Całokrwiowa przepływowa cytometria ilościowa płytek dodatnich na czynnik tkankowy: Zharmonizowany wieloośrodkowy proces roboczy

Marta Brambilla; Alessia Becchetti; Kevin Nallio; Arianna Galotta; Manuela Capone; Martina Toma; Roberto Caporale; Antonella Aiello; Marina Camera

doi:10.3791/71395

Artykuł metodologiczny

Całokrwiowa przepływowa cytometria ilościowa płytek dodatnich na czynnik tkankowy: Zharmonizowany wieloośrodkowy proces roboczy

110 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71395

⸱

7 sierpnia 2026

Marta Brambilla¹ , Alessia Becchetti¹ , Kevin Nallio¹ , Arianna Galotta¹ , Manuela Capone² , Martina Toma³ , Roberto Caporale⁴ , Antonella Aiello³ , Marina Camera¹^,⁵

¹Unit of Cell and Molecular Biology in Cardiovascular Diseases, Centro Cardiologico Monzino IRCCS, ²Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, ³Department of Advanced Diagnostics, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, ⁴Flow Cytometry Diagnostic Center and Immunotherapy (CDCI), AOU Careggi, ⁵Department of Pharmaceutical Sciences, Università degli Studi di Milano

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy tu ujednolicony proces ilościowego pomiaru płytek krwi zawierających czynnik tkankowy za pomocą cytometrii przepływowej w badaniach multicentrum. Protokół opisuje standaryzowane procedury pobierania krwi, fiksację pełnej krwi, barwienie i ujednolicenie instrumentów, co pozwala na przeprowadzenie analizy zarówno lokalnie, jak i centralnie, w zależności od możliwości laboratorium.

Streszczenie

Czynnik Tkankowy (TF)^pos-płytki stanowią podzbiór populacji płytek krwi. Ostatnio wykazano, że ta podgrupa może przewidywać śmiertelność z powodu chorób układu krążenia u pacjentów z chorobą wieńcową, co czyni ją biomarkerem przydatnym do stratyfikacji ryzyka zakrzepowego. Dokładne ilościowe określenie TF^pos-płytek przez cytometrię przepływową wymaga ścisłej standaryzacji pobranego materiału, procedur barwienia i ustawień urządzenia, szczególnie w badaniach wieloośrodkowych, gdzie zmienność techniczną może wpłynąć na ich pomiar. Ten protokół opisuje spójny proces oceny krwi pełnej metodą cytometrii przepływowej dla krążących TF^pos-płytek, zaprojektowany w celu zapewnienia odtwarzalności pomiędzy laboratoriami o różnej infrastrukturze technicznej. Procedura obejmuje standaryzowane pobieranie krwi i fiksację krwi pełnej, aby zachować in vivo fenotyp płytek. Według lokalnych możliwości laboratorium, dostępne są dwie różne metody przygotowania próbki: przesyłka ustalonej próbki do Laboratorium Centralnego w celu centralnego barwienia, akwizycji i analizy dla centrów bez urządzeń do cytometrii przepływowej, lub lokalne barwienie i akwizycja dla centrów wyposażonych w urządzenia do cytometrii przepływowej i przeszkolonego personelu. Ocena odsetka TF^pos-płytek jest osiągana przez bezpośrednie znakowanie przeciwciałami anti-TF Star Fluor 488 i anti-CD41 PerCP-Cy5.5 w celu identyfikacji białka docelowego i markera populacji płytek, odpowiednio. Harmonizacja cytometru przepływowego jest osiągana poprzez wspólny szablon akwizycji dla identycznych modeli cytometrów lub poprzez aliniację opartą na kulkach dla różnych platform. Proces obejmuje również standaryzowany podchod do bramki i centralną analizę danych, aby umożliwić wiarygodne porównanie pomiarów TF^pos-płytek między ośrodkami. Wyniki reprezentatywne wykazały, że ten proces wspiera odtwarzalne ilościowe określenie TF^pos-płytek w walidowanych wieloośrodkowych ustawieniach akwizycji. Ten protokół może ułatwić szerzej zastosowanie oceny TF^pos-płytek w stratyfikacji ryzyka zakrzepowego i wspierać szerszą standaryzację cytometrii przepływowej płytek w badaniach translacyjnych i klinicznych.

Wprowadzenie

Czynnik tkankowy (TF) jest głównym inicjatorem kaskady krzepnięcia krwi i kluczowym determinantem wytwarzania trombiny. Poza jego klasycznym występowaniem w komórkach podendotelialnych i leukocytach, TF jest również kojarzony z krążącymi płytkami krwi¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Podczas krwiotwórstwa megakariocyty przenoszą TF na podzbiór płytek krwi⁶. W fizjologicznych warunkach, około 20–30% krążących płytek zawiera TF przechowywane w układzie kanałyczkowym, przestrzennie oddzielone od czynnika VII w osoczu⁷. W tym skomponowalnym stanie, TF jest funkcjonalnie chronione przed krążącymi czynnikami krzepnięcia i pozostaje nieaktywne. W związku z tym, tylko niewielka frakcja płytek wykazuje wykrywalny TF na powierzchni, gdy krew pełna osób zdrowych jest analizowana za pomocą cytometrii przepływowej, co odzwierciedla fizjologiczną homeostazę²^,⁸. Patologiczne stany charakteryzujące się aktywacją płytek i równowagą trombo-zapaleniem mogą zakłócić tę równowagę, prowadząc do zwiększonej ekspozycji TF na powierzchni. Podwyższona proporcja płytek dodatnich na TF (TF^pos) została zgłoszona w kilku zaburzeniach zakrzepowych⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵. Należy zauważyć, że w chorobie wieńcowej, poziomy płytek TF^pos przekraczające 4% niezależnie przewidują śmiertelność z powodu chorób układu krążenia w 5-letnim przeglądzie, ustanawiając procent płytek TF^pos jako klinicznie istotny biomarker ryzyka zakrzepowego¹⁶.

Dokładne i powtarzalne ilościowe określenie płytek TF^pos jest zatem niezbędne zarówno dla zastosowań w badaniach translacyjnych, jak i klinicznych. Wcześniej opublikowany przepływ cytometrii płytek krwi dla oceny płytek TF^pos poprawił badania nad tym białkiem w ustawieniach jednocentrum¹⁷, dostarczając porad dotyczących optymalizacji wybranych etapów przed analitycznych lub analitycznych. Jednak to podejście nie zostało specjalnie zaprojektowane, aby radzić sobie z dodatkowymi wyzwaniami logistycznymi i analitycznymi badań wielocentrowych, w tym procedurami wysyłki, standaryzowanym przetwarzaniem próbek i koniecznością harmonizacji pobierania próbek na różnych platformach cytometrii przepływowej. Ponadto należy również wziąć pod uwagę różne infrastruktury i poziomy fachowej wiedzy uczestniczących centrów.

