Farmakologia sieciowa i walidacja nakłucia dysku ogonowego szczura dekokcji Yi Qi Huo Xue w leczeniu zwyrodnienia dysku lędźwiowego

Podsumowanie

Badanie to wykorzystało farmakologię sieci, dokowanie molekularne oraz model nakłucia dysku ogonowego szczura do zbadania potencjalnych przedklinicznych efektów dekokcji Yi Qi Huo Xue na degenerację dysku lędźwiowego, ze szczególnym uwzględnieniem kandydatów na cele, w tym AKT1, BCL2 i STAT3, oraz szlakach takich jak sygnalizacja PI3K-AKT.

Streszczenie

W tym badaniu wykorzystano farmakologię sieci, dokowanie molekularne, symulację dynamiki molekularnej oraz walidację eksperymentalną do zbadania farmakologicznych podstaw i potencjalnych mechanizmów molekularnych dekokcji Yi Qi Huo Xue (YQHXD) w degeneracji dysku lędźwiowego (LDD). Zidentyfikowano łącznie 678 aktywnych celów związanych ze związkami YQHXD oraz 296 potencjalnych celów terapeutycznych związanych z LDD. Analiza sieci interakcji białko-białko oraz analiza topologiczna zidentyfikowały kilka kandydatów na cele, w tym AKT1, IL6, TNF, BCL2 i STAT3. Analizy wzbogacenia z wykorzystaniem Gene Ontology oraz Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes wykazały, że kandydaty na cele były powiązane z funkcjami takimi jak wiązanie białek i ATP, z wzbogaceniem szlaków obejmującym sygnalizację PI3K-AKT. Molekularne dokowanie przewidywało interakcje między wybranymi aktywnymi związkami, takimi jak kwercetyna, tetraneuryna A i izorhamnetyna, a celami rdzeniowymi. Symulacje dynamiki molekularnej sugerowały również, że kompleksy o najniższej energii pozostają stabilne. Siedemdziesięciu samców szczurów Sprague-Dawley zostało losowo przydzielonych do grup kontrolnych, fikcyjnych operowanych, modelowych, pozytywnych oraz niskich, średnich i wysokich dawk YQHXD. Po ustanowieniu modelu nakłucia międzykręgowego krążka ogonowego w grupach modelowej, pozytywnej kontroli i YQHXD, szczurom podawano YQHXD lub celekoksyb doustnie przez 8 tygodni, podczas gdy grupy kontrolne i operacje fikcyjne otrzymywały prawidłową sól fizjologiczną. Ocena histopatologiczna wykazała, że leczenie YQHXD wiązało się ze zmniejszoną degeneracją dysku międzykręgowego w tym modelu. Analizy immunosorbentów powiązanych z enzymami, reakcji łańcuchowej polimerazy oraz western blot wykazały zmiany w poziomach ekspresji mRNA i białek wybranych celów, w tym AKT1, BCL2 i STAT3. Wyniki te sugerują, że YQHXD może wywierać przedkliniczne efekty ochronne w LDD poprzez wieloskładnikową i wielocelową regulację związaną z mechanizmami zapalnymi i apoptozą. To badanie dostarcza wstępnych dowodów przedklinicznych wspierających dalsze badania YQHXD w leczeniu LDD.

Wprowadzenie

Zwyrodnienie krążka lędźwiowego (LDD) to powszechna choroba ortopedyczna związana z wiekiem, charakteryzująca się późnym początkiem, trudnością leczenia, częstym nawrotem oraz niepełnosprawnością. LDD wiąże się z degeneracyjnymi zmianami patologicznymi związanymi z zaburzeniem równowagi między katabolicznym a anabolicznym metabolizmem macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w dysku międzykręgowym (IVD) i jest ściśle powiązana z bólem dolnej części pleców (LBP)¹. Badania epidemiologiczne pokazują, że LBP jest jedną z głównych przyczyn niepełnosprawności w praktyce klinicznej².

W latach 1990–2017 liczba przypadków na świecie wzrosła z 42,5 miliona do 64,9 miliona³, co wpłynęło na codzienne życie i nałożyło na znaczne obciążenie społeczne oraz ekonomiczne. Dlatego skuteczne leczenie LDD pozostaje klinicznie istotne. W praktyce klinicznej LDD często leczone jest zachowawczym lub chirurgicznym leczeniem objawowym, które może łagodzić objawy, ale zazwyczaj nie odwraca zwyrodnienia dysku międzykręgowego (IVDD). Powszechnie stosowane doustne, niesteroidowe leki przeciwzapalne w leczeniu zachowawczym mogą również wiązać się z niepożądanymi skutkami nerkowymi, pokarmowymi i sercowo-naczyniowymi.

