego picia alkoholu. (A) Schemat aparatury IntelliCage z butelkami do picia zawierającymi alkohol w dwóch z czterech narożników. (B) Harmonogram eksperymentalny przedstawiający plan wszystkich faz eksperymentu, zastosowany w poprzedniej publikacji23. Kohorta 1 przeszła test alkoholu z domieszką chininy po zakończeniu przerywanego picia alkoholu, natomiast kohorty 2 i 3 powróciły do przerywanego picia alkoholu po domieszce. (C) Szczegółowy kalendarz eksperymentalny przedstawiający zmiany w oprogramowaniu dla wszystkich faz eksperymentalnych: habituacji, treningu z wodą, przerywanego picia alkoholu, testu alkoholu z domieszką chininy oraz picia alkoholu w trybie „open bar”/wolnego dostępu. Wymiana klatek jest planowana co najmniej raz w tygodniu po zakończeniu modułu „Alcohol Access ON”. Ilustracje wykonane z zmodyfikowanych szablonów BioRender przez Lucy Anderson, licencjonowane na podstawie CC BY 4.0 (https://BioRender.com/ko79xuy). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Przeprowadzenie eksperymentu

UWAGA: Operantny paradygmat przerywanego spożycia alkoholu składa się z pięciu faz: (1) habituacji, (2) treningu z wodą, (3) przerywanego spożycia alkoholu, (4) testu alkoholu z domieszką chininy oraz (5) „otwartego baru”/swobodnego dostępu do alkoholu. Każda faza eksperymentu jest uruchamiana przy użyciu różnych plików eksperymentu, z wyjątkiem przerywanego spożycia alkoholu oraz testu alkoholu z domieszką chininy, które oba wykorzystują parametry określone w pliku Intermittent Alcohol.experiment. Poza wymianą klatek, badacze powinni sprawdzać stan myszy co najmniej trzy razy w tygodniu, aby ocenić dobrostan zwierząt i upewnić się, że oprogramowanie działa prawidłowo. Wszelkie myszy, u których stwierdzono urazy lub złe samopoczucie, należy wykluczyć z eksperymentu. Przykładowy harmonogram eksperymentu przedstawiono na Rysunku 2.