W tym kontekście, wartość dodana obecnego protokołu polega na zapewnieniu szczegółowego przepływu pracy, który łączy standaryzowane pobieranie krwi i fiksację pełnej krwi, elastyczne protokoły przetwarzania próbek, harmonizację akwizycji między platformami i bezpośrednie barwienie oraz scentralizowaną kontrolę jakości poprzez analizę danych.

Celem niniejszej pracy jest zatem dostarczenie operacyjnego ram dla zharmonizowanej wielocentrowej implementacji analizy płytek TF^pos w pełnej krwi za pomocą cytometrii przepływowej. Ta zintegrowana konstrukcja zmniejsza zmienność przed analityczną, analityczną i między urządzeniami, dzięki czemu ustala warunki dla spójnej oceny płytek TF^pos w ustawieniach wielocentrowych.

Protokół

Wszyscy dawcy krwi wyrazili pisemną świadomą zgodę zatwierdzoną przez Komisję Etyczną Instytucji (nr 70/24, CE 18.06.24).

Wieloośrodkowy schemat pracy dla ilościowego oznaczania w krwi pełnej za pomocą cytometrii przepływowej płytek krwi TF^pos przedstawiono na Rysunku 1. Poniższy szczegółowy protokół przeprowadzi użytkownika przez pięć głównych etapów.

Schemat analizy płytek krwi dodatnich pod kątem TF, cytometria przepływowa, diagram, etapy przetwarzania próbek klinicznych.
Rycina 1: Wieloośrodkowy schemat analizy płytek krwi TF^pos. Schematyczne przedstawienie potoku analitycznego dla wieloośrodkowej oceny krążących płytek krwi TF^pos za pomocą cytometrii przepływowej krwi pełnej. Po zakwalifikowaniu uczestników i pobraniu krwi, próbki są utrwalane i przetwarzane zgodnie z zasobami technicznymi dostępnymi w każdej Jednostce Klinicznej. Ośrodki nieposiadające zaplecza cytometrii przepływowej przesyłają utrwalone próbki do Laboratorium Centralnego w celu barwienia, akwizycji i analizy. Ośrodki wyposażone w cytometry przepływowe mogą przeprowadzać barwienie i akwizycję na miejscu, korzystając ze zstandaryzowanych szablonów akwizycji. Harmonizacja instrumentów jest osiągana za pomocą wspólnych szablonów (ten sam model instrumentu), szablonów wygenerowanych w Laboratorium Centralnym (dostępny inny model do wyrównania) lub kalibracji za pomocą kulek fluorescencyjnych, gdy bezpośrednia harmonizacja szablonów nie jest możliwa. Analiza danych jest przeprowadzana centralnie przy użyciu zstandaryzowanego schematu bramkowania (gating). Diagram został stworzony przy użyciu ChatGPT (OpenAI). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

1. Pobieranie krwi

UWAGA: Ocena TF^pos-płytek wymaga maksymalnie 50 µL krwi pełnej.

Pobrać krew żylną obwodową z żyły łokciowej, używając igły motylkowej o rozmiarze 19G. Stosować stazę jedynie na czas wkłucia i zwolnić ją natychmiast po wprowadzeniu igły, aby zminimalizować aktywację płytek krwi ex vivo.
Odrzucić pierwszą probówkę z EDTA. Następnie pobrać krew do probówki typu vacutainer z 0,129 M cytratem sodu, napełniając ją do kreski producenta w celu zachowania prawidłowego stosunku krwi do antykoagulanta.
Delikatnie odwrócić probówkę 5 razy, aby dokładnie wymieszać krew z antykoagulantem.
Przechowywać probówkę w pozycji pionowej w temperaturze pokojowej, unikając wstrząsania, chłodzenia lub transportu pneumatycznego.
Przetworzyć próbkę w ciągu 3 h od momentu pobrania.

2. Przygotowanie próbek

UWAGA: Wszystkie przeciwciała muszą zostać zakupione przez Laboratorium Główne i muszą pochodzić z tej samej serii. Jeśli w trakcie trwania badania konieczna okaże się zmiana serii, nową serię odczynników należy zwalidować bezpośrednio względem serii aktualnie używanej poprzez równoległe testowanie w tych samych warunkach badania i wdrożyć ją tylko po potwierdzeniu porównywalnej wydajności. Powszechnie stosowane odczynniki (np. PBS – roztwór soli fosforanowej i PFA – paraformaldehyd) mogą być kupowane przez każde z uczestniczących ośrodków; jednak kody produktów muszą być zgodne z kodami używanymi przez Laboratorium Główne, a spójność serii musi być zachowana przez cały okres badania.

Utwierdź próbkę.
UWAGA: Przed rozpoczęciem przetwarzania krwi przygotuj 1% PFA poprzez rozcieńczenie 4% PFA w PBS w temperaturze pokojowej.
OSTROŻNIE: PFA jest toksyczne i należy z nim pracować w dygestorium, stosując odpowiednie środki ochrony indywidualnej (fartuch laboratoryjny, rękawiczki i ochronę oczu). Unikać wdychania oraz kontaktu ze skórą lub oczami. UTYLIZACJA ODPADÓW: Wszystkie roztwory zawierające PFA, utwierdzone próbki i zanieczyszczone materiały jednorazowe należy zebrać do odpowiednio oznakowanych, zamkniętych pojemników na odpady niebezpieczne, zgodnie z przepisami instytucjonalnymi i lokalnymi.
1. Delikatnie odwróć probówkę typu vacutainer 5 razy, aby wymieszać krew z antykoagulantem.
2. Przenieś 50 µL krwi do probówki o pojemności 2 mL zawierającej 950 µL 1% PFA.
3. Delikatnie wymieszaj próbkę i inkubuj przez 1 h i 30 min w temperaturze pokojowej.
4. Dodaj 500 µL PBS.
5. Wiruj przy 1500 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
6. Usuń nadosad i resuspenduj osad w 1 mL PBS.
  UWAGA: Punkt kontrolny: Po wirowaniu, przed usunięciem nadosadu, upewnij się, że osad jest widoczny. Ostrożnie usuń nadosad, nie naruszając osadu. Po resuspensji sprawdź, czy próbka jest homogenna i wolna od widocznych grudek lub agregatów.
7. Prześlij utwierdzoną próbkę do laboratorium centralnego w opakowaniu z kontrolowaną temperaturą utrzymywaną w zakresie 2-8 °C w ciągu 24 h po utwierdzeniu. Nie zamrażać. Udokumentuj czas pobrania, czas utwierdzania oraz czas wysyłki.
Etykietowanie próbek do analizy cytometrycznej.
UWAGA: Przeciwciało anti-TF Star Fluor 488 (klon HTF1; anti-CD142) jest skierowane przeciwko czynnikowi tkankowemu (Tissue Factor), natomiast anti-CD41 PerCP-Cy5.5 rozpoznaje integrynę płytkową alphaIIb. Przed rozpoczęciem procedury barwienia odwiruj przeciwciała przy 17000 x g przez 5 min w temperaturze +4 °C, aby usunąć ewentualne agregaty¹⁸. Rozcieńcz przeciwciało anti-TF Star Fluor 488 (1:100) w PBS. Przeciwciało anti-CD41 PerCP-Cy5.5 nie wymaga rozcieńczenia pośredniego i powinno być stosowane w objętości zalecanej przez producenta.
1. Przygotuj cztery polipropylenowe probówki o pojemności 2 mL.
2. Odmiar 80 µL utwierdzonej próbki do każdej probówki.
3. Do każdej probówki dodaj odpowiednią objętość PBS i przeciwciała anti-TF Star Fluor 488, zgodnie z treścią Tabeli 1 (Dzień 1).
4. Delikatnie wymieszaj próbki.
5. Inkubuj przez noc (O/N) w temperaturze 4 °C w ciemności.
6. Następnego dnia (Dzień 2) dodaj anti-CD41 PerCP-Cy5.5 do probówek 3 i 4, zgodnie z treścią Tabeli 1.
7. Delikatnie wymieszaj próbki.
8. Inkubuj przez 15 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
9. Rozcieńcz zawartość każdej probówki 300 µL PBS.
10. Przechowuj zbarwione próbki w ciemności do czasu akwizycji cytometrycznej.
  UWAGA: Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C do trzech dni¹⁷. Dłuższe przechowywanie prowadzi do stopniowego zaniku sygnału i należy go unikać.

