Od tkanki do morfometrii: krok po kroku workflow Golgiego–Coxa do analizy kręgosłupa neuronalnego i dendrytycznego u dorosłych myszy

Podsumowanie

Artykuł ten opisuje krok po kroku metodę barwienia Golgiego–Coxa u dorosłych myszy, przygotowywanie roztworu pokrywającego, impregnację tkanek, krioprotekcję, sekcjonowanie, wywoływanie i montaż. Kładzie nacisk na zachowanie tkanek oraz jednorodne barwienie o niskim tle, umożliwiając wyraźną wizualizację morfologii neuronów. Metoda oznacza trzonki dendrytyczne i wspiera ilościową analizę morfometryczną kolców dendrytycznych.

Streszczenie

Analiza morfologii neuronów w zdrowiu i chorobach jest podstawowa dla zrozumienia funkcji mózgu oraz oceny skutków interwencji eksperymentalnych. Barwienie Golgiego–Coxa pozostaje klasyczną, lecz bardzo istotną techniką wizualizacji kompletnych łuków neuronalnych i kolców dendrytycznych. Jednak opublikowane protokoły często różnią się krytycznymi krokami proceduralnymi i często brakuje im istotnych szczegółów metodologicznych, co prowadzi do znacznej zmienności jakości barwienia i sprawia, że standaryzacja laboratoryjna jest czasochłonna i trudna. Tutaj przedstawiono kompleksowy, krok po kroku protokół Golgi–Coxa dla dorosłych myszy, obejmujący cały proces od obsługi in vivo i przetwarzania tkanek po obrazowanie i ekstrakcję danych morfometrycznych. Szczegółowo opisuje praktyczne kwestie i typowe pułapki wpływające na efektywność impregnacji, integralność sekcji oraz stosunek sygnału do szumu, a także dostarcza wskazówek metodologicznych poprawiających powtarzalność. Ogólnie protokół ten umożliwia niezawodną wizualizację i ilościową analizę całych neuronów, segmentów dendrytycznych oraz kolców dendrytycznych. Przewiduje się, że to źródło ułatwi wdrożenie barwienia Golgiego–Coxa z większą spójnością, przejrzystością i rygorem technicznym, jednocześnie oferując jasne ramy do dostosowania metody do różnych warunków laboratoryjnych.

Wprowadzenie

Głównym celem metody barwienia Golgiego–Coxa jest umożliwienie wysokiej rozdzielczości wizualizacji kompletnej morfologii neuronów, w tym drzew dendrytycznych i kolców dendrytycznych, w unieruchomionej tkance mózgowej 1,2,3,4. Technika ta umożliwia szczegółową analizę strukturalną poszczególnych neuronów w złożonych obwodach nerwowych, co czyni ją szczególnie cenną w badaniach plastyczności synaptycznej, rozwoju neuro, neurodegeneracji oraz zależnej od doświadczenia remodelacji strukturalnej ^5,6.

Uzasadnienie rozwoju i dalszego stosowania metod opartych na Golgim leży w ich unikalnej zdolności do generowania rzadkiej i całkowitej impregnacji neuronów ^1,2. Pierwotnie opisana przez Camillo Golgiego w 1873 roku i udoskonalona w 1891 roku przez Coxa ^7,8, metoda opiera się na wytrąceniu chromianu srebra w ograniczonym zbiorze neuronów, umożliwiając pełną rekonstrukcję morfologiczną bez nakładania się etykietowania³. Modyfikacja Golgiego–Coxa zastępuje azotan srebra używany w oryginalnej metodzie Golgiego chlorkiem kurczy, poprawiając penetrację tkanek i spójność barwienia². W porównaniu z alternatywnymi technikami znakowania neuronów, takimi jak ekspresja białek fluorescencyjnej, śledzenie wirusa czy metody wypełniania barwnikiem, barwienie Golgiego–Coxa oferuje kilka zalet. Nie wymaga manipulacji genetycznej, stereotaktycznych zastrzyków ani specjalistycznego sprzętu mikroskopowego, a także umożliwia wizualizację kolców dendrytycznych z dużym kontrastem pod mikroskopią jasnego pola ^1,2. Chociaż nowoczesne metody fluorescencji zapewniają specyficzność typu komórki, barwienie Golgiego–Coxa pozostaje szczególnie korzystne dla bezstronnego pobierania próbek morfologicznych ^9,10 oraz do stosowania w warunkach gatunkowych lub eksperymentalnych, gdzie nie ma dostępnych narzędzi transgenicznych.

