Zstandardizowana in vitro procedura oceny zmian mikrohardości powierzchni kompozytów żywicy nanohybrydowej po ekspozycji na napój białkowy z serwatki

Summary

Ten protokół opisuje standaryzowany in vitro metodę oceny wpływu napojów z białkiem serwatki na mikrohardness kompozytów żywicznych. Podejście to umożliwia kontrolowaną ocenę narażenia dietetycznego z wykorzystaniem cyklicznego zanurzania i testowania Vickersa, zapewniając model powtarzalny do badania interakcji między napojami odżywczymi a biomateriałami regenerującymi.

Abstract

Celem niniejszej in vitro badania była ocena wpływu różnych napojów z białkiem serwatkowym na mikrohardość powierzchni trzech nanohybrydowych kompozytów żywic. Łącznie przygotowano 90 próbek o kształcie dysku z trzech nanohybrydowych kompozytów żywic (n = 30 na materiał) i podzielono je na trzy grupy (n = 10) zgodnie z środkiem do zanurzania: koncentrat serwatki, izolat serwatki i woda destylowana. Próbki były zanurzane przez 10 minut dwa razy dziennie przez 30 dni. Mikrohardość powierzchni mierzono na początku i po zanurzeniu za pomocą testerów mikrohardości Vickersa, a zmianę twardości obliczano jako ΔVHN. Dane analizowano za pomocą dwustronnej analizy wariancji z powtórzeniami i testów post-hoc. Analiza wykazała, że typ kompozytu, roztwór do zanurzania i ich wzajemne działanie miały statystycznie istotny wpływ na wartości ΔVHN (p < 0.0001). Największą utratę twardości zanotowano w przypadku kompozytu wstrzykiwanego eksponowanego na koncentrat serwatki (ΔVHN: 10,4 ± 2,1), podczas gdy najniższą zmianę odnotowano w wysoce wypełnionym kompozycie przechowywanym w wodzie destylowanej (ΔVHN: 0,9 ± 0,4). Zanurzenie w koncentracie serwatki wywołało znacznie większą utratę twardości we wszystkich kompozytach w porównaniu z wodą destylowaną (p < 0.05). Izolat serwatki również spowodował znacznie większą utratę twardości we wszystkich kompozytach z wyjątkiem wysoko wypełnionego kompozytu, w którym nie zaobserwowano statystycznie istotnej różnicy (p = 0.076). Te wyniki wskazują, że napoje z białkiem serwatkowym mogą zmniejszać mikrohardość powierzchni kompozytów żywic, a stopień degradacji zależy zarówno od składu materiału, jak i od formuły napoju.

Introduction

Długoterminowy sukces rekonstrukcji z kompozytów żywicowych zależy od ich odporności na złożone wyzwania środowiskowe jamy ustnej, w tym na obciążenia mechaniczne, narażenie na dietetyczne czynniki oraz degradację chemiczną^1,2. Kompozyty żywiczne nanohybrydowe są szeroko stosowane ze względu na swoje korzystne właściwości estetyczne i mechaniczne, w szczególności mikrohardość powierzchni, która służy jako ważny wskaźnik odporności na zużycie i degradację strukturalną^3,4.

Poprzednie badania wykazały, że narażenie na kwaśne napoje takie jak soki owocowe, napoje gazowane i napoje energetyczne może niekorzystnie wpływać na rekonstrukcje kompozytowe poprzez zmniejszenie mikrohardości powierzchni i zmianę integralności powierzchni^5,6,7,8. Te efekty degradacyjne są wpływane przez wiele czynników, w tym pH, czas narażenia i skład wypełniacz-matryca. Jednak większość istniejących modeli eksperymentalnych opiera się na bardzo kwaśnych roztworach, które mogą nie dokładnie odzwierciedlać wyzwań chemicznych spotykanych we współczesnych nawykach żywieniowych.

W przeciwieństwie do tego, napoje na bazie białka serwatki zyskały szeroką popularność ze względu na swoją wartość odżywczą i rosnące spożycie wśród osób zainteresowanych fitnessem^9,10. Pomimo ich prawie neutralnego pH, napoje te zawierają laktozę, białka i inne składniki organiczne, które mogą wchodzić w interakcje z matrycą żywicową i wpływać na stabilność materiału. Dlatego ocena ich wpływu wymaga protokołu, który uwzględnia nie tylko kwasowość, ale także skład organiczny i powtarzające się wzorce narażenia.

Głównym celem tego protokołu jest zapewnienie standaryzowanej i możliwej do powtórzenia metody in vitro do oceny wpływu napojów na bazie białka serwatki, szczególnie w formułach stężonych i izolowanych, na mikrohardość powierzchni nanohybrydowych kompozytów żywicowych. Ta metoda umożliwia kontrolowane symulowanie codziennego narażenia dietetycznego poprzez cykliczne zanurzanie, poprawiając tym samym eksperymentalną istotność warunków testów in vitro.

