Całokrwiowa przepływowa cytometria ilościowa płytek dodatnich na czynnik tkankowy: Zharmonizowany wieloośrodkowy proces roboczy

Podsumowanie

Przedstawiamy tu ujednolicony proces ilościowego pomiaru płytek krwi zawierających czynnik tkankowy za pomocą cytometrii przepływowej w badaniach multicentrum. Protokół opisuje standaryzowane procedury pobierania krwi, fiksację pełnej krwi, barwienie i ujednolicenie instrumentów, co pozwala na przeprowadzenie analizy zarówno lokalnie, jak i centralnie, w zależności od możliwości laboratorium.

Streszczenie

Czynnik Tkankowy (TF)^pos-płytki stanowią podzbiór populacji płytek krwi. Ostatnio wykazano, że ta podgrupa może przewidywać śmiertelność z powodu chorób układu krążenia u pacjentów z chorobą wieńcową, co czyni ją biomarkerem przydatnym do stratyfikacji ryzyka zakrzepowego. Dokładne ilościowe określenie TF^pos-płytek przez cytometrię przepływową wymaga ścisłej standaryzacji pobranego materiału, procedur barwienia i ustawień urządzenia, szczególnie w badaniach wieloośrodkowych, gdzie zmienność techniczną może wpłynąć na ich pomiar. Ten protokół opisuje spójny proces oceny krwi pełnej metodą cytometrii przepływowej dla krążących TF^pos-płytek, zaprojektowany w celu zapewnienia odtwarzalności pomiędzy laboratoriami o różnej infrastrukturze technicznej. Procedura obejmuje standaryzowane pobieranie krwi i fiksację krwi pełnej, aby zachować in vivo fenotyp płytek. Według lokalnych możliwości laboratorium, dostępne są dwie różne metody przygotowania próbki: przesyłka ustalonej próbki do Laboratorium Centralnego w celu centralnego barwienia, akwizycji i analizy dla centrów bez urządzeń do cytometrii przepływowej, lub lokalne barwienie i akwizycja dla centrów wyposażonych w urządzenia do cytometrii przepływowej i przeszkolonego personelu. Ocena odsetka TF^pos-płytek jest osiągana przez bezpośrednie znakowanie przeciwciałami anti-TF Star Fluor 488 i anti-CD41 PerCP-Cy5.5 w celu identyfikacji białka docelowego i markera populacji płytek, odpowiednio. Harmonizacja cytometru przepływowego jest osiągana poprzez wspólny szablon akwizycji dla identycznych modeli cytometrów lub poprzez aliniację opartą na kulkach dla różnych platform. Proces obejmuje również standaryzowany podchod do bramki i centralną analizę danych, aby umożliwić wiarygodne porównanie pomiarów TF^pos-płytek między ośrodkami. Wyniki reprezentatywne wykazały, że ten proces wspiera odtwarzalne ilościowe określenie TF^pos-płytek w walidowanych wieloośrodkowych ustawieniach akwizycji. Ten protokół może ułatwić szerzej zastosowanie oceny TF^pos-płytek w stratyfikacji ryzyka zakrzepowego i wspierać szerszą standaryzację cytometrii przepływowej płytek w badaniach translacyjnych i klinicznych.

Wprowadzenie

Czynnik tkankowy (TF) jest głównym inicjatorem kaskady krzepnięcia krwi i kluczowym determinantem wytwarzania trombiny. Poza jego klasycznym występowaniem w komórkach podendotelialnych i leukocytach, TF jest również kojarzony z krążącymi płytkami krwi^1,2,3,4,5. Podczas krwiotwórstwa megakariocyty przenoszą TF na podzbiór płytek krwi⁶. W fizjologicznych warunkach, około 20–30% krążących płytek zawiera TF przechowywane w układzie kanałyczkowym, przestrzennie oddzielone od czynnika VII w osoczu⁷. W tym skomponowalnym stanie, TF jest funkcjonalnie chronione przed krążącymi czynnikami krzepnięcia i pozostaje nieaktywne. W związku z tym, tylko niewielka frakcja płytek wykazuje wykrywalny TF na powierzchni, gdy krew pełna osób zdrowych jest analizowana za pomocą cytometrii przepływowej, co odzwierciedla fizjologiczną homeostazę^2,8. Patologiczne stany charakteryzujące się aktywacją płytek i równowagą trombo-zapaleniem mogą zakłócić tę równowagę, prowadząc do zwiększonej ekspozycji TF na powierzchni. Podwyższona proporcja płytek dodatnich na TF (TF^pos) została zgłoszona w kilku zaburzeniach zakrzepowych^{9,10,11,12,13,14,15}. Należy zauważyć, że w chorobie wieńcowej, poziomy płytek TF^pos przekraczające 4% niezależnie przewidują śmiertelność z powodu chorób układu krążenia w 5-letnim przeglądzie, ustanawiając procent płytek TF^pos jako klinicznie istotny biomarker ryzyka zakrzepowego¹⁶.