Tradycyjna medycyna chińska (TCM) od dawna jest stosowana w zarządzaniu chorobami⁴. Związki ziołowe i pojedyncze składniki zgłaszano, że opóźniają postęp IVDD i wspierają regenerację tkanek⁵. W praktyce klinicznej formuły TCM są również stosowane jako część zachowawczych strategii leczenia zwyrodnieniowych chorób kości i stawów. Szkoła medyczna rodziny Wu w rejonie Suzhou stosowała wywar Yi Qi Huo Xue (YQHXD) jako podstawową receptę na choroby IVD w oddziale lędźwiowym; jednak potrzebne są dalsze dowody mechanistyczne, aby wyjaśnić jego potencjalną rolę w LDD.

Wcześniejsze badania sugerowały, że YQHXD może opóźniać IVDD, promując autofagię komórkową i wywołując działanie przeciwstarzeniowe ^6,7. Jednak mechanizmy farmakologiczne wpływające na LDD pozostają niejasne, a systematyczna analiza jego działania wciąż pozostaje nieznana. W tym badaniu zastosowano farmakologię sieciową do analizy cech wieloskładnikowych i wielocelowych YQHXD w odniesieniu do LDD. Do oceny interakcji między związkami a białkami docelowymi zastosowano dokowanie molekularne, a następnie przeprowadzono symulacje dynamiki molekularnej. Te przewidywania zostały następnie ocenione za pomocą modelu nakłucia dysku ogonowego szczura, aby zbadać potencjalne mechanizmy YQHXD w LDD⁸. Jak pokazano na Rysunku 1, badanie to dostarcza dowodów przedklinicznych, że YQHXD może wpływać na procesy związane z LDD poprzez modulację genów i białek takich jak AKT1, BCL2 i STAT3, przy wzbogacaniu szlaków obejmującym sygnalizację PI3K-Akt oraz inne kategorie szlaków chorobowych.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Radę Przeglądową Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Nankinie (Kod protokołu: 202501A018) i przeprowadzono zgodnie z Przewodnikiem Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych. Wszystkie procedury eksperymentalne były zgodne z wytycznymi ARRIVE.

Leki eksperymentalne
Roztwór próbki YQHXD zawierał 20 g korzenia Astragalus membranaceus , 20 g korzenia Angelica sinensis , 15 g kłącza Ligusticum chuanxiong , 6 g korzenia Stephania tetrandra , 15 g owocu Chaenomeles speciosa oraz 10 g dojrzałych nasion Sinapis alba , o łącznej masie surowego leku 86 g na receptę. Wszystkie materiały ziołowe zostały potwierdzone zgodnie z Farmakopeją Chińską (wydanie z 2020 roku) przez Wydział Farmacji Szpitala Ruikang afiliowany przy Uniwersytet Medycyny Chińskiej w Guangxi. Roztwór próbki YQHXD został przygotowany metodą dekokcji wodnej. Dodano sterylną wodę destylowaną w 8 razy większej objętości surowego leku, a zioła moczono przez 30 minut, aż całkowicie zanurzono. Mieszanka była następnie gotowana i deokowana na niskim ogniu przez 30 minut przed filtracją. Pozostałości zostały ponownie wyekstrahowane tą samą objętością sterylnej wody destylowanej według tej samej procedury. Filtraty z obu ekstrakcji zostały połączone i skoncentrowane do 55,5 mL przy obniżonym ciśnieniu za pomocą odparowania rotacyjnego, aby uzyskać roztwór YQHXD. Na podstawie całkowitej masy surowego leku, końcowe stężenie surowego leku wynosiło 1,55 g/mL, z wydajnością ekstrakcji około 64,5%. Dawka podawana eksperymentalnym szczurom została przekształcona z klinicznej dawki dla dorosłych metodą normalizacji powierzchni ciała. Współczynnik konwersji między ludźmi a szczurami wynosił około 6,3; dlatego dawka szczurów (mg/kg) została obliczona jako dawka dla ludzi (mg/kg) × 6,3. Grupa przyjmująca wysokie dawki otrzymała 15,48 g/kg/dzień jako dawkę referencyjną, natomiast grupy średniej i niskiej dawki otrzymały odpowiednio 7,74 g/kg/dzień oraz 3,87 g/kg/dzień. Dla objętości gavage 10 mL/kg, odpowiadające stężenia robocze wynosiły odpowiednio 1,548, 0,774 i 0,387 g/mL dla grup wysokich, średnich i niskich. Roztwór zapasowy rozcieńczono odpowiednio, aby osiągnąć docelową dawkę dla każdej grupy eksperymentalnej przed podaniem. Po przygotowaniu wywary były chłodzone, alicytowane w warunkach sterylnych i przechowywane w temperaturze −40 °C do czasu użycia.