		Dzień 1		Dzień 2
Nie.	Identyfikator probówki	1X PBS (µL)	Przeciw-TF Star Fluor 488 (µL)	Przeciwciało anty-CD41 PerCP-Cy5.5 (µL)
1	Nebarwiony	20	0	0
2	TF	12.5	7.5	0
3	CD41	15	0	5
4	TF/CD41	7.5	7.5	5

Tabela 1: Protokół barwienia do oceny płytek krwi TF^pos.

3. Standaryzacja akwizycji w cytometrii przepływowej

Konfiguracja szablonu akwizycji (wykonywana przez Laboratorium Centralne).
1. Konfiguracja szablonu dla cytometru przepływowego A.
  1. Otwórz oprogramowanie A v2.6.
  2. Utwórz wykres kropkowy FSC-A/SSC-A [Wszystkie zdarzenia] w skali logarytmicznej w celu wizualizacji populacji komórek (Rycina 2A).
  3. Utwórz wykres kropkowy CD41 PerCP-Cy5.5-A/SSC-A [Wszystkie zdarzenia] w skali logarytmicznej w celu zidentyfikowania płytkami krwi w obrębie [Płytki krwibramka (Rysunek 2B).
  4. Utwórz wykres pseudokolorowy PerCP-Cy5.5-A/Star Fluor 488-A [Wszystkie zdarzenia] w celu sprawdzenia przesiąku/kompensacji (Rycina 2C).
  5. Utwórz wykres kropkowy FSC-A/FSC-H w [Płytki krwiwyznacz bramkę i zdefiniuj obszar w celu identyfikacji singletów ([Singlety]; Rycina 2D).
  6. Utwórz wykres kropkowy CD41 PerCP-Cy5.5-A/TF Star Fluor 488-A w [Singletybramka w celu identyfikacji TF^pozytywny-płytki krwi (Rycina 2E).
  7. Ustaw próg na 1000 dla SSC-H.
  8. Ustaw szybkość przepływu na „Slow”.
  9. Ustaw wzmocnienie B525 na 315, aby zapewnić optymalne rozróżnienie między zdarzeniami pozytywnymi a negatywnymi; w razie potrzeby dostosuj tę wartość w zależności od użytego urządzenia.
  10. Ustaw wzmocnienie B690 zgodnie z codzienną kontrolą jakości (QC). Akwizycja jest dopuszczalna tylko wtedy, gdy CD41^pozycja- populacja płytek krwi jest całkowicie oddzielona od tła negatywnego i pozostaje w obrębie wcześniej zdefiniowanego bramkowania referencyjnego, ustanowionego w szablonie podczas akwizycji.
  11. Eksportuj szablon, korzystając z funkcji „Export Experiment Template”.
  12. Pobierz: Szablon akwizycji dla TF^pozytywny-analiza płytek krwi wykonana na cytometrze przepływowym A jest dostępna do pobrania jako Plik uzupełniający 1 i Rycina uzupełniająca 1.
    UWAGA: Wykres służący do sprawdzania przelewów/kompensacji (Rycina 2C), choć nie jest wymagany do tej analizy multiparametrycznej, został uwzględniony. Należy jednak rozważyć, czy zostanie zastosowana kombinacja fluorochromów inna niż zaproponowana w niniejszym protokole.
2. Utwórz szablon dla cytometru przepływowego B.
  1. Utwórz plik protokołu, który zawiera pełną konfigurację akwizycji opisaną w punkcie 3.1.1.
  2. Wyeksportuj szablon za pomocą funkcji „Export Protocol” w oprogramowaniu B v1.6, generując plik protokołu.
  3. W urządzeniu odbiorczym zaimportuj plik protokołu, korzystając z funkcji „Import Protocol” w oprogramowaniu.
3. Tworzenie szablonu dla cytometru przepływowego C.
  1. Utwórz plik przestrzeni roboczej, który obejmuje całą konfigurację akwizycji opisaną w punkcie 3.1.1., a następnie go wyeksportuj.
  2. Na urządzeniu odbiorczym zaimportuj plik obszaru roboczego, korzystając z funkcji „Copy” oprogramowania C v3.1.
Harmonizacja cytometrów przepływowych przy użyciu kulek kalibracyjnych.
UWAGA: Należy użyć 6-szczytowych kuleczek kalibracyjnych Rainbow.
1. Definicja wartości docelowej.
  UWAGA: Do określenia medianowej intensywności fluorescencji (MdFI) pierwszego piku w kanale fluorescencji B525 należy użyć następującego wzoru:
  MdFI_CU =
  gdzie CU: instrumenty jednostki klinicznej (Clinical Unit) i RI: instrument referencyjny (Reference Instrument).
2. Przygotowanie próbek.
  1. Wymieszać probówkę z kuleczkami na wirówce typu vortex.
  2. Do probówki z próbką dodać 5 kropli kulek.
  3. Dodać 1 ml PBS.
  4. Mieszaj w wirówce wierzchołkowej (vortex) przez 5–10 s.
3. Pozyskiwanie kulek.
  1. Utwórz wykres punktowy FSC-A/SSC-A w skali logarytmicznej przedstawiający [Wszystkie zdarzenia], i zdefiniuj obszar o nazwie [Kuleczki] (Rycina 3A).
  2. Utwórz wykres kropkowy FSC-A/FSC-H w [Kuleczkizastosuj bramkowanie i zdefiniuj obszar w celu identyfikacji singletówSinglet] (Rycina 3B).
  3. Utwórz histogram dla kanału fluorescencji Star Fluor 488 (B525).
  4. Wyświetl tylko [Singlet] na histogramie.
  5. Wyznacz bramkę obejmującą całą szerokość pierwszego piku (region B w Rysunek 3C).
  6. W karcie Statystyka wyświetl wartości mediany X (X-Med).
  7. Usuń wszelką istniejącą kompensację.
  8. Ustaw prędkość przepływu na „Slow”.
  9. Uruchom akwizycję w trybie „Run”.
  10. W sekcji „Acquisition setting” zmień napięcie/wzmocnienie B525, aby osiągnąć wartość docelową X-Med obliczoną zgodnie z wartością referencyjną.
  11. Zarejestruj plik danych zawierający 10 000 zdarzeń w [Singletwyznaczać bramkę dopiero po osiągnięciu tego kryterium akceptacji. Nie należy pobierać próbek badawczych do momentu uzyskania zakresu docelowego.