Dokładne i powtarzalne ilościowe określenie płytek TF^pos jest zatem niezbędne zarówno dla zastosowań w badaniach translacyjnych, jak i klinicznych. Wcześniej opublikowany przepływ cytometrii płytek krwi dla oceny płytek TF^pos poprawił badania nad tym białkiem w ustawieniach jednocentrum¹⁷, dostarczając porad dotyczących optymalizacji wybranych etapów przed analitycznych lub analitycznych. Jednak to podejście nie zostało specjalnie zaprojektowane, aby radzić sobie z dodatkowymi wyzwaniami logistycznymi i analitycznymi badań wielocentrowych, w tym procedurami wysyłki, standaryzowanym przetwarzaniem próbek i koniecznością harmonizacji pobierania próbek na różnych platformach cytometrii przepływowej. Ponadto należy również wziąć pod uwagę różne infrastruktury i poziomy fachowej wiedzy uczestniczących centrów.

W tym kontekście, wartość dodana obecnego protokołu polega na zapewnieniu szczegółowego przepływu pracy, który łączy standaryzowane pobieranie krwi i fiksację pełnej krwi, elastyczne protokoły przetwarzania próbek, harmonizację akwizycji między platformami i bezpośrednie barwienie oraz scentralizowaną kontrolę jakości poprzez analizę danych.

Celem niniejszej pracy jest zatem dostarczenie operacyjnego ram dla zharmonizowanej wielocentrowej implementacji analizy płytek TF^pos w pełnej krwi za pomocą cytometrii przepływowej. Ta zintegrowana konstrukcja zmniejsza zmienność przed analityczną, analityczną i między urządzeniami, dzięki czemu ustala warunki dla spójnej oceny płytek TF^pos w ustawieniach wielocentrowych.

Protokół

Wszyscy dawców krwi udzielili pisemnej, świadomej zgody zatwierdzonej przez Komitet Etyczny Instytucji (nr 70/24, CE 18.06.24).

Wieloośrodkowy przepływ pracy dotyczącej ilościowej oceny płytek TF^pos w pełnej krwi za pomocą cytometrii przepływowej ilustruje Rysunek 1. Poniższy protokół przeprowadzi użytkownika przez pięć głównych etapów.

Rysunek 1: Wieloośrodkowy przepływ pracy do analizy płytek TF^pos. Schematyczne przedstawienie przepływu analitycznego do wieloośrodkowej oceny krążących płytek TF^pos za pomocą cytometrii przepływowej w pełnej krwi. Po zapisaniu się do badania i pobraniu krwi próbki są fiksowane i przetwarzane zgodnie z zasobami technicznymi dostępnymi w każdej Jednostce Klinicznej. Centra bez urządzeń do cytometrii przepływowej przesyłają fiksowane próbki do Laboratorium Centralnego w celu barwienia, akwizycji i analizy. Centra wyposażone w cytometry przepływowe mogą wykonać barwienie i akwizycję na miejscu z wykorzystaniem standaryzowanych szablonów akwizycji. Harmonizację urządzeń osiąga się poprzez wspólne szablony (ten sam model urządzenia), szablony wygenerowane w Laboratorium Centralnym (dostępny różny model do dopasowania) lub kalibracji za pomocą fluorescencyjnych kulek, gdy bezpośrednia harmonizacja szablonów nie jest możliwa. Analiza danych jest przeprowadzana centralnie za pomocą standaryzowanego przepływu bramkowego. Diagram został stworzony za pomocą modelu językowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Pobór krwi

UWAGA: Ocena płytek TF^pos wymaga maksymalnie 50 μL pełnej krwi.