  1. Wymiana klatek
    ​UWAGA: Wymianę klatek należy przeprowadzać co najmniej raz w tygodniu. Podczas podawania alkoholu zmiany te należy wykonywać wyłącznie po godzinie 12:30 w trakcie fazy „Water Access ONLY” (tylko dostęp do wody), aby nie przerywać spożycia alkoholu. W tym celu pliki Intermittent Alcohol.experiment oraz Open Bar.experiment będą zawsze rozpoczynać się od fazy „Water Access ONLY”. Ze względu na rozmiar klatek, samodzielna obsługa zajętych klatek jest trudna. Autorzy zalecają, aby w wymianie klatek pomagał co najmniej jeden dodatkowy badacz. Należy sprawdzić stan myszy 24 h po każdej wymianie klatki, aby upewnić się, że oprogramowanie działa poprawnie i że w reakcji na stres związany z wymianą klatki nie doszło do agresji lub walk.
    1. Przed rozpoczęciem wymiany klatki przygotować nową, czystą klatkę plastikową z nową ściółką i materiałami do budowy gniazd. Napełnić każdą z ośmiu butelek poidełek na klatkę ok. 250 mL wody z kranu lub 20% alkoholu (95% etanol [190 proof] w wodzie z kranu, v/v).
      UWAGA: Opcjonalnie badacze mogą dodać niewielką ilość starego materiału ściółki do nowej, czystej klatki. Minimalizuje to zakłócenia w ustalonych hierarchiach grupowych i może obniżyć ryzyko walk.
    2. Zatrzymać eksperyment w aplikacji „Controller”. Po upewnieniu się, że w narożnikach operantowych nie ma myszy, usunąć metalny podajnik karmy. Jedna osoba powinna unieść metalową aparaturę mikroprocesorową na tyle wysoko, aby druga osoba mogła wysunąć plastikową klatkę spod niej. Zweryfikować poprawną liczbę myszy.
    3. Wyjąć myszy pojedynczo z brudnej klatki, zeskanować transponder RFID i zapisać masę ciała. Wizualnie zbadać każdą mysz pod kątem oznak urazów lub choroby.
      UWAGA: Autorzy zalecają zapisywanie masy ciała w elektronicznym arkuszu kalkulacyjnym (csv), aby można było go łatwo zaimportować do potoku analizy.
    4. Po zapisaniu masy ciała tymczasowo umieścić myszy w czystym pojemniku przejściowym.
    5. Wyczyścić górną część oraz narożniki wilgotnym ręcznikiem nasączonym środkiem dezynfekującym. Należy szczególnie starannie przetrzeć powierzchnię i dolną krawędź płyty narożnika, nie dopuszczając do wycieku cieczy na elementy elektroniczne.
    6. Unieść metalową aparaturę mikroprocesorową na tyle wysoko, aby wsunąć na miejsce nową, czystą klatkę plastikową.
    7. Ostrożnie wkręcić nowe butelki poidełek w otwory likometru, zapewniając szczelne połączenie z likometrem.
    8. Przenieść myszy do nowej, czystej aparatury.
    9. Wymienić podajnik karmy na nowy, czysty podajnik z nową karmą dla gryzoni.
    10. Ponownie uruchomić ten sam eksperyment w aplikacji „Controller” lub załadować i uruchomić nowy plik eksperymentu.
    11. Upewnić się, że program działa poprawnie i że wszystkie wizyty, wkładanie nosa (nosepokes) oraz lizania wszystkich myszy są odpowiednio rejestrowane.
      UWAGA: Program „Controller” automatycznie wyświetli ostrzeżenia, gdy w okresie 12 h nie zarejestrowano lizania u danego zwierzęcia.
    12. Wyczyścić brudny sprzęt. Klatki plastikowe, butelki poidełek i plastikowe struktury do kopania można zazwyczaj myć w typowych systemach mycia klatek.
  2. Dzień 0: Habituacja
    ​UWAGA: Faza habituacji jest przeprowadzana przy użyciu pliku Habituation.experiment. W tej fazie wszystkie butelki poidełek zawierają wodę z kranu. Myszy mają swobodny dostęp do wszystkich butelek bez konieczności operantnego wkładania nosa. Zmotoryzowane drzwi otwierają się, gdy myszy wejdą do narożnika operantnego, odsłaniając dostęp do końcówek butelek poidełek.
    1. Po zweryfikowaniu obecności transponderów RFID i zapisaniu masy ciała myszy, napełnić wszystkie osiem butelek poidełek ok. 250 mL wody z kranu i ostrożnie wkręcić w otwory likometru.
    2. Umieścić do 16 myszy tej samej płci w przygotowanej aparaturze IntelliCage.
    3. Załadować plik Habituation.experiment do aplikacji „Controller” i rozpocząć rejestrację.
    4. Zweryfikować, czy wszystkie zmotoryzowane drzwi otwierają się poprawnie, gdy mysz wchodzi do narożnika operantnego, oraz czy wszystkie wizyty, wkładanie nosa i lizania są pomyślnie rejestrowane dla każdej myszy. Jeśli w ciągu 6 h nie zarejestrowano żadnych wizyt, wkładania nosa ani lizania dla danej myszy, należy sprawdzić plik .animal pod kątem błędów.
  3. Dzień 1-3: Trening wodny
    UWAGA: Faza treningu wodnego jest przeprowadzana przy użyciu pliku Water Training.experiment. Wszystkie butelki poidełek powinny nadal zawierać wyłącznie wodę z kranu. W tej fazie myszy będą trenowane do wkładania nosa według schematu FR-1, a następnie FR-3, aby uzyskać dostęp do końcówek butelek poidełek. Po udanym włożeniu nosa zmotoryzowane drzwi otworzą się, zapewniając dostęp do butelki poidełka przez 5 s. Gdy pojedyncza mysz osiągnie skuteczność na poziomie 60% lub wyższym, zostaje przeniesiona na schemat FR-3 na pozostały czas trwania programu. Zazwyczaj myszy przechodzą na schemat FR-3 w ciągu 24–72 h. Monitorować wyniki zwierząt w programie „Controller”. Jeśli zwierzę nie osiągnie schematu FR-3 w ciągu 72 h, należy je wykluczyć z dalszych eksperymentów.
    1. Jeśli po 24 h habituacji wszystkie myszy wyglądają na nawodnione i nieposzkodowane, zatrzymać uruchamianie pliku Habitatuation.experiment i rozpocząć uruchamianie pliku Water Training.experiment.
    2. Zweryfikować, czy wizyty, wkładanie nosa i lizania są pomyślnie rejestrowane przez oprogramowanie dla każdej myszy oraz czy wszystkie zmotoryzowane drzwi otwierają się poprawnie.
  4. Dzień 4+: Intermitentne spożycie alkoholu
    UWAGA: Faza intermitentnego spożycia alkoholu jest przeprowadzana przy użyciu pliku Intermittent Alcohol.experiment. W tej fazie butelki poidełek w dwóch z czterech narożników operantnych zostają zastąpione 20% alkoholem. Narożniki z wodą i alkoholem są wcześniej określone za pomocą funkcji „Clusters” w pliku eksperymentu. W szablonie woda jest podawana w narożnikach pierwszym i trzecim (oznaczonych jako „neutral”), natomiast alkohol w narożnikach drugim i czwartym (oznaczonych jako „incorrect”). Myszy mają ciągły dostęp do wody, ale intermitentny dostęp do alkoholu w okresach 24-godzinnych (od 12:30 do 12:30) co drugi dzień. Dostęp do butelki poidełka przez 5 s jest zapewniony na schemacie FR-3 dla wszystkich narożników. W tej fazie eksperymentu należy przeprowadzać wymianę klatek w okresach „Water Access ONLY”, aby uniknąć przerywania spożycia alkoholu. Badacze powinni upewnić się, że grupy eksperymentalne wykazują mniej więcej taką samą preferencję dla wszystkich czterech narożników podczas treningu wodnego, przed przypisaniem narożników z alkoholem do intermitentnego spożycia alkoholu. W każdej z kohort grupy eksperymentalne wykazywały mniej więcej taką samą liczbę wizyt i lizania we wszystkich czterech narożnikach podczas treningu wodnego. Z tego powodu autorzy utrzymali stałe przypisania narożników we wszystkich kohortach. Eksperymentatorzy mogą łatwo sprawdzić proporcje lizania i wizyt w poszczególnych narożnikach za pomocą programu „Controller”. Należy regularnie monitorować dane dotyczące wizyt i lizania w trakcie całego eksperymentu, aby upewnić się, że nie pojawiają się żadne problemy (np. awarie sprzętu lub „monopolizowanie” niektórych narożników przez myszy).
    1. Po tym, jak wszystkie myszy pomyślnie osiągną schemat FR-3 w dostępie do butelek poidełek, przygotować 20% alkohol (95% etanol [190 proof] w wodzie z kranu, v/v; ok. 250 mL/butelka).
    2. Zatrzymać uruchamianie pliku Water Training.experiment.
    3. Usunąć butelki poidełek w narożnikach operantnych drugim i czwartym (lub w narożnikach określonych w pliku eksperymentu, jeśli są inne) i zastąpić każdą z nich ok. 250 mL 20% alkoholu.
    4. Ostrożnie wkręcić nowe butelki poidełek zawierające alkohol w otwory likometru, zapewniając szczelne połączenie z likometrem.
    5. Załadować plik Intermittent Alcohol.experiment i rozpocząć rejestrację.
    6. Zweryfikować, czy wizyty, wkładanie nosa i lizania są pomyślnie rejestrowane przez oprogramowanie dla każdej myszy oraz czy wszystkie zmotoryzowane drzwi otwierają się poprawnie.
    7. Następnego dnia po godzinie 12:30 zweryfikować, czy program pomyślnie przełączył się z modułu „Water Access ONLY” na moduł „Alcohol Access ON” i czy zarejestrowano lizania w narożnikach operantnych zawierających alkohol.
  5. Dzień 16+: Test alkoholu z dodatkiem chininy
    ​UWAGA: Faza testu alkoholu z dodatkiem chininy jest przeprowadzana przy użyciu pliku Intermittent Alcohol.experiment. W tej fazie butelki poidełek w dwóch narożnikach operantnych, które wcześniej zawierały 20% alkohol, są zastępowane 20% alkoholem z dodatkiem 0,5 mM, a następnie 1 mM chininy, aby ocenić spożycie niewrażliwe na karę. Stwierdzono wcześniej, że te stężenia chininy, które odpowiadają odpowiednio 0,016% i 0,032% chininy (w/v), są awersyjne w testach przeprowadzonych przez grupę27,28 oraz innych31 Myszy mają ciągły dostęp do wody, ale intermitentny dostęp do alkoholu z dodatkiem chininy w okresach 24-godzinnych co drugi dzień (tj. jeden dzień z chininą 0,5 mM, jeden dzień z dostępem tylko do wody, jeden dzień z chininą 1,0 mM). Dostęp jest zapewniony na schemacie FR-3 dla wszystkich narożników. W niniejszym badaniu myszy wykonywały tę fazę zadania po 16 lub 24 kolejnych dniach intermitentnego spożycia czystego alkoholu. Wymiany klatek nie przeprowadzano w dniu podawania wody pomiędzy testami z dodatkiem chininy, aby uniknąć zakłócającego wpływu stresu. Po tej fazie eksperymentu myszy mogą albo rozpocząć spożycie alkoholu w systemie „open bar”/swobodny dostęp, albo powrócić do spożycia intermitentnego w celu oceny efektu odbicia (rebound drinking) po dodaniu chininy.
    1. Przygotować 20% alkohol z dodatkiem 0,5 mM i 1 mM chininy (95% etanol [190 proof] w wodzie z kranu, v/v; ok. 250 mL/butelka).
    2. Przeprowadzić wymianę klatki, usuwając wszystkie butelki poidełek.
    3. Napełnić każdą butelkę poidełka w narożnikach z alkoholem ok. 250 mL 20% roztworu alkoholu z dodatkiem 0,5 mM chininy.
    4. Ostrożnie wkręcić nowe butelki poidełek zawierające alkohol w otwory likometru, zapewniając szczelne połączenie z likometrem.
    5. Załadować plik Intermittent Alcohol.experiment i rozpocząć rejestrację.
    6. Zweryfikować, czy wizyty, wkładanie nosa i lizania są pomyślnie rejestrowane przez oprogramowanie dla każdej myszy oraz czy wszystkie zmotoryzowane drzwi otwierają się poprawnie.
    7. Po godzinie 12:30 zweryfikować, czy program pomyślnie przełączył się z modułu „Water Access ONLY” na moduł „Alcohol Access ON” i czy zarejestrowano lizania w narożnikach operantnych zawierających alkohol.
    8. Przed godziną 12:30 w następnym dniu podawania alkoholu zastąpić każdą butelkę w narożniku z alkoholem ok. 250 mL 20% roztworu alkoholu z dodatkiem 1 mM chininy. Nie ma potrzeby zatrzymywania eksperymentu na czas wymiany butelek.
    9. Przed godziną 12:30 w następnym dniu podawania alkoholu usunąć butelki poidełek zawierające alkohol z dodatkiem chininy i zastąpić każdą z nich ok. 250 mL czystego 20% alkoholu.
  6. Dzień 20+: „Open bar”/swobodny dostęp do alkoholu
    ​UWAGA: Opcjonalnie można przeprowadzić jeden dzień spożycia alkoholu w systemie „open bar”/swobodny dostęp, aby służył jako kontrola nieoperantna. Faza ta jest przeprowadzana przy użyciu pliku Open Bar.experiment. W tej fazie butelki poidełek w dwóch z czterech narożników operantnych zawierają 20% alkohol, do którego myszy mają dostęp przez jeden okres 24-godzinny (od 12:30 do 12:30). Wizyta w narożniku otworzy drzwi bez konieczności wkładania nosa. W niniejszym badaniu myszy wykonywały tę fazę zadania po fazie intermitentnego spożycia alkoholu lub fazie testu alkoholu z dodatkiem chininy.
    1. W razie potrzeby przygotować 20% alkohol (95% etanol [190 proof] w wodzie z kranu, v/v; ok. 250 mL/butelka).
    2. Przed godziną 12:30 w następnym dniu podawania alkoholu zatrzymać uruchamianie aktualnego pliku eksperymentu.
    3. W razie potrzeby usunąć butelki poidełek w narożnikach z alkoholem i zastąpić każdą z nich ok. 250 mL 20% alkoholu.
    4. Ostrożnie wkręcić nowe butelki poidełek zawierające alkohol w otwory likometru, zapewniając szczelne połączenie z likometrem.
    5. Załadować plik Open Bar.experiment i rozpocząć rejestrację.
    6. Zweryfikować, czy wizyty, wkładanie nosa i lizania są pomyślnie rejestrowane przez oprogramowanie dla każdej myszy oraz czy wszystkie zmotoryzowane drzwi otwierają się swobodnie.
    7. Po godzinie 12:30 zweryfikować, czy program pomyślnie przełączył się z modułu „Water Access ONLY” na moduł „Alcohol Access ON” i czy zarejestrowano lizania w narożnikach operantnych zawierających alkohol.

