Funkcjonalna charakterystyka indywidualnych partnerów przed- i postsynaptycznych w larwalnym ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila z użyciem CaMPARI

Summary

Protokół ten ocenia funkcjonalną aktywność synaptyczną pomiędzy zdefiniowanymi partnerami neuronalnymi in vivo w ośrodkowym układzie nerwowym larw Drosophila melanogaster , wykorzystując genetycznie zakodowane narzędzia. Stymulacja optogenetyczna presynaptycznych neuronów sensorycznych cIVda za pośrednictwem CsChrimsona indukuje wapniowo-zależną fotokonwersję CaMPARI w interneuronach postsynaptycznych Basin-4.

Abstract

Badania konektomu znacznie poszerzyły wiedzę o łączności synaptycznej w układach nerwowych różnych gatunków. Chociaż charakterystyka partnerów synaptycznych za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) dostarcza szczegółowych informacji anatomicznych, funkcjonalne aspekty sieci neuronalnych wymagają podejścia uzupełniających. Najnowsze badania na Drosophila ujawniły nie tylko pełny konektom larwalnej, a także ośrodkowy ośrodkowy układ nerwowy dorosłych samców i samic, ale także komórkowe komponenty sieci neuronalnych regulujące określone zachowania, takie jak sieć nocyceptywna larw. W trzecim stadium larwalnym neurony sensoryczne klasy IV dendrytycznej (cIVda) nawiązują większość kontaktów synaptycznych z interneuronami Basin-4. Aby ocenić funkcjonalną istotność tych połączeń anatomicznych, genetycznie kodowany wskaźnik wapnia CaMPARI (Calcium Modulated Photoactivatable Ratiometric Integrator) został użyty u żywych, nierozciętych larw trzeciego stadium jako raportujący zależny od aktywności do oceny łączności synaptycznej między neuronami cIVda a interneuronami Basin-4. CaMPARI to ratiometryczny wskaźnik fluorescencyjny, którego widmo emisji zmienia się w odpowiedzi na podwyższony poziom wapnia wewnątrzkomórkowego. W warunkach wyjściowych CaMPARI fluorescuje na zielono; W obecności wysokich stężeń wapnia i po ekspozycji na światło fotokonwersji (~400 nm) nieodwracalnie przechodzi na czerwoną fluorescencję. Ponieważ napływ wapnia do neuronów postsynaptycznych jest cechą charakterystyczną aktywacji synaptycznej, fotokonwersja CaMPARI zapewnia odczyt funkcjonalnego sygnalizacji synaptycznej. Przedstawiono metodę krok po kroku polegającą na unieruchomieniu larw trzeciego stadium na mikroskopowym szkiele w celu optogenetycznej aktywacji nociceptorów cIVda przy użyciu przesuniętego ku czerwieni kanału CsChrimson, połączonego z jednoczesną fotokonwersją CaMPARI w neuronach Basin-4. Fotokonwersja zależna od wapnia w neuronach Basin-4, mimo ruchów wewnętrznych i zmian płaszczyzny ogniskowej, dostarcza funkcjonalnych dowodów na łączność synaptyczną między tymi komórkami. Stanowi to dowód zasady stosowania CaMPARI w połączeniu z przedsynaptyczną stymulacją optogenetyczną u nienaruszonych, nierozciętych larw Drosophila .

Introduction

Precyzyjna identyfikacja partnerów synaptycznych w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) umożliwia śledzenie tworzenia i udoskonalania połączeń synaptycznych podczas rozwoju układu nerwowego. W związku z tym wysiłki koncentrowały się na wykorzystaniu objętościowej mikroskopii elektronowej (EM) do rekonstrukcji nie tylko kompletnych konektomów u potężnych organizmów modelowych genetycznych, takich jak Caenorhabditis elegans ^1,2 i Drosophila melanogaster ^3,4,5, ale także na objętościach elektromagnetycznych w skali milimetrowej złożonych mózgów ssaków, w tym pierwotnej kory wzrokowej myszy⁶ oraz ludzkiej kory skroniowej⁷. Te badania dostarczają unikalnych wglądów w zasady organizacyjne leżące u podstaw łączności synaptycznej na poziomie anatomicznym. Jednak funkcjonalna charakterystyka partnerów synaptycznych dostarcza uzupełniających wglądów w łączność neuronów i jest niezbędna do potwierdzenia wyników anatomicznych.