1. Pobierz krew z żyły przedramienia przy pomocy igły motylowej o grubości 19 kalibrów. Nakładaj opaskę tylko na czas nakłucia żyły i zdejmuj ją natychmiast po włożeniu igły, aby zminimalizować aktywację płytek ex vivo.
2. Wyrzuć pierwszą probówkę z EDTA. Następnie pobierz krew do probówki z citrynianem sodu o stężeniu 0,129 M, napełniając probówkę do znaku producenta, aby zachować odpowiednią proporcję krew-antykoagulant.
3. Delikatnie odwróć 5 razy, aby dokładnie wymieszać krew i antykoagulant.
4. Przechowuj probówkę w pozycji pionowej w temperaturze pokojowej, unikając mieszania, chłodzenia czy transportu pneumatycznego.
5. Przetwarzaj próbkę w ciągu 3 godzin od pobrania.

2. Przygotowanie próbki

UWAGA: Wszystkie przeciwciała muszą być zakupione przez Laboratorium Centralne i muszą pochodzić z tej samej partii. Jeśli zmiana partii staje się konieczna w trakcie trwającego badania, nową partię reagentów należy bezpośrednio dostosować do aktualnie używanej partii poprzez równoległe testy w tych samych warunkach badania i przyjąć jedynie w przypadku potwierdzenia porównywalnej wydajności. Powszechnie stosowane reagenty (np. PBS – bufor fosforanowy fosforanowy – i PFA – paraformaldehyd) mogą być zakupione przez każde uczestniczące centrum; jednakże kody produktów muszą odpowiadać kodom stosowanym przez Laboratorium Centralne, a spójność partii musi być zachowana przez całe badanie.

1. Fiksacja próbki.
   UWAGA: Przed rozpoczęciem przetwarzania krwi przygotuj 1% PFA poprzez rozcieńczenie 4% PFA buforem PBS w temperaturze pokojowej.
   OSTROŻNIE: PFA jest toksyczne i należy z nim pracować w wyciągu chemicznym, zakładając odpowiednie środki ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawiczki i osłony oczu). Unikaj wdychania i kontaktu ze skórą lub oczami. USUWANIE ODPADÓW: Zbierz wszystkie roztwory zawierające PFA, fiksowane próbki i zanieczyszczone materiały eksploatacyjne do odpowiednio oznaczonych, zamkniętych pojemników na odpady niebezpieczne zgodnie z przepisami instytucjonalnymi i lokalnymi.
   1. Delikatnie odwróć probówkę 5 razy, aby dokładnie wymieszać krew i antykoagulant.
   2. Przenieś 50 μL krwi do 2 mL probówki zawierającej 950 μL 1% PFA.
   3. Delikatnie wymieszaj próbkę i inkubować przez 1 godzinę i 30 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Dodaj 500 μL PBS.
   5. Wiruj przez 5 min w temperaturze pokojowej z przyspieszeniem 1500 x g.
   6. Usuń nadstan i ponownie zawieś osadu w 1 mL PBS.
      UWAGA: Punkt kontrolny techniczny: Po wirowaniu upewnij się, że osadzanie jest widoczne przed usunięciem nadstanu. Ostrożnie usuń nadstan bez zakłócania osadu. Po ponownym zawieszeniu upewnij się, że próbka jest jednorodna i nie zawiera widocznych skupień czy agregatów.
   7. Wyślij fiksowaną próbkę do Laboratorium Centralnego w opakowań termicznych utrzymujących

