Charakterystyka funkcjonalna indywidualnych partnerów przed- i postsynaptycznych w Drosophila Ośrodkowym Układzie Nerwowym Larwalnym przy użyciu CaMPARI

Claudia Gualtieri; Fernando J Vonhoff

doi:10.3791/71399

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Charakterystyka funkcjonalna indywidualnych partnerów przed- i postsynaptycznych w Drosophila Ośrodkowym Układzie Nerwowym Larwalnym przy użyciu CaMPARI

274 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71399

⸱

16 czerwca 2026

Claudia Gualtieri¹ , Fernando J Vonhoff¹

¹Department of Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County (UMBC)

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół ocenia aktywność synaptyczną funkcjonalną między określonymi partnerami neuronowymi in vivo w centralnym układzie nerwowym larw Drosophila melanogaster przy użyciu genetycznie zakodowanych narzędzi. Optogenetyczna stymulacja presynaptycznych cIVda neuronów sensorycznych za pomocą CsChrimson indukuje fotokonwersję zależną od wapnia CaMPARI w postsynaptycznych interneuronach Basin-4.

Streszczenie

Studia nad konektomem znacznie rozszerzyły zrozumienie łączności synaptycznej w układach nerwowych różnych gatunków. Chociaż charakterystyka partnerów synaptycznych przy użyciu mikroskopii elektronowej (ME) zapewnia szczegółowe informacje anatomiczne, funkcjonalne aspekty sieci neuronowych wymagają uzupełniających podejść. Ostatnie badania na Drosophila ujawniły nie tylko kompletne konektome larwalnego, jak również męskiego i żeńskiego dorosłego układu nerwowego, ale także komponenty komórkowe sieci neuronowych, które regulują określone zachowania, takie jak larwalna sieć nocyceptywna. Na etapie trzeciej larwki, multidendryczne neurony sensoryczne typu cIVda (nocyceptory) ustanawiają większość kontaktów synaptycznych z interneuronami Basin-4. Aby ocenić funkcjonalne znaczenie tych połączeń anatomicznych, zakodowany genetycznie wskaźnik wapnia CaMPARI (Calcium Modulated Photoactivatable Ratiometric Integrator) został zastosowany w żywych, niesekcjonowanych larwkach trzeciej instar jako reporter zależny od aktywności do oceny łączności synaptycznej między neuronami cIVda a interneuronami Basin-4. CaMPARI jest wskaźnikiem fluorescencyjnym ratiometrycznym, którego widmo emisji zmienia się w odpowiedzi na podwyższone poziomy wapnia wewnątrzkomórkowego. W warunkach wyjściowych, CaMPARI fluorescencja zielona; w obecności wysokich stężeń wapnia i po ekspozycji na światło fotokonwersji (~400 nm), nieodwracalnie przełącza się na czerwoną fluorescencje. Ponieważ napływ wapnia do neuronów postsynaptycznych jest charakterystyczny dla aktywacji synaptycznej, fotokonwersja CaMPARI zapewnia odczyt funkcjonalnego przekazywania sygnałów synaptycznych. Przedstawiono krok po kroku metodę unieruchomienia larwek trzeciej instar na szklanym slajdzie do optogenetycznej aktywacji nocyceptorów cIVda za pomocą przesuniętego na czerwono channelrhodopsin CsChrimson, w połączeniu z jednoczesną fotokonwersją CaMPARI w neuronach Basin-4. Fotokonwersja zależna od wapnia w neuronach Basin-4, pomimo wewnętrznych ruchów i zmian płaszczyzny ogniskowej, dostarcza funkcjonalnych dowodów na łączność synaptyczną między tymi komórkami. Służy to jako dowód na zasady dla użycia CaMPARI w połączeniu z presynaptyczną stymulacją optogenetyczną w nienaruszonych, niesekcjonowanych larwkach Drosophila.

Wprowadzenie

Identyfikacja precyzyjnych partnerów synaptycznych w centralnym układzie nerwowym (CNS) umożliwia śledzenie tworzenia i uszczegółowiania połączeń synaptycznych podczas rozwoju układu nerwowego. Dlatego wysiłki skupione są na wykorzystaniu woluminowej mikroskopii elektronowej (EM) do odtworzenia nie tylko pełnych konektomów w potężnych organizmach modelowych, takich jak Caenorhabditis elegans¹^,² i Drosophila melanogaster³^,⁴^,⁵, ale także woluminów EM w skali milimetrów złożonych mózgów ssaków, w tym p....