5. Analiza danych

UWAGA: Dane z każdego eksperymentu są przechowywane wewnętrznie do momentu zatrzymania programu. Wówczas tworzony jest skompresowany plik archiwum danych, który jest zapisywany na lokalnym dysku twardym w folderze C:\Documents\NewBehavior\IntelliCage Plus\Archives. Nazwa pliku składa się z daty i godziny uruchomienia programu i kończy się rozszerzeniem .zip. Pliki archiwum danych zawierają wszystkie istotne informacje o eksperymencie, w tym wizyty w narożnikach (czas rozpoczęcia, czas zakończenia, czas trwania, sekwencja wizyt), nosepokes (czas rozpoczęcia, czas zakończenia, czas trwania), lizania (czas rozpoczęcia, czas zakończenia, czas trwania), czasy oświetlenia i ciemności oraz dane o temperaturze. Archiwum danych to można odczytać i przeanalizować za pomocą programu „Analyzer”. Chociaż istnieją inne pakiety open-source do analizy wyników z IntelliCage (Ruffini et al., 2021; Gastaldi et al., 2025), autorzy stworzyli rurociąg analizy danych w języku R, wykorzystując ogólnodostępne pakiety z tidyverse, aby analizować dane z paradygmatu przerywanego spożycia alkoholu. Rurociąg ten obejmuje wiele etapów kontroli jakości, w tym analizę czasu przebywania myszy w narożnikach; średnią częstotliwość wizyt, nosepokes i lizania w obrębie rytmu okołodobowego; szybkość nabywania reakcji lizania FR-3 na mysz oraz dzienną liczbę lizania na mysz. Dodatkowo autorzy udostępniają skrypty do podstawowych analiz miar spożycia alkoholu. Podstawą jest plik szablonu notatnika R w języku znaczników Quarto, który przetwarza pliki danych i może zostać dostosowany do wariacji specyficznych dla kohorty zwierząt. Analiza jest przeprowadzana przy użyciu bezpłatnej wersji RStudio. Plik szablonu projektu dla R znajduje się w repozytorium GitHub29.

  1. Zgromadź wszystkie dane, w tym pliki zip wygenerowane przez aplikację „Controller” oraz plik CSV zawierający dane o masie ciała myszy.
    UWAGA: Masa ciała jest wymagana do normalizacji spożycia względem masy ciała. W tym procesie bardziej zasadne było zbieranie danych o masie w osobnym pliku niż dodawanie ich do każdego pliku eksperymentalnego. Pierwsza kolumna musi odpowiadać identyfikatorowi zwierzęcia (Animal ID) z plików archiwalnych.
  2. Pobierz szablon projektu R z repozytorium GitHub. 
    1. Zmień nazwę projektu tak, aby odpowiadała eksperymentowi.
    2. Szablon zawiera przykładowe pliki danych służące do zilustrowania działania analizy, które znajdują się w podfolderze data/C1. Zastąp pliki archiwalne spersonalizowanymi archiwami danych.
  3. Uruchom program RStudio i otwórz projekt.
    1. W sekcji plików okna w prawym dolnym rogu RStudio przejdź do folderu qmd i otwórz plik IC_template.qmd.
    2. Skopiuj plik szablonu i zmień jego nazwę tak, aby odpowiadała eksperymentowi.
    3. Skoryguj metadane w sekcji nagłówka YAML skopiowanego pliku oraz w początkowym bloku kodu.
    4. Dostosuj nazwy grup w pliku IC_Commons.R w katalogu R, aby odpowiadały grupom eksperymentalnym. (Szablon wykorzystuje dwie grupy: Control i LBN).
  4. Uruchom plik notatnika.
    UWAGA: Bardziej szczegółowe instrukcje znajdują się w plikach README.md w repozytorium GitHub.