W szerszej literaturze metody oparte na Golgim były szeroko stosowane do ilościowego określania gęstości i morfologii kolców dendrytycznych w badaniach uczenia się i pamięci⁵, zaburzeń stresowych i psychiatrycznych¹¹, starzenia^{się 12} oraz chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera^{12, 13, 14}. Jego ciągłe stosowanie przez dziesięciolecia podkreśla jego niezawodność w neuroanatomii strukturalnej². Metoda ta jest szczególnie odpowiednia dla badaczy analizujących architekturę dendrytyczną i morfologię kręgosłupa w tkance mózgowej, gdy wymagana jest wizualizacja całokomórkowa¹. Jest doskonale przystosowany do porównawczych badań morfologicznych między grupami eksperymentalnymi. Jednak badacze wymagający specyficzności typu komórkowego, obrazowania na żywo lub kolokalizacji molekularnej mogą bardziej skorzystać z podejść do znakowania fluorescencyjnego lub kodowanego genetycznie ^9,10.

Protokół

W badaniu wykorzystano dorosłe samice myszy typu dzikiego B6129SF2/J (n = 3). Jednak podobne barwienia można osiągnąć u obu płci w dorosłym stadium. Wszystkie procedury eksperymentalne uzyskały wcześniejszą zgodę Komisji Bioetyki. (#117.A, Instytut Neurobiologii (INb), Narodowy Uniwersytet Autonomiczny Meksyku)

1. Przygotowanie rozwiązań

UWAGA: Chlorek merkuria jest wysoce toksyczny i żrący. Trzymaj się wewnątrz okapu z oparami chemicznymi, mając na sobie rękawiczki, fartuch laboratoryjny i ochronę oczu. Utylizuj odpady w oznaczonym pojemniku na odpady niebezpieczne. Dichromian potasu i chromian potasu są toksycznymi i rakotwórczymi utleniaczami. Trzymaj się wewnątrz okapu chemicznego i unikaj kontaktu ze skórą lub wdychania.

1. Przygotowanie roztworów impregnacji materiału
   1. Waż 15 g dichromianu potasu. Rozpuść go w 300 mL podwójnie destylowanej wody, aby uzyskać roztwór 5% (w/v).
   2. Waż 15 g chlorku kurkuru. Rozpuść go w 300 mL podwójnie destylowanej wody, aby uzyskać roztwór 5% (w/v).
   3. Waż 15 g chromianu potasu. Rozpuść go w 300 mL podwójnie destylowanej wody, aby uzyskać roztwór 5% (w/v).
   4. Owiń wszystkie pojemniki folią aluminiową i przechowuj w temperaturze pokojowej, chronione przed światłem.
2. Przygotuj rozwiązanie robocze Golgiego–Coxa
   1. Wymieszaj 50 mL roztworu dichromianu potasu, 50 mL roztworu chlorku kruszku oraz 40 mL roztworu chromianu potasu.
   2. Dodaj 100 ml wody destylowanej i dokładnie wymieszaj.
   3. Inkubuj mieszankę przez 48 godzin w temperaturze pokojowej, chronioną przed światłem.
   4. Pozwól osadowi się osadzić. Do impregnacji tkanek używaj tylko supernatantu.
      UWAGA: Roztwór Golgiego–Coxa można przechowywać do miesiąca, jeśli jest chroniony przed światłem. Aby zmniejszyć ilość odpadów odczynników i zapewnić świeżość roztworu, przygotuj tylko wymaganą objętość zarówno roztworów zapasowych, jak i końcowego roztworu Golgiego–Coxa potrzebnego do eksperymentu. Przygotuj co najmniej 23 mL na mózg, aby uzyskać 20 mL użytecznego supernatantu po utracie osadu.
3. Przygotuj roztwór krioprotektującego
   1. Rozpuścić 300 g sacharozy w soli fizjologicznej o stężeniu 0,1 M buforowanego fosforanem (PBS), pH 7,4, przygotowanej z bezwodnego fosforanu sodu dwuzasadowego, monohydrohydrowanego fosforanu sodu monozasadowego oraz chlorku sodu.
   2. Reguluj końcową objętość do 1 L.
   3. Przechowywać w temperaturze 4 °C do tygodnia.

2. Pobieranie i impregnacja tkanek

1. Wykonaj perfuzję wewnątrzsercową
   1. Znieczulaj zwierzę pentobarbitalem sodu (252 mg/kg, dożylnie). Przed rozpoczęciem potwierdz odpowiednią głębokość znieczulenia poprzez brak wycofania pedałów.
   2. Wykonaj perfuzję wewnątrzsercową z około 30 mL 0,1 M PBS (pH 7,4) aż ścieki wypłyną czysto, zapewniając całkowite usunięcie krwi z tkanki mózgowej. Nie użyto utrwalającego; samo rozwiązanie Golgi–Cox pełni rolę fiksacji w tym procesie.
   3. Ostrożnie wyciągnij mózg i przepłucz go w wodzie destylowanej. Upewnij się, że mózg jest prawidłowo przekrwiony i wolny od resztek krwi (Rysunek 1A).
2. Zapłodnij tkankę
   1. Podziel mózg na półkule lub bloki koronne (~3 mm grubości) za pomocą macierzy mózgowej, aby poprawić zapłodnienie. Mniejsze bloki tkanek umożliwiają bardziej równomierne zapłodnienie i zmniejszają zmienność, podczas gdy większe próbki mogą wymagać dłuższego czasu inkubacji i wykazywać mniej jednorodne barwienia.
   2. Umieść mózg w roztworze Golgiego–Coxa o 10 mL pracy. Chroń się przed światłem.
      UWAGA: Objętość 10 ml roztworu Golgiego–Coxa wystarcza na cały mózg dorosłej myszy. Przy użyciu jednej półkuli lub mniejszych bloków koronowych (~3 mm grubości) objętość roztworu może być proporcjonalnie zmniejszona, pod warunkiem, że tkanka pozostaje w pełni zanurzona. Jeśli użyto całego mózgu, zaleca się jego podział na sekcje przy zachowaniu interesującego obszaru, aby zapewnić optymalne przenikanie odczynników i jednorodne impregnowanie.
   3. Inkubuj przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
   4. Zamień na 10 ml świeżego roztworu Golgiego–Coxa. Wysiabuj przez 10-14 dni w temperaturze 22–25 °C w ciemności.
      PUNKT ZATRZYMANIA: Przechowuj tkanki w roztworze Golgiego–Coxa do 15 dni bez poważnej utraty żywotności.
      UWAGA: Po zapłodnieniu Golgiego–Coxa mózg zyskuje ciemnozłoty wygląd i staje się bardzo kruchy; dlatego obchodzić się z nim ostrożnie (Rysunek 1B). Zaleca się używanie plastikowej pęsety do manipulacji, aby uniknąć reakcji chemicznych ze stalowymi materiałami.

3. Krioochrona

1. Przelej tkankę do roztworu krioprotektującego 10 mL (30% sacharozy (z wodą) w 0,1 M PBS, pH 7,4, przygotowane w kroku 1,3).
2. Inkubuj przez 24 godziny (4 °C).
3. W tej samej temperaturze (4 °C) zastąpić świeżym roztworem krioprotekcjonującym i inkubować przez co najmniej 4–7 dni.
   PUNKT ZATRZYMANIA: Przed przecięciem przechowuj tkankę w roztworze krioprotekcyjnym do 3 tygodni w temperaturze 4 °C.

4. Osadzanie i sekcjonowanie

1. Osadzenie tkanki
   1. Przygotuj 8% (w/w) agarozy w gorącej wodzie destylowanej. Pozwól jej ostygnąć do około 40 °C.
   2. Umieść tkankę w formach do osadzania i odpowiednio ją ukierunkuj.
   3. Polej tkankę agarozą i pozwól jej zastygnąć przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub 30 minut w 4 °C (Rysunek 1C).
   4. Przytnij nadmiar agarozy z bloku (Rysunek 1D).
2. Tkanka przekrojowa
   1. Przymocuj blok agarozy do sceny wibratomu za pomocą kleju. (Rysunek 1E)
   2. Napełnij komorę cięcia roztworem krioprotektacyjnego.
   3. Tkanka cięcia o grubości 100–200 μm. Cieńsze przekroje (np. 100–120 μm) są zalecane do analizy kolca dendrytycznego w celu poprawy rozdzielczości obrazowania, natomiast grubsze przekroje (np. 150–200 μm) mogą być stosowane do rekonstrukcji całego neuronu. W tym badaniu cięcia przekroju były o średnicy 120 μm (rysunek 1F).
   4. Zbieraj fragmenty miękkim pędzlem.
      UWAGA: Zapisz ustawienia wibratomu w Tabeli Materiałów. Nie płucz szkiełów pod żadnym pozorem po zamontowaniu sekcji. Sacharoza chroni tkankę aż do etapu rozwoju.

5. Montaż

1. Przygotowanie szkiełek pokrytych żelatyną
   1. Przygotuj roztwór powłokowy, rozpuszczając 0,5 g żelatyny w 100 mL (0,5% w/v) wody destylowanej podgrzanej do wrzenia.
   2. Mieszaj, aż żelatyna całkowicie się rozpuści i pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej.
   3. Dodaj 0,05 g siarczanu chromu potasu (0,05% w/v) i mieszaj, aż całkowicie się rozpuści. Usuń pozostałą piankę, jeśli trzeba.
   4. Przefiltruj roztwór żelatyny przez papier filtracyjny, aby usunąć nierozpuszczone cząstki i pozostałą piankę, zapewniając jednolitą powłokę szkieł.
   5. Umyj szkła neutralnym detergentem i wodą, dokładnie spłukaj, a następnie przepłucz wodą destylowaną.
   6. Zanurz szkiełka w 96% etanolu, aż nie pozostaną widoczne krople.
   7. Susz w piekarniku w temperaturze 50–60 °C przez 30 minut lub aż całkowicie wyschnie.
   8. Zanurz się w roztworze żelatyny i pozwól nadmiarowi roztworu odpłynąć.
   9. Włóż szkiełka do piekarnika w temperaturze 50–60 °C na 30 minut lub aż całkowicie wyschną.
   10. Powtórz proces pokrywania i suszenia co najmniej pięć razy, aby zapewnić prawidłową przyczepność.
   11. Po ostatnim etapie suszenia pozwól zamkom ostygnąć do temperatury pokojowej w środowisku wolnym od kurzu (np. wewnątrz okapu chemicznego) i przechowuj je w czystym, zamkniętym pojemniku do użycia.
       UWAGA: Przygotuj tylko objętość roztworu żelatyny potrzebną do liczby preparatów do pokrycia. Ilości odczynników można skalować proporcjonalnie, zachowując określone stężenia (w/v).
2. Nakładaj sekcje na szkiełkach mikroskopowych pokrytych żelatyną miękkim pędzelkiem
   UWAGA: Używaj szkiełek mikroskopowych pokrytych co najmniej pięcioma warstwami żelatyny o stężeniu 0,5%. Przygotuj preparaty świeżo, aby zapewnić integralność tkanek podczas wywoływania. W tym protokole nie testowano elektroładowanych szkieł.
3. Namocz chłonny papier w roztworze krioprotekcjonującego i połóż go na tych sekcjach.
4. Delikatnie naciskaj dłonią, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza i zapewnić równomierny kontakt między przekrojem tkanki a szkłem pokrytym żelatyną, co sprzyja stabilnej przyczepności podczas dalszego przetwarzania.
   UWAGA: Delikatny nacisk poprawia przyczepność, maksymalizując kontakt między sekcją a warstwą żelatyny, zmniejszając ryzyko odwarstwienia podczas rozwoju wodnego.
5. Ostrożnie zdejmij papier i pozwól szkiełkom wyschnąć w ciemności przez 2–3 dni w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Suszenie w środowisku o niskiej wilgotności jest kluczowe dla stabilnej przyczepności. Ochrona przed światłem minimalizuje fotochemiczne zmiany tkanki impregnowanej Golgi–Coxem, która jest wrażliwa na światło ze względu na obecność soli chromianowych. Ponadto resztkowa agaroza nie zakłóca znacząco procesu rozwoju i można ją zaobserwować wokół tkanki w wywołanym przekroju (Rysunek 2A). Obecność agarozy ułatwia bezpieczniejszą obróbkę tkanki podczas montowania, ponieważ tkanka impregnowana Golgi–Cox jest bardzo delikatna. W razie potrzeby nadmiar agarozy można ostrożnie usunąć ręcznie po zamontowaniu sekcji na prowadzach.
   PUNKT PAUZY: Chronić zjeżdżalnie przed światłem.

6. Rozwój

UWAGA: Ksylen jest łatwopalny i toksyczny przez wdychanie. Trzymaj się w okapu chemicznym i unikaj otwartych ogniów. Amoniak jest żrący i wytwarza drażniące opary. Uchwyt w okapie spalinowym.

1. Sekcje nawodniające
   1. Zanurz zjeżdżalnie w wodzie destylowanej przez 5 minut.
   2. Przelej do świeżej wody destylowanej na 5 minut.
   3. Zanurz w 50% etanolu przez 5 minut.
      UWAGA: Krok 50% etanolu zapewnia stopniowe przejście od warunków wodnych do odwodnienia, ułatwiając penetrację odczynników i pomagając zachować integralność tkanek przed etapem rozwoju.
2. Rozwój przebarwień
   1. Inkubuj preparaty w wodnym roztworze amoniaku przygotowanym przez wymieszanie 2 objętości 25% amoniaku z 1 objętością wody destylowanej (2:1, v/v) przez 8 minut
   2. Myj w wodzie destylowanej przez 5 minut.
   3. Ponownie myj w wodzie destylowanej przez 5 minut.
   4. Inkubuj w 5% (w/w) tiosiarczanie sodu w wodzie destylowanej przez 10 minut w ciemności.
   5. Umyj w wodzie destylowanej przez 1 minutę.
   6. Ponownie myj w wodzie destylowanej przez 1 minutę.
      UWAGA: Po rozpoczęciu procesu tworzenia należy zakończyć proces bez przerw.
3. Susz i wypuszcza
   1. Zanurz szkiełka w 70% etanolu przez 5 minut.
   2. Zanurz w 96% etanolu przez 5 minut.
   3. Zanurz szkiełka w 100% etanolu przez 5 minut.
   4. Przenieś preparaty do ksylenu przez co najmniej 6 minut.

7. Stałe montaże

1. Na każdą sekcję zastosuj medium montażowe Permount® (współczynnik załamania ~1,52).
   UWAGA: Współczynnik załamania medium montażowego powinien być zgodny z obiektywami zanurzanymi w oleju, aby zapewnić optymalną jakość obrazu.
2. Delikatnie załóż pokrywkę, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza.
3. Zabezpiecz brzegi przezroczystym lakierem do paznokci.
4. Pozwól szkiełkom wyschnąć w ciemności przez 48 godzin w temperaturze pokojowej.

8. Obrazowanie

UWAGA: Metody obrazowania i konfiguracje pozyskiwania obrazowania różnią się w zależności od marki mikroskopu; Optymalne ustawienia powinny być określone dla każdego systemu.

1. Włącz mikroskop.
2. Otwórz oprogramowanie mikroskopu
3. Umieść preparat na scenie mikroskopu.
4. Zrób dwuwymiarowy obraz szerokokątny przekroju mózgu za pomocą obiektywu o niskim powiększeniu, takiego jak 1X/0,04 N.A. lub 4x/0,10 (Rysunek 2A, B).

9. Obrazowanie całych neuronów

1. Uchwyć stosy obrazów o wysokiej rozdzielczości obszaru zawierającego interesujący neuron, używając obiektywu 10x/0,25 N.A. lub 20x/0,40 N.A. (Rysunek 2C).
   UWAGA: Neurony wybrane do analizy powinny wykazywać pełne i jednorodne impregnację Golgiego–Coxa, z wyraźnie określonymi dendrytycznymi arbarami i minimalnym barwieniem tła. Komórki o obciętych wyrostkach, niepełnym impregnacji, nakładających się strukturach lub silnym sygnale tła powinny być wyłączone, aby zapewnić dokładną analizę morfometryczną.
2. Wyostrz obraz i dostosuj ustawienia aparatu, w tym ekspozycję i balans bieli.
3. Ustaw górne i dolne granice dla stosu obrazów.
4. Ustaw odległość kroku na 0,5 μm w oknie akwizycji obrazu.
5. Przechwyć stos obrazów za pomocą polecenia programowego do akwizycji stosu.
6. Powtórz powyższe kroki, aby uchwycić każdy obszar zainteresowania.
7. Zapisz plik danych i wszystkie pliki obrazów. Format TIFF do przetwarzania zewnętrznego.

10. Obrazowanie kolców dendrytycznych

1. Uchwyć stosy obrazów o wysokiej rozdzielczości obszaru zawierającego interesujący neuron, używając obiektywu olejowego 63x/1.4 N.A. w odpowiednim mikroskopie jasnego pola (rysunek 2D).
   UWAGA: W niniejszym manuskrypie uzyskano wysokorozdzielcze obrazy kolców dendrytycznych pokazane na Rysunku 2D za pomocą trybu jasnego pola mikroskopu konfokalnego, model Zeissa LSM 780. Jednak inne mikroskopy jasnego pola mogą służyć do uzyskania 63x wysokiej jakości obrazów stosu z, których parametry powinny być standaryzowane przez każde laboratorium.
2. Nałóż 1–2 krople oleju immersyjnego na zamek i umieść obiektyw nad zamkiem, dbając o kontakt między obiektywem a olejem.
3. Wyostrz obraz i dostosuj ustawienia aparatu, w tym ekspozycję i balans bieli.
4. Ustaw górne i dolne granice dla stosu obrazów.
5. Ustaw odległość kroku na 0,3 μm w oknie akwizycji obrazu.
6. Przechwyć stos obrazów za pomocą polecenia programowego do akwizycji stosu.
7. Powtórz powyższe kroki, aby uchwycić każdy interesujący obszar
8. Zapisz plik danych i wszystkie pliki obrazów w formacie TIFF do przetwarzania zewnętrznego.
   UWAGA: Dla kroków 9 i 10. Jeśli mikroskop nie jest wyposażony w zmotoryzowany podaż do pozyskiwania stosu Z, obrazy można pobierać ręcznie poprzez regulację ostrości mikrometrycznej. Jednak odstępy między sekcjami optycznymi mogą być mniej precyzyjne. W takim przypadku stosy Z można później odtworzyć w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu (np. ImageJ) na podstawie uzyskanej sekwencji obrazu.

11. Analiza morfometryczna

UWAGA: Do tego celu można stosować różne podejścia i specjalistyczne programy programowe. Do narzędzi do analizy kręgosłupa dendrytycznego należy ImageJ lub, jak w tym badaniu, PyReconstruct¹⁵. Aby uzyskać bardziej szczegółowy opis PyReconstruct i jego funkcjonalności w rekonstrukcji neuronów oraz analizie morfometrycznej, zobacz źródło referencyjne.