Drosophila oferuje liczne zalety w badaniu łączności neuronalnej, w tym dostępność kompletnych połączeń dla larwalnych^{3 oraz żeńskiego} 4^{i samca} 5 dorosłych ośrodkowego układu nerwowego, a także dobrze scharakteryzowane obwody neuronalne regulujące przewidywalne zachowania ^8,9,10. Sieć larwalna nocyceptywna stanowi jeden z dobrze przystosowanych obwodów do badania precyzyjnej łączności synaptycznej¹¹. Rekonstrukcja EM tej sieci ujawniła szczegółowe partnerstwa synaptyczne niezbędne do przetwarzania bodźców nocyceptywnych, prowadząc do charakterystycznego zachowania ucieczki znanego jako nocifensywne toczenie^12,13.

W tej sieci^neurony dendrytycznej arboryzacji klasy IV (cIVda) pełnią funkcję głównych nociceptorów sensorycznych odpowiedzialnych za wykrywanie bólu 11,12,13,15,16. Ich ciała komórkowe i dendryty znajdują się peryferyjnie w ścianie ciała, podczas gdy aksony projekcjonują się do larwalnego brzusznego nerwu nerwowego (VNC)¹⁵. W obrębie OUN neurony cIVda arboryfikują swoje aksonalne zakończenia w stereotypowym wzorze i tworzą większość kontaktów synaptycznych z interneuronami Basin-4 11,12,13,17. Ta zdefiniowana zależność synaptyczna ustanawia neurony cIVda i interneurony Basin-4 jako idealną parę do funkcjonalnej oceny łączności synaptycznej in vivo. Rozwój metod analizy powiązań funkcjonalnych między indywidualnie zidentyfikowanymi partnerami synaptycznymi ułatwi badanie mechanizmów leżących u podstaw rozwoju i udoskonalania synaptycznych, szczególnie w genetycznie rozwiązywalnych systemach ze stereotypowymi obwodami nerwowymi.

CaMPARI (Calcium Modulated Photoactivatable Ratiometric Integrator)¹⁸ to genetycznie kodowany ratiometryczny wskaźnik fluorescencyjny, którego widmo emisji zmienia się w odpowiedzi na podwyższony poziom wapnia wewnątrzkomórkowego. W warunkach wyjściowych CaMPARI fluorescuje na zielono; W obecności wysokiego stężenia wapnia i po ekspozycji na światło fotokonwersji (~400 nanometrów (nm)) nieodwracalnie przekształca się w czerwoną fluorescencję¹⁸. Ponieważ napływ wapnia do neuronów postsynaptycznych jest cechą charakterystyczną aktywacji synaptycznej, fotokonwersja CaMPARI zapewnia odczyt funkcjonalnego sygnalizacji synaptycznej^19,20.

Oprócz CaMPARI, aktywność neuronów można wizualizować za pomocą odwracalnych czujników, takich jak genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI), w tym GCaMP czy RCAMP²¹, a także genetycznie kodowane wskaźniki napięcia (GEVIs)^22, takie jak Arclight²³, Ace2N-mNeon²⁴ czy VARNAM²⁵. Chociaż te szybkie, odwracalne czujniki doskonale nadają się do monitorowania aktywności przejściowej w czasie rzeczywistym, są podatne na artefakty ruchu podczas obrazowania in vivo . Natomiast integracyjne i nieodwracalne właściwości fotokonwersji CaMPARI umożliwiają wychwycenie aktywności w określonym przedziale czasowym, umożliwiając wykrycie aktywacji neuronalnej nawet przy przesunięciu płaszczyzn ogniskowych podczas obrazowania²⁰. Dodatkowo fotokonwersję CaMPARI można dostroić poprzez regulację natężenia światła fioletowego, co umożliwia wykrywanie zmniejszonej siły synaptycznej lub podprogowych sygnałów^{wejściowych 26}. Te właściwości umożliwiły mapowanie aktywności u swobodnie poruszających się zwierząt bez fiksacji głowy lub uwiązania, w tym badania w korze myszy²⁷, mózgu danio danowanego²⁸, C. elegans²⁹ oraz dorosłej Drosophila²⁰.

