Artykuł badawczy

Reprezentatywna, celowana charakterystyka molekularna i genomowa genów zjadliwości u gronkowca aureusowego w wyniku infekcji stóp cukrzycowych

DOI:

10.3791/71373

⸱

29 maja 2026

 ,  , 
1Department of Microbiology, College of Medicine, University of Anbar, 2Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Pharmacy, University of Anbar

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to charakteryzowało mechanizmy oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, determinantów zjadliwości oraz cech genomowych izolatów Staphylococcus aureus wyleczonych po infekcjach stóp cukrzycowych za pomocą testów podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe, profilowania zjadliwości opartego na PCR oraz sekwencjonowania całego genomu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infekcje stóp cukrzycowych (DFIs) stanowią poważny problem zdrowia publicznego, a metycylinooporny Staphylococcus aureus (MRSA) należy do najbardziej istotnych klinicznie patogenów. Badanie to obejmowało częstość występowania genów zjadliwości (can i hlg), profile oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe oraz reprezentatywne cechy genomowe wieloopornych izolatów S. aureus wykrytych u pacjentów z DFI. Badanie obserwacyjne przekrojowe przeprowadzono na 125 pacjentach z infekcjami stóp cukrzycowych między styczniem a grudniem 2024 roku. Testy podatności na antybakteryje przeprowadzono metodą dyfuzji dysków Kirby–Bauera oraz przesiewową ceoksytyną zgodnie z wytycznymi Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), przy czym S. aureus ATCC 25923 został użyty jako szczep kontroli jakości. Podatność na wankomycynę potwierdzono testem minimalnego stężenia hamującego (MIC). Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) została wykorzystana do wykrywania genów zjadliwości (can i hlg) oraz blaOXA-grupy I. Sekwencjonowanie całego genomu (WGS) przeprowadzono na dwóch reprezentatywnych izolatach, w tym jednym wielolekoopornym (MDR) izolacie oraz jednym izolacie o bardzo zaawansowanym na leki (XDR), stosując podejście sekwencjonowania de novo do generowania szkic zespołów genomowych. Wśród 125 próbek klinicznych zaobserwowano wzrost bakterii w 90 próbkach (72%), z czego 45 izolatów (50%) zidentyfikowano jako S. aureus. Spośród tych izolatów 35/45 (77,78%) zostało sklasyfikowanych jako MRSA, a 36/45 (80%) było opornych na wiele leków. Gen HLG wykryto we wszystkich izolatach, natomiast gen can w 13/45 (28,89%) izolatach. Nie wykryto genów grupy blaOXA I. Analiza genomowa zidentyfikowała wiele genów związanych z opornością, w tym blaZ, tet(38), norA i vanT, wraz z elementami CRISPR-Cas i determinantami oporności związanymi z plazmidami. Wyniki te podkreślają wysoką częstość występowania wielolekoopornej S. aureus w DFI oraz potwierdzają znaczenie dalszego nadzoru genomowego klinicznie istotnych szczepów opornych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liczne cechy kolonizacji i zjadliwości sprawiają, że bakteria gram-dodatnia Staphylococcus aureus (S. aureus) jest powszechnym patogenem oportunistycznym zdolnym do wywoływania szerokiego zakresu infekcji, w tym liszatka, infekcji ran, furunkuli, ropni skóry, bakteriemii oraz zakaźnego zapalenia wsierdzia1. Niektóre z tych infekcji mogą przekształcić się w ciężki przebieg choroby i wymagać hospitalizacji, szczególnie u pacjentów z cukrzycą, immunosupresją, nowotworami, cewnikami moczowymi lub zakażeniem wirusem niedoboru odporności ludzkiej1.

Szczepy S. aureus (MRSA) oporne na metycylinę wiążą się ze znaczną zachorowalnością i śmiertelnością ze względu na zdolność szybkiego nabycia determinantów oporności na działanie przeciwdrobnoustrojowe oraz utrzymywania się w środowisku opieki zdrowotnej1. Pacjenci z cukrzycą często rozwijają owrzodzenia stóp cukrzycowych z powodu neuropatii, niewydolności naczyń oraz osłabionych odpowiedzi immunologicznych2. Infekcje stóp cukrzycowych (DFI) mają złożoną patofizjologię, a wyniki kliniczne są zależne zarówno od czynników mikroorganizmów, jak i związanych z gospodarzem, w tym przez zjadliwość bakteryjną3. Chociaż wrzody stóp cukrzycowych mogą zawierać polidrobnoustrojowe społeczności złożone z bakterii tlenowych i beztlenowych oraz grzybów, S. aureus pozostaje jednym z dominujących patogenów wyizolowanych z tych infekcji4. Organizm posiada kilka czynników determinujących zjadliwość, które ułatwiają unikanie odporności, inwazję tkanek, przewlekłą kolonizację oraz przewlekłe infekcje. Ponadto nabycie oporności na metycylinę pośredniczoną przez mecA/SCCmec oraz innych czynników determinujących oporność przeciwdrobnoustrojową znacznie ograniczyło możliwości terapeutyczne w przypadku infekcji związanych z DFI 4,5. Wcześniejsze badania wykazały wysoką częstość występowania wielolekoopornych (MDR) izolatów S. aureus w infekcjach stóp cukrzycowych, z opornością często związaną z genami β-laktamazy, w tym wariantami blaTEM, bla OXA i blaCTX-M 6.