W porównaniu z konwencjonalnymi modelami narażenia na kwaśne napoje, ten protokół oferuje kilka zalet. Po pierwsze, pozwala na badanie degradacji materiału w warunkach prawie neutralnego pH, umożliwiając ocenę reakcji materiału poza efektami wynikającymi z kwasów. Po drugie, cykliczne zanurzanie lepiej odbija wzorce rzeczywistego spożycia. Po trzecie, metoda umożliwia porównawczą ocenę różnych formuł kompozytów na podstawie cech strukturalnych, takich jak zawartość wypełniaczy i skład matrycy żywicowej.

Ten protokół jest szczególnie odpowiedni dla badaczy, którzy chcą ocenić chemiczną stabilność materiałów rekonstrukcyjnych w warunkach odżywczych, jak również dla badań dotyczących interakcji między składnikami dietetycznymi a biomateriałami dentystycznymi. Może on również być dostosowany do testowania alternatywnych formuł napojów, powierzchniowych obróbek lub nowo opracowanych materiałów kompozytowych.

Protocol

Suplementy i sprzęt użyty są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie próbek

1. Przygotuj łącznie 90 próbek o kształcie dysku z trzech nanohybrydowych kompozytów żywic (n = 30 na materiał).
2. Wykonaj próbki za pomocą cylindrycznych foremek z przezroczystego silikonu (6 mm średnicy × 2 mm grubości), aby zapewnić standaryzowane wymiary.
3. Włóż materiał kompozytowy do foremek jednym krokiem (2 mm grubości) i przykryj powierzchnię przezroczystym szkiełkiem mikroskopowym, aby uzyskać płaską powierzchnię.
4. Polimeryzuj próbkę za pomocą niebieskiego LED urządzenia do utwardzania światłem (≈440–480 nm widmo emisji) umieszczonego w odległości około 1 mm od powierzchni z intensywnością wyjściową 1000 mW/cm² przez 20 s.
5. Sprawdź intensywność światła utwardzającego za pomocą radiometru przed każdym cyklem polimeryzacji, aby zapewnić spójne naświetlenie.
6. Przechowywaj przygotowane próbki w destylowanej wodzie w temperaturze 37 °C przez 24 godziny, aby pozwolić na polimeryzację i symulować początkowe warunki jamy ustnej.
   UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w destylowanej wodzie w temperaturze 37 °C do 24 godzin przed dalszym przetwarzaniem.

2. Procedura wykańczania i polerowania

1. Wykończ i wypoleruj górną powierzchnię wszystkich próbek za pomocą tarcz polerujących nasączonych tlenkiem glinu. Wszystkie procedury polerowania powinny być wykonywane przez jednego operatora, aby zapewnić standaryzację powierzchni.
2. Wykonuj polerowanie sekwencyjnie za pomocą tarcz średnich, drobnych i bardzo drobnych po 10 s każda pod chłodzeniem wodnym przy około 10 000 obr./min z lekkim naciskiem i jednokierunkowym ruchem obrotowym.
3. Wymieniaj tarcze polerujące co pięć próbek, aby zachować spójną efektywność ścierania i zapewnić standaryzację powierzchni.
4. Po każdym etapie polerowania, spłucz próbki destylowaną wodą przez 10 s, aby usunąć zanieczyszczenia i lekko osusz je na powietrzu przez 5 s przed przejściem do kolejnej tarczy.
5. Znacz każdą niepolerowaną powierzchnię próbki unikalnym kodem identyfikacyjnym, aby zapewnić spójną orientację podczas kolejnych testów.
6. Przechowywaj próbki w destylowanej wodzie w temperaturze 37 °C przez 24 godziny przed testem twardości bazowej.
   UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w destylowanej wodzie w temperaturze 37 °C do 24 godzin przed testem bazowym.

3. Pomiar twardości bazowej

1. Przeprowadź bazowy test mikrohardness Vickersa (VHN) zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami za pomocą tester mikrotwardości Vickersa¹¹.
2. Zastosuj obciążenie 200 g przez 15 s czasu trwania.
3. Wykonaj trzy wgłębienia na każdej próbce z odstępem co najmniej 1 mm. Przeprowadź wgłębienia na środkowej powierzchni każdej próbki, aby uniknąć efektów krawędzi.
4. Oblicz średnią bazalną VHN.
5. Wykonuj pomiary jednoosobowo, kalibrowanym operatorem, aby zminimalizować zmienność.
   UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w destylowanej wodzie w temperaturze 37 °C do 24 godzin przed zanurzeniem.