Mapa ciepła zajętości narożników; trening z wodą i alkoholem; wyniki badania zachowania zwierząt; dni vs godziny.
Rysunek 3: Porównywalny dostęp do narożników operacyjnych u wszystkich myszy podczas treningu i faz przerwowego spożycia alkoholu. Wśród myszy z kohorty pierwszej23, mapa ciepła przedstawiająca całkowity czas spędzony w każdym narożniku na dobę na jedną mysz podczas (A) habituacji i treningu z wodą oraz (B) pierwszych czterech dni przerwowego spożycia alkoholu (n = 15 F, 16 M). Ciemniejsze odcienie czerwieni oznaczają dłuższy czas spędzony w narożniku w ciągu dnia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza zachowania zwierząt na wykresach; dane dotyczące wizyt, wkładania nosa, lizania, treningu oraz efektów alkoholu.
Rycina 4: Myszy wykazują aktywność w postaci wizyt, wkładania nosa i lizania zgodną z rytmem okołodobowym oraz skutecznie nabywają dostęp do operantnej butelki z poidłem w schemacie FR-3. Wśród myszy z pierwszej kohorty23, średnia gęstość wizyt w narożniku operantnym (A), wkładania nosa (B) oraz lizania (C) w czasie sesji podczas pierwszych ośmiu dni testów. (D) Czas do momentu, w którym każda mysz skutecznie polizała w schemacie FR-3 podczas treningu z wodą. (E) Wskaźnik sukcesu wizyt (= % wizyt zakończonych lizaniem / całkowita liczba wizyt) wśród myszy podczas habituacji i treningu z wodą (lewo) w porównaniu z pierwszymi czterema dniami przerywanego picia alkoholu (prawo). Symbole okręgów oznaczają samice (n = 15); symbole kwadratów oznaczają samce (n = 16). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy; preferencja alkoholu względem wody u osobników płci męskiej/żeńskiej w ciągu dni eksperymentalnych; analiza spożycia.
Rycina 5: Myszy wykazują porównywalną dzienną liczbę liznięć podczas fazy treningu i przerywanego spożycia alkoholu. Wśród kohorty pierwszej myszy (A) samic (n = 15) i (B) samców (n = 16)23, całkowita liczba dziennych liznięć wody (niebieski) i alkoholu (czerwony) podczas habituacji i treningu z wodą (dni -4–0) w porównaniu z przerywanym spożyciem alkoholu (dni 1–4). C oznacza hodowlę kontrolną; L oznacza hodowlę LBN. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

spożycie alkoholu w przeliczeniu na masę ciała, wykresy liniowe i gęstości, grupy eksperymentalne, analiza grupy kontrolnej vs LBN
Rysunek 6: Myszy narażone na niekorzystne warunki wczesnodziecięce spożywają więcej alkoholu niż grupa kontrolna w operantowym, przerywanym paradygmacie spożycia alkoholu. (A) Średnia liczba liznięć alkoholu na dobę znormalizowana według masy ciała (g; mierzona co tydzień) podczas 8 dni przerywanego dostępu do alkoholu w grupie kontrolnej (szary; lewo) i myszach wychowywanych w systemie LBN (różowy; prawo). (B) Średnia liczba liznięć alkoholu na dobę znormalizowana według masy ciała przed, w trakcie i po dodaniu chininy (0.5 mM, 1 mM). (C) Wykres gęstości przedstawiający średnią liczbę liznięć alkoholu na dobę znormalizowaną według masy ciała podczas jednego dnia dostępu do alkoholu w trybie FR-0 „Open Bar”. Symbole kół oznaczają samice (n = 15); symbole kwadratów oznaczają samce (n = 16). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

Autorzy wykorzystali zautomatyzowane testy w klatce za pomocą IntelliCage, aby ocenić, jak przeciwności wczesnego życia (ELA) wpływają na podatność nazachowania podobne do AUD. Aby wywołać przeciwności, zastosowali paradygmat ograniczonego łóżka i gniazdowania (LBN), model niedoboru zasobów, który prowadzi do nieprzewidywalnej i fragmentarycznej opieki macierzyńskiej 51,52,53,54,55,56. Badanie było nowatorskie w ocenie wpływu ELA na zachowania związane z piciem alkoholu u myszy mieszkających społecznie, bez zakłócających skutków stresu wywołanego izolacją społeczną. Było to istotne, biorąc pod uwagę, że izolacja społeczna w dorosłości jest znana z różnym wpływem na myszy narażone na ELA22,57. Aby osiągnąć maksymalną przepustowość, autorzy jednocześnie mierzyli zachowania związane z piciem alkoholu w czterech aparatach IntelliCage, po dwóch dla każdej płci.

Autorzy rozpoczęli proces analizy od przeprowadzenia dokładnej kontroli jakości surowych danych. Przedstawione tutaj wykresy pokazują reprezentatywne dane z pierwszej kohorty (n = 15 F, 16 M) opublikowanego badania23. Skrypty do całej analizy i wykresów są zawarte w repozytoriumGitHub 29. Dzień 0 eksperymentu został wykluczony z powodu zmiany klatki, która zakłóciła zbieranie danych. Wśród czynników uwzględnionych przy eksploracji danych i kontroli jakości autorzy zadbali, aby wszystkie myszy miały mniej więcej równy dostęp do wszystkich zakątków operacyjnych zarówno podczas treningu (Rysunek 3A), jak i fazy przerywanego picia alkoholu (Rysunek 3B). To wyklucza znaczący wpływ myszy na "zajęcie" narożników operantowych, uniemożliwiając innym myszom dostęp do butelek z popijaniem. Autorzy następnie potwierdzili, że myszy wykonywały wizyty, dotykanie nosem i lizania w oczekiwanym rytmie okołodobowym w ciągu dnia eksperymentalnego (rysunek 4A–C) oraz że wszystkie myszy pomyślnie wykonały pierwsze lizanie na stosunku FR-3 w ciągu sześciu godzin od rozpoczęcia modułu (rysunek 4D). Pod koniec fazy treningu wodnego wszystkie myszy osiągnęły stosunkowo wysoki wskaźnik skuteczności lizania (= % wizyt kończących się lizaniem / całkowita liczba wizyt), co dodatkowo potwierdzało skuteczność treningu na wodzie (Rysunek 4E).