Kilka genów związanych z zjadliwością przyczynia się do patogenności i trwałości S. aureus w przewlekłych infekcjach ran. Wśród nich gen hlg koduje γ-hemolizynę, czynnik cytotoksyczny związany z niszczeniem tkanek, stanem zapalnym, uniknięciem układu odpornościowego oraz utrzymywania się szczepów MRSA nabytych przez społeczność 7,8. Gen can koduje kolagenową adhezynę, która ułatwia przyleganie bakterii do tkanek bogatych w kolagen i przyczynia się do przewlekłej kolonizacji i trwałości infekcji8. Wcześniejsze badania wykazały wysoką częstość występowania hlg wśród izolatów MRSA wyleczonych po infekcjach stóp cukrzycowych, podkreślając współwystępowanie zjadliwości i determinantów oporności przeciwdrobnoustrojowej w tych infekcjach9. Nieodpowiednia ekspozycja na antybiotyki, długotrwała hospitalizacja, zaburzona penetracja substancji przeciwdrobnoustrojowych do tkanek oraz przewlekły postęp rany dodatkowo przyczyniają się do pojawiania się i rozprzestrzeniania organizmów MDR u pacjentów zDFIs 10. Według międzynarodowych definicji, wielolekooporne bakterie (MDR) wykazują oporność na co najmniej jeden środek przeciwdrobnoustrojowy z trzech lub więcej klas antybakteryjnych, intensywnie odporne na leki (XDR) pozostają podatne tylko na jedną lub dwie klasy przeciwdrobnoustrojów, a panlekooporne (PDR) są odporne na wszystkie testowane klasy antybakteryjne10. Pomimo uznanego znaczenia klinicznego S. aureus w infekcjach stóp cukrzycowych, istnieją ograniczone zintegrowane informacje molekularne i genomowe łączące determinanty zjadliwości z profilami oporności przeciwdrobnoustrojowej w klinicznych izolatach z tego regionu.

Dlatego celem tego badania było scharakteryzowanie wzorców oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, określenie częstości występowania wybranych genów zjadliwości (hlg i can), zbadanie występowania genów blaOXA grupy I oraz przeprowadzenie reprezentatywnej analizy sekwencjonowania całego genomu wybranych wieloopornych izolatów S. aureus wyleczonych u pacjentów z infekcjami stóp cukrzycowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pacjenci badawczy

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Etycznych Aprobacji Uniwersytetu w Anbarze, Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań Naukowych, Irak (Zatwierdzenie nr 145), miasto Ramadi, gubernatorat Anbar, Irak, 24 grudnia 2023 roku. Wszystkie procedury z udziałem uczestników ludzkich były wykonywane zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi etycznymi Uniwersytetu w Anbarze. Przed zapisaniem się wszyscy uczestnicy uzyskali pisemną świadomą zgodę.

Od stycznia do grudnia 2024 roku przeprowadzono przekrojowe badanie obserwacyjne w Ramadi Teaching Hospitals oraz powiązanych prywatnych klinikach w gubernatorstwie Anbar w Iraku. W okresie badania włączono łącznie 125 kolejnych uprawnionych pacjentów z infekcjami cukrzycowych stopy (DFI). Wielkość próby została ustalona na podstawie liczby uprawnionych pacjentów dostępnych w okresie badania, a nie na podstawie obliczeń statystycznych. Klinicznie DFI definiowano jako obecność wrzodu stopy dowolnego stopnia u pacjentów z cukrzycą typu 1 (T1DM) lub cukrzycą typu 2 (T2DM). Wśród nich byli pacjenci męscy i żeńscy o różnym nasileniu wrzodów.

Pacjenci byli uprawnieni, jeśli mieli klinicznie zdiagnozowany wrzód cukrzycowej stopy, odwiedzali uczestniczące placówki opieki zdrowotnej i wyrażali świadomą zgodę. Kryteria wykluczenia obejmowały wrzody stopy niezwiązane z cukrzycą (np. wrzody pourazowe), skierowanie z innych placówek medycznych, niemożność wyrażenia świadomej zgody z powodu poważnej choroby, przyjęcie terapii antybiotykami w ciągu 48 godzin przed pobraniem próbki oraz zakażenia polidrobnoustrojowe. Pacjenci z infekcjami polidrobnoustrojowymi zostali wykluczeni, aby zapewnić dokładną charakterystykę fenotypicką, molekularną i genomową izolatów Staphylococcus aureus . Dane demograficzne i kliniczne, w tym wiek, płeć, powikłania cukrzycowe, czas trwania cukrzycy, historia antybiotyków oraz choroby współistniejące, zostały zebrane za pomocą ustrukturyzowanego kwestionariusza.