Wyniki

Ten przepływ został specjalnie zaprojektowany, aby umożliwić ośrodkom o heterogenicznej infrastrukturze technicznej uczestniczenie w badaniach wieloośrodkowych, które wymagają ilościowego oznaczania płytek krwi TF^pos. Rycina 1 przedstawia schemat organizacyjny przepływu zaprojektowany w celu wsparcia badań wieloośrodkowych mających na celu pomiar krążących płytek krwi TF^pos za pomocą cytometrii przepływowej krwi pełnej. W zależności od zasobów technicznych dostępnych w uczestniczących ośrodkach wdrażane są różne procedury przygotowania próbek. Konkretnie, (i) gdy jednostka kliniczna nie dysponuje udostępnionym laboratorium cytometrii przepływowej ani wyszkolonym personelem, próbki krwi pełnej są natychmiast fiksowane po pobraniu i następnie wysyłane do laboratorium centralnego w celu scentralizowanego barwienia, gromadzenia i analizy. (ii) Alternatywnie, ośrodki wyposażone w laboratoria cytometrii przepływowej mogą przeprowadzać barwienie i gromadzenie w lokalu. W takich przypadkach gromadzenie danych odbywa się zgodnie z ujednoliconym przepływem zdefiniowanym przez laboratorium centralne. Jeśli model urządzenia odpowiada modelowi użytemu w laboratorium centralnym, gromadzenie danych jest przeprowadzane przy użyciu standaryzowanego szablonu dostarczonego przez laboratorium centralne. Gdy używane są różne modele urządzeń, ujednolicenie można osiągnąć poprzez transfer szablonu - gdy urządzenia są dostępne do wyrównania w laboratorium centralnym - lub poprzez procedury kalibracji oparte na kulkach przed gromadzeniem próbek. Próbki mogą następnie być gromadzone i analizowane zgodnie ze standaryzowanym przepływem.

Poniższe wyniki reprezentatywne mają na celu zilustrowanie wykonalności przepływu i kluczowych kroków ujednolicenia, a nie dostarczenie formalnej walidacji testu wieloośrodkowego. Aby zapewnić niezawodne wykrywanie TF, strategie barwienia zostały po raz pierwszy oceniane pod kątem kompatybilności spektralnej i stabilności sygnału. Płytki krwi zostały zidentyfikowane za pomocą przeciwciała anty-CD41 PerCP-Cy5.5, podczas gdy wykrywanie TF opierało się na przeciwciałach monoklonalnych anty-TF sprzężonych z Star Fluor 488. Jednokanałowe kontrole barwienia zostały użyte do zweryfikowania braku przesączania fluorescencji między kanałami wykrywania. Jak pokazano na Rycinie 6A, próbki jednokanałowe anty-CD41 PerCP-Cy5.5 nie wytwarzały wykrywalnego sygnału w kanale Star Fluor 488. Zgodnie z tym, odsetek płytek TF^pos zmierzony w próbkach podwójnie barwionych był porównywalny z tym uzyskanym w próbkach jednokanałowych TF (Rycina 6B).

Rycina 6: Walidacja specyficzności barwienia. (A) Jednokanałowe przeciwciało anty-CD41 PerCP-Cy5.5 analizowane na przestrzeni kropek PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488, aby zweryfikować specyficzność sygnału. (B) Odsetki płytek TF^pos zmierzone w próbkach jednokanałowych TF w porównaniu z podwójnie barwionymi próbkami TF/CD41 są przedstawione jako pojedyncze pomiary sparowane (kropki) i średnia ± SD (n = 18 niezależnych osób). Dane zostały przeanalizowane za pomocą testu Wilcoxona dla dopasowanych par sygnowanych rangowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.Czułość analityczna zaproponowanego testu została oceniona na próbkach pobranej od n=200 zdrowych osób. Za pomocą biologicznie pustych próbek obliczony limit pustego (LoB) wynosił 0,39%, limit wykrywalności (LoD) wynosił 0,77%, a limit ilościowania (LoQ) wynosił 1,12%, definiowane jako najniższy poziom związany z CV ≤ 20%. Międzyoperatorowa reprodykowalność strategii bramki została oceniona na 40 niezależnych próbkach przeanalizowanych przez 6 operatorów przy użyciu wstępnie zdefiniowanego szablonu analizy, dając ICC 0,985 (95% CI: 0,978-0,990).

Następnie oceniano stabilność wykrywania TF po fiksacji krwi pełnej przez barwienie fiksowanych próbek wzdłużnie. W porównaniu do próbek bazowych barwionych w dniu fiksacji (D0), poziomy płytek TF^pos pozostały stabilne przez cztery dni po fiksacji (D3-D4), wykazując jedynie nieznaczne zmniejszenie o około 22% w D3-D4 (77,8 ± 7,2% - procentowa różnica w TF^pos-płytkach) w porównaniu z poziomem D0. Kiedy barwienie zostało przeprowadzone w dniach D5-D6, wykrywanie płytek TF^pos zmniejszyło się znacząco do 53,8% ± 20,7% (procentowa różnica w TF^pos-płytkach; p < 0,0001; Rycina 7). Te wyniki wskazują, że fiksowane próbki mogą być niezawodnie analizowane w ciągu czterech dni po fiksacji z jedynie nieznaczną utratą sygnału.

Dyskusja

Ten protokół zapewnia krokową procedurę do ilościowego wyznaczania TF^pos-płytek w pełnej krwi za pomocą cytometrii przepływowej, specjalnie zaprojektowany do wieloośrodkowej implementacji. Jego główną zaletą metodologiczną w porównaniu z konwencjonalnymi przepływami opartymi na analizie płytek krwi metodą cytometrii przepływowej jest to, że standaryzuje cały proces analityczny, od pobrania krwi i fiksacji pełnej krwi po oznakowane próbek, harmonizację urządzeń przed pobraniem próbki oraz scentralizowaną analizę i kontrolę jakości danych. Umożliwia to uczestnictwo w badaniach wieloośrodkowych centrom, które nie mają możliwości przetwarzania próbek, jeśli mogą dostarczyć próbki krwi. Obecny przepływ radzi sobie z praktycznymi źródłami zmienności między ośrodkami, które są najbardziej istotne, biorąc pod uwagę, że tylko niewielka część płytek wykazuje wykrywalne powierzchniowe TF w warunkach fizjologicznych^7,8. Źródła te obejmują różnice w lokalnym postępowaniu z próbkami, dostęp do urządzeń do cytometrii przepływowej, konfigurację urządzenia i analizę danych zależną od operatora.

Aby przezwyciężyć te problemy, pełna krew jest fiksowana wkrótce po pobraniu, stabilizując in vivo fenotyp płytek i unikając potrzeby natychmiastowego oznakowania i pobierania próbek. Wyniki reprezentatywne wskazują, że to podejście do fiksowanych próbek pozwala na opóźnioną scentralizowaną obróbkę w walidowanym przedziale po fiksacji. Rozszerza to potencjał do uczestnictwa w badaniach na ośrodki bez własnych urządzeń do cytometrii przepływowej, zachowując jednocześnie spójny przepływ przed-analityczny. Drugą zaletą protokołu jest zastosowanie uproszczonej strategii barwienia bezpośredniego z prostym dwukolorowym panelem, co zmniejsza złożoność procedury.

W panelu użyliśmy dobrze scharakteryzowanego monoklonalnego przeciwciała anty-TF, klonowane HTF1, które rozpoznaje miejsce katalityczne TF i konkuruje związaniem czynnika VII, czyniąc je jednym z najbardziej niezawodnych reagentów dostępnych do wykrywania TF, również w płytkach^14,16,17. Przeciwciało zostało sprzężone z Star Fluor 488, jasnym, fotostable fluorochromem spektralnie podobnym do FITC, ale z lepszą stabilnością sygnału. Co ważne, wzbudzenie na 488 nm pozwala na wykrywanie próbek z konfiguracją lasera niebieskiego dostępną na prawie wszystkich konwencjonalnych cytometrach przepływowych, włączając urządzenia podstawowe. Ta kombinacja specyficzności epitopem i prostego wykrywania fluorochromu poprawia czułość analityczną i skalowalność w wielu miejscach. W tym pojedynku progi dodatniości zostały zdefiniowane przy użyciu kontroli niebarwionych i FMO jako lepsza opcja w porównaniu z kontrolą izotypu do ustawienia progów w populacjach o niskiej częstotliwości¹⁸.