Plik uzupełniający 1: Szablon akwizycji dla analizy płytek TF^pos na cytometrze przepływowym A dostępny do pobrania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 1: Zrzut ekranu szablonu akwizycji dla analizy płytek TF^pos na cytometrze przepływowym A. (A) Wykres kropkowy FSC-A vs SSC-A zapewnia wizualną reprezentację ogólnego rozkładu zdarzeń. (B) Płytki są identyfikowane na wykresie CD41 vs SSC-A i bramkowane jako [Platelets]. (C) Wykres PerCP-Cy5.5 vs Star Fluor 488 został dołączony w celu oceny potencjalnego przesączania sygnału (spillover). (D) Dublety są wykluczane w obrębie bramki [Platelets] za pomocą wykresu FSC-A vs FSC-H, co definiuje populację [Singlets]. (E) Płytki TF^pos są identyfikowane w obrębie bramki [Singlets] na podstawie fluorescencji PerCP-Cy5.5 i Star Fluor 488. (F-H) Przedstawiono ustawienia akwizycji zaimplementowane w szablonie, w tym szybkość przepływu próbki (Slow), próg główny (SSC) oraz wzmocnienia detektorów (B525 i B690). Pełne szczegóły konfiguracji akwizycji i schematu postępowania znajdują się w sekcji 3.1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Wykresy cytometrii przepływowej; analiza bramkowania płytek i singletów w stanie spoczynku; marker CD41.
Rycina 2: Szablon akwizycji i strategia bramkowania w celu identyfikacji płytek TF^pos. (A) Wykres kropkowy FSC-A/SSC-A (skala logarytmiczna) przedstawiający wszystkie wykryte zdarzenia. (B) Wykres kropkowy CD41-A/SSC-A użyty do identyfikacji populacji płytek krwi. (C) Wykres pseudokolorowy PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 użyty do oceny przenikania spektralnego i wymagań dotyczących kompensacji. (D) Wykres FSC-A/FSC-H w bramce [Platelets] użyty do wykluczenia dubletów i zdefiniowania singletów. (E) Wykres kropkowy PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 w bramce [Singlets] użyty do identyfikacji płytek TF^pos. Pola statystyczne wyświetlane w nawiasach są automatycznie wypełniane wartościami specyficznymi dla próbki podczas stosowania szablonu w trakcie akwizycji próbek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza cytometrii przepływowej; wykresy kropkowe FSC-A vs SSC-A oraz FSC-A vs FSC-H, histogram liczby kulek.
Rycina 3: Procedura kalibracji instrumentu z użyciem kulek kalibracyjnych. (A) Wykres FSC-A/SSC-A użyty do identyfikacji zdarzeń odpowiadających kulkom. (B) Wykres FSC-A/FSC-H w obrębie zdarzeń kulek, użyty do wykluczenia agregatów i zdefiniowania singletów. (C) Histogram fluorescencji Star Fluor 488 przedstawiający piki kulek z zastosowanym bramkowaniem pierwszego piku kulek w celu wyznaczenia mediany intensywności fluorescencji. Przedstawione statystyki należy uznać za reprezentatywne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Pozyskiwanie próbek w cytometrii przepływowej do analizy płytek krwi TF^pos

Nabyć przy użyciu szablonu FCM.
1. Zaimportuj szablon akwizycji za pomocą “Szablon importu” funkcja w oprogramowaniu A.
2. Pobrać próbki przygotowane w kroku 2.
3. Przed rozpoczęciem rejestracji danych należy zweryfikować, czy bramki dla płytek krwi oraz singletów są zgodne z geometrią wykresu referencyjnego. W razie potrzeby należy skorygować ustawienia bramek.
4. Rozpocznij rejestrację po 5–10 s stabilnego przepływu. Zarejestruj plik danych zawierający 20 000 zdarzeń w obrębie [Singlety] bramka (patrz Rycina 2D). Zapisz niekompensowane pliki .fcs i prześlij je do laboratorium centralnego (Core Laboratory).
Akwizycja bez szablonu FCM.
1. Odtwórz arkusz akwizycji opisany w sekcji 3.1, uwzględniając pięć opisanych wykresów oraz hierarchię bramkowania: Wszystkie zdarzenia (All Events) > Płytki krwi > Singlety > kwadranty TF/CD41.
2. Ustaw próg na 1000 dla parametru SSC-H.
3. Ustaw szybkość przepływu na „Slow”.
4. Ustaw napięcie/wzmocnienie B525 zgodnie z definicją w punkcie 3.2.3.
5. Należy pobrać próbkę przygotowaną w kroku 2. Rejestrację należy rozpocząć po 5–10 s stabilnego przepływu; należy zebrać 20 000 zdarzeń w obrębie [Singletybramkę. Zapisz niekompensowane pliki .fcs i prześlij je do Laboratorium Centralnego.
  UWAGA: Akwizycja jest dopuszczalna tylko w przypadku przejścia codziennej kontroli jakości (QC) instrumentu. Jeśli celem jest 20 000 CD41^{pozycjonowanie}– jeśli nie można uzyskać płytkami krwi, należy zebrać minimum 10 000 zdarzeń CD41^pozycja-zdarzenia płytkowe.

