Charakterystyka funkcjonalna pojedynczych partnerów przed- i postsynaptycznych W Drosophila larwalnym układzie nerwowym centralnym przy użyciu CaMPARI

Summary

Ten protokół ocenia aktywność synaptyczną funkcjonalną między określonymi partnerami neuronowymi in vivo w środkowym układzie nerwowym larw Drosophila melanogaster z użyciem genetycznie zakodowanych narzędzi. Optogenetyczna stymulacja presynaptycznych sensorycznych neuronów cIVda za pomocą CsChrimson indukuje zależną od wapnia fotokonwersję CaMPARI w postsynaptycznych interneuronach Basin-4.

Abstract

Studia nad konektomem znacznie poszerzyły zrozumienie łączności synaptycznej w układach nerwowych różnych gatunków. Podczas gdy charakterystyka partnerów synaptycznych za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) zapewnia szczegółowe informacje anatomiczne, funkcjonalne aspekty sieci neuronowych wymagają uzupełniających podejść. Ostatnie badania na Drosophila ujawniły nie tylko kompletny konektom larwalnego, jak również męskiego i żeńskiego dorosłego układu nerwowego, ale także komponenty komórkowe sieci neuronowych, które regulują określone zachowania, takie jak larwalna sieć nocyceptywna. W trzecim stadium larwalnym, multidendryczne neurony czuciowe typu IV dendrytowej arboryzacji (cIVda) (nocyceptory) ustanawiają większość łączy synaptycznych z interneuronami Basin-4. Aby ocenić funkcjonalne znaczenie tych połączeń anatomicznych, zastosowano genetycznie zakodowany wskaźnik wapnia CaMPARI (Calcium Modulated Photoactivatable Ratiometric Integrator) w żywych, niesezcejonowanych larwach trzeciego stadium jako reporter zależny od aktywności do oceny łączności synaptycznej między neuronami cIVda a interneuronami Basin-4. CaMPARI to wskaźnik fluorescencyjny ratiometryczny, którego widmo emisji zmienia się w odpowiedzi na podwyższone poziomy wapnia wewnątrzkomórkowego. W warunkach podstawowych CaMPARI fluorescencji zielono; w obecności wysokich stężeń wapnia i po wystawieniu na światło fotokonwersji (~400 nm) nieodwracalnie przełącza się na czerwoną fluorescencje. Ponieważ napływ wapnia do neuronów postsynaptycznych jest charakterystyczny dla aktywacji synaptycznej, fotokonwersja CaMPARI zapewnia odczyt funkcjonalnego sygnałowania synaptycznego. Przedstawiono metodę krok po kroku w celu unieruchomienia larw trzeciego stadium na szkiełku mikroskopowym do optogenetycznej aktywacji nocyceptorów cIVda za pomocą przesuniętego na czerwono channelrhodopsinu CsChrimson, w połączeniu z jednoczesną fotokonwersją CaMPARI w neuronach Basin-4. Fotokonwersja zależna od wapnia w neuronach Basin-4, mimo ruchów wewnętrznych i zmian w płaszczyźnie ogniskowej, dostarcza funkcjonalnego dowodu łączności synaptycznej między tymi komórkami. Służy to jako dowód na zasadność zastosowania CaMPARI w połączeniu z presynaptyczną stymulacją optogenetyczną w intaktnych, niesezcejonowanych larw Drosophila.

Introduction

Identyfikowanie dokładnych partnerów synaptycznych w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) umożliwia śledzenie powstawania i udoskonalania połączeń synaptycznych podczas rozwoju układu nerwowego. Dlatego wysiłki skupiają się na wykorzystaniu woluminowej mikroskopii elektronowej (EM) do odtworzenia nie tylko pełnych konektomów w potężnych organizmach modelowych genetycznych, takich jak Caenorhabditis elegans^1,2 i Drosophila melanogaster^3,4,5, ale także woluminów EM w skali milimetrów złożonych mózgów ssaków, w tym pierwotnej kory wzrokowej myszy⁶ i ludzkiej kory skroniowej⁷. Badania te zapewniają unikalny wgląd w zasady organizacyjne leżące u podstaw połączeń synaptycznych na poziomie anatomicznym. Jednakże funkcjonalne charakteryzowanie partnerów synaptycznych zapewnia uzupełniające wglądy w łączność neuronową i jest wymagane do walidacji znalezisk anatomicznych.

Drosophila oferuje liczne zalety w badaniu łączności neuronowej, w tym dostępność pełnych konektomów dla larwalnego³ oraz żeńskiego⁴ i męskiego⁵ dorosłego ośrodkowego układu nerwowego, oprócz dobrze scharakteryzowanych obwodów neuronowych regulujących przewidywalne zachowania^8,9,10. Sieć nocyceptywna larw stanowi jeden z takich dobrze przystosowanych obwodów do badania precyzyjnych połączeń synaptycznych¹¹. Rekonstrukcja EM tej sieci ujawniła szczegółowe partnerstwa synaptyczne wymagane do przetwarzania bodźców nocyceptywnych, prowadząc do charakterystycznego zachowania ucieczki zwanego toczeniem się nocyfensywnym^12,13.

W obrębie tej sieci, neurony rozgałęzień dendrytów klasy IV (cIVda)¹⁴ pełnią funkcję pierwotnych sensorycznych nocyceptorów odpowiedzialnych za wykrywanie bólu^{11,12,13,15,16}. Ich ciała komórkowe i dendryty znajdują się obwodowo w ścianie ciała, podczas gdy ich aksony rzutują się do larwalnego grzbietowego sznura nerwowego (VNC)¹⁵. Wewnątrz OUN, neurony cIVda rozgałęziają swoje terminalne zakończenia aksonów w stereotypowym wzorcu i tworzą większość swoich kontaktów synaptycznych z interneuronami Basin-4^11,12,13,17. Ta zdefiniowana relacja synaptyczna ustanawia neurony cIVda i interneurony Basin-4 jako idealną parę do funkcjonalnej oceny łączności synaptycznej in vivo. Rozwój metod do analizy funkcjonalnych połączeń między indywidualnie zidentyfikowanymi partnerami synaptycznymi ułatwi badania mechanizmów leżących u podstaw rozwoju i udoskonalania synaps, szczególnie w genetycznie dostępnych systemach z uporządkowanymi obwodami neuronowymi.

CaMPARI (Calcium Modulated Photoactivatable Ratiometric Integrator)¹⁸ to genetycznie zakodowany fluorescencyjny wskaźnik ratiometryczny, którego widmo emisyjne przesuwa się w odpowiedzi na podwyższone poziomy wapnia wewnątrzkomórkowego. W warunkach wyjściowych, CaMPARI fluoreskuje na zielono; w obecności wysokich stężeń wapnia i po ekspozycji na światło fotokonwersji (około 400 nanometrów (nm)), nieodwracalnie przekształca się w czerwoną fluorescencję¹⁸. Ponieważ napływ wapnia do neuronów postsynaptycznych jest charakterystyczny dla aktywacji synaptycznej, fotokonwersja CaMPARI zapewnia odczyt funkcjonalnego sygnałowania synaptycznego^19,20.

Oprócz CaMPARI, aktywność neuronowa może być wizualizowana za pomocą odwracalnych czujników, takich jak genetycznie zakodowane wskaźniki wapnia (GECIs) w tym GCaMP lub RCAMP²¹, a także genetycznie zakodowane wskaźniki napięcia (GEVIs)²² takie jak Arclight²³, Ace2N-mNeon²⁴, czy VARNAM²⁵. Podczas gdy te szybkie, odwracalne czujniki są odpowiednie do monitorowania przejściowej aktywności w czasie rzeczywistym, są podatne na artefakty związane z ruchem podczas obrazowania in vivo. Natomiast integracyjne i nieodwracalne właściwości fotokonwersji CaMPARI umożliwiają rejestrację aktywności w określonym oknie czasowym, pozwalając na wykrycie aktywacji neuronowej nawet gdy płaszczyzny ogniskowe zmieniają się podczas obrazowania²⁰. Dodatkowo, fotokonwersja CaMPARI może być dostrojona poprzez regulację intensywności światła fioletowego, umożliwiając wykrycie zmniejszonej siły synapsy lub subprogowych wejść²⁶. Te właściwości

Protocol

Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem Drosophila melanogaster były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Użyto genotypu w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4 (uzyskany przez rekombinację RRID:BDSC_54899¹² i RRID:BDSC_32079¹⁶) do sterowania ekspresją optogenetyczną i CaMPARI (za pomocą linii w^-, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/Cyo uzyskany przez rekombinację RRID:BDSC_81085 z markerami na drugim chromosomie) w partnerach przed- i postsynaptycznych, odpowiednio. Narzędzia badawcze użyte w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie larw

1. Ustaw krzyżówki genetyczne między samicami dziewiczymi UAS-CsChrimson, LexAop-CaMPARI; CyO/sp (RRID:BDSC_81085) a samcami z linii muchy zawierającej dwa systemy binarne, na przykład z neuronem przedsynapatycznym, który interesuje nas, sterującym ekspresją GAL4 i neuronem postsynapatycznym, który nas interesuje, sterującym LexA^33,34.
2. Ustaw krzyżówki genetyczne w plastikowych pojemnikach zawierających standardowe pożywki na bazie mąki kukurydzianej^35,36,37,38 uzupełnione o 0,5 mM all-trans retinal (ATR) do aktywacji CsChrimson^30,33. Przygotuj równoległe pojemniki bez ATR jako kontrole bez-ATR.
   UWAGA: Stop mąkę kukurydzianą bez gotowania. Pozwól, aby się schłodziła bez stwardnienia. Przygotuj 40 mM roztwór stockowy ATR (proszek ATR rozcieńczony w 95% alkoholu zgodnie z instrukcjami producenta), a następnie rozcieńcz do 0,5 mM w pożywce i dokładnie wymieszaj.
3. Przykryj pojemniki całkowicie folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło.
   UWAGA: Utrzymuj warunki chowu w ciągłych ciemnościach ze względu na światłoczułą naturę ATR i aby zapobiec niezamierzonej aktywacji neuronów. Chociaż CsChrimson jest najbardziej wrażliwy na światło czerwone (590–680 nm), może być również aktywowany przez inne widoczne długości fal^31,39.
4. Inkubować pojemniki w 25 °C i wyhodować larwy do trzeciego stadium larwalnego.  

2. Unieruchomienie larw

1. Zbierz larwy trzeciego stadium za pomocą pędzelka. Umyj larwy w trzech dołkach płytki mikro do badań zawierającej 0,1 M PBS, aby usunąć resztki pokarmu.
   UWAGA: Nie usuwaj nadmiernej ilości PBS; pomaga to utrzymać nawodnienie.
2. Umieść małą ilość glinki modelarskiej w każdym rogu czystej szkiełki pokrywowej (18 × 18 mm). Umieść larwę na kropli PBS na szkiełku i pozwól jej ustawienia się brzuszną stroną w dół.
   UWAGA: Do obrazowania rdzenia nerwowego brzusznego (VNC), umieść larwę na grzbietowej stronie, aby brzuszna powierzchnia stykała się ze szkiełkiem. Ta orientacja umożliwia skierowanie neuronów interneuronowych Basin-4 w VNC w stronę obiektywu przez szkiełko.
3. Przykryj szkiełko mikroskopu szkiełkiem pokrywowym zawierającym larwę.
4. Zabezpiecz szkiełko pokrywowe, stosując dodatkową glinkę modelarską do rogów. Wykonaj wystarczającą siłę, aby unieruchomić larwę, unikając jednocześnie rozerwania larwy lub szkiełka pokrywowego.

3. Stymulacja, fotokonwersja i przepływ pracy obrazowania

1. Zdobądź początkowy z-stack neuronów postsynapatycznych ekspresujących CaMPARI za pomocą jednoczesnych kanałów zielonych (488 nm, 0,8% mocy lasera) i czerwonych (~561 nm, 0,8% mocy lasera). Użyj Z-stepu 1 µm, 256 × 256 pikseli rozdzielczości, średniowanie linii 2, skanowanie dwukierunkowe i prędkość skanowania 9 na mikroskopie konfokalnym wyposażonym w obiektyw 40×/1,2. Przeprowadź wszystkie obrazy w ciemnym środowisku. Utrzymuj identyczne parametry z-stacku w całym eksperymencie.
   UWAGA: Oczekuj jasnych zielonych ciałek komórkowych w stereotypowych pozycjach w rdzeniu nerwowym brzusznym larwy i braku wykrywalnej czerwonej fluorescencji w bazie.
2. Stymuluj larwę ciągle przez 30 s za pomocą jednoczesnego światła fotokonwersji (405 nm, 0,5% mocy lasera) i światła stymulacji optogenetycznej (594 nm, 0,8% mocy lasera).
3. Zdobądź po-stymulacyjny z-stack za pomocą takich samych parametrów jak w krok 3.1 pod zarówno czerwonymi (~561 nm), jak i zielonymi (488 nm) kanałami. Oczekuj ciałek komórkowych VNC w podobnych pozycja

Results

Zgodnie z tym protokołem, połączenie funkcjonalne między neuronami cIVda a interneuronami Basin-4 zostało ocenione u żywych, nierozciętych larw D. melanogaster w trzecim stadium wzrostu przy użyciu CaMPARI (Rysunek 2). Przed jakąkolwiek stymulacją światłem do fotokonwersji (PC) lub aktywacją optogenetyczną, interneurony Basin-4 wykazywały zieloną fluorescencje z powodu ekspresji cytozolowej CaMPARI (Rysunek 2A). Żadna czerwona fluorescencja nie została ...

Discussion

Opisany tutaj protokół umożliwia jakościową i ilościową ocenę połączeń synaptycznych między określonymi partnerami synaptycznymi w nienaruszonych larwach D. melanogaster. Podejście to wykorzystuje kombinację optogenetycznej stymulacji neuronów czuciowych cIVda z wizualizacja opartą na CaMPARI aktywowanych postsynaptycznych interneuronów Basin-4 w celu monitorowania aktywności synaptycznej w układzie nerwowym (CNS) nienaukowań. Poprzednie zastosowania CaMPARI w D. melanogaster koncentrowały się głównie n...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK	Chemikalia używane w roztworze do nawadniania i montowania larw
All-trans-retinal (ATR)	Sigma Aldrich	R2500-500mg	Chemikalia dodawane do pokarmu w celu aktywacji narzędzi optogenetycznych
Konfokalny mikroskop	ZEISS	LSM900 Konfokalny	Konfokalny mikroskop, Obiektyw (40×/1.2 NA), Źródło światła/lasera (405, 488, 561 nm)
Pokrzywka (18x18mm)	VWR	48366-205	Używane do montowania zwierząt do obrazowania
Etanol (95%)	Sigma Aldrich	E7023	Używane jako rozpuszczalnik dla proszku ATR
Fiji (ImageJ)	Open source	RRID:SCR_002285	Używane do analizy obrazów
Prism version 10.4.1	GraphPad Software Inc.	RRID:SCR_002798	Używane do analizy statystycznej
Ślidy mikroskopowe	VWR	48300-041	Używane do montowania zwierząt do obrazowania
Glina do modelowania	Flinn scientific	FB0600	Używane do trzymania szkiełka pokrywającego na ślizdze mikroskopowej z larwami pomiędzy
Pędzel	Genesee scientific	59-204	Używane do przenoszenia larw między lokalizacjami
Standardowy agarowy pożywki kukurydzianej	Genesee scientific	66-123	Jedzenie można również przygotować używając podobnych standardowych receptur i składników
Standardowe plastikowe fiolki Drosophila (25mm x 95mm ciasne fiolki Drosophila)	Genesee scientific	32-109	Można również używać większych fiolek lub butelek
Płytka mikro spotowa trójkomorowa	Electron Microscopy Sciences	71561-01	Płytka używana do separacji i czyszczenia pojedynczych larw
Zasoby Drosophila (genotyp: w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4)	Bloomington Drosophila Stock Center	RRID:BDSC_54899 & RRID:BDSC_32079	Uzyskane z rekombinacji RRID:BDSC_54899 i RRID:BDSC_32079
Zasoby Drosophila (genotyp: w, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/CyO)	Bloomington Drosophila Stock Center	RRID:BDSC_81085	Uzyskane z rekombinacji RRID:BDSC_81085 z markerami drugiego chromosomu