Podczas habituacji, treningu wodnego i rozpoczęcia okresowego picia alkoholu myszy utrzymywały mniej więcej porównywalną liczbę codziennych lizań (rysunek 5A–B). Chociaż niektóre myszy wykazywały spadek całkowitej liczby codziennych lizań na początku treningu operantnego w wodnym dniu -3 (np. P241260-1), większość myszy szybko przyjęła harmonogram nosa FR-1 i FR-3, aby utrzymać podstawową częstotliwość lizania. Dlatego mało prawdopodobne jest, aby myszy doświadczyły nadmiernego odwodnienia podczas treningu wodnego. Wszystkie myszy nauczyły się harmonogramu FR-3 w rozsądnym tempie. Gdy w pierwszym dniu eksperymentu zaczęto przerywane picie alkoholu, niemal wszystkie myszy zdecydowały się na picie alkoholu, choć w różnym tempie. Ogólnie rzecz biorąc, myszy nie zwiększały znacząco całkowitej liczby dziennie lizań podczas spożycia alkoholu. Zamiast tego myszy stosowały mniej lizania wody, aby dostosować się do zwiększonego spożycia alkoholu.

Przez wszystkie dni przerywanego picia alkoholu, myszy z grupy pierwszej znacznie różniły się w codziennych lizaniach alkoholu w stosunku do masy ciała (Rysunek 6A). Autorzy stwierdzili, że myszy przeszły paradygmat LBN miały znacznie mniejszą masę ciała niż grupy kontrolowane z krzyżowo hodowlanymi23. Dlatego badając różnice grupowe w piciu alkoholu, zdecydowali się normalizować codzienne lizania alkoholu według masy ciała, którą autorzy oceniali co tydzień podczas zmian w klatkach. Myszy wychowywane w LBN zazwyczaj spożywały więcej alkoholu na gram masy ciała niż osoby kontrolne, zarówno podczas przerywanego picia (Rysunek 6A) jak i fałszowania chininy (Rysunek 6B). Ten trend utrzymywał się przez jeden dzień nieoperacyjnego otwartego dostępu (Rysunek 6C). Wyniki te z pierwszej kohorty są zgodne z opublikowanymi wynikami, w których autorzy podają, że myszy narażone na ELA konsekwentnie spożywały więcej alkoholu na gram masy ciała niż kontrolne osoby stosowane przez krzyżowo stosowane podczas dostępu przerywanego, co było szczególnie widoczne u mężczyznw wieku 23 lat.

Dzięki efektywności zautomatyzowanych systemów monitoringu w klatkach domowych, opublikowane badanie potwierdziło podwyższone spożycie alkoholu wśród gryzoni narażonych na ELA w społecznym mieszkaniu przy bardzo solidnych próbkach, obejmujących obie płcie (n = 54 kontrolne, 43 LBN)23. Wyniki te stanowią krok naprzód w modelowaniu zachowań podobnych do AUD, obserwowanych u pacjentów z AUD z historią niekorzystnych doświadczeń w dzieciństwie 58,59,60,61,62, i otwierają drzwi do przyszłych badań mechanistycznych, które identyfikują neurobiologiczne podwyższenia podatności na AUD po ELA.

Dyskusja

Jak przykładem jest wykorzystanie przez autorów IntelliCages do solidnej oceny zachowań podobnych do AUD u myszy narażonych na ELA27 oraz wcześniejsze badania nad liniami transgenicznymi28, zautomatyzowane systemy monitoringu w klatkach domowych oferują efektywne i elastyczne rozwiązanie do badania przedklinicznych modeli AUD. Jednoczesna ocena do 16 myszy mieszkających razem znacząco zwiększa wydajność metodologii picia alkoholu, unikając jednocześnie zakłócających skutków stresu wywołanego izolacją społeczną. Paradygmat operantnego, przerywanego picia alkoholu pozwala eksperymentatorom badać wiele aspektów zachowań podobnych do AUD w ciągu jednego ~5–6 tygodni, w tym picie na umór, eskalację w czasie oraz picie nieczułe na karę. Chociaż paradygmat oferuje jedną metodę oceny zachowań podobnych do AUD, projekt można łatwo dostosować do przewlekłego pomiaru przerywanego picia, testowania picia nieczułego na karę w odpowiedzi na zaciągnięcie powietrzem lub dodawania zmiennego stosunku operantów, między innymi. Ogólnie rzecz biorąc, zautomatyzowane systemy monitoringu w klatce w domu znacznie zwiększają przepustowość i szczegółowość, z jaką badacze mogą oceniać zachowania podobne do AUD, co umożliwia identyfikację nowych układów i metod leczenia.

Jak w przypadku każdej technologii, autorzy czasami doświadczają awarii mechanicznych i technicznych. Pomimo pokusy, by pozwolić systemowi działać bez nadzoru, kluczowe jest, aby śledczy regularnie monitorowali aparat, aby zapewnić prawidłowe funkcjonowanie. Okazjonalne awarie mechaniczne magnetycznych drzwi powodowały, że butelki z popijakiem były dla myszy niedostępne. Zdarzało się to rzadko przy odpowiednim czyszczeniu i konserwacji, zwykle minimalnie zakłócało zbieranie danych. Aby szybko wykrywać błędy, ważne jest monitorowanie butelek do sączenia pod kątem porównywalnych spadków płynów oraz regularne sprawdzanie aplikacji "Controller", aby upewnić się, że lizania są rejestrowane we wszystkich kątach u wszystkich zwierząt. Aby uzyskać bardziej szczegółowe porady, Masuda i współpracownicy przedstawiają doskonały opis, jak skonfigurować i wykonywać konserwację IntelliCage48.

Ważne jest również regularne obserwowanie zachowań zwierząt, aby monitorować walki lub inne zakłócające zachowania. Chociaż autorzy nie mieli większych problemów z walką podczas stosowania tego paradygmatu na myszach C57/BL6, wspólne mieszkanie samców o bardziej agresywnych genotypach powodowało poważne problemy. Regularnie obserwuj zaschniętą krew, kulejące zwierzęta lub inne oznaki walki, zwłaszcza po zmianie klatki. Jeśli ktoś zauważy te oznaki, natychmiast usuń wywołane zwierzę i wyklucz je z dalszych eksperymentów. Użyj sekcji "Indywidualna wydajność myszy" w dostępnym kodzie, aby ocenić, czy i przez jak długo agresja wpływała na zachowania picia poszczególnych myszy. Wyklucz wszystkie dotknięte dni z analizy. Jak wspomniano wcześniej, autorzy nie mogą zagwarantować uogólnialności protokołu na różne genotypy czy układy mieszkaniowe.

Z kolei autorzy czasem mieli problemy z myszami "zajmującymi" narożniki operantne, śpiąc lub zajmując ten sam kąt przez wiele godzin. To zachowanie blokuje innym myszom dostęp do butelek z popijkami w tym rogu. Takie sytuacje mogą zaburzyć wyniki picia, jeśli nie zostaną odpowiednio uwzględnione w analizie. Użyj sekcji "Corner Occupancy (Visit Durations)" oraz "Individual mouse performance" w dostępnym kodzie, aby zdecydować, czy "zajęcie" wpływało na zachowanie myszy na tyle, by wykluczyć niektóre dni eksperymentalne. Ogólnie rzecz biorąc, niemożność rejestrowania lub ilościowego określania zachowań społecznych podczas eksperymentów jest poważnym ograniczeniem tego zautomatyzowanego systemu monitoringu.

Wreszcie, jak to coraz częściej bywa w przypadku zaawansowanych metod neuronaukowych, zautomatyzowane systemy monitorowania klatki domowej generują ogromne ilości danych. Dzięki kodowi open-source, takiemu jak ten przedstawiony tutaj29 i opracowany przez innych63,64, eksperymentatorzy dysponują wieloma narzędziami do organizowania i analizy danych wychodzących. Jednak modyfikacje przedstawionego tutaj protokołu będą wymagały adaptacji kodu. Ponadto można by przeprowadzić liczne dodatkowe analizy na podstawie ogromu danych wyjściowych, które nie zostały tu przedstawione.

Na przykład badacze mogą być zainteresowani ilościowym określeniem spożycia alkoholu (g alkoholu na kg masy myszy dziennie). Autorzy omawiają to krótko i udostępniają wstępny kod do analizy w repozytorium GitHub29. Tam autorzy stosują współczynnik konwersji liza do objętości na poziomie 1,94 μL/lick, zgodny z obliczeniami Kasii Radwańskiej i współpracowników30,37. Chociaż współczynnik konwersji lizów był używany do oszacowania spożycia alkoholu przez innych w terenie 30,37,38,39, został on obliczony na podstawie pomiaru zużycia wody. Dlatego może to nie być dokładny pomiar 20% spożycia alkoholu ze względu na różnice w napięciu powierzchniowym między wodą a alkoholem. Inni w tej dziedzinie stosowali współczynnik konwersji liza 3 μL/lik 31,34,36,38, podkreślając potrzebę rozstrzygnięcia tego pomiaru. Nie można wykluczyć możliwości, że myszy wykonują lizania o różnych rozmiarach, co dodatkowo komplikuje obliczenia. Jeśli badacze są zainteresowani dokładnym pomiarem spożycia alkoholu (g/kg/dzień), autorzy zalecają obliczenie współczynnika konwersji lizania do objętości zgodnego z projektem eksperymentalnym.

Podsumowując, postęp i zwiększona dostępność zautomatyzowanych systemów monitorowania w klatkach domowych oferują badaczom AUD nowe i ulepszone narzędzia do preklinicznej oceny spożycia alkoholu. Operantne paradygmaty picia alkoholu przerywanego, takie jak ten, umożliwiają eksperymentatorom jednoczesną ocenę wielu aspektów zachowań podobnych do AUD z dużo większą przepustowością i z większą etyczną istotnością niż tradycyjne metody. Dzięki systemom testowym IntelliCage oraz otwartym alternatywom20,26, badacze mogą efektywniej i bardziej elastycznie badać zachowania związane z piciem alkoholu zgodne z AUD, przyspieszając identyfikację skutecznych interwencji.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Podziękowania

Prace te były wspierane finansowo z programu badań intramuralnych NIH National Institutes of Health dla V.A.A. (ZIA AA000421; ZIA MH002987). Chcielibyśmy podziękować Miriam Bocarsly, Anoo Maskeri i Erin Murray za pomoc w opracowaniu tego protokołu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Etanol, 190 proofDecon Laboratories2801G
System testowania IntelliCageSystemy TSEhttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/Zawiera 1x klatkę statyczną 2000P (Tecniplast, 2000P001) i nbsp; 4x domki do myszy (Tecniplast, ACRE011) oraz 8x butelki do sątania (Techniplast, ACBT0252) i kapsle (Techniplast, ACCP3521)
Oprogramowanie IntelliCage ("Designer", "Controller", "Analyzer")Systemy TSEhttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/Wersja 3.6.9.0
Pady ISO, 6" x 10"Braintree Scientific, Inc.ISO 6105Kompresowane wkładki z włókna bawełnianego (15,24 x 25,4 cm)
IzofluranBaxter10019-360-40
Isofluran VXP ™ Dobrze napełniony waporyzatorMedVet91305535
Dieta dla gryzoni laboratoryjnychLabDiet5001
Średnia komora indukcyjna myszy/szczura z pewnym uszczelnieniem;Światowe Precyzyjne InstrumentyEZ-178
GniazdkaAncareNES 3600Małe bawełniane kwadraty (5,08 x 5,08 cm)
OHAUS Compass™ Skala CX - 2 200 gramów x 1 gramUlineH-8110Do pomiarów masy ciała myszy
PC + DisplaySupermicrohttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/Sprzedawana jako część systemu testowego IntelliCage
Transponder RFID (1,25 x 7 mm)Systemy TSE290000-IC-60400
Injector transpondera RFIDAVIDAVID2028
Czytnik transpondera RFIDSystemy TSE290000-IC-50800
RStudioPozycjahttps://posit.co/download/rstudio-desktopWersja 2026.01.1+403; z Tidyverse (2.0.0) i Quarto (1.9.37)
Jednorazowa zlewka Tri PourConsolidated Plastics45317Do pomiarów masy ciała myszy