Opisano protokół wizualizacji funkcjonalnych partnerów synaptycznych za pomocą fotokonwersji CaMPARI w połączeniu z przedsynaptyczną stymulacją optogenetyczną za pomocą mikroskopii konfokalnej u nienaruszonych, nierozciętych larw Drosophila. W tym podejściu CaMPARI służy do wykrywania postsynaptycznego napływu wapnia do interneuronów Basin-4 po optogenetycznej aktywacji neuronów cIVda u żywych larw trzeciego stadium. Neurony cIVda wyrażają kanałrodopsynę CsChrimson^30,31 aktywowaną przez czerwone światło, podczas gdy interneurony Basin-4 wyrażają CaMPARI. Ekspozycja na czerwone światło selektywnie aktywuje nocyceptory, naśladując bodziec nocyceptywny w sposób kontrolowany czasowo^16,30. Ta strategia umożliwia ocenę, czy aktywacja presynaptyczna indukuje wapniowozależną fotokonwersję CaMPARI w neuronach postsynaptycznych, dostarczając tym samym funkcjonalnych dowodów na łączność synaptyczną.

Kilka zalet technicznych wspiera zastosowanie CaMPARI w połączeniu z CsChrimson do analizy łączności cIVda–Basin-4. Po pierwsze, dendryty cIVda tworzą całkowite, nienakładające się pokrycie ściany ciała larwalnej³², umożliwiając optogenetyczną aktywację nienaruszonych neuronów czuciowych bez zakłócających efektów spowodowanych uszkodzeniami wywołanymi przez sekcję¹⁶. Po drugie, chociaż larwy są fizycznie unieruchomione na szkiełku mikroskopowym, ruchy wewnętrzne często zmieniają położenie OUN i płaszczyznę ogniskową podczas obrazowania; Fotokonwersja CaMPARI jest mniej czuła na takie artefakty ruchu i zapewnia stabilny, zintegrowany w czasie odczyt aktywności neuronalnej. Po trzecie, integracyjne i regulowane właściwości CaMPARI umożliwiają wykrywanie aktywności synaptycznej nawet przy zmniejszonej sile lub liczbie kontaktów synaptycznych, na przykład we wczesnych etapach rozwoju, co wspiera przyszłe badania nad formowaniem i udoskonalaniem synaps.

Protocol

Wszystkie eksperymentalne procedury z udziałem Drosophila melanogaster były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Genotyp w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4 (uzyskany przez ponowne połączenie RRID:BDSC_54899¹² i RRID:BDSC_32079¹⁶) był używany do sterowania ekspresją optogenetyczną i CaMPARI (wykorzystując linię w^-, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/Cyo uzyskane przez ponowne połączenie RRID:BDSC_81085 z markerami drugiego chromosomu) odpowiednio u partnerów przedsynaptycznych i postsynaptycznych. Narzędzia badawcze używane w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie larw

