Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zintegrowane podejścia do uczenia maszynowego w celu zbadania roli genów związanych z glikozylacją w idiopatycznej sklerodermii płuc

177 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71408

⸱

31 lipca 2026

 ,  ,  , 
1Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Jinan University, 2Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Badanie to wykorzystało zintegrowaną analizę transkryptomu, uczenie maszynowe (LASSO, SVM-RFE i XGBoost), analizę infiltracji immunologicznej, dokowanie molekularne i walidację RT-qPCR w celu zidentyfikowania genów związanych z glikozylacją, powiązanych z idiopatyczną zwłóknieniem płuc. Zidentyfikowano dziesięć kandydackich genów diagnostycznych i opracowano oraz zweryfikowano model diagnostyczny o wysokiej wydajności w zbiorach danych tkanki płucnej.

Streszczenie

Idiopatyczna fibroza płuc (IPF) to postępująca przewlekła choroba płuc o niejasnej etiologii, a wkład genów związanych z glikozylacją (GRG) w jej patogenezę pozostaje słabo poznany. Niniejsze badanie koncentruje się na wyjaśnieniu potencjalnych mechanizmów GRG w IPF, identyfikacji kluczowych biomarkerów oraz opracowaniu modelu diagnostycznego z wykorzystaniem bioinformatyki i uczenia maszynowego. Dane transkryptomowe z bazy GEO zostały zintegrowane z GRG w celu zbadania ich roli w IPF. Zidentyfikowano różnicowo ekspresowane geny (DEG) i poddano je analizie wzbogacenia funkcjonalnego oraz analizie interakcji białko-białko (PPI). Zastosowano przepływ pracy uczenia maszynowego łączący regresję LASSO, maszynę wektorów nośnych-rekurencyjną eliminację funkcji (SVM-RFE) oraz XGBoost w celu zidentyfikowania kluczowych genów i skonstruowania modelu diagnostycznego z wykorzystaniem zbioru danych do szkolenia GSE150910. Wynikająca wydajność modelu została następnie oceniona w czterech niezależnych zbiorach walidacyjnych. Przeprowadzono dodatkowe analizy, w tym analizę wzbogacenia zestawów genów (GSEA), analizę infiltracji immunologicznej, analizę interakcji leki-gen, dokowanie molekularne oraz walidację RT-qPCR przy użyciu próbek krwi obwodowej od pacjentów z IPF i zdrowych kontroli, w celu zbadania biologicznego znaczenia zidentyfikowanych genów. Zidentyfikowano łącznie 126 genów DEG związanych z glikozylacją, a wybrano 10 kluczowych genów. Model diagnostyczny osiągnął wartości AUC wynoszące 0,963 i 0,814 dla zbiorów danych dotyczących tkanki płucnej oraz 0,681 i 0,706 dla zbiorów danych krwi. Analiza infiltracji immunologicznej wykazała różnice w obfitości limfocytów B między podgrupami pacjentów, a walidacja RT-qPCR potwierdziła różnicowe występowanie wybranych genów w próbkach klinicznych. Te wyniki dostarczają wglądu w potencjalne zaangażowanie GRG w IPF i potwierdzają ich znaczenie jako kandydatów do genów diagnostycznych.

Wprowadzenie

Idiopatyczne zwłóknienie płuc (IPF) jest progresywną, zwłókniającą chorobą międzypłucną charakteryzującą się heterogeniczną patogenezą, która obejmuje predyspozycje genetyczne, czynniki środowiskowe i dysfunkcję układu odpornościowego1,2. Choroba stanowi znaczące wyzwania kliniczne, głównie z powodu trudności w wczesnej diagnozie, ograniczonej skuteczności terapii i ogólnie złego rokowania. Częstość występowania IPF waha się od 20 do 80 pacjentów na 100 tysięcy, a bez leczenia mediana przeżycia po rozpoznaniu wynosi zazwyczaj 3–5 lat3,4. Identyfikowanie pacjentów o wyższym ryzyku szybkiego postępu choroby jest kluczowe dla skutecznych strategii leczenia, umożliwiające ukierunkowane terapie dla tych, którzy najbardziej prawdopodobnie doświadczą pogorszenia stanu zdrowia.

Glikozylacja, kotranslacyjna i posttranslacyjna modyfikacja białek, odgrywa kluczowa rolę w regulacji aktywności białek i biologii komórki5,6. Dysregulacja glikozylacji białek prawdopodobnie przyczynia się do postępu IPF7,8. W wielu chorobach reumatycznych obserwuje się zmiany w glikozylacji białek, które są ściśle związane z procesami zapalnymi i postępem choroby9. Na przykład Lyu i wsp. odkryli, że CRLF1 i GLG1 są kluczowymi graczami w patologicznych procesach osteoartrozy10. Co więcej, glikozylacja została związana z aktywacją komórek odpornościowych w tkankach płucnych, co dodatkowo łączy ją z patogenezą chorób płuc11. Biorąc to pod uwagę, dysregulacja glikozylacji białek może również przyczyniać się do postępu IPF. Jednakże rola genów związanych z glikozylacją (GRGs) w IPF pozostaje niedostatecznie zbadana, a ich potencjał w diagnostyce IPF wymaga dalszych badań.

Przeprowadziliśmy tutaj badanie integrujące podejścia uczenia maszynowego i dane sekwencjonowania RNA, aby zidentyfikować kluczowe GRGs związane z IPF. Poprzednie badania nad IPF często opierały się na konwencjonalnych analizach różnicowej ekspresji lub pojedynczym algorytmie uczenia maszynowego, co może ograniczać wytrzymałość i ogólność kandydatów na biomarkery12,13. Aby przeciwdziałać tym ograniczeniom, zastosowaliśmy wieloetapowy przepływ obliczeniowy, który łączył analizę różnicowej ekspresji z wieloma algorytmami uczenia maszynowego, w tym LASSO, SVM-RFE i XGBoost, aby poprawić niezawodność selekcji cech. Ponadto model diagnostyczny został ewaluowany na wielu niezależnych zestawach danych, a kluczowe wyniki zostały dodatkowo zweryfikowane za pomocą próbek klinicznych. Następnie opracowano i zweryfikowano model diagnostyczny, a przeanalizowano cechy infiltracji immunologicznej. Dodatkowo zbadano mikrośrodowisko immunologiczne oraz potencjalne interakcje molekularne związane z zidentyfikowanymi genami. Chociaż niniejsze badanie koncentrowało się na IPF, zastosowana tutaj strategia analityczna może być stosowana do innych przewlekłych chorób płuc i zbiorów danych transkryptomowych, zapewniając reproduktywalny szkic do identyfikacji i walidacji kluczowych genów. Zobacz Rysunek 1 dla konkretnego procesu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Etyczną Pierwszego Szpitala Uniwersytetu Medycznego w Bengbu (Numer zgody: 2023YJS162). Pisemną, poinformowaną zgodę wszyscy uczestnicy wyrazili przed zebraniem próbek.

Zbieranie danych

Dane transkryptomu użyte w tym badaniu zostały uzyskane z bazy danych Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/; RRID: SCR_005012). Główny zestaw danych treningowych, GSE150910, został wygenerowany przy użyciu platformy Illumina NovaSeq 6000 (GPL24676) i obejmował 103 próbki tkanki płucnej IPF i 103 normalne próbki tkanki płucnej. Aby zweryfikować wyniki, zastosowano niezależne zestawy danych GSE24206, GSE110147, GSE93606 i GSE38958. Szczegółowe informacje na temat każdego zestawu danych są dostępne w Tabeli 1. Dodatkowo, łącznie 636 GRG zostało wybranych z wcześniej opublikowanego badania14.

Analiza różnicowej ekspresji i charakterystyka funkcjonalna glikozylacji-związanych DEG

Analiza różnicowej ekspresji między próbkami tkanki płucnej IPF i normalnej z zestawu danych GSE150910 została przeprowadzona za pomocą pakietu R DESeq2 (RRID: SCR_015687). Geny o wartości P-value (padj) < 0.05 i |log2FoldChange| > 0.5 zostały uznane za geny o zróżnicowanej ekspresji (DEG). Glikozylacja-związane DEG (GR-DEG) zostały zidentyfikowane przez przecięcie DEG z wstępnie zdefiniowanym zestawem 636 GRG. Aby dalsze zbadać biologiczne role tych genów, przeprowadzono analizę wzbogacenia Gene Ontology (GO) oraz analizę ścieżek Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), aby wyjaśnić ich funkcjonalne role i zaangażowanie w ścieżki. Sieć interakcji białko-białko (PPI) została wygenerowana przy użyciu bazy danych STRING (RRID: SCR_005223)15 z progiem pewności interakcji na poziomie > 0.7, aby wyjaśnić molekularne interakcje i potencjalne mechanizmy regulacyjne GR-DEG w IPF.

Ekranowanie kluczowych genów i budowa modelu diagnostycznego 

Aby ekranować kluczowe geny IPF z GR-DEG, zastosowaliśmy wiele algorytmów uczenia maszynowego. Początkowo, regresja LASSO (RRID: SCR_003418) została dopasowana do regresji logistycznej binarnej (family = “binomial”) i optymalny parametr kary λ został wybrany poprzez 10-krotną walidację krzyżową (nfold = 10). Ostateczne wyniki selekcji to funkcje z niezerowymi współczynnikami odpowiadającymi λ_(min) (0.01700442). W przypadku SVM-RFE zastosowano funkcję rfe z pakietu R caret. Rekurrencyjne usuwanie funkcji zostało przeprowadzone poprzez 10-krotną walidację krzyżową (method = “cv”, number = 10), stopniowo filtrowano funkcje od 1 do 126, przy czym do określenia optymalnego podzbioru funkcji używano dokładności. W XGBoost funkcja celu została ustalona na regresję logistyczną binarną (objective = “binary: logistic”), z metryką ewaluacyjną ustawioną na log loss (eval_metric = “logloss”), liczbą iteracji (nrounds) ustawioną na 100, a stałą uczenia (eta) ustawioną na 0.1. Top 20 genów zostało wybranych na podstawie ich wyników ważności funkcji (Gain). Przecinając wyniki z tych metod, zidentyfikowano rafinowany zestaw kluczowych genów. Na podstawie tego zestawu genów skonstruowano model diagnostyczny XGBoost za pomocą zestawu treningowego (GSE150910), a jego wydajność predykcyjną oceniono za pomocą analizy charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) na zewnętrznych zestawach walidacyjnych (GSE110147, GSE24206, GSE93606 i GSE38958). Dodatkowo, stworzono nomogram, aby wizualizować wkład każdego wybranego genu w prawdopodobieństwo choroby, a użyteczność kliniczna modelu została dodatkowo oszacowana za pomocą krzywych kalibracji i analizy krzywych decyzyjnych (DCA).

Eksplorowanie biologicznych ścieżek kluczowych genów

Aby zbadać biologiczny kontekst kluczowych genów zidentyfikowanych przez uczenie maszynowe. Analiza wzbogacenia zestawu genów (GSEA)16 została przeprowadzona na podstawie list genów z Molecular Signatures Database (MSigDB) (RRID: SCR_016863)17 i ścieżki były przesiewane na NES > 1. Najbardziej wzbogacone ścieżki zostały zwizualizowane za pomocą funkcji enrichplot.

Eksplorowanie funkcji biologicznej i różnic w otoczeniu immunologicznym w podtypach IPF na podstawie wyników kluczowych genów

Na podstawie profili ekspresji zidentyfikowanych kluczowych genów, obliczono wyniki pojedynczego zestawu genów (ssGSEA) i użyto ich do stratyfikacji pacjentów z IPF na grupy o wysokim i niskim wynikach na podstawie mediany. Analiza różnicowej ekspresji została przeprowadzona między dw

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analiza funkcjonalna i analiza sieci oddziaływań GR-DEG  

W celu zbadania udziału genów w IPF przeprowadzono analizę różnicowej ekspresji zbioru GSE150910, w wyniku której zidentyfikowano 4 216 DEG (Rysunek 2A). Poprzez przecięcie tych DEG z 636 GRG zidentyfikowano 126 genów glikozylacji związanych z chorobą. zidentyfikowano (Rysunek 2B). Ponadto, w celu oceny potencjalnych funkcji biologicz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

IPF to przewlekła, postępująca choroba o nieznanej etiologii, która znacząco obniża jakość życia pacjentów i prowadzi do wcześniejszej śmiertelności4. Pomimo postępów w strategiach terapeutycznych, mediana czasu przeżycia po postawieniu diagnozy pozostaje niska, a patogeneza IPF nadal nie jest w pełni zrozumiała22. Dlatego wyjaśnienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw IPF jest zarówno pilne, jak i kluczowe. Poprzednie badania wykazały związek między niekontrolowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zadeklarowania.

Podziękowania

Wysuwamy podziękowania wszystkim kolegom, którzy świadczyli pomoc i wsparcie w trakcie całego procesu badawczego. Ich współpraca i zachęty były nieocenione dla naszej pracy. Badania te nie otrzymały żadnego zewnętrznego finansowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CaretR Foundation for Statistical ComputingWersja 6.0.94SVM-RFE
ClusterProfilerR Foundation for Statistical ComputingWersja 4.12.6Analiza wzbogacania GSEA, GO i KEGG
DESeq2R Foundation for Statistical ComputingWersja 1.44.0Analiza różnicowej ekspresji
Fast First-Strand cDNA Synthesis MixGoonie Biotech Co., Ltd.500-101Synteza cDNA dla RT-qPCR
FastTaq qPCR SYBR Green Master MixGooniebio500-102Ilościowa amplifikacja PCR
Fluorescent Quantitative PCR SystemBio-Rad Laboratories, Inc.CFX96Ilościowa amplifikacja PCR
GEO DatabaseNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/Źródło danych transkryptomu
ggpubr R Foundation for Statistical ComputingWersja 0.6.0Generowanie wykresów pudełkowych
GSVAR Foundation for Statistical ComputingWersja 1.52.3ssGSEA
MSigDBBroad Institutehttps://www.gsea-msigdb.org/Analiza GSEA
PCR SystemBio-Rad Laboratories, Inc.PTC TempoSynteza cDNA dla RT-qPCR
PrimersTsingke Biotechnology Co., Ltd.N/AIndywidualna synteza primerów qPCR
R softwareR Foundation for Statistical ComputingWersja 4.4.1Analiza statystyczna i wizualizacja
RNA Isolater Total RNA Extraction ReagentVazyme Biotech Co., Ltd.R401-01Ekstrakcja całkowitego RNA z pełnej krwi
STRING DatabaseSTRING Consortiumhttps://string-db.org/Budowa sieci PPI
Synergy HTX Multi-Mode ReaderBioTek Instruments, Inc.Synergy HTXPomiar stężenia RNA

Bibliografia

  1. Koudstaal T, Wijsenbeek MS. Idiopathic pulmonary fibrosis. Presse Med. 2023;52(3):104166.
  2. Moss BJ, Ryter SW, Rosas IO. Pathogenic Mechanisms Underlying Idiopathic Pulmonary Fibrosis. Annu Rev Pathol. 2022;17:515-46.
  3. Bonella F, Spagnolo P, Ryerson C. Current and Future Treatment Landscape for Idiopathic Pulmonary Fibrosis. Drugs. 2023;83(17):1581-93.
  4. Spagnolo P, et al. Idiopathic pulmonary fibrosis: Disease mechanisms and drug development. Pharmacol Ther. 2021;222:107798.
  5. Schjoldager KT, Narimatsu Y, Joshi HJ, Clausen H. Global view of human protein glycosylation pathways and functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21(12):729-49.
  6. He M, Zhou X, Wang X. Glycosylation: mechanisms, biological functions and clinical implications. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):194.
  7. Xie X, Kong S, Cao W. Targeting protein glycosylation to regulate inflammation in the respiratory tract: novel diagnostic and therapeutic candidates for chronic respiratory diseases. Front Immunol. 2023;14:1168023.
  8. Shi X, et al. Secreted RCN3 acts as an early epithelial-fibroblast mediator via TGFβR1-Smad signaling in post-ALI pulmonary fibrosis. Cell Commun Signal. 2026;24(1).
  9. Kissel T, Toes REM, Huizinga TWJ, Wuhrer M. Glycobiology of rheumatic diseases. Nat Rev Rheumatol. 2023;19(1):28-43.
  10. Lyu Y, et al. Identification of proteins and N-glycosylation sites of knee cartilage in Kashin-Beck disease compared with osteoarthritis. Int J Biol Macromol. 2022;210:128-38.
  11. Komaromy A, Reider B, Jarvas G, Guttman A. Glycoprotein biomarkers and analysis in chronic obstructive pulmonary disease and lung cancer with special focus on serum immunoglobulin G. Clin Chim Acta. 2020;506:204-13.
  12. Ruan H, Ren C. Integrating machine learning with bioinformatics for predicting idiopathic pulmonary fibrosis prognosis: developing an individualized clinical prediction tool. Exp Biol Med (Maywood). 2024;249:10215.
  13. Wang L, et al. Serum Proteomics Identifies Biomarkers Associated With the Pathogenesis of Idiopathic Pulmonary Fibrosis. Mol Cell Proteomics. 2023;22(4):100524.
  14. Shi Y, et al. Glycosylation-related molecular subtypes and risk score of hepatocellular carcinoma: Novel insights to clinical decision-making. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:1090324.
  15. Szklarczyk D, et al. The STRING database in 2023: protein-protein association networks and functional enrichment analyses for any sequenced genome of interest. Nucleic Acids Res. 2023;51(D1):D638-d46.
  16. Yan S, et al. Identification of ITGAX and CCR1 as potential biomarkers of atherosclerosis via Gene Set Enrichment Analysis. J Int Med Res. 2022;50(3):3000605211039480.
  17. Wang T, He Q, Chan KHK. A Multi-omics approach to identify and validate shared genetic architecture in rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, and type 1 diabetes: integrating GWAS, GEO, MSigDB, and scRNA-seq data. Funct Integr Genomics. 2025;25(1):91.
  18. Lu Y, Lu D, Li C, Chen L. Exploring Immune Cell Infiltration and Small Molecule Compounds for Ulcerative Colitis Treatment. Genes (Basel). 2024;15(12).
  19. Guan M, Jiao Y, Zhou L. Immune Infiltration Analysis with the CIBERSORT Method in Lung Cancer. Dis Markers. 2022;2022:3186427.
  20. Roy D, Ramasamy R, Schmidt AM. Journey to a Receptor for Advanced Glycation End Products Connection in Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Infection: With Stops Along the Way in the Lung, Heart, Blood Vessels, and Adipose Tissue. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021;41(2):614-27.
  21. Li Z, Yang P, Feng B. Effect of atorvastatin on AGEs-induced injury of cerebral cortex via inhibiting NADPH oxidase -NF-κB pathway in ApoE(-/-) mice. Mol Biol Rep. 2020;47(12):9479-88.
  22. Liu GY, Budinger GRS, Dematte JE. Advances in the management of idiopathic pulmonary fibrosis and progressive pulmonary fibrosis. Bmj. 2022;377:e066354.
  23. Liao Y, et al. Integrating cellular experiments, single-cell sequencing, and machine learning to identify endoplasmic reticulum stress biomarkers in idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Med. 2024;56(1):2409352.
  24. Liu B, et al. A novel model for predicting prognosis in patients with idiopathic pulmonary fibrosis based on endoplasmic reticulum stress-related genes. Cell Biol Int. 2024;48(4):483-95.
  25. Zhu H, et al. Comprehensive analysis of an endoplasmic reticulum stress-related gene prediction model and immune infiltration in idiopathic pulmonary fibrosis. Front Immunol. 2023;14:1305025.
  26. Yeo HJ, et al. Development of a Novel Biomarker for the Progression of Idiopathic Pulmonary Fibrosis. Int J Mol Sci. 2024;25(1).
  27. Perkins TN, Oury TD. The perplexing role of RAGE in pulmonary fibrosis: causality or casualty? Ther Adv Respir Dis. 2021;15:17534666211016071.
  28. Dai J, et al. Construction of a lipid metabolism-related and immune-associated prognostic score for gastric cancer. BMC Medical Genomics. 2023;16(1):93.
  29. Li W, et al. An 11-gene glycosyltransferases-related model for the prognosis of patients with bladder urothelial carcinoma: development and validation based on TCGA and GEO datasets. Translational Andrology and Urology. 2024;13(12).
  30. Li SJ, et al. Identifying causal genes for migraine by integrating the proteome and transcriptome. J Headache Pain. 2023;24(1):111.
  31. Zhang W, et al. ANK2 as a novel predictive biomarker for immune checkpoint inhibitors and its correlation with antitumor immunity in lung adenocarcinoma. BMC Pulm Med. 2022;22(1):483.
  32. Burkhard T, et al. BS10 Characterising the degradome of the metalloprotease ADAMTS8: implications for pulmonary arterial hypertension. BMJ Publishing Group Ltd and British Cardiovascular Society; 2025.
  33. Lee HC, et al. The Therapeutic Potential of ADAMTS8 in Lung Adenocarcinoma without Targetable Therapy. J Pers Med. 2022;12(6).
  34. Bera T, Ghosh M, Ghosh SK. Elucidating the mycochemistry and anticancer efficacy of F5 fraction of ethanolic extract of Daldinia eschscholtzii. Scientific Reports. 2025;15(1):34953.
  35. Li F, et al. Construction and validation of a prognostic model for lung adenocarcinoma based on endoplasmic reticulum stress-related genes. Sci Rep. 2022;12(1):19857.
  36. Lin L, et al. Integrated profiling of endoplasmic reticulum stress-related DERL3 in the prognostic and immune features of lung adenocarcinoma. Front Immunol. 2022;13:906420.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

BiochemiaWydanie 233Wydanie 233Wartość pustaWydanieInfiltracja immunologiczna
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.