5. Analiza danych

UWAGA: Opisany poniżej schemat analizy ma na celu wsparcie działań Laboratorium Centralnego odpowiedzialnego za scentralizowane przetwarzanie danych i kontrolę jakości.

Otwórz nowy arkusz analizy i załaduj pliki .fcs.
Dla każdej próbki utwórz szablon analizy, jak pokazano na Rysunku 2. W przypadku korzystania z różnych platform, użyj równoważnego szablonu specyficznego dla danej platformy o takiej samej strukturze bramkowania i wynikach statystycznych.
Zweryfikuj, czy bramkowanie prawidłowo identyfikuje populację płytek krwi zgodnie z predefiniowanymi charakterystykami rozproszenia i strategią dyskryminacji singletów (Rysunek 4A,B,D).
Sprawdź występowanie przelewów sygnału (spillover) lub konieczność kompensacji za pomocą wykresu pseudokolorowego [All Events] (Rysunek 4C).
UWAGA: Fluorochrom Star Fluor 488 posiada emisję spektralną przy 520 nm, w porównaniu do PerCP-Cy5.5, który ma emisję spektralną przy 676 nm, co wyjaśnia brak nakładania się widm i brak konieczności stosowania kompensacji.
Zastosuj następującą sekwencję bramkowania na wykresie kropkowym Star Fluor 488 (Rysunek 5):
1. Niebarwiona: zdefiniuj kwadranty przy użyciu kontroli niebarwionej w taki sposób, aby zdarzenia TF^pos w tle pozostały na poziomie 0,01% lub poniżej zdarzeń płytek krwi, wykluczając tym samym autofluorescencję płytek (Rysunek 5A).
2. TF: zastosuj współrzędne kwadrantów zdefiniowane dla próbki niebarwionej, aby zidentyfikować sygnał TF^pos w próbkach barwionych pojedynczo (Rysunek 5B).
3. CD41: zdefiniuj kwadranty przy użyciu próbki barwionej pojedynczo CD41, aby wykluczyć fluorescencję tła płytek krwi (Rysunek 5C).
4. TF/CD41: zastosuj te same współrzędne kwadrantów, aby zidentyfikować sygnał TF^pos w próbkach barwionych TF/CD41 (Rysunek 5D).
  UWAGA: Końcowy procent płytek TF^pos jest uzyskiwany z danych statystycznych wygenerowanych przez oprogramowanie analityczne i raportowany jako procent zdarzeń CD41^pos, które mieszczą się w kwadrancie TF^pos bramkowanej populacji płytek krwi.
Przeprowadź scentralizowaną kontrolę jakości w zakresie identyfikacji nazw plików, serii odczynników, odstępu czasu od fiksacji do akwizycji, temperatury transportu, liczby zdarzeń oraz rozkładów fluorescencji wartości odstających. Pliki wykazujące udokumentowane odchylenia w lokalnej obsłudze, transporcie, czasie fiksacji lub ustawieniach akwizycji powinny zostać oznaczone, zweryfikowane centralnie, a następnie wykluczone lub powtórzone, zgodnie z planem zarządzania odchyleniami specyficznym dla badania.

Wykresy cytometrii przepływowej; bramkowanie i analiza płytek krwi; niebramkowane wykresy rozproszenia; FSC/SSC, markery CD41.
Rysunek 4: Sekwencyjna strategia bramkowania dla analizy płytek krwi TF^pos. Reprezentatywny schemat analizy ilustruje identyfikację populacji płytek krwi po wczytaniu plików .fcs. (A-B) Wykresy kropkowe potwierdzające prawidłowe bramkowanie populacji płytek krwi. (C) Pseudokolorowy wykres PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 użyty do oceny przesączania widmowego (spectral spillover). (D) Wykres FSC-A/FSC-H w obrębie bramki płytek krwi użyty do wykluczenia dubletów i zdefiniowania singletów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat cytometrii przepływowej z wykresami rozrzutu Anti-CD41 i TF. Analiza danych populacji komórek CD41+.
Rysunek 5: Szablon analizy danych. Reprezentatywne wykresy kropkowe dla (A) kontroli niebarwionej, użytej do określenia bazowej autofluorescencji i rozmieszczenia kwadrantów. (B) próbek barwionych pojedynczo na TF; (C) próbki barwionej pojedynczo na CD41, użytej do określenia rozmieszczenia kwadrantów. (D) próbki barwionej podwójnie na TF/CD41, użytej do analizy płytek krwi TF^pos. Liczby wskazują procent płytek krwi TF^pos w reprezentatywnej próbce. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

Niniejszy schemat postępowania został zaprojektowany specjalnie po to, aby umożliwić ośrodkom o zróżnicowanej infrastrukturze technicznej udział w badaniach wieloośrodkowych wymagających ilościowego oznaczenia płytek TF^pos. Rysunek 1 przedstawia organizacyjny schemat postępowania opracowany w celu wsparcia badań wieloośrodkowych ukierunkowanych na pomiar krążących płytek TF^pos przy użyciu cytometrii przepływowej krwi pełnej. W zależności od zasobów technicznych dostępnych w uczestniczących ośrodkach wdrażane są różne procedury przygotowania próbek. W szczególności: (i) gdy jednostka kliniczna nie dysponuje zapleczem do cytometrii przepływowej lub przeszkolonym personelem, próbki krwi pełnej poddawane są fiksacji bezpośrednio po pobraniu, a następnie przesyłane do laboratorium centralnego w celu scentralizowanego barwienia, akwizycji i analizy. (ii) Alternatywnie, ośrodki wyposażone w aparaturę do cytometrii przepływowej mogą przeprowadzać barwienie i akwizycję lokalnie. W takich przypadkach akwizycja danych odbywa się zgodnie z ujednoliconym schematem określonym przez laboratorium centralne. Jeśli model instrumentu jest zgodny z modelem używanym w laboratorium centralnym, akwizycja jest wykonywana przy użyciu zstandaryzowanego szablonu dostarczonego przez laboratorium centralne. W przypadku użycia różnych modeli instrumentów ujednolicenie może zostać osiągnięte albo poprzez transfer szablonu – gdy instrumenty są dostępne do kalibracji w laboratorium centralnym – albo poprzez procedury kalibracji oparte na kuleczkach przed akwizycją próbek. Następnie próbki mogą być akwizycyjne i analizowane zgodnie ze zstandaryzowanym schematem postępowania.