1. Zorganizował genetyczne krzyżówki między dziewicami samicami UAS-CsChrimson, LexAop-CaMPARI; CyO/sp (RRID:BDSC_81085) oraz samce z linii muchowej zawierającej dwa układy binarne, na przykład, z neuronem presynaptycznym zainteresowanego czynnikiem napędzającym ekspresję GAL4, a neuronem postsynaptycznym odpowiadającym za LexA^33,34.
2. Ustalenie krzyżowania genetycznego w plastikowych fiolkach zawierających standardowe medium agar z mąki kukurydzianej 35,36,37,38 uzupełnione 0,5 mM all-trans retinal (ATR) dla aktywacji CsChrimson ^30,33. Przygotuj równoległe fiolki bez ATR jako sterowanie bez ATR.
   UWAGA: Rozpuść medium z agaru z mąki kukurydzianej bez gotowania. Pozwól mu ostygnąć bez zastygnięcia. Przygotuj 40 mM roztwór zapasowy ATR (proszek ATR rozcieńczony w 95% etanolu zgodnie z zaleceniami producenta), następnie rozcieńcz do 0,5 mM w medium i dokładnie wymieszaj.
3. Całkowicie przykryj fiolki folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło.
   UWAGA: Utrzymuj warunki wychowu w stałej ciemności ze względu na światłoczułość ATR oraz zapobieganie niezamierzonej aktywacji neuronów. Chociaż CsChrimson jest najbardziej wrażliwy na światło czerwone (590–680 nm), może być również aktywowany przez inne widzialne długości fal^31,39.
4. Inkubuj fiolki w temperaturze 25 °C i wychowuj larwy do trzeciego stadium instaru.

2. Unieruchomienie larwy

1. Zbierz larwę trzeciego stadium za pomocą pędzla. Przemyj larwy w mikro-płytkowej płycie z trzema dołkami zawierającej 0,1 M PBS, aby usunąć pokarm.
   UWAGA: Nie usuwaj nadmiaru PBS; Pomaga utrzymać nawodnienie.
2. Umieść niewielką ilość gliny modelarskiej na każdym rogu czystej pokrywy (18 × 18 mm). Umieść larwę w kropli PBS na pokrywce i pozwól jej skierowaną brzuszną stroną do dołu.
   UWAGA: Do obrazowania brzusznego przewodu nerwowego (VNC) zamontuj larwę po stronie grzbietowej tak, aby powierzchnia brzuszna stykała się z pokrywką. Taka orientacja pozwala interneuronom Basin-4 w VNC zwrócić się do celu przez slip pokrywający.
3. Na pokrywce z larwą załóż czyste szkiełko mikroskopowe.
4. Zabezpiecz pokrywkę, nakładając dodatkową glinę modelarską na narożniki. Wywieraj wystarczający nacisk, aby unieruchomić larwę, unikając jednocześnie pęknięcia larwy lub przesunięcia się pokrycia.

3. Przepływ pracy stymulacji, konwersji zdjęć i obrazowania

1. Uzyskaj bazowy stos z neuronów postsynaptycznych wyrażających CaMPARI za pomocą jednoczesnego kanału zielonego (488 nm, 0,8% mocy lasera) i czerwonego (~561 nm, 0,8% mocy lasera). Stosuj krok Z o rozdzielczości 1 μm, rozdzielczość 256 × 256 pikseli, średnią linii 2, skanowanie dwukierunkowe i prędkość skanowania 9 na mikroskopie konfokalnym wyposażonym w obiektyw 40×/1.2. Wszystkie obrazy wykonuj w ciemnym środowisku. Utrzymuj identyczne parametry stosu z przez cały eksperyment.
   UWAGA: Spodziewaj się jasnozielonych ciał komórkowych na stereotypowych pozycjach w larwalnym VNC i braku wykrywalnej czerwonej fluorescencji na poziomie wyjściowym.
2. Stymuluj larwę nieprzerwanie przez 30 sekund za pomocą jednoczesnego światła fotokonwersji (405 nm, 0,5% mocy lasera) oraz światła stymulacji optogenetycznej (594 nm, 0,8% mocy lasera).
3. Uzyskaj stos z po stymulacji, używając tych samych parametrów co w kroku 3.1 zarówno na czerwonym (~561 nm), jak i zielonym (488 nm) kanale. Spodziewaj się ciał komórek VNC na podobnych pozycjach jak w bazie. Wykrywanie czerwonej fluorescencji CaMPARI w neuronach aktywowanych podczas stymulacji u larw karmionych ATR, z minimalną fotokonwersją u osób kontrolujących bez ATR.
   UWAGA: Przepływ pracy i parametry są podsumowane na Rysunku 1.

Rysunek 1: Przepływ pracy stymulacji, konwersja zdjęć (PC) i obrazowanie. Do oceny aktywności wapnia w neuronach Basin-4 wykorzystano trzy kolejne fazy obrazowania. W fazie bazowej stosy z-stacki były pozyskiwane za pomocą laserów 488 nm i 561 nm, aby uchwycić zieloną i czerwoną fluorescencję CaMPARI przed stymulacją. Podczas fazy stymulacji neurony cIVda były optogenetycznie aktywowane za pomocą CsChrimsona (594 nm), podczas jednoczesnej iluminacji 405 nm fotokonwertowało aktywne CaMPARI z fluorescencji zielonej na czerwoną; W tym okresie 30 lat nie wykonano żadnych obrazów. W fazie po stymulacji stosy z Z-Stack były ponownie pozyskiwane przy użyciu tych samych ustawień lasera co na początku, aby wykryć fotokonwertowany czerwony sygnał w ciałach komórek Basin-4. Wszystkie stosy Z zostały uzyskane z rozdzielczością 256 × 256 pikseli z 1 μm krokami Z, średnią linii 2 oraz skanowaniem dwukierunkowym w ciemnych warunkach za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw 40×/1,2 NA. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

4. Analiza obrazowania

1. Otwieraj obrazy z-stack na Fidżi (RRID:SCR_002285) z włączonymi Bio-Formatami. Ustaw wyświetlanie stosu na Hyperstack, tryb kolorów na Composite i włącz Autoscale. Przewiń Z-płaszczyzny i wybierz płaszczyznę z optymalnym ostrowaniem. Zduplikuj wybraną płaszczyznę (Obraz → Zduplikuj; Kanały: 1–2; wybrał płaszczyznę Z).
2. Rozdzielone kanały czerwone i zielone (Obraz → Kolor → Podzielone kanały).
   UWAGA: Dostosuj jasność i kontrast za pomocą Image → Dostosuj → Jasność/Kontrast → Auto dla obu kanałów.
3. Odejmij tło od obu kanałów (Proces → Odejmij tło) używając promienia kuli toczącej się 50 px.
4. Konfiguruj pomiary (Analizuj → Zestaw Pomiarów), aby uwzględnić powierzchnię, średnią wartość szarości, gęstość zintegrowaną (IntDen), odchylenie standardowe oraz wartości szarości minimalnej i maksymalnej.
5. Narysuj obszary zainteresowania (ROI) wokół każdej komórki w zielonym kanale za pomocą narzędzia Freehand. Dodaj zwroty z inwestycji do menedżera ROI i mierz. Stosuj te same zwroty z inwestycji do czerwonego kanału i mierz.
6. Zapisuj wszystkie pomiary w arkuszu kalkulacyjnym, w tym identyfikatory larw i komórek.
   UWAGA: Wykonaj pomiary zarówno do zdjęć przed- jak i po stymulacji.
7. Oblicz stosunki fluorescencji czerwono-zielonej za pomocą wartości gęstości zintegrowanej, aby uzyskać (R/G)_post i (R/G)_pre dla każdej komórki. Średnie wartości na poziomie komórek na larwę.
   UWAGA: Zintegrowana gęstość (średnia powierzchni ×) umożliwia porównanie między komórkami o różnych rozmiarach.
8. Oblicz Δ(R/G) jako (R/G)_post − (R/G)_pre , używając średnich larwalnych. Interpretuj dodatnie wartości Δ(R/G) jako zwiększoną aktywność wapnia postsynaptycznego podczas fotokonwersji.
   UWAGA: Ujemne wartości Δ(R/G) mogą wynikać z szumu lub asymetrii tła. Ustaw wartości ujemne na 0. W tym zbiorze danych jedna larwa wykazała wartość ujemną (−0,008), która została ustawiona na 0.

Results

Zgodnie z tym protokołem oceniono funkcjonalną łączność między neuronami cIVda a interneuronami Basin-4 u żywych, nieprzeciętych larw trzeciego stadium D. melanogaster za pomocą CaMPARI (Rysunek 2). Przed jakąkolwiek stymulacją światłem fotokonwersji (PC) lub aktywacją optogenetyczną, interneurony Basin-4 wykazywały zieloną fluorescencję z powodu ekspresji CaMPARI w cytosolach (Rysunek 2A). Nie wykryto czerwonej fluorescencji w warunkach wyjściowych (rysunek 2B), co potwierdza brak fotokonwersji przed stymulacją.

Jednoczesna ekspozycja na światło PC i stymulację optogenetyczną skutkowała fotokonwersją CaMPARI z zielonej na czerwoną fluorescencję (Rysunek 2C, D). Aby potwierdzić, że fotokonwersja była specyficznie napędzana przez aktywność neuronalną pośredniczoną przez CsChrimson, przeprowadzono negatywną kontrolę na larwach o tym samym tle genetycznym (z tego samego krzyżowania rodzicielskiego) wychowanych bez całkowicie trans siatkówki (ATR). Ponieważ ATR jest niezbędnym kofaktorem dla funkcji CsChrimsona, jego brak sprawia, że opsyna jest niefunkcjonalna mimo ekspozycji na światło stymulujące 594 nm. Ta kontrola uwzględnia również potencjalną aktywację nocyceptorów przez światło PC 405 nm^{, ponieważ} larwy wolne od ATR były poddawane temu samemu protokołowi stymulacji, w tym ekspozycji na światło PC⁴⁰.

Chociaż u larw kontrolnych wolnych od ATR zaobserwowano niski poziom czerwonej fluorescencji CaMPARI, co jest zgodne z częściową fotokonwersją indukowaną wyłącznie światłem PC, ilościowość Δ(R/G) wykazała istotnie wyższe wartości u zwierząt eksperymentalnych w porównaniu z kontrolami (Rysunek 2E). Ten wzrost wskazuje, że zwiększona fotokonwersja u larw eksperymentalnych zależy od aktywności neuronalnej napędzanej przez CsChrimson.

Analiza obrazów została przeprowadzona na Fidżi (RRID:SCR_002285), zgodnie z protokołem. Statystyczne porównanie wartości Δ(R/G) między eksperymentalnymi a grupami kontrolnymi bez ATR przeprowadzono w GraphPad (RRID:SCR_002798) za pomocą nieparowanego testu t po potwierdzeniu rozkładu normalnego i mniej więcej równych odchyleniach standardowych między grupami.

Rysunek 2. Fotokonwersja CaMPARI w interneuronach Basin-4 ujawnia funkcjonalną aktywność synaptyczną po optogenetycznej stymulacji neuronów czuciowych cIVda in vivo. (A) Białe strzałki wskazują ciała komórek międzyneuronów Basin-4 w larwalnym brzusznym sznurze nerwowym (VNC) wykazujące zieloną fluorescencję CaPARI. (B) Brak czerwonej fluorescencji CaMPARI w komórkach Basin-4 wyznaczonych liniami przerywanymi przed stymulacją optogenetyczną i przed ekspozycją na światło fotokonwersji. Obszary zainteresowania (ROI) były ręcznie definiowane wokół ciał komórek zielofluorescencyjnych w zielonym kanale za pomocą narzędzia do wyboru odręcznego na Fidżi, a następnie zastosowano je do czerwonego kanału. (C) Czerwona i (D) zielona fluorescencja CaMPARI w interneuronach Basin-4 po jednoczesnej stymulacji optogenetycznej i ekspozycji na światło fotokonwersji. (E) Każdy punkt danych reprezentuje średnią wartość Δ(R/G) na larwę, obliczaną na podstawie 1–4 komórek na osobnika (całkowite wielkości próbek: kontrolne, 8 larw, w tym 23 komórki; grupa eksperymentalna: 9 larw, w tym 19 komórek). Analiza statystyczna wykazała istotny wzrost Δ(R/G) po stymulacji optogenetycznej i fotokonwersji (grupa eksperymentalna) w porównaniu z wynikiem w warunkach bez ATR (kontrola). Skala: 10,2 μm Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Opisany tutaj protokół umożliwia jakościową i ilościową ocenę łączności synaptycznej pomiędzy zdefiniowanymi partnerami synaptycznymi u nienaruszonych larw D. melanogaster . Podejście to wykorzystuje połączenie optogenetycznej stymulacji neuronów sensorycznych cIVda z wizualizacją aktywowanych postsynaptycznych interneuronów Basin-4 opartą na CaMPARI do monitorowania aktywności synaptycznej w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) nierozciętych larw. Wcześniejsze zastosowania CaMPARI u D. melanogaster koncentrowały się głównie na dorosłych stadiach²⁰ lub wymaganej fizycznej stymulacji presynaptycznej (np. nocyceptywna stymulacja termiczna)¹⁷. Obecna metoda rozszerza użycie CaMPARI na wcześniejsze etapy rozwoju i wprowadza strategię funkcjonalnej oceny aktywności synaptycznej poprzez łączenie optogenetycznej stymulacji presynaptycznej z detekcją postsynaptyczną opartą na CaMPARI. Aktywacja optogenetyczna zapewnia precyzyjną kontrolę czasową nad bodźcami presynaptycznymi, umożliwiając kontrolowaną stymulację i późniejsze monitorowanie postsynaptycznej odpowiedzi CaMPARI.

Pomimo tych zalet, wdrożenie tego podejścia wymaga starannego rozważenia projektu eksperymentalnego, odpowiednich kontrol oraz ograniczeń technicznych. Negatywne kontrole, w tym larwy wychowane bez all-trans retinal (ATR), które uniemożliwiają aktywację CsChrimson^30,33, lub larwy pozbawione ekspresji CsChrimson, muszą potwierdzić brak fotokonwersji CaMPARI przy braku stymulacji optogenetycznej presynaptycznej. Należy również wziąć pod uwagę dodatkowe czynniki. Spontaniczna lub endogenna aktywność postsynaptyczna może zbiegać się z ekspozycją na światło fotokonwersji (PC), co skutkuje presynaptycznie niezależną konwersją CaMPARI z zielonego na czerwony. Chociaż CsChrimson jest zoptymalizowany pod kątem aktywacji przez czerwone światło (590–680 nm), zachowuje czułość na krótsze długości fal³⁹, a lasery obrazujące przed stymulacją mogą nieumyślnie wywołać niezamierzoną aktywację presynaptyczną. Ponadto neurony postsynaptyczne otrzymują sygnały od wielu partnerów presynaptycznych, tak że aktywacja z bodźców niebędących celem może pokrywać się z ekspozycją na światło PC i prowadzić do fotokonwersji CaMPARI niezależnej od kontrolowanej stymulacji optogenetycznej.

Na przykład interneurony Basin-4 otrzymują sygnały synaptyczne nie tylko od neuronów cIVda, ale także od neuronów wielodendrytycznych klasy III (cIIIda) oraz neuronów chordotonalnych (Ch) jako część obwodu nocyceptywnego 11,12,13,17. Interneurony te mogą być zatem aktywowane przez alternatywne bodźce pobudzające, w tym stymulację mechanosensoryczną wywołaną naciskiem z pokrywy pokrywowej. Ten czynnik jest specyficzny dla opisanej tutaj konfiguracji eksperymentalnej, ale podkreśla znaczenie uwzględnienia pośredniej fotokonwersji CaMPARI sterowanej siecią lub nieoptogenetycznie indukowanej, szczególnie w warunkach kontrolnych bez ATR.

Aby dodatkowo kontrolować niespecyficzny napływ wapnia i związaną z nią fotokonwersję, larwy można podzielić na dwie grupy: jedną grupę wystawioną wyłącznie na światło PC, a drugą grupę poddawaną łącznej stymulacji światła PC i optogenetyki, przy czym czerwone i zielone stosy z z uzyskiwanymi są po każdym schorzeniu, co umożliwia bezpośrednie porównanie między grupami. Intensywności fluorescencji uzyskane w warunkach wyłącznie PC można następnie odjąć od tych mierzonych po łączonej stymulacji. Poziomy fotokonwersji obserwowane w warunkach kontrolnych (brak ATR i stymulacja wyłącznie PC) dostarczają szacunków aktywacji postsynaptycznych wynikających ze stochastycznej endogennej aktywności i wejść sterowanych siecią.

W opisanych warunkach eksperymentalnych stymulacja optogenetyczna neuronów cIVda w połączeniu z fotokonwersją CaMPARI w interneuronach Basin-4 skutkowała dodatnim Δ(R/G), co wskazuje na aktywność synaptyczną między tymi partnerami przed- i postsynaptycznymi. Protokół ten stanowi ramy do badania funkcjonalnych relacji synaptycznych in vivo i może być adaptowany do innych obwodów neuronalnych u Drosophila. Dzięki umożliwieniu ukierunkowanej aktywacji presynaptycznej i wykrywania zależnej od aktywności u neuronów postsynaptycznych, podejście to wspiera walidację połączeń synaptycznych przewidywanych na podstawie zbiorów danych konektomowych i ułatwia badanie funkcjonalnej łączności podczas rozwoju. W związku z tym stanowi wszechstronną metodę analizy funkcji obwodów nerwowych w genetycznie rozstrzygnialnym układzie nerwowym Drosophila .

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 M fosforanów buforowanej soli fizjologicznej (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK	Substancja chemiczna stosowana w roztworze do nawadniania i montowania larw
Całkowicie trans-siatkówkowy (ATR)	Sigma Aldrich	R2500-500mg	Chemikalia dodawane do jedzenia, aby aktywować narzędzia optogenetyczne
Mikroskop konfokalny	ZEISS	LSM900 Confocal	Mikroskop konfokalny, obiektyw (40&k; 1,2 NA), źródło światła/lasera (405, 488, 561 nm)
Pokrywki (18x18mm)	VWR	48366-205	Wykorzystywane do mocowania zwierząt do obrazowania
Etanol (95%)	Sigma Aldrich	E7023	Używany jako rozpuszczalnik do proszku ATR
Fidżi (ImageJ)	Open source	RRID: SCR_002285	Wykorzystywane do analizy obrazowej
Prism wersja 10.4.1	GraphPad Software Inc.	RRID:SCR_002798	Wykorzystywane do analizy statystycznej
Szkiełka mikroskopowe	VWR	48300-041	Wykorzystywane do mocowania zwierząt do obrazowania
Modelingowa glina	Flinn Scientific	FB0600	Używane do trzymania szkła osłonowego na szkiełku mikroskopowym z larwami pomiędzy nimi
Pędzel	Genesee Scientific	59-204	Wykorzystywane do przenoszenia larw między lokalizacjami
Standardowe medium agarowe z mąką kukurydzianą	Genesee Scientific	66-123	Jedzenie można również przygotowywać według podobnych standardowych przepisów i składników
Standardowe plastikowe fiolki Drosophila (25mm x 95mm wąskie fiolki Drosophila)	Genesee Scientific	32-109	Można także używać dużych fiolek lub butelek
Mikro płytka punktowa z trzema dołkami	Nauki o mikroskopii elektronowej;	71561-01	Płytka używana do oddzielania i oczyszczania pojedynczych larw
Drzewo Drosophila (genotyp: w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4)	Centrum Hodowla Drosophila w Bloomington	RRID:BDSC_54899 & RRID:BDSC_32079	Uzyskano przez ponowne połączenie RRID:BDSC_54899 i RRID:BDSC_32079
Rasa Drosophila (genotyp: w, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/CyO)	Centrum Hodowla Drosophila w Bloomington	RRID:BDSC_81085	Uzyskano to poprzez ponowne połączenie RRID:BDSC_81085 z markerami drugiego chromosomu