Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie strojonych hydrożeli poliakrylamidowych do badania efektu sztywności macierzy na komórki Leydiga macierzyste

DOI:

10.3791/71387

⸱

5 czerwca 2026

 ,  ,  ,  , 
1Scientific Research Center, The Seventh Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2School of Medicine, Shenzhen Campus of Sun Yat-sen University, 3Department of Urology, The Sixth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, 4Center for Stem Cell Biology and Tissue Engineering, Key Laboratory for Stem Cells and Tissue Engineering, Sun Yat-sen University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje wytwarzanie hydrożeli poliakrylamidowych o sztywności do badania wpływu mechaniki macierzy na zachowanie komórek Leydiga macierzystych w kontrolowanym dwuwymiarowym systemie hodowli.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) krytycznie reguluje zachowanie komórek macierzystych. Wcześniej wykazaliśmy, że patologiczne zwiększanie sztywności macierzy podczas starzenia zaburza homeostazę komórek Leydiga (SLC) komórek macierzystych, prowadząc do spadku poziomu testosteronu. Bazując na tym odkryciu, przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół — pierwotnie opracowany w naszym laboratorium — do wytwarzania hydrożeli poliakrylamidowych (PA) o sztywności do modelowania mikrośrodowiska jąder in vitro. Metoda ta umożliwia powtarzalne odlewanie żeli w zakresie sztywności od 1 do 100 kPa, obejmując warunki fizjologiczne i patologiczne. Kluczowe kroki obejmują precyzyjne mieszanie akrylamidu/bis-akrylamidu, wyrównanie pęcznienia żelu, aktywację powierzchni Sulfo-SANPAH oraz powłokę kolagenową wspierającą adhezję i hodowlę SLC. Oferujemy zoptymalizowane formuły dotyczące sztywności docelowych oraz wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów z typowymi problemami, takimi jak niepełna polimeryzacja i słabe przyczepienie komórek. System ten umożliwia systematyczne badania tego, jak sztywność podłoża moduluje proliferację, różnicowanie i funkcję sterydogenną SLC w określonych warunkach dwuwymiarowych. Poza biologią rozrodu, stanowi także cenną platformę do badań mechanobiologicznych innych typów komórek oraz do przesiewowych terapii wymierzonych w zaburzenia związane ze sztywnością.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Właściwości mechaniczne macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) odgrywają kluczową rolę w regulacji losu komórek macierzystych, w tym w proliferacji, różnicowaniu i utrzymaniu funkcjonalności 1,2,3,4. W jądrze zesztywnienie ECM związane z wiekiem zostało powiązane ze spadkiem produkcji testosteronu. Jednak podstawowe mechanizmy mechanobiologiczne pozostają słabo poznane, częściowo z powodu braku standaryzowanych modeli in vitro, które wiernie oddają zakres fizjologicznej sztywności niszy jąder. Fizjologiczna sztywność młodej tkanki jąder myszy wynosi około 1–15 kPa, podczas gdy starzej lub włóknistej tkanki może osiągać 20–30 kPa lub więcej.

Hydrożele poliakrylamidu (PA) stały się wszechstronną platformą do badania interakcji między komórką a macierzą, ponieważ ich sztywność można precyzyjnie dostrojić poprzez zmianę stosunku akrylamidu do bisakrylamidu 5,6. W porównaniu z innymi podłożami, takimi jak szkło pokryte kolagenem czy komercyjne hydrożele, żele PA oferują niezależną kontrolę sztywności i biochemicznej gęstości ligandów, umożliwiając systematyczną analizę sygnałów mechanicznych. Chociaż istnieje kilka protokołów dla produkcji żelu PA 7,8,9, często brakuje im szczegółowej optymalizacji dla konkretnych typów komórek, szczególnie dla rzadkich komórek pierwotnych, takich jak SLC.