Poniższe reprezentatywne wyniki mają na celu zilustrowanie wykonalności procedury oraz kluczowych kroków harmonizacji, a nie dostarczenie formalnej walidacji wieloośrodkowej testu. Aby zapewnić niezawodną detekcję TF, w pierwszej kolejności oceniono strategię barwienia pod kątem kompatybilności spektralnej i stabilności sygnału. Płytki krwi zidentyfikowano przy użyciu przeciwciała anty-CD41 PerCP-Cy5.5, natomiast detekcja TF opierała się na przeciwciałach monoklonalnych anty-TF sprzężonych z Star Fluor 488. Kontrole barwione pojedynczo wykorzystano do weryfikacji braku przesięku fluorescencji między kanałami detekcji. Jak pokazano na Ryc. 6A, próbki barwione pojedynczo CD41 PerCP-Cy5.5 nie wygenerowały wykrywalnego sygnału w kanale Star Fluor 488. Spójnie z tym, odsetek płytek TF^pos zmierzony w próbkach barwionych podwójnie był porównywalny z odsetkiem uzyskanym w próbkach barwionych pojedynczo na TF (Ryc. 6B).

Wykres rozproszenia cytometrii przepływowej dla analizy CD41, PerCP Cy5.5, Star Fluor 488; wyniki na wykresie słupkowym.
Rysunek 6: Walidacja specyficzności barwienia. (A>) Próbka barwiona pojedynczo przeciwciałem anty-CD41 PerCP-Cy5.5 analizowana na wykresie kropkowym PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 w celu weryfikacji specyficzności sygnału. (B>) Procenty płytek TF^pos zmierzone w próbkach barwionych pojedynczo TF oraz w próbkach barwionych podwójnie TF/CD41 przedstawiono jako poszczególne pomiary sparowane (kropki) oraz średnią ± SD (n = 18 niezależnych osób). Dane analizowano za pomocą testu znaków rang dla par powiązanych Wilcoxona. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.Czułość analityczna proponowanego testu została oceniona na próbkach od n=200 zdrowych osób. Przy użyciu próbek biologicznie pustych obliczona granica wykrywalności tła (LoB) wyniosła 0,39%, granica wykrywalności (LoD) wyniosła 0,77%, a granica oznaczalności (LoQ) wyniosła 1,12%, zdefiniowana jako najniższy poziom powiązany z CV ≤ 20%. Powtarzalność międzyoperatorska strategii bramkowania została oceniona na 40 niezależnych próbkach analizowanych przez 6 operatorów z użyciem zdefiniowanego szablonu analizy, co dało wartość ICC równą 0,985 (95% CI: 0,978-0,990).

Następnie oceniono stabilność detekcji TF po utrwaleniu krwi pełnej poprzez podłużne barwienie utrwalonych próbek. W porównaniu z próbkami wyjściowymi barwionymi w dniu utrwalenia (D0), poziom płytek TF^pos pozostał stabilny do czterech dni po utrwaleniu (D3-D4), wykazując jedynie nieistotny statystycznie spadek o około 22% w dniach D3-D4 (77,8 ± 7,2% - procent względny płytek TF^pos) w stosunku do poziomu w dniu D0. Gdy barwienie przeprowadzono w dniach D5-D6, detekcja płytek TF^pos spadła znacząco do 53,8% ± 20,7% (procent względny płytek TF^pos; p< 0,0001; Rysunek 7). Wyniki te wskazują, że utrwalone próbki można wiarygodnie analizować w ciągu czterech dni od utrwalenia przy jedynie niewielkiej utracie sygnału.

Wykres słupkowy przedstawiający względny procent TFpos PLT w dniach 0-6 z istotnością p<0.0001.
Rycina 7: Analiza przebiegu czasowego po utrwaleniu próbek. Ilościowe oznaczenie płytek krwi TF^pos zmierzone w różnych punktach czasowych po utrwaleniu, wskazanych na osi X w następujący sposób: D0 = dzień pobrania krwi; D1 = dzień 1.; D2 = dzień 2.; D3-4 = dzień 3. lub 4.; D5-6 = dzień 5. lub 6. Dane przedstawiono jako średnia ± SD względnego procentu w porównaniu do D0 (n = 7-10 zdrowych ochotników, ocenianych w wskazanych punktach czasowych po utrwaleniu). Dane analizowano za pomocą testu Anova, a następnie testu wielokrotnych porównań Dunnetta. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wydajność zharmonizowanego procesu akwizycji została następnie oceniona na różnych platformach cytometrii przepływowej. Harmonizację opartą na szablonie oceniono w pierwszej kolejności, wykorzystując instrumenty FACSLyric oraz MACSQuant jako cytometry referencyjne. Jako platformy testowe wykorzystano dodatkowe instrumenty tych samych modeli znajdujące się w zewnętrznych placówkach. Próbki krwi pełnej zawierające płytki krwi w stanie spoczynku były akwizycyjne na instrumentach referencyjnych i testowych z wykorzystaniem zstandaryzowanego szablonu akwizycji. Jak pokazano na Rysunku 8A,B, uzyskano porównywalne wartości procentowe płytek TF^pos na cytometrach referencyjnych i testowych, co potwierdza powtarzalność podejścia opartego na wspólnym szablonie.

Porównanie płytek krwi TF-dodatnich; wykres słupkowy; analiza FACS; metoda ilościowa; wynik eksperymentu.
Rycina 8: Powtarzalność międzyinstrumentalna z wykorzystaniem wspólnych szablonów akwizycji. Procenty płytek TF^pos zmierzone w krwi pełnej od n=6 zdrowych ochotników, pozyskane na instrumentach referencyjnym i testowym FACSLyric (A) lub MACSQuant (B) za pomocą wspólnego szablonu akwizycji zastosowanego w różnych instrumentach. Dane przedstawiono jako poszczególne oznaczenia (kropki) oraz średnia ± SD. Dane przeanalizowano za pomocą sparowanego testu t. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Na koniec oceniono harmonizację opartą na kuleczkach w celu dostrojenia instrumentów o różnych konfiguracjach. Jako instrument referencyjny wykorzystano cytometr A, a jako instrument testowy system FACSymphony. Dostrojenie przeprowadzono przy użyciu 6-szczytowych kuleczek kalibracyjnych Rainbow, regulując napięcie detektora 488 nm w systemie FACSymphony do momentu, aż intensywność fluorescencji kuleczek zmieściła się w zdefiniowanym zakresie docelowym. Profile histogramów ilustrujące rozkłady szczytów kuleczek przed i po dostrojeniu przedstawiono na Ryc. 9A. Następnie próbki krwi pełnej pobrano na instrumencie testowym przed i po kalibracji. Przed harmonizacją wartości procentowe płytek TF^pos różniły się między obiema platformami. Po dostrojeniu opartym na kuleczkach wartości ściśle odpowiadały tym uzyskanym na cytometrze referencyjnym (Ryc. 9B), co wykazało pomyślną harmonizację międzyplatformową oraz odtwarzalną kwantyfikację TF.