Analiza farmakologii sieciowej

Przewidywanie białek docelowych składników aktywnych
24 listopada 2025 roku aktywne związki zostały pobrane z bazy danych TCMSP za pomocą haseł "Huangqi, Angelica, Chuanxiong, Stephania, Mugua i Jiezi." Związki zostały przesiewane na podstawie biodostępności doustnej (OB ≥ 30%) oraz podobieństwa do leku (DL ≥ 0,18)⁹. Uzasadnienie tych progów jest następujące: baza danych TCMSP integruje dane złożone z autorytatywnych źródeł, takich jak PubChem, ChEMBL i ChemSpider, oraz dostarcza parametry związane z ADME, w tym biodostępność ustną. Biodostępność doustna odnosi się do proporcji dawki doustnej, która dociera do krążenia układowego bez zmian, a wysoki poziom OB jest niezbędny do identyfikacji bioaktywnych cząsteczek. Podobieństwo do leku to wskaźnik używany do oceny podatności na działanie substancji oraz do przewidywania ich rozpuszczalności i stabilności. W tym badaniu zastosowano bardziej rygorystyczny próg OB (≥30%), przekraczający zalecaną wartość bazy danych (≥20%), aby zidentyfikować związki kandydatów o korzystnym profilu wchłaniania doustnego i farmakokinetycznego. Tymczasem DL użyto do oszacowania potencjału lekowego związków, a próg DL ≥ 0,18 został przyjęty na podstawie średniej wartości DL obserwowanej w związkach medycyny chińskiej. Wybrane aktywne związki zostały pobrane w formacie SMILES z bazy danych PubChem i zaimportowane do bazy SwissTargetPrediction w celu przewidywania celów, z gatunkiem ustawionym na Homo sapiens. Białka docelowe zostały standaryzowane przy użyciu oficjalnych symboli genów, a zachowano tylko cele o wartościach prawdopodobieństwa większym niż 0, aby poprawić wiarygodność predykcji. Związki bez przewidywanych celów zostały wykluczone z późniejszej analizy sieci. Po połączeniu wszystkich celów duplikaty zostały usunięte za pomocą oprogramowania arkuszy kalkulacyjnych, aby zapewnić, że każdy cel jest reprezentowany tylko raz w końcowym zbiorze danych.

Zbiór kluczowych celów
Geny związane z chorobą zostały pobrane z baz danych GeneCards¹⁰,^{OMIM 11} i^{TTD 12} przy użyciu słowa kluczowego "degeneracja dysku lędźwiowego". Zebrane cele genów zostały połączone, a duplikaty wpisów usunięto, aby uzyskać ostateczny zestaw celów związanych z chorobą.

Potencjalne cele YQHXD w leczeniu LDD
Platforma Venny 2.1.0 została użyta do określenia potencjalnych celów YQHXD w LDD. Następnie wygenerowano sieć pokazującą powiązania między aktywnymi komponentami a ich przewidywanymi celami. Podstawowe aktywne komponenty były wybierane zgodnie z ich wartościami stopni w sieci.

Konstrukcja sieci komponentów leków i celów przecięcia chorób
Składniki aktywne, białka docelowe oraz geny powiązane z LDD z formuły TCM YQHXD zostały zaimportowane do oprogramowania Cytoscape¹³ , aby stworzyć diagram sieci komponent-lek-cel-choroba.