Bibliografia

  1. Melendez, R. I. Intermittent (Every-Other-Day) Drinking Induces Rapid Escalation of Ethanol Intake and Preference in Adolescent and Adult C57BL/6J Mice. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 35 (4), 652-658 (2011).
  2. Xiao, T., Chen, Y., Boisvert, A., Cole, M., Kimbrough, A. Chronic Intermittent Ethanol Vapor Exposure Paired with Two-Bottle Choice to Model Alcohol Use Disorder. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (196), e65320 (2023).
  3. Rhodes, J. S., Best, K., Belknap, J. K., Finn, D. A., Crabbe, J. C. Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice. Physiology & Behavior. 84 (1), 53-63 (2005).
  4. Thiele, T. E., Crabbe, J. C., Boehm, S. L. “Drinking in the Dark” (DID): A Simple Mouse Model of Binge-Like Alcohol Intake. Curr Protoc Neurosci. 68, 9.49.1-9.49.12 (2014).
  5. Huynh, N., Arabian, N. M., Asatryan, L., Davies, D. L. Murine Drinking Models in the Development of Pharmacotherapies for Alcoholism: Drinking in the Dark and Two-bottle Choice. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (143), e57027 (2019).
  6. Longley, M., Willis, E. L., Tay, C. X., Chen, H. An open source device for operant licking in rats. PeerJ. 5, e2981 (2017).
  7. Melo, M. C., Alves, P. E., Nogueira Cecyn, M., Eduardo, P. M. C., Abrahao, K. P. Development of an Eight-Wireless Automated Cage System with Two Lickometers Each for Rodents. eNeuro. 9 (4), ENEURO.0526-21.2022 (2022).
  8. Petersen, N., Adank, D. N., Raghavan, R., Winder, D. G., Doyle, M. A. LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home Cage Device): An Open-Source Tool for Recording Undisturbed Two-Bottle Drinking Behavior in a Home Cage Environment. eNeuro. 10 (4), (2023).
  9. Hou, S., Soto, N. M. A., Glover, E. J., Hou, S., Soto, N. M. A., et al. Modeling Alcohol Consumption in Rodents Using Two-Bottle Choice Home Cage Drinking and Microstructural Analysis. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (213), e67486 (2024).
  10. Wilcox, M. V., Cuzon Carlson, V. C., Sherazee, N., Sprow, G. M., Bock, R., et al. Repeated binge-like ethanol drinking alters ethanol drinking patterns and depresses striatal GABAergic transmission. Neuropsychopharmacology. 39 (3), 579-594 (2014).
  11. Godynyuk, E., Bluitt, M. N., Tooley, J. R., Kravitz, A. V., Creed, M. C. An Open-Source, Automated Home-Cage Sipper Device for Monitoring Liquid Ingestive Behavior in Rodents. eNeuro. 6 (5), (2019).
  12. Frie, J. A., Khokar, J. Y. An open source automated two-bottle choice test apparatus for rats. HardwareX. 5, e00061 (2019).
  13. Ieraci, A., Mallei, A., Popoli, M. Social Isolation Stress Induces Anxious-Depressive-Like Behavior and Alterations of Neuroplasticity-Related Genes in Adult Male Mice. Neural Plast. 2016, 6212983 (2016).
  14. Hebda-Bauer, E. K., Dokas, L. A., Watson, S. J., Akil, H. Adaptation to single housing is dynamic: Changes in hormone levels, gene expression, signaling in the brain, and anxiety-like behavior in adult male C57Bl/6J mice. Horm Behav. 114, 104541 (2019).
  15. Johnson, M. C., Zweig, J. A., Zhang, Y., Ryabinin, A. E. Effects of social housing on alcohol intake in mice depend on the non-social environment. Front Behav Neurosci. 18, (2024).
  16. Logue, S., Chein, J., Gould, T., Holliday, E., Steinberg, L. Adolescent mice, unlike adults, consume more alcohol in the presence of peers than alone. Developmental Science. 17 (1), 79-85 (2014).
  17. Holgate, J. Y., Garcia, H., Chatterjee, S., Bartlett, S. E. Social and environmental enrichment has different effects on ethanol and sucrose consumption in mice. Brain Behav. 7 (8), e00767 (2017).
  18. Panksepp, J. B., Rodriguez, E. D., Ryabinin, A. E. Sweetened-ethanol drinking during social isolation: Enhanced intake, resistance to genetic heterogeneity and the emergence of a distinctive drinking pattern in adolescent mice. Genes Brain Behav. 16 (3), 369-383 (2017).
  19. Johnson, M. C., Zweig, J. A., Zhang, Y., Ryabinin, A. E. Effects of social housing on alcohol intake in mice depend on the non-social environment. Front Behav Neurosci. 18, 1380031 (2024).
  20. Petersen, N., Adank, D. N., Quan, Y., Edwards, C. M., Hallal, S. D., et al. A Novel Mouse Home Cage Lickometer System Reveals Sex- and Housing-Based Influences on Alcohol Drinking. eNeuro. 11 (10), (2024).
  21. Lander, S. S., Linder-Shacham, D., Gaisler-Salomon, I. Differential effects of social isolation in adolescent and adult mice on behavior and cortical gene expression. Behavioural Brain Research. 316, 245-254 (2017).
  22. Kuhlman, K. R. Pitfalls and potential: Translating the two-hit model of early life stress from pre-clinical non-human experiments to human samples. Brain Behav Immun Health. 35, 100711 (2023).
  23. Lipp, H. P. High-throughput and Automated Behavioural Screening of Normal and Genetically Modified Mice. Bus Brief Future Drug Discov. , (2005).
  24. Kiryk, A., Janusz, A., Zglinicki, B., Turkes, E., Knapska, E., et al. IntelliCage as a tool for measuring mouse behavior - 20 years perspective. Behav Brain Res. 388, 112620 (2020).
  25. Iman, I. N., Yusof, N. A. M., Talib, U. N., Ahmad, N. A. Z., Norazit, A., et al. The IntelliCage System: A Review of Its Utility as a Novel Behavioral Platform for a Rodent Model of Substance Use Disorder. Front Behav Neurosci. 15, 683780 (2021).
  26. Frie, J. A., Khokhar, J. Y. FARESHARE: An open-source apparatus for assessing drinking microstructure in socially housed rats. NPP—Digit Psychiatry Neurosci. 2 (1), 1 (2024).
  27. Anderson, L. G., Tischer, A. E., Bock, R., Michaelides, M., Alvarez, V. A. Early life adversity increases striatal dopamine D1 receptor density and promotes social alcohol drinking in mice, especially males. Transl Psychiatry. , (2026).
  28. Bocarsly, M. E., Shaw, M. J., Ventriglia, E., Anderson, L. G., Goldbach, H. C., et al. Preexisting risk-avoidance and enhanced alcohol relief are driven by imbalance of the striatal dopamine receptors in mice. Nat Commun. 15 (1), 1-17 (2024).
  29. Bock, R., Anderson, L., Averbeck, T. . IntelliCage Intermittent Drinking Analysis Template [R]. , (2026).
  30. Radwanska, K., Kaczmarek, L. Characterization of an alcohol addiction-prone phenotype in mice. Addiction Biology. 17 (3), 601-612 (2012).
  31. Smutek, M., Turbasa, M., Sikora, M., Piechota, M., Zajdel, J., et al. A Model of Alcohol Drinking under an Intermittent Access Schedule Using Group-Housed Mice. PLOS ONE. 9 (5), e96787 (2014).
  32. Mijakowska, Z., Łukasiewicz, K., Ziółkowska, M., Lipiński, M., Trąbczyńska, A., et al. Autophosphorylation of alpha isoform of calcium/calmodulin-dependent kinase II regulates alcohol addiction-related behaviors. Addiction Biology. 22 (2), 331-341 (2017).
  33. Holgate, J. Y., Garcia, H., Chatterjee, S., Bartlett, S. E. Social and environmental enrichment has different effects on ethanol and sucrose consumption in mice. Brain and Behavior. 7 (8), e00767 (2017).
  34. Koskela, M., Piepponen, T. P., Andressoo, J. O., Võikar, V., Airavaara, M. Towards developing a model to study alcohol drinking and craving in female mice housed in automated cages. Behavioural Brain Research. 352, 116-124 (2018).