Histogramy cytometrii przepływowej przed i po harmonizacji (A), wykres słupkowy dla płytek krwi TF-dodatnich (B).
Rycina 9: Harmonizacja instrumentów oparta na kuleczkach. (A) Reprezentatywny histogram fluorescencji kalibracyjnych kuleczek Rainbow o 6 peakach, pozyskany przed (peaki czerwone) i po (peaki zielone) wyrównaniu instrumentu. (B) Procenty płytek krwi TF^pos zmierzone w próbkach spoczynkowych przygotowanych od n=6 zdrowych osób, pozyskane na instrumencie testowym przed (Pre) i po (Post) harmonizacji. Dla porównania przedstawiono pomiary uzyskane na instrumencie referencyjnym. Dane analizowano za pomocą sparowanego testu t. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Ten protokół zapewnia krokową procedurę do ilościowego wyznaczania TF^pos-płytek w pełnej krwi za pomocą cytometrii przepływowej, specjalnie zaprojektowany do wieloośrodkowej implementacji. Jego główną zaletą metodologiczną w porównaniu z konwencjonalnymi przepływami opartymi na analizie płytek krwi metodą cytometrii przepływowej jest to, że standaryzuje cały proces analityczny, od pobrania krwi i fiksacji pełnej krwi po oznakowane próbek, harmonizację urządzeń przed pobraniem próbki oraz scentralizowaną analizę i kontrolę jakości danych. Umożliwia to uczestnictwo w badaniach wieloośrodkowych centrom, które nie mają możliwości przetwarzania próbek, jeśli mogą dostarczyć próbki krwi. Obecny przepływ radzi sobie z praktycznymi źródłami zmienności między ośrodkami, które są najbardziej istotne, biorąc pod uwagę, że tylko niewielka część płytek wykazuje wykrywalne powierzchniowe TF w warunkach fizjologicznych⁷^,⁸. Źródła te obejmują różnice w lokalnym postępowaniu z próbkami, dostęp do urządzeń do cytometrii przepływowej, konfigurację urządzenia i analizę danych zależną od operatora.

Aby przezwyciężyć te problemy, pełna krew jest fiksowana wkrótce po pobraniu, stabilizując in vivo fenotyp płytek i unikając potrzeby natychmiastowego oznakowania i pobierania próbek. Wyniki reprezentatywne wskazują, że to podejście do fiksowanych próbek pozwala na opóźnioną scentralizowaną obróbkę w walidowanym przedziale po fiksacji. Rozszerza to potencjał do uczestnictwa w badaniach na ośrodki bez własnych urządzeń do cytometrii przepływowej, zachowując jednocześnie spójny przepływ przed-analityczny. Drugą zaletą protokołu jest zastosowanie uproszczonej strategii barwienia bezpośredniego z prostym dwukolorowym panelem, co zmniejsza złożoność procedury.

W panelu użyliśmy dobrze scharakteryzowanego monoklonalnego przeciwciała anty-TF, klonowane HTF1, które rozpoznaje miejsce katalityczne TF i konkuruje związaniem czynnika VII, czyniąc je jednym z najbardziej niezawodnych reagentów dostępnych do wykrywania TF, również w płytkach¹⁴^,¹⁶^,¹⁷. Przeciwciało zostało sprzężone z Star Fluor 488, jasnym, fotostable fluorochromem spektralnie podobnym do FITC, ale z lepszą stabilnością sygnału. Co ważne, wzbudzenie na 488 nm pozwala na wykrywanie próbek z konfiguracją lasera niebieskiego dostępną na prawie wszystkich konwencjonalnych cytometrach przepływowych, włączając urządzenia podstawowe. Ta kombinacja specyficzności epitopem i prostego wykrywania fluorochromu poprawia czułość analityczną i skalowalność w wielu miejscach. W tym pojedynku progi dodatniości zostały zdefiniowane przy użyciu kontroli niebarwionych i FMO jako lepsza opcja w porównaniu z kontrolą izotypu do ustawienia progów w populacjach o niskiej częstotliwości¹⁸.

Użycie różnych cytometrów przepływowych może być źródłem zmienności w wieloośrodkowych badaniach cytometrii przepływowej¹⁹^,²⁰^,²¹. Wcześniej dostarczyliśmy porad dotyczących postępowania przed-analitycznego, konfiguracji barwienia i lokalnej optymalizacji urządzeń¹⁷. Ale te środki nie zapewniają spójnych sygnałów fluorescencyjnych na różnych platformach. Obecny przepływ radzi sobie z tym problemem łącząc scentralizowaną analizę z synchronizacją zakupu perspektywicznego. Wspólne szablony zakupu mogą być używane, gdy dostępne są identyczne cytometry, podczas gdy aligment na podstawie perełek może być zastosowany, gdy muszą być uwzględnione różne platformy. Ta podwójna strategia oferuje praktyczną przewagę nad wieloośrodkowymi modelami analitycznymi, które polegają wyłącznie na scentralizowanej analizie po heterogenicznym pobraniu lokalnym, zmniejszając zmienność analizy danych ab initio i wspierając bardziej powtarzalne stosowanie bram w całym obszarze.

Powinno się nie przeceniać ogólności przepływu. Protokół został zweryfikowany przy użyciu określonych warunków fiksacji pełnej krwi, kombinacji reagujących anty-TF-Star Fluor 488 i anty-CD41 PerCP-Cy5.5, procedur harmonizacji i ograniczonego zestawu konfiguracji cytometrów przepływowych. Jeśli używane są inne klony anty-TF, kombinacje fluorochromów, czasy fiksacji lub stężenia środka fiksującego, lub cytometry przepływowe o znacznie innej optyce, powinna być sprawdzona wydajność analityczna przepływu. Ogólnie, wszelkie niepowodzenia protokołu powinny być zarządzane poprzez sugerowane wcześniej zasady odchyleń. W zależności od powagi odchylenia, dane mogą być flagowane, powtarzane lub wykluczone zgodnie z planem odchyleń specyficznym dla badania. W tych granicach, obecny protokół powinien być traktowany jako operacyjna ramka dla wieloośrodkowej implementacji analizy TF^pos-płytek. Formalna walidacja analityczna, włączając szerzej ocenianą wydajność międzyośrodkową, walidację wysyłki i powtarzalność testu, jest obecnie uwzględniana w poświęconym międzynarodowemu studio standardyzacji od Międzynarodowego Towarzystwa Trombozy i Hemostazy. Klin

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują żadnego konfliktu interesów. Rysunek 1 został stworzony za pomocą ChatGPT (OpenAI). Wszystkie treści wygenerowane przez AI zostały krytycznie przejrzane i edytowane przez autorów. Wykorzystanie AI ograniczyło się do przygotowania Rysunku 1 i nie obejmowało generowania, analizy ani interpretacji danych.