4. Przygotowanie środowiska do zanurzania

1. Przygotuj dwie formuły białka serwatki: koncentrat białka serwatki (WC) i izolat białka serwatki (WI) za pomocą dostępnych komercyjnie proszków.
2. Rozpuść 25 g proszku białka serwatki w 200 ml destylowanej wody (0,125 g/ml), aby przygotować roztwory do zanurzania.
3. Wymieszaj roztwory za pomocą ekstraktora laboratoryjnego przez 60 s, aż osiągniesz całkowite rozpuszczenie.
4. Pozwól, aby roztwory zrównoważały się w temperaturze pokojowej przez 5 min, aby zminimalizować tworzenie piany i zapewnić jednorodność.
5. Zmierzyj i zapisz pH każdego roztworu za pomocą skalibrowanego cyfrowego miernika pH przed zanurzeniem.
6. Przygotuj świeże roztwory serwatki przed każdym cyklem zanurzania, aby zapewnić spójną składnik chemiczny i uniknąć degradacji białka.
7. Użyj 10 ml roztworu do zanurzania na próbkę, aby zapewnić całkowite zanurzenie podczas każdego cyklu.

5. Procedura zanurzania

1. Podziel każdą grupę kompozytów na trzy podgrupy (n = 10).
2. Zaniekaj próbki w przypisanych roztworach przez 10 min, dwa razy dziennie. Wybierz czas i częstotliwość zanurzania na podstawie wcześniej ustanowionych in vitro modeli ekspozycji na napoje, za

Results

Statystyki opisowe

Średnie wartości ΔVHN (±SD) dla kombinacji kompozyt-roztwór są przedstawione w Tabeli 1.

Kompozyt żywicy	Roztwór	ΔVHN (Średnia ± SD)	95% CI	n
EA

Discussion

Niniejszy protokół zapewnia standaryzowane podejście do oceny wpływu chemicznego napojów białkowych z serwatki na mikrohardość kompozytu żywicowego. Kluczowe kroki obejmują jednolite wykonanie próbek, kontrolowane warunki utwardzania światłem oraz standaryzowane parametry testowania Vickersa. Konieczne jest utrzymanie spójnych wymiarów próbek i intensywności utwardzania, ponieważ zmiany mogą wpływać na stopień konwersji i stabilność mechaniczną. Dodatkowo, ścisła kontrola czasu i temperatury zanurzenia zapewnia powtarzal...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum oxide polishing discs	RubyPlaton, Inci Dental Tibbi Malz. San. ve Tic. Ltd. Sti., Istanbul, Turkey	5714	Medium, fine, superfine, used for finishing and polishing
Analytical balance			Used for weighing materials
Artificial saliva solution	DIN 53160-1, Testonic Laboratory, Istanbul, Turkey		Used for storage between immersion cycles
Digital pH meter	Hanna Instruments, Woonsocket, RI, USA	HI2211	Measurement of beverage pH
Distilled water	Not specified	Not applicable	Used as control solution and for specimen storage
Glass microscope slide	Ningbo Trueline Imp. & Exp. Co., Ltd, Zhejiang, China	7102	Used to obtain a flat specimen surface during composite placement
Graduated cylinder	Not specified	Not applicable	Used for measuring liquid volumes
Highly filled nano hybrid resin composite (EA)	Estelite Asteria (Tokuyama Dental, Tokyo, Japan)	10942	Used as restorative material; differs in filler content and resin matrix composition
Incubator	Memmert Universal, Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany	UN55	Used for storage at 37 °C
Injectable nano hybrid resin composite (GUI)	G-ænial Universal Injectable (GC Corporation, Tokyo, Japan)	12365	Used as restorative material; differs in filler content and resin matrix composition
Laboratory beaker	Not specified	Not applicable	Used for preparation of whey protein solutions
Laboratory shaker	Not specified	Not applicable	Used for mixing and homogenization of solutions
LED light-curing unit and radiometer	Woodpecker LED curing unit (Guilin Woodpecker Medical Instrument Co., Ltd., Guangxi, China)	FD-300	Polymerization and  verification of light intensity
Micromotor handpiece	FX205, NSK Ltd., Kanuma, Japan	C1056002	Used in polishing procedure
Moderately filled nano hybrid resin composite (FU)	Filtek Universal (3M ESPE, St. Paul, MN, USA)	6570A2	Used as restorative material; differs in filler content and resin matrix composition
Silicone mold	Not specified	Not applicable	Disc-shaped, 6 mm diameter × 2 mm thickness, used for specimen fabrication
Vickers microhardness tester	HMV, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan	HMV-G31	Vickers hardness number (VHN) testing
Whey protein concentrate powder	Whey Protein Strawberry Flavor, Proteinocean Gida AS., Ankara, Turkey		Lactose content: ~1–2%, protein content: ~85–90%
Whey protein isolate powder	Isolate Whey Chocolate Flavor, Proteinocean Gida AS., Ankara, Turkey		Lactose content: ~4–6%, protein content: ~70–80%