  35. Beroun, A., Nalberczak-Skóra, M., Harda, Z., Piechota, M., Ziółkowska, M., et al. Generation of silent synapses in dentate gyrus correlates with development of alcohol addiction. Neuropsychopharmacology. 43 (10), 1989-1999 (2018).
  36. Simmons, K. E., Healey, K. L., Li, Q., Moore, S. D., Klein, R. C. Effects of sex and genotype in human APOE-targeted replacement mice on alcohol self-administration measured with the automated IntelliCage system before and after repeated mild traumatic brain injury. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 45 (11), 2231-2245 (2021).
  37. Pagano, R., Salamian, A., Skonieczna, E., Wojtas, B., Gielniewski, B., et al. Molecular fingerprints in the hippocampus of alcohol seeking during withdrawal. Res Sq. , rs.3.rs-3337670 (2023).
  38. Stefaniuk, M., Pawłowska, M., Barański, M., Nowicka, K., Zieliński, Z., et al. Global brain c-Fos profiling reveals major functional brain networks rearrangements after alcohol reexposure. Neurobiol Dis. 178, 106006 (2023).
  39. Frycz, B. A., Nowicka, K., Konopka, A., Hoener, M. C., Bulska, E., et al. Activation of trace amine-associated receptor 1 (TAAR1) transiently reduces alcohol drinking in socially housed mice. Addiction Biology. 28 (7), e13285 (2023).
  40. Skupio, U., Sikora, M., Korostynski, M., Wawrzczak-Bargiela, A., Piechota, M., et al. Behavioral and transcriptional patterns of protracted opioid self-administration in mice. Addiction Biology. 22 (6), 1802-1816 (2017).
  41. Ismail, N. I. W., Jayabalan, N., Mansor, S. M., Müller, C. P., Muzaimi, M. Chronic mitragynine (kratom) enhances punishment resistance in natural reward seeking and impairs place learning in mice. Addiction Biology. 22 (4), 967-976 (2017).
  42. Ajonijebu, D. C., Abboussi, O., Mabandla, M. V., Daniels, W. M. U. Differential epigenetic changes in the hippocampus and prefrontal cortex of female mice that had free access to cocaine. Metab Brain Dis. 33 (2), 411-420 (2018).
  43. Kimbrough, A., Kim, S., Cole, M., Brennan, M., George, O. Intermittent Access to Ethanol Drinking Facilitates the Transition to Excessive Drinking After Chronic Intermittent Ethanol Vapor Exposure. Alcohol Clin Exp Res. 41 (8), 1502-1509 (2017).
  44. Gage, G. A., Muench, M. A., Jee, C., Kearns, D. N., Chen, H., et al. Intermittent-Access Operant Alcohol Self-Administration Promotes Binge-like Drinking and Drinking Despite Negative Consequences in Male and Female Heterogeneous Stock Rats. Neuropharmacology. 235, 109564 (2023).
  45. Hwa, L. S., Chu, A., Levinson, S. A., Kayyali, T. M., DeBold, J. F., et al. Persistent escalation of alcohol drinking in C57BL/6J mice with intermittent access to 20% ethanol. Alcohol Clin Exp Res. 35 (11), 1938-1947 (2011).
  46. Miczek, K. A., Akdilek, N., Ferreira, V. M. M., Kenneally, E., Leonard, M. Z., et al. Excessive alcohol consumption after exposure to two types of chronic social stress: intermittent episodes vs. continuous exposure in C57BL/6J mice with a history of drinking. Psychopharmacology (Berl). 239 (10), 3287-3296 (2022).
  47. Ko, Y. E., Hwa, L. S. Serotonin regulation of intermittent and continuous alcohol drinking in male and female C57BL/6J mice with systemic SB242084 and buspirone. Alcohol Alcohol. 58 (3), 280-288 (2023).
  48. Masuda, A., Kobayashi, Y., Itohara, S. Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer’s Disease, Using IntelliCage. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (138), e58009 (2018).
  49. Kahnau, P. General Instructions for Using the IntelliCage with Mice. Curr Protoc. 6 (2), e70314 (2026).
  50. Thiele, T. E., Navarro, M. “Drinking in the dark” (DID) procedures: a model of binge-like ethanol drinking in non-dependent mice. Alcohol. 48 (3), 235-241 (2014).
  51. Rice, C. J., Sandman, C. A., Lenjavi, M. R., Baram, T. Z. A novel mouse model for acute and long-lasting consequences of early life stress. Endocrinology. 149 (10), 4892-4900 (2008).
  52. Ivy, A. S., Brunson, K. L., Sandman, C., Baram, T. Z. Dysfunctional nurturing behavior in rat dams with limited access to nesting material: a clinically relevant model for early-life stress. Neuroscience. 154 (3), 1132-1142 (2008).
  53. Baram, T. Z., Davis, E. P., Obenaus, A., Sandman, C. A., Small, S. L., et al. Fragmentation and unpredictability of early-life experience in mental disorders. Am J Psychiatry. 169 (9), 907-915 (2012).
  54. Molet, J., Maras, P. M., Avishai-Eliner, S., Baram, T. Z. Naturalistic rodent models of chronic early-life stress. Dev Psychobiol. 56 (8), 1675-1688 (2014).
  55. Walker, C. D., Bath, K. G., Joels, M., Korosi, A., Larauche, M., et al. Chronic early life stress induced by limited bedding and nesting (LBN) material in rodents: critical considerations of methodology, outcomes and translational potential. Stress. 20 (5), 421-448 (2017).
  56. Demaestri, C., Gallo, M., Mazenod, E., Hong, A. T., Arora, H., et al. Resource scarcity but not maternal separation provokes unpredictable maternal care sequences in mice and both upregulate Crh-associated gene expression in the amygdala. Neurobiology of Stress. 20, 100484 (2022).
  57. Peña, C. J. Early-life stress sensitizes response to future stress: Evidence and mechanisms. Neurobiology of Stress. 35, 100716 (2025).
  58. Dube, S. R., Felitti, V. J., Dong, M., Chapman, D. P., Giles, W. H., et al. Childhood abuse, neglect, and household dysfunction and the risk of illicit drug use: the adverse childhood experiences study. Pediatrics. 111 (3), 564-572 (2003).
  59. Anda, R. F., Felitti, V. J., Bremner, J. D., Walker, J. D., Whitfield, C., et al. The enduring effects of abuse and related adverse experiences in childhood. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 256 (3), 174-186 (2006).
  60. Pilowsky, D. J., Keyes, K. M., Hasin, D. S. Adverse Childhood Events and Lifetime Alcohol Dependence. Am J Public Health. 99 (2), 258-263 (2009).
  61. Kirsch, D., Nemeroff, C. M., Lippard, E. T. C. Early Life Stress and Substance Use Disorders: Underlying Neurobiology and Pathways to Adverse Outcomes. ADV RES SCI. 1 (1), 29-47 (2020).
  62. Leza, L., Siria, S., López-Goñi, J. J., Fernández-Montalvo, J. Adverse childhood experiences (ACEs) and substance use disorder (SUD): A scoping review. Drug Alcohol Depend. 221, 108563 (2021).
  63. Ruffini, N., Müller, M. B., Schmitt, U., Gerber, S. IntelliPy: a GUI for analyzing IntelliCage data. Bioinformatics. 37 (21), 3972-3973 (2021).
  64. Daguano Gastaldi, V., Hindermann, M., Wilke, J. B. H., Ronnenberg, A., Arinrad, S., et al. A comprehensive and standardized pipeline for automated profiling of higher cognition in mice. Cell Reports Methods. 5 (3), 101011 (2025).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Warunkowanie instrumentalnesystem IntelliCagezaburzenia związane z używaniem alkoholuzautomatyzowana ocenaprzerywany dostęp do alkoholutransponder RFIDdobrowolne piciebadania wysokoprzepustowe

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.