Próbki kliniczne były transportowane do laboratorium mikrobiologicznego w ciągu 2 godzin od pobrania w warunkach chłodzonych (4 °C) za pomocą sterylnych wymazów transportowych zawierających podłoże Amiesa i natychmiast przetwarzane do analizy mikrobiologicznej. Wszystkie procedury obejmujące próbki kliniczne, hodowle bakteryjne, testy podatności na antybaktery, reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) oraz wizualizację ultrafioletową (UV) były przeprowadzane w warunkach laboratoryjnych poziomu biobezpieczeństwa 2 (BSL-2) zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego biobezpieczeństwa. Personel laboratorium używał odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (PPE), w tym fartuchów laboratoryjnych, jednorazowych rękawiczek, masek chirurgicznych oraz ochrony oczu, gdy było to konieczne. Stosowano surowe procedury aseptyczne we wszystkich procedurach mikrobiologicznych i molekularnych, aby zminimalizować ryzyko skażenia i narażenia. Dedykowane obszary robocze wykorzystywano do obsługi hodowli bakterii oraz procedur amplifikacji DNA, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Zanieczyszczone materiały, w tym płytki hodowlane, wymazy, końcówki pipet i jednorazowe materiały, były autoklawowano w temperaturze 121 °C i 15 psi przez 15–20 minut przed utylizacją. Ostre przedmioty były wyrzucane w wyznaczonych pojemnikach odpornych na przebicie i niebezpiecznych dla biologicznych. Odpady biologiczne były zarządzane zgodnie z instytucjonalnymi protokołami utylizacji odpadów biomedycznych. Te środki bezpieczeństwa biologicznego zapewniły bezpieczne obchodzenie się z organizmami opornymi na wiele leków, w tym MRSA i izolatami opornymi na wankomycynę (Rysunek 1).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przegląd klinicznego, mikrobiologicznego, molekularnego, całego genomu i bioinformatycznego workflow stosowanego w badaniu. Rysunek podsumowuje pobieranie próbek, hodowlę mikrobiologiczną, testy podatności na antybaktery, molekularną detekcję opartą na PCR, sekwencjonowanie całego genomu oraz analizy bioinformatyczne w dalszej fazie. Wartość ta została wygenerowana przy wsparciu platformy projektowej opartej na AI Gamma Pro (Gamma App), a następnie przeanalizowana, poprawiana i weryfikowana przez autorów pod kątem dokładności naukowej. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Dane analizowano przy użyciu oprogramowania SPSS w wersji 22.0. Obliczono statystyki opisowe, w tym średnie i procenty. Powiązania między zmiennymi kategorycznymi analizowano za pomocą testu chi-kwadrat. Wartość p <0,05 została uznana za statystycznie istotną.

2. Przetwarzanie i zbieranie próbek

Próbki pobrano z głębszej części owrzodzeń stóp cukrzycowych metodą głębokiego wymazu. Dwa sterylne patyczki wacikowe wstępnie nawilżone sterylnym bulionem były mocno obracane na podstawie rany po oczyszczaniu sterylnym skalpelem i oczyszczaniu sterylną solą fizjologiczną, aby zminimalizować zanieczyszczenie przez kolonizujące mikroorganizmy. Jeden wymaz służył do barwienia Grama, natomiast drugi do hodowli mikrobiologicznej. Bezpośrednie rozmazy barwione Gramem były badane mikroskopowo.

Próbki tkanki kostnej pobrano od pacjentów z klinicznie podejrzewanym zapaleniem osteomyelitis w warunkach sterylnych po chirurgicznym debride. Przed pobraniem próbki powierzchnie wrzodów były oczyszczane sterylną soli fizjologicznej, aby zmniejszyć powierzchniowe zanieczyszczenie. Próbki tkanki kostnej były aseptycznie pobierane za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych i natychmiast przenoszone do sterylnych pojemników w celu przetwarzania mikrobiologicznego.

Próbki były homogenizowane lub drobno mielone w warunkach sterylnych i inokulowane na agarze krwi, agarze solnym Mannitol (MSA), agarze MacConkey oraz agarze odżywczym. Płyty były inkubowane aerobicznie w temperaturze 37 °C przez 18–24 godziny. Agar krwiowy i agar odżywczy wspierały wzrost organizmów Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, podczas gdy MSA był stosowany do selektywnej izolacji i różnicowania gatunków Staphylococcus , w tym S. aureus. Agar MacConkey był używany do odzyskiwania bakterii Gram-ujemnych. Po inkubacji zbadano płytki hodowlane, a próbki bez widocznego wzrostu po 48 godzinach zgłoszono jako "brak wzrostu".

Wstępna identyfikacja bakteryjna opierała się na morfologii kolonii, barwieniu Gram oraz cechach biochemicznych, a następnie molekularnym potwierdzeniu S. aureus za pomocą amplifikacji PCR genu nucowego . Identyfikacja biochemiczna obejmowała testy katalazy, testy koagulazy i szkiełkowe, fermentację manitolową oraz testy DNazy. Potwierdzone izolaty były dodatkowo identyfikowane za pomocą systemu VITEK 2 Compact z kartą identyfikacyjną VITEK 2 GP. Wyniki identyfikacji akceptowano tylko wtedy, gdy poziom ufności wynosił ≥95%. Wyniki niezgodności lub o niskiej pewności były ponownie testowane za pomocą powtarzanej analizy biochemicznej oraz testów VITEK. Czyste izolaty były przechowywane w 20% glicerolu przygotowanym w bulionie do infuzji serca mózgu (BHI) do późniejszych analiz molekularnych i genomowych (Rysunek 1).