1. Procedura morfometrycznej analizy kolca dendrytycznego
   1. Po otwarciu pliku w ImageJ zmień format na RGB, wybierając Image > Type > RGB Color.
   2. Przekonwertuj stosy Z na sekwencję obrazów w ImageJ: kliknij File > Save As > Image Sequence. Zapisz każdą sekwencję obrazów w osobnym folderze do dalszej analizy. W PyReconstruct załaduj sekwencję obrazów, klikając Plik > Nowe > Z Obrazów.
   3. Pojawi się okno dialogowe, które zachęca do przypisania nazwy do pliku (np. WTVR1N1 – Wild-Type Vehicle Mouse 1 Neuron 1).
   4. Wtedy pojawią się trzy kolejne okna dialogowe. W pierwszym oknie wpisz wartość kalibracyjną (μm/px). Informacje te są dostępne w metadanych stosu Z i można je uzyskać w ImageJ.
   5. W drugim oknie wpisz grubość każdego kolejnego przekroju optycznego (μm). Na koniec seria obrazów zacznie się ładować automatycznie (Rysunek uzupełniający 1A).
   6. Po zidentyfikowaniu interesującego segmentu, zgodnie z kryteriami włączenia zdefiniowanymi przez badacza, przystąpi się do śledzenia w celu uzyskania danych ilościowych.
   7. Przypisz każdemu typu śladu odrębną nazwę i domenę. Umieść dziedziny w dolnym panelu, gdzie są reprezentowane przez różne kolorowe kształty geometryczne (Ilustracja uzupełniająca 1B).
   8. Narysuj linię odpowiadającą pożądanej długości próbki za pomocą narzędzia ołówka. Następnie wygeneruj drugi ślad przez stos Z wzdłuż segmentu dendrytycznego za pomocą narzędzia Z.
   9. Użyj początkowego śladu, aby określić odpowiednią długość segmentu i zweryfikować go w sekcji Listy > Z-ślady (Ilustracja uzupełniająca 1B).
   10. Przejdź przez stos Z i zidentyfikowaj głowice kolców dendrytycznych z optymalnym skupieniem. Za pomocą narzędzia ołówkowego przerysuj najszerszy dystalny obszar każdej główki kręgosłupa. Następnie użyj narzędzia Z, aby przerysować szyjkę kręgosłupa przez cały stos Z (Ilustracja Uzupełniająca 1C, D). Powtarzaj ten zabieg, aż wszystkie głowy i szyje kolców w wybranym segmencie dendrytycznym zostaną prześledzone.
2. Eksportowe pomiary głowicy kręgosłupa
   1. Otwórz listy zawierające pomiary szerokości i długości głowicy kręgosłupów. Uzyskaj dostęp do nich w Listach > Listach Śladów (dla szerokości) oraz Listach > Liście Z-śladów (dla długości).
   2. Wyeksportuj dane do wybranego miejsca na komputerze. Zostaną wygenerowane dwa oddzielne pliki Excel, z których każdy zawiera odpowiadające dane pomiarowe.
3. Sklasyfikuj morfologię kolców i oblicz gęstość
   1. Wyodrębnij pomiary szerokości i długości główek i szyjki kręgosłupów z wcześniej wygenerowanych plików Excel.
   2. Dane powinny być uporządkowane w odpowiadające kolumny oznaczone szerokością i długością do klasyfikacji morfologicznej według następujących kryteriów¹⁶: filopodia (>2 μm), cienkie (< 2 μm), krótkie (stosunek długości do szerokości głowy ≤1) oraz grzyb (szerokość głowy >0,6 μm). (Rysunek uzupełniający 1E). Filopodia rzadko obserwowano w analizowanych segmentach dendrytycznych i dlatego nie zostały uwzględnione w analizie.
   3. Na tym etapie określa się całkowitą liczbę kolców na analizowany segment dendrytyczny, wraz z gęstością kolców (kolców na μm liniowym), a także typem i liczbą każdego podtypu kolca. Szablon Excel¹⁶ używany do tej analizy jest dostępny w i jest dostępny w cytowanym źródle. Stosując tę metodę, gęstość dendrytycznego kolca podstawy została zmierzona w regionie CA1 hipokampa u 12-miesięcznych samic myszy.
   4. Eksportuj dane ilościowe i generuj wykresy za pomocą specjalistycznych programów naukowych przeznaczonych do analizy danych, wykresów i statystyki. Tutaj wykres na Rysunku 3 został stworzony za pomocą oprogramowania GraphPad Prism.

Wyniki

Impregnacja tkanek i sekcjonowanie
Opisany tutaj protokół Golgiego–Coxa wykazał wiarygodne i jednorodne barwienie neuronalne w tkance mózgowej dorosłych myszy. Po zapłodnieniu w roztworze Golgiego–Coxa mózg nabrał charakterystycznego ciemnego, złocistego zabarwienia, co wskazuje na skuteczną dyfuzję roztworu barwiącego w całej tkance. Sekcjonowanie wibratomowe zachowało integralność strukturalną somatów neuronalnych oraz wyrostków dendrytycznych.

Wizualizacja neur...

Dyskusja

Metoda barwienia Golgiego–Coxa pozostaje jedną z najczęściej stosowanych technik wizualizacji morfologii neuronów i kolców dendrytycznych w usztywnionej tkance mózgowej ^3,4. Poprzez impregnację niewielkiego, losowego podzbioru neuronów, metoda ta umożliwia wizualizację całych drzew dendrytycznych przy minimalnym barwieniu tła. W obecnym protokole technika umożliwiała wyraźną wizualizację neuronów piramidowych hipokampa i ich kolców dendrytycznych, umożliwiając ni...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agarose	Technologie życia	15510-027	CAS 9012-56-6
Roztwór amoniaku 25%	Merck	208380	CAS 1336-21-6. Niebezpieczne.
Bezwodny fosforan sodu dibazowy	Sigma-Aldrich	S3264	CAS 7558-79-4
Mikroskop jasnego pola	Nikon	Zaćmienie Ci
Siarczan chromu potasu	Sigma-Aldrich	243361
Mikroskop konfokalny	Zeiss	LSM 780
Waga cyfrowa	Accuris Instruments	W3200-1200
Formy osadzające	Merck	E6032	Wymiary: 22x22 mm
Etanol	Meyer	394
Zwierzęta doświadczalne	Laboratorium Jacksona	2124-01	Szczep myszy B6129SF2/J
Proszek żelatynowy	Sigma-Aldrich	G2500
Oprogramowanie GraphPad Prism	GraphPad Software Inc.		Wersja 8.0.2
ImageJ Fiji Software	Narodowy Instytut Zdrowia USA		Wersja 1.54p, https://imagej.net/software/fiji/downloads
Chlorek merkura	J.T. Baker	2594-01	CAS 7487-94-7. Niebezpieczne.
Kamera mikroskopowa	Nikon	DS-Vi1
Obiektyw mikroskopowy (10x)	Nikon	93183	Plan 10x/0,25 N.A.
Obiektyw mikroskopowy (1x)	Nikon	93180	Plan UW 1x/0.04 N.A.
Obiektyw mikroskopowy (20x)	Nikon	93184	Plan 20x/0,40 N.A.
Obiektyw mikroskopowy (4x)	Nikon	93182	Plan 4x/0.10 N.A.
Obiektyw mikroskopowy (63x)	Zeiss	420782-9900-799	Plan APO 63x/1.4 N.A. oil DIC
Szkiełka mikroskopowe	Sigma-Aldrich	S8902
Monohydrogenowany fosforan sodu monozasadowy	J.T. Baker	3818-05	CAS 10049-21-5
Lakier do paznokci	GRZESZNE KOLORY	KOLOR BOLD	Przezroczystość
Nośniki montażowe Permount	Fisher Scientific	SP15-500
Chromian potasu	Productos Quí micos Monterrey	2784	CAS 7789-00-6. Niebezpieczne.
Dichromian potasu	Sigma-Aldrich	207802	CAS 7778-50-9. Niebezpieczne.
Oprogramowanie PyReconstruct	Uniwersytet Teksasu, Austin		wersja 1.19.0, https://github.com/SynapseWeb/PyReconstruct
Chlorek sodu	Fermont	24912	CAS 7647-14-5
Tiosiarczan sodu	Productos Quí micos Monterrey	7291	CAS 7772-98-7. Niebezpieczne.
Sacharoza	J.T. Baker (Avantor)	4072-05	66,55 stopni; Specyficzna rotacja, odczynnik ACS
Wibratom	Leica Biosystems	VT1200S	PRĘDKOŚĆ 20 mm/s, AMPL i ndash; 0,60 mm
Ksylen	CTR Scientific	CTR05128	CAS 1330-20-7. Niebezpieczne.