Przedstawiamy tutaj solidny i powtarzalny protokół przygotowania hydrożeli PA o określonej sztywności (1–100 kPa), dostosowany do hodowli myszy SLC. Metoda obejmuje instrukcje krok po kroku dotyczące odlewania żelu, wyrównywania opuchnięć, funkcjonalizacji powierzchni za pomocą Sulfo-SANPAH oraz powłoki kolagenowej wspierającej przyczepność komórek. Stosując ten protokół, naukowcy mogą generować podłoża o regulowanej sztywności (od 1 do 100 kPa), które naśladują środowisko mechaniczne młodych (miękkich) i starzejących się (sztywnych) jąder, umożliwiając ilościowe badania odpowiedzi SLC zależnych od sztywności. System jest również adaptacyjny do innych typów komórek mechanoczułych i stanowi platformę do badań przesiewowych na obecność leków wymierzonych w patologie związane ze sztywnością.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Sun Yat-sena (Nr Zatwierdzenia SYSU-IACUC-2026-B1278) i zostały wykonane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

1. Izolacja i hodowla pierwotnych myszy SLC

  1. Rozciąć jądra myszy C57BL/6 i ostrożnie usunąć tunica albuginea.
  2. Pokrój jądra na małe kawałki.
  3. Rozdziel komórki śródmiąższowe od kanalików mimiennych, inkubując się w kolagenazie typu IV o stężeniu 1 mg/mL w DMEM/F12 w temperaturze 37 ºC przez 15 minut.
  4. Dodaj surowicę z DMEM/F12 zawierającą 10% surowicy płodowej bydła, aby zatrzymać aktywność kolagenazy.
  5. Wirówka w 1500 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  6. Ponownie zawiesić pellet w PBS i przefiltrować przez filtr o średnicy 70 μm.
  7. Wzbogacaj komórki CD51⁺ za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) za pomocą sortera komórek napływających (Influx Cell Sorter).
  8. Nasiać wzbogacone komórki w pożywce hodowlanej SLC, składające się z DMEM/F12 uzupełnionych o: 1 nM deksametazonu, 1 ng/mL LIF, 5 μg/L insulinowotransferynowo-sodowego selenitu, 5% ekstrakt z zarodków kurczaka, 0,1 mM β-merkaptoetanolu, 1% aminokwasów nieistotnych, 1% N2, 2% B27, 20 ng/mL zasadowego fibroblastowego czynnika wzrostu, naskórkowego czynnika wzrostu, czynnik wzrostu pochodzący z płytek krwi oraz onkostatyna M.
  9. Hodować SLC w standardowych warunkach (37 °C, 5% CO₂), aż osiągną pożądaną gęstość do siewania na hydrożele.

2. Montaż szklanego pojemnika do odlewania żelu

  1. Dokładnie sprawdź i wyczyść specjalistyczne szklane płytki oraz podkładki używane do odlewania żelowych żeli poliakrylamidowych (PAGE), aby upewnić się, że są wolne od kurzu, uszkodzeń i pozostałości.
  2. Prawidłowo zmontuj szklane płyty, dystansy i zaciski zgodnie z instrukcjami producenta, zapewniając dobre uszczelnienie zespołu, aby zapobiec przeciekom podczas odlewania żelu.
  3. Umieść złożony szklany pojemnik bezpiecznie na stojaku laboratoryjnym, gotowy do odlewania.
    UWAGA: Zestaw odlewniczy wykorzystuje standardowe płyty szkła Western blot (sodu dodecylosiarczanu [SDS]-PAGE) z stałymi dystansami o grubości 1,0 mm, co zapewnia powtarzalną grubość żelu i płaską powierzchnię do hodowli komórek.

3. Przygotowanie roztworu żelowego PAGE

  1. Dokładnie zmierz następujące odczynniki zgodnie z projektem eksperymentalnym (patrz Tabela 1) w rurce sterylnej wirówki o pojemności 15 mL lub 50 mL: 40% roztwór akrylowy, 2% roztwór bisakrylowy, 1M bufor HEPES (pH 8,5), sterylny ddH₂O.
    UWAGA: Akrylamid i bisakrylamid to neurotoksyny. Zawsze zakładaj rękawiczki i maskę przeciwkurzową podczas ważenia suchego proszku, aby uniknąć kontaktu ze skórą i wdychania cząstek unoszących się w powietrzu. Zabiegi powinny być wykonywane w okapie spalinowym.

4. Dodanie inicjatora i katalizatora oraz odlewanie żelu

  1. Kolejno dodaj do roztworu mieszanego: 10% nadsiarczanu amonu (APS): Działa jako inicjator do rozpoczęcia reakcji polimeryzacji. N,N,N',N'-Tetrametyloenodiamina (TEMED): Działa jako katalizator przyspieszający reakcję polimeryzacji. Dla całkowitej objętości żelu 6 mL dodaj 60 μL 10% APS i 6 μL TEMED (patrz Tabela 1 dla skalowania).
    UWAGA: Reakcja polimeryzacji rozpoczyna się natychmiast po dodaniu TEMED; dlatego kolejne kroki muszą być wykonywane szybko.

5. Wlewanie mieszanego roztworu

  1. Natychmiast pipetuj lub wylewaj mieszankę równomiernie wzdłuż jednej krawędzi szklanego pojemnika, aby uniknąć powstawania pęcherzyków.

6. Pozwalanie żelowi na polimeryzację

  1. Pozwól naczynie żelowe leżowe leżeć niezakłócone w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Polimeryzacja zwykle trwa 15–30 minut w temperaturze pokojowej (20–25 °C).
  2. Przechodź do kolejnego kroku, gdy widoczne jest wyraźne granice między niepolimeryzowaną mieszanką żelu a zpolimeryzowanym żelem, a żel jest całkowicie stały (żel nie płynie po przechyleniu pojemnika).
  3. Bezpośrednio po odlewaniu ostrożnie nałóż cienką warstwę etanolu absolutnego (lub etanolu nasyconego wodą) na mieszankę żelową, aby wykluczyć tlen atmosferyczny, który hamuje polimeryzację radykalną. Etanol pomaga także utworzyć płaską górną powierzchnię.
  4. Po polimeryzacji usuń etanol przed rozmontowaniem płyt.

7. Rozłożenie pojemnika i pobranie żelu

  1. Ostrożnie rozłóż zaciski i użyj plastikowego klina lub szpatułki, aby delikatnie rozdzielić szklane płytki, pozwalając polimeryzowanemu żelowi PAGE pozostać nienaruszonym na jednej płytce.
  2. Przygotuj naczynie hodowlane zawierające odpowiednią ilość sterylnego PBS.
  3. Ostrożnie odbierz żel od szklanej płytki za pomocą szpatułki lub rękawiczki i pozwól mu płynnie wślizgnąć się do PBS.
  4. Zamknij naczynie z żelem w PBS i inkubuj w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Ten krok jest kluczowy. Nowo przygotowany żel jest odwodniony i musi całkowicie wchłonąć wodę oraz pęcznieć do ostatecznych rozmiarów w PBS. Jeśli ten krok zostanie pominięty i żel zostanie przecięty bezpośrednio, będzie się dalej rozszerzał w kolejnym podłożu komórkowym, prawdopodobnie przekraczając powierzchnię dołku hodowli i czyniąc go bezużytecznym. Grubość żelu po obrzęku wynosi 1 mm. Jest to kluczowe, ponieważ gdy grubość żelu spada poniżej 100 μm, komórki mogą wyczuć sztywność sztywnej płyty hodowlowej, co zakłóca zamierzone pomiary mechanobiologiczne.

8. Cięcie i przeniesienie żelu na płytkę hodowlową

  1. Następnego dnia pobierz żel z temperatury 4 °C. Używając sterylnego wykraczacza do biopsji lub nożyka do ostrza (o średnicy odpowiadającej rozmiarowi płytki hodowlanej, np. płytki 6-dołkowej), przeciąń żel w warunkach sterylnych.
  2. W szafce biosafety użyj sterylnych kleszczy, aby delikatnie podnieść przecięty dysk żelowy i umieścić go na środku pustej, sterylnej dołki hodowlanej.

9. Początkowe płukanie i promieniowanie UV

  1. Dodaj odpowiednią ilość bezpłodnego PBS do dołka zawierającego żel, zapewniając jego całkowite zanurzenie.
  2. Delikatnie kołysz płytkę hodowlową, aby umyć powierzchnię żelu.
  3. Aspiruj PBS pipetą.
  4. Powtórz ten proces prania jeszcze raz, łącznie dwa razy, każde trwające 3 minuty.
  5. Po umyciu dodaj wystarczająco dużo sterylnego PBS, aby ponownie pokryć żel. Umieść całą płytkę hodowlową z lekko uchyloną pokrywką pod lampą UV (wewnątrz szafki bioasekuracyjnej lub dedykowanego sieciera UV) i naświetlaj przez 1 godzinę dla podstawowej sterylizacji.