3. Testy podatności na antybakterium

Testy podatności na działanie przeciwdrobnoustrojów przeprowadzono przy użyciu metody dyfuzji dyskowej Kirby–Bauera zgodnie z wytycznymi Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) z 2022 roku. Testy przeprowadzono na agarze Mueller–Hinton o ustandaryzowanej głębokości agaru 4 mm. Świeże hodowle bakteryjne były dostosowywane do standardu 0,5 McFarlanda za pomocą densytometru przed inokulacją. Do równomiernego zaszczepienia powierzchni agaru używano sterylnych wymazów.

Zastosowano następujące dyski przeciwdrobnoustrojowe: ampicylina (10 μg), gentamicyna (10 μg), amikacyna (30 μg), cefosytyna (30 μg), cefuroksyma (30 μg), piperacylina/tazobaktam (100/10 μg), meropenem (10 μg), amoksycylina–kwas klavulanowy (30 μg), oksacylina (1 μg), lewofloksacyna (5 μg), klindamycyna (2 μg), tigecyklina (15 μg), Cyprofloksacyna (5 μg), erytromycyna (15 μg), trimetoprim–sulfametatoksazol (25 μg), linezolid (30 μg) oraz wankomycyna (30 μg). Płyty były inkubowane aerobicznie w temperaturze 37 °C przez 16–18 godzin. Średnice stref interpretowano według punktów przełomowych CLSI.

Metycylinooporny Staphylococcus aureus (MRSA) został zidentyfikowany za pomocą przesiewowego testu cefoxytyny (30 μg) zgodnie z zaleceniami CLSI. Testy kontroli jakości przeprowadzono przy użyciu S. aureus ATCC 25923. Wszystkie eksperymenty przeprowadzano w duplikacie, aby zapewnić powtarzalność. Izolaty wielolekooporne (MDR), szeroko odporne na leki (XDR) oraz panlekooporne (PDR) zostały sklasyfikowane według międzynarodowych standardowych definicji opartych na profilach oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (Rysunek 1).

4. Wykrywanie S. aureus (MRSA) opornego na metycylinę

Jako metoda fenotypowa wykrywania MRSA zastosowano test dyfuzji dyskowej ceoksytyny (30 μg). Izolaty ze strefami hamującymi ≥22 mm zostały sklasyfikowane jako S. aureus (MSSA) wrażliwe na metycylinę, natomiast izolaty ze strefami hamującymi ≤21 mm sklasyfikowano jako MRSA zgodnie z kryteriami CLSI (Rysunek 1).

5 Określenie oporności na wankomycynę na podstawie testów minimalnego stężenia hamującego (MIC)

Minimalne stężenia hamujące wankomycyny (MIC) zostały określone metodą mikrorozcieńczania bulionu zgodnie z wytycznymi CLSI11. Seryjnie przygotowywano podwójne rozcieńczenia wankomycyny (4–512 μg/mL) w bulionie Muellera–Hintona. Zawiesina bakteryjne została dostosowana do standardu 0,5 McFarlanda i rozcieńczona do około 1 × 105 CFU/mL.

Po inkubacji w 37 °C przez 24 godziny MIC został zdefiniowany jako najniższe stężenie, przy którym nie zaobserwowano widocznego wzrostu bakterii. Podatność na wankomycynę interpretowano według kryteriów CLSI następująco: podatność (≤2 μg/mL), pośrednia (4–8 μg/mL) oraz oporna (≥16 μg/mL)11,12 (Rysunek 1).

6. Detekcja molekularna

6.1 Ekstrakcja DNA

Izolaty gronkowca aureusa hodowano w bulionie do infuzji mózgu serca (BHI) przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. DNA genomowe bakteryjne było ekstrahowane za pomocą komercyjnego zestawu oraz zautomatyzowanego systemu ekstrakcji kwasów nukleinowych. Wyodrębnione DNA przechowywano w temperaturze −20 °C do czasu użycia. Stężenie DNA zmierzono za pomocą fluorometru, aby ocenić przydatność do amplifikacji PCR. Średnie stężenie DNA wynosiło 85 ± 8,2 ng/μL.

Primery skierowane do genów can, hlg oraz klasy D β-laktamazy (blaOXA-grupa I) zostały pozyskane komercyjnie i wykorzystane do amplifikacji PCR, zgodnie z tabelą 1 13,14,15,16.

Tabela 1: Sekwencje primerowe używane do amplifikacji PCR genów docelowych badanych w tym badaniu. Tabela podsumowuje geny docelowe, sekwencje primerów, oczekiwane rozmiary amplikonów, temperatury wyżarzania oraz odniesienia wykorzystywane do amplifikacji PCR genów nuc, mecA, hlg, can i blaOXA-grupy I w izolatach Staphylococcus aureus wyleczonych po infekcjach stóp cukrzycowych. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

6.2 Molekularne wykrywanie zjadliwości i genów klasy D β-laktamazy (blaOXA-grupa I) za pomocą PCR

Sekwencje pierwsze użyte w tym badaniu wymienione są w Tabeli 1. Amplifikacja PCR mecA, nuc, genów związanych z zjadliwością oraz genów klasy D β-laktamazy (blaOXA-grupa I) została przeprowadzona w mieszaninach reakcji 25 μL zawierających 12,5 μL GoTaq Green Master Mix (2×), 0,5 μL MgCl2, 3 μL genomowej matrycy DNA, po 1 μL starterów do przodu i do tyłu (10 pmol/μL), oraz 7 μL wody wolnej od nukleazy.