Użycie różnych cytometrów przepływowych może być źródłem zmienności w wieloośrodkowych badaniach cytometrii przepływowej^19,20,21. Wcześniej dostarczyliśmy porad dotyczących postępowania przed-analitycznego, konfiguracji barwienia i lokalnej optymalizacji urządzeń¹⁷. Ale te środki nie zapewniają spójnych sygnałów fluorescencyjnych na różnych platformach. Obecny przepływ radzi sobie z tym problemem łącząc scentralizowaną analizę z synchronizacją zakupu perspektywicznego. Wspólne szablony zakupu mogą być używane, gdy dostępne są identyczne cytometry, podczas gdy aligment na podstawie perełek może być zastosowany, gdy muszą być uwzględnione różne platformy. Ta podwójna strategia oferuje praktyczną przewagę nad wieloośrodkowymi modelami analitycznymi, które polegają wyłącznie na scentralizowanej analizie po heterogenicznym pobraniu lokalnym, zmniejszając zmienność analizy danych ab initio i wspierając bardziej powtarzalne stosowanie bram w całym obszarze.

Powinno się nie przeceniać ogólności przepływu. Protokół został zweryfikowany przy użyciu określonych warunków fiksacji pełnej krwi, kombinacji reagujących anty-TF-Star Fluor 488 i anty-CD41 PerCP-Cy5.5, procedur harmonizacji i ograniczonego zestawu konfiguracji cytometrów przepływowych. Jeśli używane są inne klony anty-TF, kombinacje fluorochromów, czasy fiksacji lub stężenia środka fiksującego, lub cytometry przepływowe o znacznie innej optyce, powinna być sprawdzona wydajność analityczna przepływu. Ogólnie, wszelkie niepowodzenia protokołu powinny być zarządzane poprzez sugerowane wcześniej zasady odchyleń. W zależności od powagi odchylenia, dane mogą być flagowane, powtarzane lub wykluczone zgodnie z planem odchyleń specyficznym dla badania. W tych granicach, obecny protokół powinien być traktowany jako operacyjna ramka dla wieloośrodkowej implementacji analizy TF^pos-płytek. Formalna walidacja analityczna, włączając szerzej ocenianą wydajność międzyośrodkową, walidację wysyłki i powtarzalność testu, jest obecnie uwzględniana w poświęconym międzynarodowemu studio standardyzacji od Międzynarodowego Towarzystwa Trombozy i Hemostazy. Klin

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1X PBS w/o Calcium and Magnesium	Gibco	10010-015	Do odkażania przeciwciał i próbek
Anti-CD41 PerCP-Cy5.5  (clone HIP8)	BD	333148	Przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu CD41a używane jako marker populacji płytek; powinno być dostarczane przez Laboratorium Centralne
Anti-TF Star Fluor 488  (clone HTF1)	Cyanagen	CR304	Przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu Czynnikowi Tkanki (CD142); powinno być dostarczane przez Laboratorium Centralne
BD FACSLyric Flow Cytometer	BD	non catalog item	W tekście, Cytometr przepływowy B
BD FACSuite software v1.6	BD	non catalog item	W tekście, oprogramowanie B
Butterfly Needle G19	PIKDARE	02044019030010	Do pobierania krwi
CytExpert Software	Beckman Coulter	non catalog item	W tekście, oprogramowanie A
CytoFLEX S flow cytometer	Beckman Coulter	non catalog item	W tekście, Cytometr przepływowy A
MACSQuant Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	non catalog item	W tekście, Cytometr przepływowy C
MACSQuantify software v3.1	Miltenyi Biotec	non catalog item	W tekście, oprogramowanie C
Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf	120094	Do fiksacji całej krwi
Paraformaldehyde	Antibioticos – Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	Do fiksacji próbek
Pipet tips 10 µL	Gilson	F161630	Do transferu próbek krwi
Pipet tips 1000 µL	Gilson	F161670	Do transferu próbek krwi
Pipet tips 200 µL	Gilson	F161930	Do transferu próbek krwi
Polystyrene Round-Bottom Tube 5 mL	Corning	352052	Potrzebny do nabywania cytometru przepływowego
Rainbow calibration beads (6 peaks)	Spherotech (BD)	556286	Do harmonizacji cytometru przepływowego
Vacutainer EDTA	BD	368857	Do pobrania pierwszych 3 ml krwi
Vacutainer multiple sample luer adapter	BD	367300	Do pobierania krwi
Vacutainer one use holder	BD	364815	Do pobierania krwi
Vacutainer with 0,129 M sodium citrate	BD	363079	Do pobierania krwi