10. Aktywacja krzyżowca Sulfo-SANPAH

  1. Wewnątrz szafki biobezpieczeństwa ostrożnie zasysaj PBS z odwiertu.
  2. Przed aspiracją delikatnie oddziel żel od ścianek i dna za pomocą końcówki pipety, aby nie uszkodzić żelu spowodowanego cieczą napięciem powierzchniowym.
  3. Przenieś żel do innej, czystej studni na tej samej płycie hodowlowej, używając sterylnych kleszczy.
    UWAGA: Podczas przenoszenia żelu, najpierw dodanie niewielkiej ilości PBS do czystej studni może pomóc usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione między dnem dołka a żelem podczas umieszczenia, a także służy jako dodatkowe płukanie.
  4. Przygotowanie roztworu roboczego do linkowania krzyżowego: Świeżo przygotuj roztwór roboczy Sulfo-SANPAH o stężeniu 0,2 mg/ml, rozcieńczając roztwór zapasowy (patrz Tabela 1) za pomocą wody sterylnej lub zalecanego buforu (np. PBS).
    UWAGA: Chroń roztwór przed światłem.
  5. Dodaj wystarczającą ilość roztworu roboczego Sulfo-SANPAH do pokrycia żelu (np. 250 μL dla płytki 12-dołkowej, 500 μL dla płytki 6-dołkowej), zapewniając całkowite przykrycie żelu.
  6. Umieść płytę pod światłem UV o długości fali 365 nm / 120 mJ/cm/2 i napromieniuj przez 1 godzinę.
    UWAGA: Ten etap aktywuje Sulfo-SANPAH, umożliwiając jej wiązanie się z grupami funkcjonalnymi na powierzchni żelu.

11. Aktywacja krzyżowca i końcowe płukania

  1. Po napromieniowaniu zasysaj roztwór Sulfo-SANPAH z odwiertu wewnątrz szafy biobezpieczeństwa.
  2. Dodaj odpowiednią ilość sterylnego PBS do dołku, delikatnie kołysz, aby umyć powierzchnię żelu, i zasysaj PBS.
  3. Powtórz ten proces mycia jeszcze raz, łącznie dwa mycia, każde trwające 3 minuty, aby dokładnie usunąć niezareagowane Sulfo-SANPAH.

12. Przygotowanie roztworu do pracy kolagenu typu I z ogonem szczura

  1. Użyj roztworu kwasu octowego o stężeniu 0,02 m jako rozpuszczalnika, aby rozcieńczyć roztwór kolagenu typu I typu szczura z ogonem.
  2. Dostosuj końcowe stężenie roztworu roboczego do 60–100 μg/mL. Na przykład, jeśli stężenie kolagenu wynosi 4 mg/mL, należy dodać 15–25 μL zapasu do 985–975 μL 0,02 M kwasu octowego, aby uzyskać 1 ml roztworu roboczego.

13. Powłoka kolagenowa i inkubacja

  1. Dodaj odpowiednią objętość roztworu roboczego kolagenu do każdego dołka zawierającego żel aktywowany zgodnie z typem płytki: dodaj 2 mL dla płytki 6-dołkowej lub 1 mL dla płytki 12-dołkowej.
  2. Delikatnie mieszaj płytką hodowlową, aby równomiernie pokrywać żel i dno dołka.
  3. Przykryj płytkę i inkubuj przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO₂, aby kolagen mógł się utrwalić na powierzchni żelu poprzez sieciowanie Sulfo-SANPAH.

14. Wtórne napromieniowanie UV i utrwalanie

  1. Następnego dnia zdejmij płytkę i ponownie napromieniuj pod promieniowaniem UV o temperaturze około 120 mJ/cm2 przez godzinę.

15. Usuń niezwiązany kolagen i komórki nasienne

  1. Wewnątrz szafki bioasekuracyjnej ostrożnie zasysaj roztwór kolagenu typu I z ogonu szczura z dołków.
  2. Dodaj sterylny PBS do dołków, delikatnie kołysz, aby opłukać powierzchnię żelu, i zasysaj PBS.
  3. Powtórz pranie jeszcze raz, łącznie dwa mycia, każde trwające 3 minuty.
  4. Po umyciu matryca żelowa jest gotowa. Ponownie zawiesić przygotowane komórki macierzyste Leydiga w kompletnej pożywce kultury SLC (skład opisany w kroku 1).
  5. Zasiewaj zawiesinę komórkową bezpośrednio na powierzchnię żelu. Zalecana gęstość siewu wynosi 2 × 104 komórek/cm 2 (np. około 2 × 105 komórek na odwiert dla standardowej płyty 6-dołowej).
  6. Inkubuj płytki hodowlane w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o zawartości 5% CO₂.
  7. Aby utrzymać optymalną żywotność komórek i funkcję sterydogenną, zmieniaj podłoże hodowlane co 48 godzin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomyślne wdrożenie tego protokołu daje poliakrylamidowe hydrożele o określonej sztywności (od 1 do 100 kPa), które pozostają mocno przymocowane do płytki hodowli i wspierają solidną przyczepność oraz rozprzestrzenianie się SLC. Rysunek 1 przedstawia schematyczny przegląd całego procesu pracy, od odlewania żelu po siewnictwo komórek, umożliwiając użytkownikom wizualizację kluczowych etapów protokołu.

Mechaniczna walidacja hydrożeli poliakrylamidowych (sztywność doc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Właściwości mechaniczne macierzy zewnątrzkomórkowej odgrywają fundamentalną rolę w regulacji zachowania komórek macierzystych, jednak narzędzia do systematycznego badania tych efektów w komórkach rozrodczych pozostają ograniczone. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że usztywnianie matrycy patologicznej podczas starzenia się zakłóca homeostazę komórek Leydiga (SLC) w osi Piezo1/ROS/Gli1, prowadząc do spadku testosteronu10. Bazując na tym odkryciu, opracowaliśmy protokół hydrożelowy poliakrylamido...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie tego projektu zapewniły Narodowy Program Badań Kluczowych Chińskich Badań nad Komórkami Macierzystymi i Badaniami Translacyjnymi (2021YFA1100601), Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych Chin (82371608), Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023B1515020016) oraz Program Badań Podstawowych w Shenzhen (JCYJ20240813150417024, JCYJ20240813150422030).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowySigma-AldrichKat#A6283Rozcieńczalnik dla kolagenu z ogona szczura (0,02 M)
Acryiamide     Sangon BiotechCat#A100341-0500Monomer do przygotowania żelu poliakrylamidowego
Persiarczan amonu (APS)  Sangon BiotechKatalog#A100486-0100Inicjator polimeryzacji żelowej
Suplement B27InvitrogenCat#A1486701Zdefiniowany suplement wzbogacony o antyoksydanty i hormony; wspiera przeżywalność neuronów i komórek macierzystych (2% v/v)
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)InvitrogenCat#13256029Czynnik wzrostu mitogeniczny; Sprzyja proliferacji SLC i stemnessnessu (20 ng/mL)
Bisakrylamid Shanghai yuanye Bio-TechnologyCat#S14002Crosslinker do żeli poliakrylamidowych
Ekstrakt z zarodka kurczakaBiologicals w USACat#C3999Bogate źródło czynników wzrostu i składników odżywczych; wspiera wzrost SLC i jego opłacalność (5% v/v)
Kolagen, typ I, z ogonu szczuraYEASENKatalog#40125ES50Pokrywa powierzchnię hydrożelu poliakrylamidowego aktywowaną przez sulfo-SANPAH, aby wspierać adhezję i hodowlę SLC.
Kolagenaza typu IVGibcoKatalog#17104-0191 mg/mL w DMEM/F12 do trawienia tkanki jądrowej
CYP11A1 przeciwciałaGeneTexCat#GTX56293Dla western blottingu
DeksametazonSigma-AldrichCat#D1756Agonista receptora glukokortykoidowego; wspiera proliferację SLC i utrzymanie stemnessu (1 nM)
Medium DMEM/F12GibcoCat#11320033Podłoże bazalne do trawienia, płukania i hodowli SLC
Czynnik wzrostu naskórka (EGF)PeproTechCat#AF-100-15Stymuluje proliferację SLC i utrzymuje stan niezróżnicowany (20 ng/mL)
Serum bydła płodu (FBS)VISTECHCat#SE100-011Stosowany w 10% do zatrzymania aktywności kolagenazy
FidżiNie mahttps://imagej.net/FijiOprogramowanie do analizy obrazów
Przeciwciało GADPHProteintechCat#60004-1-IgDla western blottingu
Enzymy trawiące żelowe Dokładna biotechnologiaCat#GXDLFAMieszanina enzymów do trawienia tkanki jąder i izolacji SLC
HEPES CytivaCat#SH30237.01Bufor, aby utrzymać pH 7,0 i dash; 7.4
HSD3β PrzeciwciałoSanta CruzCat#sc-515120Dla western blottingu
Sorter komórek influxowychBDhttps://www.bdbiosciences.com/content/dam/bdb/marketing-documents/BD_Influx_tech_specs.pdf
Insulina-transferyna-selenit sodu (ITS)Sigma-AldrichCat#11074547001Wspiera przeżywalność komórek, pobieranie glukozy oraz ochronę antyoksydacyjną (5 & mu; g/L)
Zastępstwo serum KnockOut (KSR) GibcoKatalog#10828-028Substytut serum dla medium hodowlanego SLC
LIF (Czynnik hamujący białaczkę)MilliporeCat#LIF1010Cytokina, która utrzymuje pluripotencję komórek macierzystych i samoodnawianie (1 ng/mL)
Jądra myszyTen artykułNie maIzolowane od myszy C57BL/6
Zestaw ELISA do testosteronu myszyFine BiotechKata#40203ES80Do ilościowego określenia testosteronu w supernatantach hodowli
Mysz: C57BL/6 Shenzhen TopBiotechNie maSzczep myszy używany do pobierania jąder
Mysz: Jądrowe komórki macierzyste Leydiga (SLC)  Ten artykułNie maKomórki pierwotne wyizolowane z jąder myszy
Suplement N2InvitrogenCat#17502001Zdefiniowany suplement bezsurowiczy wspierający hodowlę komórek nerwowych i macierzystych (1% v/v)
Aminokwasy nieistotneHyCloneKatalog#SH30050.03Dostarcza źródła azotu do syntezy białek i metabolizmu komórkowego (1% v/v)
Onkostatyna M (OSM)PeproTechKata#300-10TCytokiny zaangażowane w regulację różnicowania SLC i dojrzewanie komórek Leydiga (20 ng/mL)
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)GibcoCat#10010023Buffer do mycia i ponownej zawieszenia
Czynnik wzrostu pochodzący od płytek krwi (PDGF)PeproTechKata#100-14BWspiera proliferację, migrację i przeżywalność komórek (20 ng/mL)
Prism 9.0GraphPadhttps://www.graphpad.com/Oprogramowanie do analizy statystycznej i tworzenia wykresów
Przeciwciało StARProteintechCat#67130-1-IgDla western blottingu
Sulfo-SANPAH MACKLINKatalog#102568-43-4Heterobifunkcjonalny crosslinker do aktywacji powierzchni żelowej
TEMED PhygeneCat#PH0341Katalizator polimeryzacji
β-MerkaptoetanolInvitrogenCat#21985023Zmniejsza stres oksydacyjny i wspiera wzrost komórek w hodowli (0,1 mM)

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  2. Smith, L. R., Cho, S., Discher, D. E. Stem cell differentiation is regulated by extracellular matrix mechanics. Physiology. 33 (1), 16-25 (2018).
  3. Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity. Nature Mater. 15 (3), 326-334 (2016).
  4. Nellinger, S., Kluger, P. J. How mechanical and physicochemical material characteristics influence adipose-derived stem cell fate. Int J Mol Sci. 24 (4), 3551(2023).
  5. Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  6. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Curr Protoc Cell Biol. , (2010).
  7. Sanzari, I., et al. Parylene C topographic micropattern as a template for patterning PDMS and polyacrylamide hydrogel. Sci Rep. 7 (1), 5764(2017).
  8. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
  9. Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. J Vis Exp. 46, e2173(2010).
  10. Huang, J., et al. High matrix stiffness triggers testosterone decline in aging males by disrupting stem Leydig cell pool homeostasis. Cell Rep. 44 (9), 116207(2025).
  11. Syed, S., Karadaghy, A., Zustiak, S. Simple polyacrylamide-based multiwell stiffness assay for the study of stiffness-dependent cell responses. J Vis Exp. 97, e52643(2015).
  12. Zheng, Y. C., et al. Islet transplantation ameliorates diabetes-induced testicular interstitial fibrosis and is associated with inhibition of TGF-β1/Smad2 pathway in a rat model of type 1 diabetes. Mol Med Rep. 23 (5), 376(2021).
  13. Trottmann, M., et al. Shear-wave elastography of the testis in the healthy man - determination of standard values. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (3), 273-281 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Polyacrylamide HydrogelsMatrix StiffnessStem Leydig CellsExtracellular MatrixHydrogel FabricationCollagen CoatingSubstrate StiffnessCell DifferentiationMechanobiologySteroidogenic Function

Powiązane artykuły