Warunki cyklu termicznego składały się z początkowego etapu denaturacji w 95 °C przez 5 minut, następnie 30–35 cykli amplifikacji, w tym denaturacji w 95 °C przez 30 s–1 min, wyżarzania w 50–62 °C przez 30 s–1 minutę, w zależności od zestawu spłonków, oraz przedłużania w 72 °C przez 30 s–1 min. Ostatnie przedłużenie wykonano w temperaturze 72 °C przez 7–19 minut.

Produkty PCR o wzmocnieniu były rozdzielane na żelach agarozowych o stężeniu 1,5%–2% barwionych Safe Red i zobrazowanych pod oświetleniem ultrafioletowym za pomocą systemu dokumentacji żelowej. W każdym testie PCR uwzględniono negatywne kontrole, aby potwierdzić ważność amplifikacji.

7. Sekwencjonowanie całego genomu (WGS)

Sekwencjonowanie całego genomu (WGS) przeprowadzono na dwóch reprezentatywnych klinicznych izolatach Staphylococcus aureus uzyskanych z próbek tkanki kostnej pobranych od pacjentów z infekcjami stóp cukrzycowych. Wybrane izolaty obejmowały jeden wielolekooporny (MDR) oraz jeden izolat szeroko oporny na leki (XDR), zidentyfikowane na podstawie fenotypowych testów podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe oraz profili oporności potwierdzonych przez MIC. Ta strategia umożliwiła reprezentatywną charakterystykę genomową klinicznie istotnych izolatów opornych (Rysunek 1).

Przed sekwencjonowaniem oceniono jakość, stężenie i integralność DNA genomowego, aby zapewnić odpowiedniość do przygotowania biblioteki i dalszej analizy bioinformatycznej. DNA zostało zmierzone za pomocą fluorometru, a integralność zweryfikowano za pomocą elektroforezy żelu 1% agarozy przy napięciu 150 V przez 40 minut. Fragmenty DNA o długości około 200–400 bp zostały wybrane na dużą skalę za pomocą oczyszczenia kulek magnetycznych, następnie naprawy końców, adenylacji 3′ oraz ligacji adaptorowej.

Jednoniciowe cząsteczki DNA okrągłe były generowane przez amplifikację, oczyszczanie i cyrkularyzację fragmentów z adaptorem za pomocą oligonukleotydów splintowych. Następnie powstały nanokulki DNA (DNB) poprzez amplifikację w kształcie rolującego koła. Sekwencjonowanie przeprowadzono na platformie DNBSEQ z wykorzystaniem chemii kombinatorycznej syntezy sondy i kotwicy (cPAS).

Odczyty sekwencjonowania surowego przechodziły procedury kontroli jakości, aby usunąć odczyty niskiej jakości, zanieczyszczenia adapterami, niejednoznaczne odczyty oraz duplikujące się sekwencje. Czyste odczyty były używane do analiz dalszych. Przeprowadzono montaż genomu w celu oszacowania rozmiaru genomu, zawartości GC oraz głębokości pokrycia sekwencjonowania. Ostateczne projekty zestawów genomu zostały opracowane w formatach FASTA, GenBank i NCBI.

Adnotacje genomu zidentyfikowały sekwencje kodujące (CDS), transfer RNA (tRNA), RNA rybosomalnego (rRNA) oraz małe geny RNA (sRNA). Funkcjonalna adnotacja przewidywanych genów została przeprowadzona przy użyciu wielu baz danych, w tym Swiss-Prot, COG, KEGG, CAZy, VFDB, ARDB i CARD, dla genów związanych z leśniczością i opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe.

8. Analiza bioinformatyczna

Składanie i adnotacje genomu przeprowadzono przy użyciu Bacterial and Viral Bioinformatics Resource Center (BV-BRC). Analizy filogenetyczne przeprowadzono przy użyciu narzędzi PARIC. Powstały okrągłe mapy wizualizacji genomu, aby zilustrować sekwencje kodujące, zawartość GC, przesunięcie GC, determinanty oporności antybakteryjnej, geny związane z wirulencją oraz mobilne elementy genetyczne.

Relacje filogenetyczne zostały określone za pomocą globalnych rodzin białek PATRIC (PGFams) zidentyfikowanych z najbliższych genomów referencyjnych za pomocą analizy Mash/MinHash. Wyrównania białek zostały wygenerowane za pomocą MUSCLE, a odpowiadające im wyrównania nukleotydów zostały przypisane do rodzin białek. Drzewa filogenetyczne zostały skonstruowane przy użyciu RAxML z szybką analizą bootstrappingową (Rysunek 1).