Podziękowania

Badanie to zostało wsparte środkami badawczymi Ministerstwa Zdrowia Włoch, Ricerca Corrente dla Centro Cardiologico Monzino IRCCS oraz funduszami Uniwersytetu w Mediolanie - Piano di Sostegno alla Ricerca 2025-Linea 2 (dla M.C.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1X PBS w/o Calcium and Magnesium	Gibco	10010-015	Do odkażania przeciwciał i próbek
Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 (clone HIP8)	BD	333148	Przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu CD41a używane jako marker populacji płytek; powinno być dostarczane przez Laboratorium Centralne
Anti-TF Star Fluor 488 (clone HTF1)	Cyanagen	CR304	Przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu Czynnikowi Tkanki (CD142); powinno być dostarczane przez Laboratorium Centralne
BD FACSLyric Flow Cytometer	BD	non catalog item	W tekście, Cytometr przepływowy B
BD FACSuite software v1.6	BD	non catalog item	W tekście, oprogramowanie B
Butterfly Needle G19	PIKDARE	02044019030010	Do pobierania krwi
CytExpert Software	Beckman Coulter	non catalog item	W tekście, oprogramowanie A
CytoFLEX S flow cytometer	Beckman Coulter	non catalog item	W tekście, Cytometr przepływowy A
MACSQuant Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	non catalog item	W tekście, Cytometr przepływowy C
MACSQuantify software v3.1	Miltenyi Biotec	non catalog item	W tekście, oprogramowanie C
Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf	120094	Do fiksacji całej krwi
Paraformaldehyde	Antibioticos – Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	Do fiksacji próbek
Pipet tips 10 µL	Gilson	F161630	Do transferu próbek krwi
Pipet tips 1000 µL	Gilson	F161670	Do transferu próbek krwi
Pipet tips 200 µL	Gilson	F161930	Do transferu próbek krwi
Polystyrene Round-Bottom Tube 5 mL	Corning	352052	Potrzebny do nabywania cytometru przepływowego
Rainbow calibration beads (6 peaks)	Spherotech (BD)	556286	Do harmonizacji cytometru przepływowego
Vacutainer EDTA	BD	368857	Do pobrania pierwszych 3 ml krwi
Vacutainer multiple sample luer adapter	BD	367300	Do pobierania krwi
Vacutainer one use holder	BD	364815	Do pobierania krwi
Vacutainer with 0,129 M sodium citrate	BD	363079	Do pobierania krwi

Bibliografia

Siddiqui FA, Desai H, Amirkhosravi A, Amaya M, Francis JL. The presence and release of Tissue Factor from human platelets. Platelets. 2002;13:247–253
Camera M et al. Platelet activation induces cell-surface immunoreactive Tissue Factor expression, which is modulated differently by antiplatelet drugs. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2003;23:1690–1696
Muller I et al. Intravascular Tissue Factor initiates coagulation via circulating microvesicles and platelets. FASEB J. 2003;17:476–478
Schwertz H et al. Signal-dependent splicing of Tissue Factor pre-mRNA modulates the thrombogenicity of human platelets. J Exp. Med. 2006;203:2433–2440
Panes O et al. Human platelets synthesize and express functional Tissue Factor. Blood. 2007;109:5242–5250
Brambilla M et al. Human megakaryocytes confer Tissue Factor to a subset of shed platelets to stimulate thrombin generation. Thromb. Haemost. 2015;114:579–592
Brambilla M et al. Cell surface platelet Tissue Factor expression: Regulation by P2Y₁₂ and link to residual platelet reactivity. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2023;43:2042–2057
Brambilla M et al. Do methodological differences account for the current controversy on Tissue Factor expression in platelets? Platelets. 2018;29:406–414
Brambilla M et al. Tissue Factor in patients with acute coronary syndromes: expression in platelets, leukocytes, and platelet-leukocyte aggregates. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2008;28:947–953
Tilley RE, Holscher T, Belani R, Nieva J, Mackman N. Tissue Factor activity is increased in a combined platelet and microparticle sample from cancer patients. Thromb Res. 2008;122:604–609
Gerrits AJ, Koekman CA, van Haeften TW, Akkerman JW. Platelet Tissue Factor synthesis in type 2 diabetic patients is resistant to inhibition by insulin. Diabetes. 2010;59:1487–1495
Manfredi AA et al. Anti-TNFalpha agents curb platelet activation in patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2016;75:1511–1520
Canzano P et al. Platelet and endothelial activation as potential mechanisms behind the thrombotic complications of Covid-19 patients. JACC Basic Transl Sci. 2021;6:202–218
Trabattoni D et al. Migraine in patients undergoing PFO closure: Characterization of a platelet-associated pathophysiological mechanism: The LEARNER study. JACC Basic Transl Sci. 2022;7:525–540
Camera M et al. Mechanisms sensitive to different drugs mediate a pro-adhesive and pro-thrombotic platelet phenotype in antiphospholipid syndrome. Haematologica. 2026;111:219–229
Camera M et al. Tissue Factor, a membrane-associated marker of platelet activation, predicts 5-year cardiovascular mortality in coronary artery disease patients. Thromb Haemost. 2025. TH-25-08-0472. Online ahead of print.
Brambilla M, Becchetti A, Nallio K, Camera M. Flow cytometry analysis of Tissue Factor expression in human platelets. J Vis Exp. 2024; 22;(213).
Aass HC et al.. Fluorescent particles in the antibody solution result in false TF- and CD14-positive microparticles in flow cytometric analysis. Cytometry A. 2011;79:990–999
Kalina T. Reproducibility of flow cytometry through standardization: Opportunities and challenges. Cytometry A. 2020;97:137–147
Westera L et al. Centrally determined standardization of flow cytometry methods reduces interlaboratory variation in a prospective multicenter study. Clin Transl Gastroenterol. 2017;8:e126
Le Lann L et al. Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies. Sci Rep. 2020;10:11567
Monaco G et al. Flowai: Automatic and interactive anomaly discerning tools for flow cytometry data. Bioinformatics. 2016;32:2473–2480
Montante S, Brinkman RR. Flow cytometry data analysis: Recent tools and algorithms. Int J Lab Hematol. 2019;41 Suppl 1:56–62

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Biologia numer 234 numer 234 warto pusta numer cytometria przep ywowa analiza krwi pe nej badanie wieloo rodkowe harmonizacja cytometr w przep ywowych biomarkery p ytek krwi zakrzepica

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Informuj mnie o aktualizacjach: