Artykuł metodologiczny

Charakterystyka funkcjonalna indywidualnych partnerów przed- i postsynaptycznych w Drosophila Ośrodkowym Układzie Nerwowym Larwalnym przy użyciu CaMPARI

DOI:

10.3791/71399

⸱

16 czerwca 2026

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County (UMBC)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół ocenia aktywność synaptyczną funkcjonalną między określonymi partnerami neuronowymi in vivo w centralnym układzie nerwowym larw Drosophila melanogaster przy użyciu genetycznie zakodowanych narzędzi. Optogenetyczna stymulacja presynaptycznych cIVda neuronów sensorycznych za pomocą CsChrimson indukuje fotokonwersję zależną od wapnia CaMPARI w postsynaptycznych interneuronach Basin-4.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Studia nad konektomem znacznie rozszerzyły zrozumienie łączności synaptycznej w układach nerwowych różnych gatunków. Chociaż charakterystyka partnerów synaptycznych przy użyciu mikroskopii elektronowej (ME) zapewnia szczegółowe informacje anatomiczne, funkcjonalne aspekty sieci neuronowych wymagają uzupełniających podejść. Ostatnie badania na Drosophila ujawniły nie tylko kompletne konektome larwalnego, jak również męskiego i żeńskiego dorosłego układu nerwowego, ale także komponenty komórkowe sieci neuronowych, które regulują określone zachowania, takie jak larwalna sieć nocyceptywna. Na etapie trzeciej larwki, multidendryczne neurony sensoryczne typu cIVda (nocyceptory) ustanawiają większość kontaktów synaptycznych z interneuronami Basin-4. Aby ocenić funkcjonalne znaczenie tych połączeń anatomicznych, zakodowany genetycznie wskaźnik wapnia CaMPARI (Calcium Modulated Photoactivatable Ratiometric Integrator) został zastosowany w żywych, niesekcjonowanych larwkach trzeciej instar jako reporter zależny od aktywności do oceny łączności synaptycznej między neuronami cIVda a interneuronami Basin-4. CaMPARI jest wskaźnikiem fluorescencyjnym ratiometrycznym, którego widmo emisji zmienia się w odpowiedzi na podwyższone poziomy wapnia wewnątrzkomórkowego. W warunkach wyjściowych, CaMPARI fluorescencja zielona; w obecności wysokich stężeń wapnia i po ekspozycji na światło fotokonwersji (~400 nm), nieodwracalnie przełącza się na czerwoną fluorescencje. Ponieważ napływ wapnia do neuronów postsynaptycznych jest charakterystyczny dla aktywacji synaptycznej, fotokonwersja CaMPARI zapewnia odczyt funkcjonalnego przekazywania sygnałów synaptycznych. Przedstawiono krok po kroku metodę unieruchomienia larwek trzeciej instar na szklanym slajdzie do optogenetycznej aktywacji nocyceptorów cIVda za pomocą przesuniętego na czerwono channelrhodopsin CsChrimson, w połączeniu z jednoczesną fotokonwersją CaMPARI w neuronach Basin-4. Fotokonwersja zależna od wapnia w neuronach Basin-4, pomimo wewnętrznych ruchów i zmian płaszczyzny ogniskowej, dostarcza funkcjonalnych dowodów na łączność synaptyczną między tymi komórkami. Służy to jako dowód na zasady dla użycia CaMPARI w połączeniu z presynaptyczną stymulacją optogenetyczną w nienaruszonych, niesekcjonowanych larwkach Drosophila.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja precyzyjnych partnerów synaptycznych w centralnym układzie nerwowym (CNS) umożliwia śledzenie tworzenia i uszczegółowiania połączeń synaptycznych podczas rozwoju układu nerwowego. Dlatego wysiłki skupione są na wykorzystaniu woluminowej mikroskopii elektronowej (EM) do odtworzenia nie tylko pełnych konektomów w potężnych organizmach modelowych, takich jak Caenorhabditis elegans1,2 i Drosophila melanogaster3,4,5, ale także woluminów EM w skali milimetrów złożonych mózgów ssaków, w tym pierwotnej kory wzrokowej myszy6 i ludzkiej kory skroniowej7. Badania te dostarczają unikalnego wglądu w zasady organizacyjne leżące u podstaw łączności synaptycznej na poziomie anatomicznym. Jednakże funkcjonalne zidentyfikowanie partnerów synaptycznych zapewnia uzupełniające wnioski dotyczące łączności neuronowej i jest wymagane do zweryfikowania wyników anatomicznych.

Drosophila oferuje liczne zalety dla badań nad łącznością neuronową, w tym dostępność pełnych konektomów dla larw3 oraz dla żeńskiego4 i męskiego5 układu nerwowego dorosłych, oprócz dobrze scharakteryzowanych obwodów neuronowych, które regulują przewidywalne zachowania8,9,10. Sieć nocyceptywna larw reprezentuje jeden z takich odpowiednich obwodów do badania precyzyjnej łączności synaptycznej11. Rekonstrukcja EM tej sieci ujawniła szczegółowe partnerstwa synaptyczne wymagane do przetwarzania bodźców nocyceptywnych, prowadzące do charakterystycznego zachowania ucieczki zwanego wałęczeniem nocyceptywnym12,13.

W obrębie tej sieci neurony czwartej klasy rozgałęzień dendrytów (cIVda)14 pełnią funkcję pierwotnych sensorycznych nocyceptorów odpowiedzialnych za wykrywanie bólu11,12,13,15,16. Ich ciała komórkowe i dendryty znajdują się obwodowo w ścianie ciała, podczas gdy ich aksony projektują się do larwalnego brzusznego słupka nerwowego (VNC)15. Wewnątrz OUN neurony cIVda rozgałęziają swoje terminale aksoniczne w stereotypowym wzorcu i tworzą większość swoich kontaktów synaptycznych z interneuronami Basin-411,12,13,17. Ta zdefiniowana relacja synaptyczna ustanawia neurony cIVda i interneurony Basin-4 jako idealną parę do funkcjonalnej oceny łączności synaptycznej in vivo. Rozwój metod analizy połączeń funkcjonalnych między indywidualnie zidentyfikowanymi partnerami synaptycznymi ułatwi badania mechanizmów leżących u podstaw rozwoju i uszczegółowiania synaps, szczególnie w genetycznie nadających się do manipulacji systemach z stereotypowymi obwodami neuronowymi.

CaMPARI (Calcium Modulated Photoactivatable Ratiometric Integrator)18 to genetycznie zakodowany wskaźnik fluorescencyjny ratiometryczny, którego widmo emisji zmienia się w odpowiedzi na podwyższone poziomy wapnia wewnątrzkomórkowego. W warunkach podstawowych CaMPARI fluoreskuje na zielono; w obecności wysokich stężeń wapnia i po wystawieniu na światło fotokonwersji (~400 nanometrów (nm)), nieodwracalnie przekształca się w czerwoną fluorescencję18. Ponieważ napływ wapnia do neuronów postsynaptycznych jest charakterystyczny dla aktywacji synaptycznej, fotokonwersja CaMPARI zapewnia odczyt funkcjonalnego przekazywania sygnałów synaptycznych19,20.

Oprócz CaMPARI, aktywność neuronowa może być wizualizowana za pomocą odwracalnych czujników, takich jak genetycznie zaprogramowane wskaźniki wapnia (GECI) w tym GCaMP czy RCAMP21, a także genetycznie zaprogramowane wskaźniki napięcia (GEVI) 22 takie jak Arclight23, Ace2N-mNeon24 czy VARNAM25. Podczas gdy te szybkie, odwracalne czujniki są dobrze przystosowane do monitorowania przejściowej aktywności w czasie rzeczywistym, są one podatne na artefakty ruchu podczas obrazowania in vivo. W przeciwieństwie do tego, integracyjne i nieodwracalne właściwości fotokonwersji CaMPARI umożliwiają rejestrację aktywności w określonym oknie czasowym, pozwalając na wykrycie aktywacji neuronów nawet wtedy, gdy płaszczyzny ogniskowe przesuwają się podczas obrazowania20. Ponadto, fotokonwersja CaMPARI może być dostrojona poprzez regulację intensywności fioletowego światła, umożliwiając wykrywanie zmniejszonej siły synapsy lub subprogowych wejść26. Te w

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem Drosophila melanogaster przeprowadzono zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Genotyp w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4 (uzyskany przez rekombinację RRID:BDSC_5489912 i RRID:BDSC_3207916) został użyty do sterowania ekspresją optogenetyczną i CaMPARI (używając linii w-, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/Cyo uzyskany przez rekombinację RRID:BDSC_81085 z markerami na drugim chromosomie) w partnerach pre- i postsynapticznych, odpowiednio. Narzędzia badawcze użyte w tym protokołach są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie larw

  1. Ustaw krzyżowanie genetyczne między samkami dziewicami UAS-CsChrimson, LexAop-CaMPARI; CyO/sp (RRID:BDSC_81085) a samcami z linii muszek zawierającej dwa systemy dwubiegunowe, na przykład z presynaptyczną neuronem interesującym, który steruje ekspresją GAL4, a postsynaptyczny neuronem interesującym sterującym LexA33,34.
  2. Ustaw krzyżowanie genetyczne w plastikowych probówkach zawierających standardowe medium z agarem kukurydzianym35,36,37,38 uzupełnione o 0,5 mM all-trans retinal (ATR) dla aktywacji CsChrimson30,33. Przygotuj równoległe probówki bez ATR jako kontrole no-ATR.
    UWAGA: Rozpuść medium z agarem kukurydzianym bez gotowania. Pozostaw, aby ostygło bez stwardnienia. Przygotuj 40 mM roztwór stockowy ATR (proszek ATR rozcieńczony w 95% alkoholu etylowym zgodnie z instrukcjami producenta), a następnie rozcieńcz do 0,5 mM w medium i dokładnie wymieszaj.
  3. Przykryj probówki całkowicie folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło.
    UWAGA: Utrzymuj warunki hodowli w ciągłej ciemności z powodu światłoczułego charakteru ATR i aby zapobiec niezamierzonej aktywacji neuronów. Chociaż CsChrimson jest najbardziej wrażliwy na światło czerwone (590–680 nm), może być również aktywowany przez inne widoczne długości fal31,39.
  4. Inkubować probówki w 25 °C i wyhodować larwy do trzeciego stadium.   

2. Unieruchomienie larw

  1. Zbierz larwy trzeciego stadium za pomocą pędzelka. Umyj larwy w trzech dołkach płytki mikro do testów zawierającej 0,1 M PBS, aby usunąć pokarm.
    UWAGA: Nie usuwaj nadmiaru PBS; pomaga to w utrzymaniu nawodnienia.
  2. Umieść małą ilość glinki modelarskiej w każdym rogu czystego pokrycia szkieletowego (18 × 18 mm). Umieść larwę w kropli PBS na pokryciu szkieletowym i pozwól jej orientować się brzuszną stroną w dół.
    UWAGA: Dla obrazowania rdzenia nerwowego brzusznego (VNC), zamontuj larwę na jej grzbietowej stronie, aby brzuszna powierzchnia stykała się z pokryciem szkieletowym. Ta orientacja pozwala neuronom interneuronom Basin-4 w VNC na skierowanie się w stronę obiektywu przez pokrycie szkieletowe.
  3. Umieść czysty slajd mikroskopowy nad pokryciem szkieletowym zawierającym larwy.
  4. Zabezpiecz pokrycie szkieletowe, stosując dodatkową glinkę modelarską do naroży. Wykonaj wystarczającą siłę, aby unieruchomić larwy, unikając rozerwania larw lub pokrycia szkieletowego.

3. Stymulowanie, fotokonwersja i przepływ pracy obrazowania

  1. Zdobądź podstawową warstwę z neuronami postsynaptycznymi ekspresującymi CaMPARI, używając jednoczesnych kanałów zielonego (488 nm, 0,8% mocy lasera) i czerwonego (~561 nm, 0,8% mocy lasera). Użyj kroku Z 1 μm, 256 × 256 pikseli rozdzielczości, przeciętnej liniowej wartości 2, dwukierunkowego skanowania i szybkości skanowania 9 na mikroskopie konfokalnym wyposażonym w obiektyw 40×/1.2. Przeprowadź wszystkie obrazy w ciemnym środowisku. Zachowaj identyczne parametry warstwy z przez cały eksperyment.
    UWAGA: Oczekuj jasnych zielonych ciał komórkowych w stereotypowych pozycjach w rdzeniu nerwowym brzusznym larw i braku wykrywalnej czerwonej fluorescencji na podstawie.
  2. Stymuluj larwy ciągle przez 30 s używając jednoczesnego światła fotokonwersyjnego (405 nm, 0,5% mocy lasera) i światła stymulacji optogenetycznej (594 nm, 0,8% mocy lasera).
  3. Zdobądź warstwę po stymulacji używając tych samych parametrów, jak w krok 3.1 pod oboma kanałami czerwonymi (~561 nm) i zielonymi (488 nm). Oczekuj ciała komórkowego VNC w podobnych pozycjach, jak na podstawie. Wykryj czerwoną fluorescencje CaMPARI w neuronach

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Following this protocol, functional connectivity between cIVda neurons and Basin-4 interneurons was assessed in live, undissected D. melanogaster third instar larvae using CaMPARI (Rysunek 2). Prior to any stimulation with photoconversion (PC) light or optogenetic activation, Basin-4 interneurons displayed green fluorescence due to cytosolic CaMPARI expression (Rysunek 2A). No red fluorescence was detected under baseline conditions (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół umożliwia jakościową i ilościową ocenę łączności synaptycznej między określonymi partnerami synaptycznymi w nienaruszonych larwach D. melanogaster. Podejście to wykorzystuje kombinację optogenetycznej stymulacji cIVda neuronów czuciowych z wizualizacja opartą na CaMPARI aktywowanych postsynaptycznych interneuronów Basin-4 w celu monitorowania aktywności synaptycznej w centralnym układzie nerwowym (OUN) niesekcjonowanych larw. Poprzednie zastosowania CaMPARI w D. melanogaster konce...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratorium Biologii Morskiej (Woods Hole, MA) jest wymienione jako instytucja, która gościła i wsparła prace nad rozwiązywaniem problemów z opisanymi technikami i protokołami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0.1 M Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma AldrichP5368-10PAKChemikalia używane w roztworze do nawadniania i montowania larw
All-trans-retinal (ATR) Sigma AldrichR2500-500mgChemikalia dodawane do pokarmu w celu aktywacji narzędzi optogenetycznych
Mikroskop konfokalnyZEISS LSM900 KonfokalnyMikroskop konfokalny, Obiektyw (40×/1.2 NA), Źródło światła/lasera (405, 488, 561 nm)
Pokrywki (18x18mm)VWR48366-205Używane do montażu zwierząt do obrazowania
Etanol (95%)Sigma AldrichE7023Używany jako rozpuszczalnik dla proszku ATR
Fiji (ImageJ)Open sourceRRID:SCR_002285 Używane do analizy obrazów
Prism wersja 10.4.1GraphPad Software Inc.RRID:SCR_002798Używane do analizy statystycznej
Szlabanki mikroskopoweVWR 48300-041Używane do montażu zwierząt do obrazowania
Glina modelarskaFlinn scientificFB0600Używane do trzymania szkiełka pokrywowego na szlabanku mikroskopowym z larwą pośrodku
PędzelGenesee scientific59-204Używane do przenoszenia larw między lokacjami
Standardowe medium agarowe z mąką kukurydzianąGenesee scientific66-123Żywność można również przygotować używając podobnych standardowych receptur i składników
Standardowe plastikowe pojemniki Drosophila (wąskie pojemniki Drosophila o wymiarach 25mm x 95mm)Genesee scientific32-109Można również używać większych pojemników lub butelek
Płytka mikroskodalna trójkomórkowaElectron Microscopy Sciences 71561-01Płytka używana do separacji i czyszczenia pojedynczych larw
Zestawy Drosophila (genotyp: w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4) Bloomington Drosophila Stock CenterRRID:BDSC_54899 & RRID:BDSC_32079Uzyskane przez rekombinację RRID:BDSC_54899 i RRID:BDSC_32079
Zestawy Drosophila (genotyp: w, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/CyO)Bloomington Drosophila Stock CenterRRID:BDSC_81085Uzyskane przez rekombinację RRID:BDSC_81085 z markerami chromosomu drugiego

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

OUN larwy Drosophilaczno synaptycznaobrazowanie CaMPARIaktywacja optogenetycznainterneurony Basin 4neurony cIVdawska nik wapniakana rodyopsyna CsChrimsonfunkcjonalne mapowanie synaptycznesie nocyceptywna

Powiązane artykuły