Dodatkowo analizowano kontigi genomu za pomocą Pathogenwatch w celu potwierdzenia gatunku i wykrycia genów odporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Geny związane z wirulencją analizowano za pomocą ABRicate. Usługa anotacji genomu PATRIC zastosowała podejście oparte na k-merach do identyfikacji genów oporności przeciwdrobnoustrojowej oraz przypisywania anotacji funkcjonalnych, klas antybakteryjnych i mechanizmów oporności. Wizualizacje genomu kołowego reprezentatywnego izolatu MDR i opornego na metycylinę S. aureus zostały wygenerowane zgodnie z opisaniem wcześniej17. Tabela uzupełniająca 1 podsumowuje wszystkie narzędzia bioinformatyczne, wersje oprogramowania, bazy danych oraz parametry analityczne wykorzystywane w analizach genomowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przetwarzanie próbek i pozytywność hodowli

W tym badaniu zebrano i przeanalizowano łącznie 125 próbek klinicznych. Wzrost bakterii zaobserwowano w 90/125 próbkach (72%). Te preparaty pozytywne hodowli zostały następnie przetworzone w celu identyfikacji bakterii i testów podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Statystyki opisowe, w tym częstotliwości i procenty, zostały wykorzystane do podsumowania rozkładu izolatów bakteryjnych pomiędzy wszystkimi próbkami klinicznymi ora...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infekcje stóp cukrzycowych (DFI) wywołane przez mikroorganizmy oporne na wiele leków (MDR) rosną na całym świecie, a słaba kontrola glikemii i nieodpowiednia higiena stóp przyczyniają się do wzrostu zachorowalności i śmiertelności 18,19,20,21. Chociaż DFI często są polidrobnobójne, Staphylococcus aureus pozostaje jednym z dominujących patogenów izolowanych z tych infekcji, a częstość w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy twierdzą, że nie mają znanych konkurujących ze sobą interesów finansowych ani relacji osobistych, które mogłyby wpłynąć na prace opisane w tym badaniu.

Wkład w autorstwo:

Shaymaa H. Al-Kubaisy przyczyniła się do koncepcji, rozwoju metodologii, badań, analizy formalnej oraz przygotowania oryginalnego szkicu rękopisu. Rawaa A. Hussein przyczynił się do weryfikacji, badania i przygotowania oryginalnego szkicu rękopisu. Mushtak T.S. Al-Ouqaili przyczynił się do koncepcji, nadzoru, zarządzania projektami, badań oraz recenzji i redakcji rękopisów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy przyznają wykorzystanie platformy projektowej opartej na AI Gamma Pro (Gamma App) do generowania Rysunku 1. Wszystkie wygenerowane treści zostały starannie przejrzane, zredagowane i zweryfikowane przez autorów, aby zapewnić naukową dokładność, spójność i integralność. Autorzy nie otrzymali żadnego wsparcia finansowego na badania, autorstwo i/lub publikację tego artykułu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Oprogramowanie AbricateGitHub (T. Seemann)Open-sourceWykrywanie genów zjadliwości
AgaroseInvitrogen, USA16500-500Elektroforeza żelowa
Zestaw XP Agencourt AMPureBeckman CoulterA63881Oczyszczanie DNA i wybór rozmiaru
Amikacin (30 & mikro; g) DyskOxoid, Wielka BrytaniaCT0107BAST
Dyski antybiotykowe (Ampicillin 20 & mikro; g)Oxoid, Wielka BrytaniaCT0003BTesty podatności na leki przeciwdrobnoustrojowe
Baza Blood AgarOxoid, Wielka BrytaniaCM0055Izolacja bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych
Bulion z infuzją mózgu i serca (BHI)Oxoid, Wielka BrytaniaCM1135Hodowla i przechowywanie izolatów
Cefoxityna (30 & mikro; g) DyskOxoid, Wielka BrytaniaCT0119BDetekcja MRSA
Cefuroksymu (30 & mikro; g) DyskOxoid, Wielka BrytaniaCT0026BAST
Ciprofloksacyna (5 & mikro; g) DyskOxoid, Wielka BrytaniaCT0425BAST
Klindamycyna (2 & mikro; g) DyskOxoid, Wielka BrytaniaCT0064BAST
Platforma DNBSEQBGI, ChinyRóżneSekwencjonowanie całego genomu
Erytromycyna (15 & mikro; g) DyskOxoid, Wielka BrytaniaCT0020BAST
FastQCSimon Andrews w Babraham Institute (Babraham Bioinformatics)NASystem kolejek
System dokumentacji żelowejBio-Rad, USAGel Doc™ XR+Obrazowanie żeli elektroforezy
Gentamicin (10 & mikro; g) DyskOxoid, Wielka BrytaniaCT0024BAST
Glicerol (Molecular Grade)Sigma-AldrichG5516Stosowany w stężeniu 20% do długotrwałego przechowywania izolatów
GoTaq Green Master Mix (2&razy;)Promega, USAM7122Mieszanka wzmacniająca PCR
Lewofloksacyna (5 & mikro; g) DyskOxoid, Wielka BrytaniaCT1587BAST
Linezolid (30 & mikro; g) DyskOxoid, Wielka BrytaniaCT1716BAST
MacConkey AgarOxoid, Wielka BrytaniaCM0007Selektywne medium dla bakterii Gram-ujemnych
Mannitol Salt Agar (MSA)Oxoid, Wielka BrytaniaCM0085Selektywne/różnicowe pożywki dla Staphylococcus spp.
Meropenem (10 & micro; g) DyskOxoid, Wielka BrytaniaCT0774BAST
MgCl2 RozwiązaniePromega, USARóżneKomponent reakcji PCR
Mueller-Hinton AgarOxoid, Wielka BrytaniaCM0337Używane do Kirby'ego– Testy dyfuzji dysku Bauera
Narzędzie do wyrównania MUSCLEOpen-sourceRóżneUkładanie sekwencji białek
Woda wolna od nukleazyPromega, USAP1193Komponent reakcji PCR
Agar odżywczyOxoid, Wielka BrytaniaCM0003Podłoże wzrostu ogólnego przeznaczenia
Okscylina (1 & mikro; g) DyskOxoid, Wielka BrytaniaCT0159BAST
PathogenWatchWitaj Instytut SangeraNarzędzie onlineIdentyfikacja gatunku i identyfikacja Wykrywanie genów AMR
PATRIC / BV-BRCCentrum Zasobów Bioinformatyki BakteryjnejPlatforma onlineSkładanie genomu i jego składanie Adnotacje
Piperacylina/Tazobaktam (100/10 & g) DyskOxoid, Wielka BrytaniaCT1628BAST
Narzędzie do wizualizacji genomu ProkseeUniwersytet w TorontoNarzędzie onlineWizualizacja map genomu
Fluorometr kwantowyPromega, USAE6150Ilościowa ilościowość DNA
Fluorometr kubitowyThermo Fisher ScientificQ33238Ilościowa identyfikacja DNA dla WGS
Oprogramowanie RAxMLOpen-sourceRóżneAnaliza filogenetyczna
S. aureus ATCC 25923ATCC, USA25923Odkształcenie kontroli jakości dla AST
Safe Red StainiNtRON BiotechnologyRóżneBejmowanie żelowe DNA
Zestaw do ekstrakcji DNA bakteryjnego SaMagSacace Biotechnologies, WłochyRóżneEkstrakcja DNA genomowa
Zautomatyzowany System Ekstrakcji SaMag-12Sacace Biotechnologies, WłochySMG-12Automatyczny ekstraktor kwasów nukleinowych
Sterylne patyczki watoweRóżni producenciRóżneWykorzystywane do pobierania próbek techniką głębokiego wymazu
Bezpłodna sól fizjologicznaRóżni producenciRóżneStosowany do mycia powierzchni wrzodów przed pobieraniem próbek
Sterylne ostrza skalpelaRóżni producenciRóżneStosowane do oczyszczania wrzodów przed pobraniem próbek
Tigecyklina (15 &; g) DyskOxoid, Wielka BrytaniaCT1849BAST
Trimetoprim-Sulfametoksazol (25 & mikro; g) DyskOxoid, Wielka BrytaniaCT0052BAST
Transiluminator UVRóżni producenciRóżneWizualizacja produktów PCR
Wankomycyna (30 & mikro; g) DyskOxoid, Wielka BrytaniaCT0588BAST
VITEK 2 CompactBioMé Rieux, FrancjaRóżneAutomatyczny system identyfikacji
Karty ID VITEK 2 GNBioMé Rieux, FrancjaRóżneIdentyfikacja bakterii Gram-ujemnych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, X., Yuan, C. X., Xu, B., Yu, Z. Diabetic foot ulcers: Classification, risk factors and management. World J Diabetes. 13 (12), 1049-1065 (2022).
  2. Budzynska, A., Kazmierczak-Siedlecka, K., Białowas-Kot, A., et al. Virulence factor genes and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus. strains isolated from blood and chronic wounds. Toxins (Basel). 13 (7), 491(2021).
  3. Xia, N., Morteza, A., Yang, F., Cao, H., Wang, A. Review of the role of cigarette smoking in diabetic foot disease. J Diabetes Investig. 10 (2), 202-215 (2019).
  4. Arfaoui, A., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. from diabetic foot infections in a Tunisian hospital with the first detection of MSSA CC398-t571. Antibiotics (Basel). 11 (12), 1755(2022).
  5. Hussein, S. Z., Mohammed Saleh, G. Molecular detection of virulence factor genes for Staphylococcus aureus. in diabetic foot ulcers in Iraq. Ibn Al-Haitham J Pure Appl Sci. 37 (3), 98-105 (2024).
  6. Shahi, S. K., Kumar, A. Isolation and genetic analysis of multidrug-resistant bacteria from diabetic foot ulcers. Front Microbiol. 6, 1464(2015).
  7. Víquez-Molina, G., Aragón-Sánchez, J., et al. Virulence factor genes in Staphylococcus aureus. isolated from diabetic foot soft tissue and bone infections. Int J Low Extrem Wounds. 17 (1), 36-41 (2018).
  8. Ventura, C. L., et al. Identification of a novel Staphylococcus aureus. two-component leukotoxin using cell surface proteomics. PLoS One. 5 (7), e11634(2010).
  9. Hussein, R. A., Al-Kubaisy, S. H., Al-Ouqaili, M. T. S. The influence of efflux pump, outer membrane permeability, and β-lactamase production on the resistance profile of multi-, extensively, and pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae. J Infect Public Health. 17 (11), 102544(2024).
  10. Magiorakos, A. P., et al. Multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and pandrug-resistant bacteria: An international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance. Clin Microbiol Infect. 18 (3), 268-281 (2012).
  11. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. , 32nd ed, CLSI. Wayne (PA). (2022).
  12. Moses, V. K., Kandi, V., Rao, S. K. D. Minimum inhibitory concentrations of vancomycin and daptomycin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. isolated from various clinical specimens: A study from South India. Cureus. 12 (1), e6749(2020).
  13. Karimzadeh, R., Ghassab, R. K. Identification of nuc nuclease and sea enterotoxin genes in Staphylococcus aureus. isolates from nasal mucosa of burn hospital staff: A cross-sectional study. New Microbes New Infect. 47, 100992(2022).
  14. Alkhafaji, I. A. Proliferation of tst genes in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. (MRSA). Clin Med Insights. 1 (1), 1-5 (2020).
  15. Kumar, J. D., Negi, Y. K., Gaur, A., Khanna, D. Detection of virulence genes in Staphylococcus aureus. isolated from paper currency. Int J Infect Dis. 13 (6), e450-e455 (2009).
  16. Armin, S., Fallah, F., Navidinia, M., Vosoghian, S. Prevalence of blaOXA-1 and blaDHA-1 AmpC β-lactamase-producing and methicillin-resistant Staphylococcus aureus. in Iran. Iran J Microbiol. 5 (4), 1-8 (2017).
  17. Grant, J. R., et al. Proksee: In-depth characterization and visualization of bacterial genomes. Nucleic Acids Res. 51 (W1), W484-W492 (2023).
  18. Adams, F. G., et al. Staphylococcus aureus. strain 63-2498 isolated from a diabetic patient. Microbiol Resour Announc. 14 (10), 1-4 (2025).
  19. Al-Ouqaili, M. T. S., Hussein, R. A., Kanaan, B. A., Al-Neda, A. T. S. Investigation of carbapenemase-encoding genes in Burkholderia cepacia and Aeromonas sobria. isolates from nosocomial infections in Iraqi patients. PLoS One. 20 (8), e0315490(2025).
  20. Anwar, K., Hussein, D., Salih, J. Antimicrobial susceptibility testing and phenotypic detection of MRSA isolated from diabetic foot infection. Int J Gen Med. 13, 1349-1357 (2020).
  21. Wazqar, A. A., Baatya, M. M., Lodhi, F. S., Khan, A. A. Assessment of knowledge and foot self-care practices among patients with diabetes mellitus in a tertiary care center in Makkah, Saudi Arabia: A cross-sectional analytical study. Pan Afr Med J. 40, 123(2021).
  22. Hinojosa, C. A., et al. Impact of the bacteriology of diabetic foot ulcers on limb loss. Wound Repair Regen. 24 (5), 923-927 (2016).
  23. Inzucchi, S. E., et al. Management of hyperglycemia in type 2 diabetes, 2015: A patient-centered approach. Diabetes Care. 38 (1), 140-149 (2015).
  24. Tentolouris, N., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus.: An increasing problem in a diabetic foot clinic. Diabet Med. 16 (9), 767-771 (1999).
  25. Citron, D. M., Goldstein, E. J., Merriam, C. V., Lipsky, B. A., Abramson, M. A. Bacteriology of moderate-to-severe diabetic foot infections and in vitro. activity of antimicrobial agents. J Clin Microbiol. 45 (9), 2819-2828 (2007).
  26. Anvarinejad, M., et al. Isolation and antibiotic susceptibility of microorganisms isolated from diabetic foot infections in Nemazee Hospital, Southern Iran. J Pathog. 2015, 328796(2015).
  27. Lipsky, B. A., Senneville, É, Abbas, Z. G., et al. Guidelines on the diagnosis and treatment of foot infection in persons with diabetes (IWGDF 2019 update). Diabetes Metab Res Rev. 36 (S1), e3280(2020).
  28. Bai, Z., et al. Identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus from methicillin-sensitive Staphylococcus aureus. and molecular characterization in Quanzhou, China. Front Cell Dev Biol. 9, 629681(2021).
  29. Abebe, T. A., Gebreyes, D. S., Abebe, B. A., Yitayew, B. Antibiotic-resistant bacteria and resistance genes in drinking water sources in North Shoa Zone, Amhara Region, Ethiopia. Front Public Health. 12, 1422137(2024).
  30. Herman-Bausier, P., et al. Mechanical strength and inhibition of Staphylococcus aureus. collagen-binding protein Cna. mBio. 7 (5), e01529-16(2016).
  31. de Almeida, L. M., et al. Comparative analysis of agr groups and virulence genes among subclinical and clinical mastitis Staphylococcus aureus. isolates from sheep herds in Northeast Brazil. Braz J Microbiol. 44 (2), 493-498 (2013).
  32. Elboshra, M. M. E., Hamedelnil, Y. F., Moglad, E. H., Altayb, H. N. Prevalence and characterization of virulence genes among methicillin-resistant Staphylococcus aureus. isolated from Sudanese patients in Khartoum State. New Microbes New Infect. 38, 100784(2020).
  33. Mohsin, S. M., Al-Ghanimi, A. A. K., Alwan, D. H. Molecular detection of virulence and antibiotic resistance genes of Staphylococcus aureus. isolated from diabetic foot infection. Med J Babylon. 22 (4), 1369-1377 (2025).
  34. Wang, M., Zhang, Q. Characteristics of virulence genes of clinically isolated Staphylococci .in Jingzhou area. Contrast Media Mol Imaging. 2022, 8804616(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

oporno na metycylinoporno na rodki przeciwdrobnoustrojowesekwencjonowanie ca ego genomuwielolekoopornoreakcja a cuchowa polimerazynadz r genomicznymetoda Kirby Baugaera
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły