Reakcja łańcuchowa wspomagana ekspansją – smFISH i immunohistochemia w mózgu Drosophili

Podsumowanie

Protokół ten opisuje wspomagany ekspansją HCR-smFISH oraz immunohistochemię workflow do ilościowej, specyficznej dla typu komórki analizy ekspresji RNA i białek w mózgu Drosophila , w tym obrazowania za pomocą mikroskopii świetlnej lub konfokalnej oraz zautomatyzowanej ilościowej transkrypcji jądrowej i cytoplazmatycznej.

Streszczenie

Ilościowa, przestrzennie rozdzielona analiza ekspresji genów jest niezbędna do oceny specyficznych dla typu komórki profili molekularnych. W układzie wzrokowym Drosophila rozbudowane narzędzia genetyczne otwierają ramy do bezpośredniej oceny zarówno poziomu RNA, jak i białka w określonych populacjach neuronalnych. Przedstawiamy tutaj protokół krok po kroku, który łączy wspomagany ekspansją HCR-smFISH (hybrydyzacja łańcuchowa reakcji łańcuchowej – pojedyncząłą fluorescencję in situ ) z immunohistochemią, umożliwiając ilościową analizę specyficznych dla typu komórek profili molekularnych w genetycznie zdefiniowanych typach neuronów układów wzrokowych. Workflow jest zoptymalizowany dla komórek znakowanych markerami zlokalizowanymi lub błonowymi zlokalizowanymi jądrowo, co pozwala na pomiar poziomu transkrypcji i białek w tych samych neuronach. Po ekspansji tkanek próbki są obrazowane za pomocą mikroskopii świetlnej dla szybkiego pozyskiwania objętościowego, z alternatywnym montażem i procesem obrazowania demonstrowanym dla standardowych odwróconych mikroskopów laserowych i konfokalnych z obrotowym dyskiem. Ponadto oferujemy zautomatyzowany algorytm segmentacji, który rozróżnia transkrypty jądrowe i cytoplazmatyczne, umożliwiając analizę stanu transkrypcji i lokalizacji podkomórkowego RNA. Udzielane są praktyczne wskazówki dotyczące parametrów eksperymentalnych oraz typowych pułapek wpływających na jakość sygnału, integralność tkanek oraz wydajność ilościową. Reprezentatywne zastosowania obejmują walidację interferencji RNA specyficznej dla typu komórki poprzez ilościowe określenie odpowiadających zmian w poziomach RNA i białek. Dzięki umożliwieniu zintegrowanych pomiarów na poziomie RNA i białek z specyficznością typu komórki, podejście to zapewnia skalowalną strategię analizy molekularnej opartej na hipotezie, a w kontekstach celowanych praktyczną alternatywę dla transkryptomicznych testów jednokomórkowych. Protokół ten oferuje praktyczne podejście do weryfikacji specyficznych dla typu komórek zaburzenia molekularnych, jednocześnie zachowując anatomiczny kontekst nienaruszonego mózgu Drosophila .

Wprowadzenie

System wzrokowy Drosophila melanogaster stał się potężnym modelem do rozwiązywania szerokiego zakresu zagadnień neurobiologii rozwojowej, w tym różnicowania neuronów ^1,2, specyfikacji typu komórkowego ^3,4 oraz molekularnej logiki przewodzenia mózgu ^5,6,7. Postęp ten był napędzany przez niezwykle bogaty zestaw narzędzi eksperymentalnych, obejmujący duże kolekcje specyficznych dla typu komórek linii genetycznych ^8,9,10, niedawne kompleksowe rekonstrukcje connectomic 10,11,12 oraz coraz bardziej szczegółowe jednokomórkowe transkryptomiczne^13,14 i^{multiomic 15} zbiorów danych. Razem te zasoby definiują typy neuronów w sposób multimodalny i umożliwiają precyzyjne manipulacje genetyczne. W rezultacie dziedzina może teraz generować coraz bardziej predykcyjne hipotezy dotyczące tego, jak konkretne geny regulują tożsamość, łączność i funkcjonowanie neuronów¹⁶.. Chociaż sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek dostarcza cennych informacji o stanach transkrypcyjnych, obfitość RNA nie zawsze przewiduje ekspresję białek¹⁷, a wiele eksperymentów perturbacyjnych ostatecznie wymaga bezpośredniego, ilościowego pomiaru zarówno RNA, jak i białka w tych samych neuronach.

Hybrydyzacja in situ fluorescencją pojedyncząłową (smFISH)^18,19 umożliwia ilościowy pomiar liczności transkryptów z rozdzielczością komórkową i subkomórkową, zachowując jednocześnie kontekst anatomiczny. Połączenie smFISH z mikroskopią ekspansyjną 20,21,22 dodatkowo rozszerzyło jego zastosowanie dla nienaruszonych mózgów poprzez fizyczne powiększenie tkanek wewnątrz pęczniącego hydrożelu, co zmniejsza stłoczenie cząsteczek, poprawia dostęp optyczny i zwiększa efektywną rozdzielczość przestrzenną. W połączeniu z hybrydyzacyjnym wzmacnianiem sygnału opartym na reakcji łańcuchowej (HCR)²³, wspomagany ekspansją smFISH umożliwia solidne wykrywanie dyskretnych transkrypcji w grubej tkance nerwowej oraz wspiera obrazowanie całego mózgu przy użyciu mikroskopii świetlnej lub konfokalnej.

Do mózgu Drosophila zastosowano szereg metod obrazowania in situ RNA, odzwierciedlając różne priorytety eksperymentalne. Wspomagany ekspansją iteracyjny HCR-FISH umożliwił wykrywanie RNA w całym mózgu, przestrzennie rozdzielone²⁴. Równolegle, metody FISH bez ekspansji były stosowane do pomiarów RNA w genetycznie oznakowanych neuronach, w tym strategie mapowania aktywności oparte na HCR skoncentrowane na bezpośrednich wczesnych genach²⁵ oraz procesy liczenia transkrypcji oparte na segmentacji z wykorzystaniem genetycznie kodowanych markerów związanych z błoną²⁶. Komercyjne metody oparte na sondach, takie jak RNAscope, dodatkowo umożliwiły wykrywanie multipleksowego RNA w całych mózgach, często w połączeniu z immunohistochemią w celu identyfikacji populacji komórek docelowych²⁷. Razem te podejścia potwierdzają, że analiza przestrzennie rozdzielonego RNA w mózgu muchy jest technicznie wykonalna. Jednak eksperymenty perturbacyjne oparte na hipotezie nakładają bardziej specyficzny zestaw wymagań, które nie są w pełni uwzględnione przez żaden pojedynczy istniejący przepływ pracy. Wiele metod priorytetowo traktuje mapowanie transkrypcji w stylu multipleksowego odkrywania, profilowanie stanu aktywności lub samą ilościową identyfikację RNA, przy czym immunobarwienie zazwyczaj służy jako identyfikator komórki, a nie jako dopasowany odczyt zaburzonego białka, lub jest stosowane w przypadku braku przypisania typu komórki genetycznego²⁸. Ponadto rutynowe aplikacje skorzystałyby na kompatybilności z wieloma platformami obrazowania oraz z automatycznymi, skalowalnymi potokami analitycznymi.

Przedstawiamy tutaj zintegrowany, krok po kroku workflow dla systemu wzrokowego Drosophila , który łączy wspomagany ekspansją HCR-smFISH z immunohistochemią przeprowadzoną przed ekspansją, umożliwiając sparowane pomiary poziomów RNA i białek w tych samych neuronach w obrębie tego samego preparatu biologicznego. Bazując na frameworku FlySeg²⁹ , który wcześniej opracowaliśmy, dostarczamy zautomatyzowany pipeline ilościowy do segmentacji jądrowej i liczenia transkrypcji, który rozróżnia jądrowe i cytoplazmatyczne punkty, wspierając zarówno pomiary całkowitej ekspresji, jak i analizy wrażliwe na stan transkrypcji. Protokół jest demonstrowany zarówno na mikroskopie świetlnym, jak i dwóch systemach konfokalnych, z alternatywnymi metodami montażu i obrazowania. Na koniec ilustrujemy użyteczność zintegrowanego odczytu RNA–białka poprzez reprezentatywny eksperyment z zaburzeniami i walidacją (czyli RNAi-mediacyjne wyniszczenie zdefiniowanego celu), dostarczając praktycznych wskazówek dotyczących parametrów i pułapek wpływających na jakość sygnału, integralność tkanek oraz wydajność ilościową.

Protokół ten zazwyczaj opiera się na wcześniej opisanym²⁴ ramach EASI-FISH do wykrywania RNA całego mózgu u Drosophila i zachowuje podstawowe zasady: kotwiczenie RNA, rozszerzanie hydrożelu oraz wzmacnianie sygnału oparte na HCR. Niniejszy protokół rozszerza i udoskonala to podejście poprzez integrację immunohistochemii przed rozbudową, umożliwiając dopasowanie pomiarów RNA i białek w tych samych neuronach, poprzez rewizję wielu etapów przetwarzania i obsługi w trakcie pracy w celu poprawy odporności i powtarzalności, dostarczając praktyczne strategie montażu i obrazowania zarówno dla mikroskopów konfokalnych z arkuszem świetlnym, jak i konwencjonalnych odwróconych konfokalnych mikroskopów oraz poprzez automatyczne segmentowanie soma i kwantyfikację transkryptu z wyraźnym rozdzieleniem pul RNA jądrowego i cytoplazmatycznego.

Ten workflow najlepiej sprawdza się w eksperymentach ukierunkowanych, których celem jest ilościowe określenie określonych odczytów RNA i białek w genetycznie zidentyfikowanych neuronach, przy jednoczesnym zachowaniu kontekstu anatomicznego. Jest szczególnie przydatny do walidacji zaburzeń molekularnych, gdy celem jest mierzenie regulacji w górę lub w dół zdefiniowanego genu lub niewielkiego zestawu genów kandydatów, porównanie ekspresji między genotypami lub etapami rozwojowymi lub ocenę stanu transkrypcji poprzez lokalizację transkryptu jądrowego i cytoplazmatycznego. Jest mniej odpowiedni do bezstronnego odkrywania transkrypcji lub mapowania ekspresji całego mózgu wysoko-pleksowej, gdzie bardziej odpowiednie mogą być sekwencjonowanie pojedynczych komórek, transkryptomika przestrzenna lub iteracyjne multipleksowane podejścia FISH.

Protokół

Oświadczenie etyczne

Protokół ten wykorzystuje Drosophila melanogaster. Nie użyto kręgowców ani ludzi. Dlatego nie było wymagane zatwierdzenie przez instytucjonalne komitety ds. opieki nad zwierzętami i użytkowania.

UWAGA: Stosuj technikę RNase-clean przez cały czas. Noś rękawiczki, wytrzyj powierzchnie i narzędzia roztworem dekontaminacyjnym RNaz, a wszystkie roztwory przygotuj wodą wolną od RNazy.

Rysunek 1. Etap pracy krok po kroku protokołu przygotowania próbki (A) Schematyczny harmonogram protokołu, wskazujący przybliżony postęp dnia po dniu oraz etapy inkubacji nocnej. (B–J) Schematyczny przegląd głównych etapów przygotowania próbki, od sekcji i fiksacji mózgu, przez immunohistochemię, sieci RNA/białka, osadzanie hydrożelu, trawienie, hybrydyzację sondą oraz amplifikację sygnału HCR. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

1. Sekcja mózgu, fiksacja i immunohistochemia (Dzień 1–3)

UWAGA: Wszystkie kroki wykonuj na wielodołowej płycie w stylu Terasaki, chyba że zaznaczono inaczej. Używaj 10 μL na odwór do inkubacji i płukania. Utrzymuj wilgotność, kładąc wilgotną chusteczkę laboratoryjną w jednym rogu talerza.

UWAGA: Paraformaldehyd i utrwalacze glioksalu są toksyczne i drażniące. Noszę okap i używaj odpowiedniego sprzętu ochronnego.

1. Rozcinaj mózgi w lodowatym medium owadzym S2. Przenieś mózgi do studni, do 10 mózgów na studnię (Rysunek 1B–C).
   UWAGA: Do reprezentatywnych eksperymentów przedstawionych tutaj użyto 72 mózgów poczwarek sprzed kilku lat.
2. Zamień medium S2 na 10 μL utrwalacza na odwiert, wymień raz.
3. Utrwal w Addax bezkwasowym glioksalu z 5% (w/v) sacharozy na noc w temperaturze 4 °C (rysunek 1C).
4. Myj mózgi 3× w 10 μL PBST (0,5% Triton X-100 w PBS) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Triton X-100 jest irytujący; Unikaj kontaktu ze skórą i wzrokami.
5. Inkubować mózgi w roztworze przeciwciał pierwotnych 10 μL (w PBST, przy rozcieńczeniach wymienionych w Tabeli Materiałów) przez 24 godziny w temperaturze 4 °C (Rysunek 1D).
6. Myj mózgi 3× przez 10 minut w 10 μL PBST w 4 °C. Dla każdego płukania wymień roztwór raz w połowie inkubacji (dwie wymiany na płukanie).
7. Inkubować mózgi w roztworze przeciwciał wtórnych 10 μL (w PBST, przy rozcieńczeniach wymienionych w Tabeli Materiałów) przez 24 godziny w temperaturze 4 °C (Rysunek 1D).
   UWAGA: Chroń próbki przed światłem.
8. Myj mózgi 3× przez 10 minut w 10 μL PBST w 4 °C. Dla każdego płukania wymień roztwór raz w połowie inkubacji (dwie wymiany na płukanie).
   UWAGA: Stosuj stężenia przeciwciał pierwotnych i wtórnych 2–3 razy wyższe niż standardowe stężenia immunohistochemii w pełnym stężeniu
   PUNKT ZATRZYMANIA: Przechowuj mózgi w 10 μL 1× PBS w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 96 godzin.

2. Kowalencyjne kotwicenie RNA i białek (Dzień 4) (Rysunek 1E)

UWAGA: alkilatory kotwicące RNA i AcX są niebezpieczne (toksyczne/drażniące; niektóre podejrzewają o działanie rakotwórczych). Przygotuj i obsługuj roztwory w okapie chemicznym z odpowiednią ochroną środków ochrony osobistej. Zbieraj wszystkie odpady jako niebezpieczne chemikalia.

1. Inkubuj mózgi w 10 μL buforu MOPS 20 mM (pH 7,7) przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
2. Przygotuj roztwór kotwiący, mieszając 49,5% (v/v) 20 mM MOPS, 49,5% (v/v) materiału Melphalan (2,5 mg·^mL-1 w DMSO) oraz 1% (v/v) AcX (10 mg·^mL-1 w DMSO). Daje to końcowe stężenia 1,24 mg·^mL-1 melfalan oraz 0,10 mg·^mL-1 AcX.
3. Zamień MOPS na 7–8 μL roztworu kotwicącego na odwiert, wymień roztwór raz i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C w ciemności.
   UWAGA: Używaj 7–8 μL, aby zminimalizować przepełnienie i mieszanie przejściowe, jednocześnie utrzymując pełne pokrycie próbki.

3. Żelacje (osadzenie mózgu w hydrożelu) i trawienie proteinazy K (dzień 5)

UWAGA: Monomery akrylowe, APS i TEMED są drażniące/toksyczne. Obsługa z użyciem środków ochrony osobistej; Przygotuj lotne/egzotermiczne składniki w okapie oparowym.

1. Przymocuj silikonową uszczelkę o grubości 0,5 mm do nienaładowanego szkła mikroskopu (rysunek 1F, lewy dolny róg), mocno dociśnij, aby zapewnić pełny kontakt i uszczelnienie.
2. Dodaj 200 μL roztworu poli-L-lizyny do komory i rozprowadz równomiernie, aby pokryć powierzchnię, inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut i usuń roztwór pipetą.
3. Pozwól poli-L-lizynie całkowicie odparować, aż powierzchnia stanie się widocznie sucha.
   UWAGA: Odparowywanie poli-L-lizyny jest powolne. Aby uzyskać wiarygodne rezultaty, przygotuj komory wcześniej i pozwól im wyschnąć przez noc w środowisku wolnym od kurzu. Alternatywnie, wyschnąć komory w inkubatorze 37 °C na ≥ 1 godzinę w dniu użycia.
4. Myj mózgi 2× w 10 μL 1× PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
5. Przygotuj roztwór monomeru żelowego i dodaj odczynniki polimeryzacyjne tuż przed użyciem, mieszając roztwór monomerowy z 4HT, TEMED i APS (make fresh) w proporcji 47:1:1:1. Ostateczny roztwór żelacyjny zawiera 1 M akrylianu sodu, 14% akrylamidu, 0,1% bisakrylamidu, 1× PBS, 0,01% 4HT, 0,2% TEMED oraz 0,2% APS.
6. Krótko zawortexuj i trzymaj ostatni roztwór żelu na lodzie. Użyj roztworu natychmiast.
7. Inkubuj mózgi w roztworze żelu zimnego o pojemności 10 μL przez 15 minut na lodzie.
8. Podczas wstępnego wyważania, używając nowej żyletki, wytnij po jednym wąskim kanale po każdej stronie silikonowej uszczelki, aby umożliwić ucieczkę powietrza podczas napełniania (Rysunek 1F, lewy górny górny róg)
9. Za pomocą końcówki pipety przenieś mózgi do przygotowanej komory żelacyjnej, dbając o to, by każdy mózg pozostawał zanurzony w roztworze żelu przez cały czas.
   UWAGA: Po zakotwiczeniu i wyważeniu mózgi stają się bardzo przyklejone i łatwo przylegają do plastikowych powierzchni. Aby zapobiec utracie próbki, użyj końcówek pipet o szerokim przeróbce lub przycinaj koniec standardowej końcówki, aby poszerzyć otwór.
10. Usuń ochronną okładkę z silikonowego kleju powierzchniowego i delikatnie nałóż czystą szklaną pokrywę 1,5H na komorę, unikając uwięzienia pęcherzyków powietrza.
11. Powoli pipetować 200 μL świeżo przygotowanego roztworu żelacyjnego do komory przez jeden z bocznych kanałów, aż komora zostanie całkowicie wypełniona.
12. Umieść zamkniętą komorę w ciemnym pojemniku i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
    UWAGA: Włóż chusteczki laboratoryjne nawilżone wodą do pojemnika. Upewnij się, że zlewka nie ma bezpośredniego kontaktu z ciekłą wodą.
13. Przygotuj bufor trawienny składający się z 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM NaCl, 1 mM EDTA oraz 0,5% (v/v) Triton X-100 w wodzie wolnej od RNazy.
14. Bezpośrednio przed użyciem dodaj Proteinazę K w proporcji 1:100 z zapasu 20 mg·^mL-1 do końcowego stężenia 0,2 mg·^mL-1.
    UWAGA: Proteinaza K jest drażniąca i należy ją stosować w rękawiczkach; Unikaj wdychania i kontaktu ze skórą.
15. Pozwól zjeżdżalni ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 5 minut przed zdjęciem pokrywy. Przytnij żel skalpelem w prostokątny kształt, używając pojedynczych, prostych cięć. Zminimalizuj nadmiar objętości żelu otaczającego każdy mózg (rysunek 1F, w prawym górnym rogu).
16. Umieść każdy przycięty żel w osobnym dołku z 24-dołkową płytką zawierającą roztwór trawienia o pojemności 1000 μL. Upewnij się, że żele są całkowicie zanurzone.
17. Uszczelnij płytę Parafilmem i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej na orbitalnym shakerze o masie 0,11 g (Rysunek 1G).

4. Trawienie DNazy i hybrydyzacja sond HCR-smFISH (dzień 6)

1. Ostrożnie zasysaj roztwór trawienny za pomocą pipety umieszczonej na krawędzi studni, aby uniknąć kontaktu lub deformacji żelu.
2. Żelowanie do płukania 3× 500 μL 1× PBS przez 15 minut każdy w temperaturze pokojowej na orbitalnym shakerze o masie 0,11 g.
   PUNKT ZATRZYMANIA: Przechowuj żele zanurzone w 500 μL 1× PBS w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 7 dni przed kontynuacją.
3. Przygotuj 500 μL roztworu roboczego DNazy na żel poprzez rozcieńczenie zapasu DNazy I z zestawu QIAGEN RNase-Free DNase 1:10 w buforze RDD. Ostateczny roztwór roboczy zawiera około 0,27 jednostki Kunitza·^μL-1.
4. Inkubuj żele w roztworze roboczym DNazy 500 μL przez 2 godziny w temperaturze 37 °C z delikatnym kołysaniem (Rysunek 1H).
5. Żel do mycia 4× z 500 μL wolnym od RNazy 1× PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
6. Wyrównuj żele w buforze hybrydyzacyjnym 500 μL podgrzanej sondy przez 30 minut w temperaturze 37 °C
7. Rozcieńczona sonda sondy HCR smFISH (1 μM; Molecular Instruments) 1:300 w buforze hybrydyzacji sondy do końcowego stężenia ~3,3 nM. Mieszanie przez wirowanie
8. Zamień bufor równoważający na mieszankę sondową o pojemności 500 μL na żel i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C na orbitalnym shakerze o masie 0,11g (Rysunek I).
   UWAGA: Bufory hybrydyzacyjne sond zawierają formamid, który jest toksyczny. Używaj rękawiczek i unikaj wdechu.

5. Reakcja łańcuchowa hybrydyzacji (dzień 7) (Rysunek 1J)

1. Żele płuczki 3× z buforem do płukania 500 μL przez 30 minut każdy w 37 °C na orbitalnym shakerze o pojemności 0,11 g.
   UWAGA: Bufory płuczące sondy zawierają formamid, który jest toksyczny. Używaj rękawiczek i unikaj wdechu.
2. Płucz żel 3× z 500 μL 1× PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej na orbitalnym shakerze o masie 0,11 g.
3. Żele pozostawić w 1 mL 1× PBS na noc w temperaturze pokojowej na orbitalnym shakerze o pojemności 0,11 g.
   UWAGA: Przedłużone nocne płukanie poprawia stosunek sygnału do szumu poprzez redukcję wiązania sondy poza celem i punktów tła. Do przetwarzania tego samego dnia przejdź bezpośrednio do amplifikacji HCR.
   PUNKT ZATRZYMANIA: Po myciu po hybrydyzacji przechowuj żele w 1 mL 1× PBS w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez maksymalnie 96 godzin przed amplifikacją HCR.
4. Zastąpić PBS buforem amplifikacyjnym 500 μL (wcześniej wyrównany do temperatury pokojowej) na odwiert i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na orbitalnym shakerze o pojemności 0,11 g.
5. Dla każdego zestawu sond rozcieńcz spinki h1 i h2 (3 μM materiału; Instrumenty molekularne) w buforze amplifikacyjnym 1:100 bufora (30 nM końcowe stężenie). Przygotuj 350 μL rozcieńczonej mieszanki do spinek na dołek.
6. Rozpustki zapinek termicznych w rurkach PCR w temperaturze 95 °C przez 90 sekund w cyklerze termicznym lub bloku grzewczym. Użyj 100 μL całkowitej objętości na probówkę, aby zapewnić równomierne ogrzewanie i równowagę temperatury.
   UWAGA: Wytyczne HCR zazwyczaj zalecają, by spinki do włosów nagrzewały się osobno, a następnie łączyły je dopiero po schłodzeniu. Alternatywnie można łączyć H1 i H2 przed nagrzewaniem zatrzaskowym, gdy potrzebne jest uproszczone traktowanie.
7. Pozwól spinkom do włosów schłodzić się do temperatury pokojowej przez 10 minut w ciemności bez zakłóceń.
8. Usuń bufor wzmacniający i dodaj 350 μL mieszanki spinek na dołek.
9. Inkubuj żele przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności na orbitalnym shakerze o masie 0,11 g.
10. Płucze się 3× z 500 μL 5× SSCT przez 10 minut każdy w temperaturze pokojowej na orbitalnym shakerze o pojemności 0,11 g.
11. Odzyskaj roztwory spinek po amplifikacji, chroń je przed światłem i przechowuj w temperaturze -20 °C do ponownego użycia.
12. Przełóż żele do 500 μL 1× PBS i myj 3× przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
13. Żele przechowuj w 500 μL 1× PBS w temperaturze 4 °C, chronione przed światłem.
    PUNKT PAUZY: Wzmacniane żele można przechowywać do 2 tygodni przed obrazowaniem przy minimalnej utracie sygnału.

6. Przygotowanie, montaż i obrazowanie rozszerzonych próbek (Dzień 8) (Rysunek 2)

1. Inkubuj żele w 1× PBS zawierającym DAPI (1:1000) przez noc w temperaturze 4 °C na orbitalnym shakerze o masie 0,11 g.
2. Użyj krótkiego oświetlenia UV, aby zobaczyć mózg w żelu. Ukierunkuj próbkę i przytnij nadmiar żelu w razie potrzeby.
   UWAGA: Podczas pozycjonowania i montowania próbek stosuje się oświetlenie UV. Noszę odpowiednie ochrony oczu.
3. Zamontuj próbki w 1× PBS uzupełnionym DAPI (1:1000), używając odpowiedniej konfiguracji dla wybranej platformy obrazowania (patrz Tabela 1).
4. Pozwól próbkom wyrównać się przez co najmniej 1 godzinę przed ich pobraniem.
5. Używaj obiektywów do zanurzenia w wodzie z odpowiednim zasięgiem roboczym, aby obrazować przez rozciągnięty żel.
6. Próbki obrazów za pomocą mikroskopii light-sheet, laserowej mikroskopii konfokalnej lub obrotowej mikroskopii dyskowej konfokalnej. Reprezentatywne parametry montażu i pozyskiwania specyficzne dla platformy użyte w tym badaniu są podsumowane w Tabeli 1.
   UWAGA: Po badaniach obrazowych sondy i spinki HCR mogą zostać usunięte za pomocą trawienia DNazy, jak opisano powyżej. Żele mogą być następnie poddawane kolejnym cyklom hybrydyzacji sondowej i amplifikacji HCR.

Peron	Przykładowa wizualizacja, montaż i lokalizacja	Obiektyw / detektor	Ustawienia reprezentatywnego pozyskiwania
Zeiss Lightsheet 7	Użyj krótkiego oświetlenia UV, aby zobrazować pozycję mózgu w żelu. Przytnij nadmiar żelu i skieruj każdy mózg na cel wykrywania. Umieść 5–6 żeli na pokrywie pokrywkowej o średnicy 1× 1 cm z powłoką poli-L-lizynową, z żelami skierowanymi na zewnątrz (Rysunek 2A). Przymocuj pokrywkę do uchwytu próbki LS7 za pomocą małej kropli kleju utwardzającego UV; wyłącz lampę UV przed nałożeniem kleju. Zamontuj w komorze LS7 i zlokalizuj obszary mózgu za pomocą podglądu na żywo w ZEN Black.	Cel detekcji zanurzenia w wodzie 20×/1.0 NA; 2,5× zoom optyczny (50× całkowite powiększenie).	Z-krok, 0,4 μm przy 2,5× zoom i 2× rozszerzanie. Skanowanie pivot włączone. Ekspozycja, 50 ms dla wszystkich kanałów. Lasery: 405 nm przy 5%, 488 nm przy 2%, 561 nm przy 8%. Emisja: 420–470 nm, 505–545 nm, 570–620 nm.
			(Rysunek 2C, po lewej)
Nikon Ti2-E AXR NSPARC laserowo skanujący konfokalnie	Użyj krótkiego oświetlenia UV, aby zobaczyć mózg w żelu. Ustaw pojedynczy żel tak, aby mózg był skierowany w dół w stronę odwróconego celu. Przenieś na miskę obrazującą ze szklanym dnem, wypełnioną 1× PBS + DAPI (rysunek 2B). Zlokalizuj mózg z celem 4×, zidentyfikuj ROI z celem 20× i rejestruj pozycje X-Y w NIS-Elements. Dodaj medium immersyjne, ponownie przeanalizuj zarejestrowane zwroty z inwestycji i skup je na ich uwagę.	40× obiektyw do zanurzenia w wodzie na długim dystansie roboczym (Nikon CFI APO LWD 40× WI, 1,15 NA Lambda S, zasięg roboczy 0,61 mm); Detektor NSPARC w trybie superrozdzielczości.	Skanowanie galwanometrem, 2048 × 2048 pikseli, 1,6 μs/piksel, 8,0× zoom. Lasery: 488 nm przy 2%, 640 nm przy 20%. Emisja: 502–546 nm i 666–732 nm.
			(Rysunek 2C, środek)
Widoczny konfokalny dysk obrotowy IXplore IX85 / Yokogawa CSU-W1	Zamontuj próbki jak w obrazowaniu konfokalnym z odwróconymi wzorami: ukierunkuj żel tak, by mózg był skierowany do obiektywu i umieść go w szklanym dnie z 1× PBS + DAPI (Rysunek 2B). Zidentyfikuj obszary zainteresowania opisane w mikroskopii konfokalnej z laserowym skanowaniem za pomocą oprogramowania cellSens.	60× obiektyw do zanurzenia w wodzie na długim dystansie roboczym (Olympus LUMFLN60XW LWD, 1,10 NA, 1,5 mm zasięgu roboczego); Kamera Hamamatsu ORCA-Fusion BT GenIII (2304 × 2304 piksele; 6,5 × 6,5 μm o rozmiarze piksela).	Wzbudzenie 488 nm przy 75% mocy, ekspozycji 200 ms; Wzbudzenie 640 nm przy 100% mocy, ekspozycja 800 ms. Emisja: 500–550 nm i 665–705 nm.
			(Rysunek 2C, po prawej)

Tabela 1: Reprezentatywne montaż, lokalizacja próbek i parametry obrazowania na platformach mikroskopowych. Podsumowanie strategii montażu próbek, podejść do lokalizacji, celów oraz parametrów akwizycji stosowanych na platformach mikroskopii świetlnej i konfokalnej.

7. Analiza ilościowa ekspresji RNA i białek

UWAGA: Wybierz workflow analizy na podstawie celu eksperymentalnego. Porównanie tych podejść przedstawiono w Tabeli Uzupełniającej 1.

1. Kwantyfikacja transkrypcji na skalę populacji z użyciem FlySeg.
   UWAGA: Analiza opiera się na zaktualizowanej wersji pipeline'u FlySeg^{29Schematyczny} przegląd workflow analizy przedstawiono na Rysunku 3A–B
   1. Zainstaluj FlySeg, pakiet oparty na Pythonie, tworząc środowisko Conda, używając:
      conda env create -f environment.yml
   2. Aktywuj środowisko przed analizą, używając:
      conda activate flyseg
   3. Rozpocznij analizę od:
      Python main.py --plik <input_file>
      Używaj obsługiwanych formatów wejściowych, w tym plików CZI lub NPY.
   4. Dostosowuj analizę, korzystając z opcjonalnych argumentów w razie potrzeby, w tym:
      Liczba kanałów (--kanałów)
      Kanał jąder (--nuclei_ch lub --nuclei_wavelength)
      Kanał cytoplazmowy (--cytoplasm_ch lub --cytoplasm_wavelength)
      Parametry detekcji jąder (--nuclei_sigma_range, --nuclei_threshold)
      Współczynnik dylatacji jądrowej (--nuclei_dilation)
      Progi wykrywania FISH (--fish_threshold_range)
      Katalog wyjściowy (--output_dir)
      Wizualizacja za pomocą Napari (--wizualizuj)
   5. Wyświetlaj wszystkie dostępne opcje za pomocą:
      Python main.py – pomoc
   6. Inspekcja metadanych obrazów używając:
      Python main.py --metadata_only.
      Potwierdź rozmiar woksela, liczbę kanałów i tożsamość kanału.
   7. Przeprowadź analizę, używając parametrów odpowiednio dostosowanych do zestawu danych. Zazwyczaj określa się łączną liczbę kanałów, kanał jąderowy, kanał cytoplazmowy (jeśli jest dostępny) oraz współczynnik dylatacji jądrowej.
      UWAGA: Ustaw wartość --nuclei_dilation odpowiednią dla pożądanej granicy jądrowo-cytoplazmatycznej. Zobacz Rysunek 3C–D jako przykład.
   8. Monitoruj dziennik przetwarzania. Wszystkie wyjścia są zapisywane w folderze nazwanym od pliku wejściowego.
   9. Zidentyfikuj główne wyniki analizy dalszej, w tym:
      1. -Nuclei-df.csv
         zawiera pomiary cech poszczególnych jąder oraz powiązane punkty liczenia dla każdego kanału FISH oraz dostarcza danych ilościowych do analizy statystycznej.
      2. -Nuclei-equivalent-diameter-area-scatter.png
         Który jest wykresem rozrzutowym używanym do identyfikacji segmentacyjnych odstających na podstawie rozmiaru i intensywności jądra; wykluczyć jądra oznaczone jako odstające, z dalszej analizy.
   10. Do zaawansowanego postprocessingu w razie potrzeby używaj dodatkowych wyjść pośrednich (np. masek segmentacji, tabel detekcji punktów oraz połączonych plików podsumowań FISH).
2. Liczenie transkryptów w indywidualnie rozpoznawalnych komórkach za pomocą Imaris
   1. Za pomocą narzędzia Surfaces segmentuj interesujący neuron na podstawie kanału markerowego cytoplazmatycznego lub błonowego.
   2. Dostosuj parametry wygładzania powierzchni i progu intensywności, aby zapewnić, że powstała powierzchnia dokładnie obejmuje somę, wykluczając sąsiednie struktury.
   3. Za pomocą narzędzia Spots detect zidentyfikuj transcript puncta w kanale FISH. Ustaw szacowaną średnicę plamki i próg intensywności na podstawie wielkości punktu i intensywności sygnału (np. 0,25 μM dla 2x rozszerzania tkanek).
   4. Ogranicz wykrywanie punktów do wcześniej wygenerowanej powierzchni, aby liczyć tylko punkty wewnątrz neuronu.
   5. Wyodrębnij łączną liczbę wykrytych plam na powierzchni neuronu za pomocą panelu Statystyki.
   6. Eksportuj liczby punktowe i powiązane pomiary do analizy dalszej.
3. Ilościowa fluorescencja oparta na ROI za pomocą FIJI/ImageJ
   1. Otwieraj stosy obrazów w FIJI i generuj projekcje maksymalnej intensywności za pomocą stosów Image > > Z Project > Maximum Intensity Projection. Używaj identycznych ustawień projekcji dla wszystkich próbek w eksperymencie.
   2. Zidentyfikuj interesującą mnie strukturę neuronalną za pomocą kanału markera anatomicznego (np. membranowego lub cytoplazmatycznego GFP). Za pomocą narzędzia Freehand lub Polygon Selection ręcznie określ zwrot z inwestycji odpowiadający strukturze (np. dendryt z olbrzymiego włókna).
   3. Przełącz się na kanał białkowy i zmierz intensywność fluorescencji w określonym ROI, używając Analyze > Measure. Zapisz następujące parametry: średnia intensywność fluorescencji; Zintegrowana gęstość; Obszar zwrotu z inwestycji.
   4. Mierz intensywność fluorescencji w pobliskim tłem ROI o podobnej wielkości, który nie emituje specyficznego sygnału i znajduje się poza oznakowaną strukturą neuronalną. Stosuj tę samą strategię ROI tła dla wszystkich próbek w eksperymencie i odejmij wartość tła od pomiaru ROI.
   5. Do porównania ilościowego między genotypami lub warunkami eksperymentalnymi używaj korekcji korekcji tła lub wartości gęstości średniej intensywności. Upewnij się, że dla wszystkich porównywanych próbek są używane identyczne ustawienia obrazowania.

Wyniki

Aby zweryfikować proces HCR-smFISH i immunohistochemii wspomagany ekspansją w kontekście biologicznie istotnym, skupiliśmy się na nadwidywającym obwodzie ucieczkowym układu wzrokowego Drosophila. Ten obwód składa się z genetycznie zdefiniowanych neuronów projekcji wzrokowej LC4^30,31, które wykrywają nadciągające bodźce, oraz dobrze scharakteryzowanych neuronów zstępujących z Wielkiego Włókna (GF), które napędzają szybkie starty^32,33, zapewniając anatomicznie stereotypowy system do specyficznych dla typu komórek pomiarów molekularnych w nienaruszonych mózgach.

Białko złącza szczelinowego Drosophila o Shaking-B (ShakB)³⁴ zostało powiązane z transmisją elektryczną w wielu komponentach obwodu GF, w tym synapsach aksonalnych³⁵ oraz bodźcach słuchowych³⁵. Chociaż bezpośrednie dowody na sprzężenie elektryczne w dendrytach GF podczas wykrywania przewijania są ograniczone, najnowsze badania wskazują, że neurony LC4 wykazują wysokie poziomy shakB³⁶. Obserwacje te skłoniły do zastosowania strategii knockdown i tagowania shakB jako przypadku testowego do oceny, czy protokół może ilościowo oceniać ukierunkowane perturbacje molekularne zarówno na poziomie RNA, jak i białka w genetycznie zdefiniowanych typach neuronów.

Najpierw oceniliśmy skuteczność redukcji shakB w GF i LC4, stosując HCR-smFISH w połączeniu z barwieniem przeciwciał ShakB. GF, pojedynczy neuron na półmózg, został oznaczony markerem błonowym (Rysunek 4A). LC4, populacja około 60 neuronów na półmózg, została oznaczona markerem jądrowym, aby umożliwić ilościowe określenie na poziomie populacji (Rysunek 4B). W mózgach kontrolnych transkrypty shakB były wyraźnie wykrywane zarówno w neuronach GF, jak i LC4. Ekspresja RNAi shakB skutkowała istotnym zmniejszeniem punktów mRNA shakB w neuronach docelowych obu typów komórek (Rysunek 4C–D). Zgodnie z cytoplazmatycznym miejscem interferencji RNA, wyczerpanie transkryptów było najbardziej widoczne w przedziale cytoplazmatycznym. Rozdzielenie jądrowych i cytoplazmatycznych punktów za pomocą ilościowości opartej na FlySeg wykazało selektywną redukcję cytoplazmatycznych transkryptów shakB w populacji LC4, podczas gdy jądrowe punkty były istotnie mniej dotknięte (Rysunek 4D, odpowiednio 69% vs 22% redukcji).

Stwierdziliśmy, że barwienie przeciwciał ShakB lokalizuje się w miejscach, gdzie dendryty GF nakładają się na aksony gigantycznych międzyneuronów komisjowych (GCI), które łączą oba włókna olbrzymie i umożliwiają przeciwległe odpowiedzi wzrokowe³⁷ (rysunek 4E). Obserwacje te są zgodne z wcześniejszymi badaniami³⁵ wykazującymi zależne od ShakB sprzężenie elektryczne między GF a GCI. Zaobserwowano również barwienie przeciwciał ShakB w miejscach, gdzie aksony LC4 stykają się z dendrytami GF, choć lokalizacja w tym rejonie była mniej wyraźna. Niezależnie od dokładnej lokalizacji podkomórkowej, sygnał przeciwciał ShakB związany z regionem dendrytycznym GF był wyraźnie zredukowany po ekspresji RNAi (Rysunek 4F).

Jednak detekcja oparta na przeciwciałach nie pozwala jednoznacznie przypisać białka ShakB do presynaptycznych zakończeń LC4 w porównaniu do postsynaptycznych dendrytów GF w miejscach kontaktu. Ponadto powszechna ekspresja shakB w całym układzie wzrokowym^34,36 ogranicza kwantyfikację specyficzną dla typu komórki w neuronach LC4 za pomocą immunobarwienia przeciw ShakB. Aby przezwyciężyć te ograniczenia i bezpośrednio ocenić lokalizację ShakB specyficzną dla typu komórki, zastosowaliśmy endogennie oznaczony allel ShakB, który wcześniej wygenerowaliśmy ^36,38. Umożliwiło to selektywną wizualizację białka ShakB, szczególnie w neuronach LC4. ShakB oznaczony SmGdP-10×V5 został wzbogacony zarówno w dendrytach (odpowiadających obszarom wejściowym z neuronów wzrokowych powyżej), jak i w terminalach aksonowych kontaktujących się z dendrytami GF (Rysunek 4G). Ekspresja RNAi shakB skutkowała niemal całkowitym zaginięciem sygnału V5 zarówno w przedziałach dendrytycznych, jak i aksonalnych (rysunek 4H). Wyniki te pokazują, że protokół umożliwia specyficzne dla typu komórki i podkomórkowe rozwiązanie endogennej lokalizacji białek w gęsto unerwionym neuropilu.

Jako dodatkową kontrolę jakościową testowaliśmy nierozszerzony FISH w połączeniu z immunohistochemią w zidentyfikowanych populacjach neuronalnych (Rysunek Uzupełniający 1). Sygnał FISH z grd nakładał się na LC22 somata, co jest zgodne z przewidywaną ekspresją z danych scRNA-seq z płata wzrokowego (Ilustracja uzupełniająca 1A–C)¹³. W neuronach Tm3 ekspresujących tdTomato, mRNA tdTomato nakładało się na białko tdTomatoes, podczas gdy mRNA VGlut1 nie nakładało się na tm3 somata, co jest zgodne z tożsamością cholinergiczną neuronów Tm3 (Ilustracja uzupełniająca 1)¹³. Te przykłady pokazują, że nierozszerzone FISH + IHC wystarczą do jakościowej oceny obecności/nieobecności, podczas gdy rozszerzenie jest konieczne do wiarygodnej ilościowej analizy pojedynczej punkty.

Pomyślna implementacja tego protokołu jest widoczna przez wyraźne, specyficzne dla typu komórki znakowanie, dyskretne punkty smFISH o niskim poziomie tła, niezawodną segmentację poszczególnych jąder lub ręcznie zdefiniowanych objętości komórek oraz konsekwentne redukcje docelowego RNA lub sygnału białka po zaburzeniu. Wyniki negatywne lub niskosygnałowe również powinny być interpretowalne: na przykład RNAi shakB produkowało zmniejszoną ilość mRNA shakB i sygnał białka ShakB, podczas gdy nierozwinięte FISH wykazało brak sygnału VGlut1 w somata Tm3 pomimo wyraźnego wykrycia mRNA tdTomato w porównaniu z wykryciem mRNA tdTomat. Wyniki suboptymalne obejmują słabe przeciwciała lub sygnał smFISH, wysokie punkty tła, niepełną segmentację, błędne przypisanie punktów lub dryf próbki podczas obrazowania, co może wpływać na dalszą ilościowość.

Rysunek 2. Montaż i obrazowanie rozszerzały próbki przy użyciu platform do mikroskopii świetlnej i konfokalnej. (A) Wizualizacja i przycinanie rozszerzonych hydrożeli (1–2), wspólne dla wszystkich platform obrazowania, a następnie montaż do mikroskopii arkuszowej (3–4; Zeiss Lightsheet 7). (B) Fotografia rozszerzonej próbki zamontowanej na odwróconym laserowym mikroskopie konfokalnym (Nikon Ti2-E AXR). (C) Reprezentatywne pojedyncze przekroje optyczne (pojedyncze płaszczyzny Z) próbki rozszerzonego układu wzrokowego Drosophila (neurony LC4 oznaczone fluorescencyjnym markerem jądrowym) zbadane pod kątem mRNA shakB (patrz Rysunek 4), pobranych na trzech platformach obrazowania. Pręty skalowe, 10 μm (tkanka poekspanscyjna). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3. Analiza ilościowa smFISH puncta z użyciem FlySeg. (A) Schematyczny przegląd workflow analizy FlySeg dla automatycznej segmentacji i kwantyfikacji punktów w zidentyfikowanych komórkach. (B) Trójwymiarowa mozaika Voronoi ilustrująca logikę segmentacji rdzenia FlySeg. Objętość obrazowania jest podzielona na domeny przestrzenne (każda pokazana w innym kolorze), przy czym każda partycja jest ograniczona do zawierania co najwyżej jednego jądra, co zapewnia przypisanie pojedynczej komórki. W obrębie każdej domeny Voronoi jądro jest segmentowane za pomocą funkcjonalnej procedury optymalizacji, która określa optymalną powierzchnię jądra na podstawie wartości intensywności cytoplazmatycznej zarówno jądrowej, jak i otaczającej. (C) Demonstracja --nuclei_dilation opcji rozróżniania transkryptów jądrowych i cytoplazmatycznych Pojedyncza optyczna przekrój ukazujący jądro znakowane GFP otoczone punktami smFISH, z rozproszonym sygnałem DAPI wyznaczającym przedział cytoplazmatyczny po obróbce DNazą. Linie wskazują 0 i 0,5 współczynnika dylatacji, odpowiadające odpowiednio objętościom jądrowym i cytoplazmatycznym. (D) Projekcja maksymalnej intensywności (C), ilustrująca, że punkty lokalizują zarówno przedziały jądrowe, jak i cytoplazmatyczne. Pręty skalowe, 10 μm (tkanka poekspanscyjna). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4. Walidacja ilościowego przepływu pracy z wykorzystaniem RNAi-mediantowanych perturbacji molekularnych (A) projekcji świetlnych (10 μm grubości, nie obejmujące całej objętości komórki) somy Giant Fiber (GF) oznaczonej markerem błonowym i zbadanej pod kątem mRNA shakB w warunkach kontrolnych (górne) oraz shakB RNAi (dolne). Przerywane zielone kontury wskazują na granice soma, aby podkreślić wyczerpanie cytoplazmatycznej, ale nie jądrowej puli mRNA. n, mózgi (jedna strona na zwierzę). (B) tak samo jak (A) dla neuronów LC4 oznaczonych markerem jądrowym. (C) Ilościowa ilościowa liczba punktów shakB FISH w neuronach GF (połączone baseny jądrowe i cytoplazmatyczne) w warunkach kontrolowanych i shakB RNAi. Kropki symbolizują pojedyncze neurony (jeden neuron na mózg, jeden bok na zwierzę). (D) Tak samo jak (C) dla neuronów LC4. Kropki symbolizują pojedyncze mózgi (jedna strona na zwierzę; liczba punktów na komórkę uśredniona na mózg). (E) Projekcje konfokalne dendrytów GF oznaczone markerem błonowym i barwione na ShakB w warunkach kontrolnych (górne) i shakB RNAi (dolne). (F) Ilościowe określenie poziomów białek ShakB w dendrytach GF mierzone jako średnia intensywność fluorescencji pod kontrolą oraz warunki RNAi GF>shakB . n, mózgi (jedna strona na zwierzę). (G) Projekcje konfokalne neuronów LC4 oznaczonych markerem błonowym i wyrażających ShakB oznaczonego smGdP-10xV5 w warunkach kontrolnych (góra) oraz shakB RNAi (na dole). Przerywane zielone kontury wskazują obszary dendrytów LC4 i zakończenia aksonów, na których oceniano gęstość ShakB-V5 (H) Ilościowa identyfikacja poziomów białek ShakB-smGdP-V5 w dendrytach LC4 i zakończeniach aksonów mierzona jako średnia intensywność fluorescencji pod kontrolą oraz warunki LC4 > shakB RNAi. n, mózgi (jedna strona na zwierzę). Paski błędu wskazują średnią ± SEM. Wszystkie porównania statystyczne przeprowadzono za pomocą dwustronnych testów Welcha t. Paski skalowe, 10 μm na wszystkich obrazach (tkanka po ekspansji). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Dyskusja

Protokół ten łączy wspomaganą ekspansją HCR-smFISH, immunohistochemię przedekspansyjną oraz kwantyfikację transkrypcji opartą na segmentacji, umożliwiając dopasowanie pomiarów RNA i białek w tych samych genetycznie zdefiniowanych neuronach. Integrując te komponenty w jeden sposób pracy, metoda ta powinna ułatwić ilościową, specyficzną dla typu komórki analizę molekularną w nienaruszonym mózgu Drosophila .

Kilka praktycznych modyfikacji wprowadzonych tutaj stanowi kluczowe kroki łączące immunohistochemię z ekspansyjnym wspomaganym HCR-smFISH w mózgu Drosophila ²⁴. Po pierwsze, immunohistochemia powinna być przeprowadzona przed rozszerzeniem tkanek i smFISH. Ponieważ protokół obejmuje etap trawienia proteinazy K, wykonanie immunohistochemii po ekspansji może obniżyć integralność epitopu. Co istotne, inkubacja przeciwciał przedekspansyjnych (24 godziny pierwotne + 24 godziny wtórne) nie zmniejsza zauważalnie intensywności sygnału RNA, gdy stosuje się technikę oczyszczania RNazy i kotwiczenia kowalencyjnego RNA. Po drugie, stężenia przeciwciał pierwotnych i wtórnych powinny być zwiększone, zazwyczaj o 2–3× względem standardowego IHC w pełnym mocowaniu, aby zrekompensować utratę sygnału związaną z trawieniem i ekspansją tkanek proteinazy K. Po trzecie, warunki wiązania są ważne dla zachowania zarówno sygnału białkowego, jak i RNA. Bezkwasowe fiksowanie glioksalu zwiększa zachowanie lokalizacji synaptycznych białek punctatowych, utrzymuje integralność strukturalną procesów neuronalnych i nie utrudnia ilościowej detekcji mRNA puncta. Zaobserwowaliśmy również, że jednoczesne kotwiczenie RNA i białka jest zgodne zarówno z detekcją HCR-smFISH, jak i immunofluorescencji. Razem te korekty poprawiają kompatybilność między immunohistochemią a wykrywaniem transkrypcji wspomaganym ekspansją.

Rozszerzenie dodaje jeden etap z dnia na dzień i nie jest technicznie skomplikowane, ale jego zastosowanie zależy od celu eksperymentalnego. Jak pokazano na Rysunku Uzupełniającym 1, nierozszerzony FISH w połączeniu z immunohistochemią wystarcza do oceny, czy gen jest ekspresjony w danym typie komórki, natomiast ekspansja jest wymagana, gdy pojedyncze sumy są potrzebne niezawodnie rozdzielcze, przypisane do poszczególnych somat i ilościowe analizy, ze względu na znaczny wzrost efektywnej rozdzielczości przestrzennej. Podobnie, wielowarstwowe płytki typu Terasaki nie są ściśle wymagane, ale ograniczają zużycie odczynników, umożliwiają jednoczesne przetwarzanie wielu warunków oraz pomagają utrzymać tożsamość próbki w małych partiach; Standardowe rurki mikrowirówkowe mogą być również stosowane, gdy objętość odczynnika jest mniej ograniczająca. Chociaż mikroskopia świetlna umożliwia szybkie obrazowanie objętościowe rozwinięcia tkanek, wykazujemy, że standardowe odwrócone systemy laserowego skanowania i obracającego się dysku konfokalnego wystarczają do pełnego obrazowania wybranych populacji neuronalnych w rozszerzonym mózgu Drosophila . Częstym ograniczeniem mikroskopii konfokalnej jest krótka odległość robocza. Jednak ponieważ mózg muchy jest mały, a próbki są powiększone o około 2× w PBS, obiektywy do zanurzenia w wodzie na dużym dystansie zapewniają odpowiednią głębokość penetracji. Do porównań ilościowych ustawienia akwizycji powinny być identyczne dla wszystkich próbek, unikać pikseli nasyconych, a rozmiar woksela powinien być wystarczający do rozróżnienia poszczególnych punktów smFISH. To rozszerza dostępność protokołu do laboratoriów bez dedykowanego oświetleniowego aparatury świetlnej.

Zaktualizowana implementacja FlySeg opiera się na wcześniej opublikowanym frameworku FlySeg i wprowadza dwa główne dodatki do tego protokołu. Po pierwsze, konfigurowalny parametr dylatacji jądrowej pozwala sklasyfikować smFISH puncta jako jądrowe lub cytoplazmatyczne na podstawie ich przestrzennego związku z segmentowanymi jądrami. Cytoplazmatyczne barwienie DAPI po leczeniu DNazą jest ważne w tym etapie, ponieważ zapewnia rozproszony sygnał wyznaczający ciało komórkowe i wspiera niezawodną segmentację jądrową, wspierając rozdzielenie puli transkryptów jądrowych i cytoplazmatycznych. Po drugie, automatyczne wykrywanie wartości odstających identyfikuje słabo segmentowane jądra, które można wykluczyć z dalszej ilościowości. Poza oceną molekularnych skutków specyficznego dla typu komórki knockdownu, rozdzielenie transkryptów jądrowych i cytoplazmatycznych może być poinformujące, gdy lokalizacja transkryptu odzwierciedla trwającą aktywność transkrypcyjną. W mózgu ssaków natychmiastowe wczesne transkrypcje genów wywołane aktywnością pojawiają się najpierw w jądrze, a następnie kumulują się w cytoplazmie podczas przetwarzania i eksportu mRNA³⁹, zasada stosowana w analizie czasów aktywacji neuronów metodą catFISH⁴⁰ . Czy porównywalna dynamika transkrypcji występuje w mózgu Drosophila , nie jest obecnie znane, ale można to w zasadzie zbadać przy użyciu obecnego workflow. W innych eksperymentach z pościgiem za impulsem rozróżnienie jądrowych od cytoplazmatycznych punktów może dostarczyć informacji czasowych wykraczającej poza całkowitą liczbę transkrypcji. Jednocześnie workflow nie ogranicza się do segmentacji jądrowej i może być dostosowany do segmentacji komórek pełnej somy (czyli zdefiniowanej przez błonę). Obecny ilościowy workflow jest zoptymalizowany pod kątem somata neuronalnych; Chociaż regiony neuropilu można obrazować, ilościowe przypisanie mRNA puncta do poszczególnych aksonów lub dendrytów wymagałoby dodatkowych strategii segmentacji specyficznych dla przedziałów. FlySeg jest najbardziej przydatny do zautomatyzowanej, wysokoprzepustowej ilościowej ilościowej analizy w gęstych populacjach neuronalnych, gdzie wymagane są statystyki na poziomie populacji. Dla indywidualnie identyfikowalnych neuronów lub ręcznie definiowanych przedziałów bardziej odpowiednie mogą być inne narzędzia, takie jak Imaris czy FIJI/ImageJ. Podsumowanie tych strategii ilościowości, w tym ich główne zastosowania, zalety i ograniczenia, znajduje się w Tabeli Uzupełniającej 1.

Typowe punkty rozwiązywania problemów to słaby sygnał przeciwciał, wysokie tło smFISH, uszkodzenia żelu lub utrata próbki, dryf próbki podczas obrazowania oraz słaba segmentacja. Słaby sygnał przeciwciał często można poprawić poprzez dalsze zwiększenie stężenia przeciwciał lub wydłużenie inkubacji pierwotnych i/lub wtórnych przeciwciał z 24 do 48 godzin. Wysokie tło smFISH często można zmniejszyć poprzez wydłużenie płukań po hybrydyzacji i unikanie ustawień nasyconego pozyskiwania. Uszkodzenia żelowe i utrata próbek są minimalizowane przez stosowanie końcówek o szerokim przełącie, przycinanie żeli za pomocą prostych cięć oraz cięcie kanałów wentylacyjnych, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków podczas napełniania komory. Dryf próbki podczas obrazowania jest redukowany przez wyrównanie żeli zamontowanych na co najmniej 1 godzinę przed pozyskaniem; jeśli dryf się utrzymuje, równowaga może zostać wydłużona do 2 godzin lub dłużej. Słaba segmentacja może wynikać ze słabego cytoplazmatycznego barwienia DAPI lub niepełnego wyrównania próbki, co może zmniejszyć sygnał granic komórkowych lub powodować przesunięcia X-Y-Z podczas pozyskiwania; należy je sprawdzić przed dostosowaniem parametrów FlySeg. W tym protokole żele są utrzymywane w 1× PBS, co skutkuje około 2× izotropową ekspansją. Jeśli wymagana jest wyższa rozdzielczość przestrzenna, można osiągnąć większą ekspansję w rozcieńczonej wodzie PBS lub zdejonizowanej. Natomiast jeśli celem jest jedynie ocena obecności lub braku ekspresji w określonym typie komórek, nierozszerzony FISH w połączeniu z immunohistochemią może być wystarczający, co pokazano na Rysunku Uzupełniającym 1. Protokół pozostaje kompatybilny z iteracyjnymi przepływami pracy FISH. Sondy i spinki HCR można usunąć za pomocą zabiegu DNazy, co pozwala na kolejne rundy hybrydyzacji i amplifikacji w tym samym okazie. Przyszłe rozszerzenia techniczne mogą obejmować iteracyjne HCR-smFISH w wyższej pleksii, automatyczną rejestrację w cyklach obrazowania, ulepszoną segmentację całych komórek lub neuritów oraz bardziej ustandaryzowane pipeline'y analizy do porównywania sygnałów RNA i białek w różnych eksperymentach. Dalszy rozwój strategii segmentacji specyficznych dla przedziałów mógłby rozszerzyć analizę ilościową poza somata neuronalne na aksony i dendryty. Łącznie połączony odczyt RNA–białko, ilościowa definicja transkrypcji w przedziałach oraz kompatybilność ze standardowymi platformami obrazowaniami sprawiają, że ten workflow nadaje się do ukierunkowanych eksperymentów walidacyjnych na genetycznie zdefiniowanych neuronach nienaruszonego mózgu Drosophila .

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwór 10N wodorotlenku sodu	Fisher Scientific	Cat# SS255-1
Roztwór wodorotlenku sodu 1N	Fisher Scientific	Cat# SS266-1
20x buforu soli fizjologicznej i cytrynianu sodu,	Invitrogen	Cat# AM9763
4-Hydroksy-TEMPO	Sigma-Aldrich	Cat# 176141
5M roztworu chlorku sodu	Sigma-Aldrich	Cat# S5150
Akrylamid	Sigma-Aldrich	Cat# A9099
Kwasy akrylowe i bez śladu;	Sigma-Aldrich	Cat# 147230
Akryl-X, SE & nbsp;	Invitrogen	Cat# A20770
Adobe Illustrator	Adobe	Nie ma
Alexa Fluor 488 Kozi Anty-Kurczak (1:200)	Jackson ImmunoResearch Labs	Cat# 103-545-155, RRID:AB_2337390
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG1 (1:200)	Invitrogen	Cat# A-21124, RRID:AB_2535766
Alexa Fluor 568 IgG1 przeciw kozom (1:200)	Invitrogen	Cat# A-11011, RRID:AB_143157
Persiarczan amonu	Sigma-Aldrich	Cat# A3678
Bezwodny DMSO	Sigma-Aldrich	Cat# 900645-4X2ML
Klej UV-utwardzający klej bondic;	Bondic	Zestaw startowy Bondic
oprogramowanie cellSens do obrazowania v4.4.1	Ewidentna naukowość	Nie ma
Poliklonalny anty-GFP dla kurczaka (1:400)	Abcam	Cat# ab13970, RRID:AB_300798
Conda (menedżer środowiska)	Anaconda, Inc	Nie ma
Corning &hand; Szkiełka mikroskopowe z matowym mikroskopem;	Corning	Kat# 2948-75X25
Specjalnie zaprojektowany uchwyt na próbki LS7	Janelia Tech	ID 2021-021
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat# D9542
Jednorazowy skalpel sterylny ze stali nierdzewnej	MedPride	MPR-47101
Kwas etylendiaminetetraoctowy	Sigma-Aldrich	Cat# EDS-100G
Oprogramowanie do analizy obrazów Fiji (ImageJ) v2.14.0	Konsorcjum ImageJ	Nie ma
FlySeg (niestandardowy pipeline)	https://github.com/avaccari/DrosophilaFISH	Nie ma
Roztwór utrwalający GAF	Addax Biosciences	Cat# VI25
GenClone® 24-dołkowe płytki hodowli komórkowej, nieobrobione	Genesee Scientific	Katalog# 25-102
GMR-86D05-Gal4 (LC4)	Centrum Stockowe Bloomington	#41315
Dawca sąry koziej	Sigma-Aldrich	Cat# G6767
HCR&handel; Bufor wzmacniacza RNA-FISH(v3.0)	Instrumenty molekularne	Nie ma
HCR&handel; Wzmacniacze RNA-FISH (v3.0): AF546, JF669	Instrumenty molekularne	Nie ma
HCR&handel; Bufor hybrydyzacji sond RNA-FISH(v3.0)	Instrumenty molekularne	Nie ma
HCR&handel; Bufor płuczki sondy RNA-FISH(v3.0)	Instrumenty molekularne	Nie ma
HCR&handel; RNA-FISH(v3.0) Sonda ShakB	Instrumenty molekularne	Nie ma
Imaris 10.1	Oxford Instruments	Nie ma
IXPlore IX85 SpinSR Obrotowy Mikroskop Konfokalny	Ewidentna naukowość	Nie ma
LS7 Mikroskop Arkuszowy LS7 oraz	Carl Zeiss	Nie ma
Melphalan	Cayman Chemical	Katalog# 16665
MOPS Buffer	Fisher Scientific	Cat# BP308-100
Myszy monoklonalny anty-V5 (SV5-Pk1) (1:100)	Abcam	Cat# ab27671, RRID:AB_471093
N,N,N',N'-Tetrametyloetylodiamina	Sigma-Aldrich	Cat# T7024
N,N'-metylenobisakryloamid	Sigma-Aldrich	Cat# M7279
Napari	Społeczność open-source	Nie ma
Zaawansowane oprogramowanie do obrazowania NIS-Elements Advanced Research	Nikon Corporation	Nie ma
Woda wolna od nukleazy	Qiagen	Cat# 129114
Nunc™ MiniTace z Nunclon™ Delta surface	Invitrogen	Cat# 163118
PBS (10X), pH 7,4	Gibco	Cat# 70011044
detergent Photo-Flo	Nauki o mikroskopii elektronowej	Katalog# 74257
Roztwór poli-L-Lizyny	Ted Pella	Cat# 18026
Okulary Precision Cover, grubość #1,5H	Thorlabs	Cat# CG15CH2
Press-to-Seal™ Izolator silikonowy z klejem, jedna jamka, średnica 20 mm, głębokość 0,5 mm	Invitrogen	Cat# P24740
Proteinaza K	Nowa Anglia  Biolabs	Cat# P8107S
Rabbit Anti-ShakB (1:400)	Prezent od Geord'a Ammera	Nie ma
RNase AWAY™ Powierzchniowy środek dekontaminujący	Invitrogen	Cat# 7002
Zestaw DNazy wolny od RNazy	Qiagen	Katalog# 79256
Schneider' s Drosophila Medium	Gibco	Cat# 21720001
shakB-KDRT-stop-KDRT-smGdP-V5;;	Frighetto i in., 2025	PMID: 41278920
Azyd sodu	Sigma-Aldrich	Cat# S8032
Stereomikroskop Stemi 508	Carl Zeiss	Nie ma
SYTO&handel; 41 Niebieskie fluorescencyjne barwienie kwasu nukleinowego	Invitrogen	Cat# S11352
Ti2E AXR NSPARC Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny	Nikon Corporation	Nie ma
Tris Base	Fisher Scientific	Cat# BP152-500
Triton &handel; X-100	Sigma-Aldrich	Cat# T8787
UAS-GFP-2A-KDR;	Sanfilippo i in. 2024	PMID: 38262414
UAS-his2A-GFP;	Dombrovski i in., 2025	PMID: 40468081
UAS-mCherry RNAi	Centrum Stockowe Bloomington	#35785
UAS-myr::GFP;	Centrum Stockowe Bloomington	#32198
UAS-shakB RNAI	Ammer i in., 2022	PMID: 35385694
UltraPure™ 1M Tris-HCI, pH 8,0	Invitrogen	Cat# 15568025
VT042336-Gal4 (Gigant Fiber)	Dombrovski i in., 2025	PMID: 40468081
Zen Black 3.1	Carl Zeiss	Nie ma