Budowa sieci PPI i identyfikacja kluczowych kluczowych celów
Przecinające się cele zostały przesłane do analizy na platformie^{STRING 14} , a organizm został ustawiony na Homo sapiens. Aby zbudować sieć interakcji białko-białko (PPI), próg wyniku interakcji został ustawiony na >0,4, odłączone węzły zostały ukryte, a wszystkie pozostałe ustawienia pozostawiono jako domyślne. Uzyskane dane zostały zaimportowane do oprogramowania, gdzie narzędzie NetworkAnalyzer służyło do oceny właściwości topologicznych i obliczania stopni węzłów. Pięć najważniejszych węzłów sklasyfikowanych według stopnia zostało wyznaczonych jako kluczowe cele hubów.

Analiza wzbogacania celów podstawowych
Cele przecinające się zostały przesłane do bazy danych DAVID¹⁵ do analiz funkcjonalnych annotacji funkcjonalnych z ontologii genów (GO) oraz analizy wzbogacania szlaków w Encyklopedii Genów i Genomów w Kioto (KEGG). Tło organizmu zostało ustalone jako Homo sapiens, a próg wzbogacenia zdefiniowany zgodnie z domyślnymi parametrami DAVID, w tym progiem EASE < 0,1 oraz progiem liczenia ≥ 2. Wszechświat genów opierał się na domyślnym tłem całego genomu dostarczonym przez DAVID. Wielokrotne testy zostały skorygowane metodą Benjamini-Hochberga w celu kontroli wskaźnika fałszywych odkryć (FDR), a wyniki DAVID zostały skorygowane na tej podstawie. Wzbogacone szlaki zostały uporządkowane według wartości Count w kolejności malejącej. Wykresy wzbogacające GO i KEGG zostały opracowane przy użyciu internetowej platformy bioinformatycznej.

Dokowanie molekularne
Aby przewidzieć interakcje między kluczowymi aktywnymi składnikami YQHXD a głównymi celami LDD, w tym badaniu przeprowadzono analizę dokowania molekularnego. Pięć najważniejszych aktywnych związków, uszeregowanych według wartości stopnia topologicznego sieci i istotności celowej, zostało wybrane jako ligandy, natomiast odpowiadające im białka docelowe wykorzystano jako receptory. Pliki Ligand SDF zostały pobrane z PubChem, a trójwymiarowe struktury docelowych białek pobrano z Protein Data Bank (PDB). Analiza dokowania została przeprowadzona na platformie CB-Dock2 z wykorzystaniem w pełni zautomatyzowanego protokołu ślepego dokowania. Po przesłaniu struktur białek platforma automatycznie usuwała heteroatomy, w tym małe cząsteczki, jony i cząsteczki wody, a następnie naprawiała brakujące i atomy wodoru. Zastosowano tryb automatycznego stacji dokowania w ciemno. W tym trybie CB-Dock2 identyfikuje potencjalne kieszenie wiązania białko-powierzchni za pomocą algorytmu wykrywania wnęk opartego na krzywiźnie, a następnie wykonuje obliczenia dokowania przy użyciu zintegrowanego silnika AutoDock Vina¹⁶. Podczas procesu dokowania białka traktowano jako struktury sztywne, podczas gdy ligandy uważano za elastyczne, a wszystkie parametry dokowania ustawiono na domyślne wartości platformy. Wyniki dokowania poddano trójwymiarowej wizualizacji i analizie interakcji przy użyciu wbudowanych narzędzi CB-Dock2¹⁷, a energie wiązania obliczono w celu oszacowania przewidywanych powinowactw wiązań między związkami aktywnymi a białkami docelowymi.

Symulacja dynamiki molekularnej
Symulacje dynamiki molekularnej przeprowadzono dla docelowego kompleksu białko-ligandu przy użyciu GROMACS 2022.2. Białko zostało modelowane za pomocą pola siłowego Amber14SB, a system rozpuszczalnika przedstawiono za pomocą modelu wodnego TIP3P. Ładunki atomowe ligandów obliczono metodą AM1-BCC zaimplementowaną w Antechamber, a następnie przypisano typy atomów GAFF2. Powstałe pliki topologiczne zostały przekonwertowane do formatu zgodnego z GROMACS za pomocą ACPYPE. Parametry jonowe zgodne z modelem wody TIP3P zostały przypisane na podstawie zestawu parametrów Joung-Cheatham. Kompleks początkowy umieszczono w obciętym dwunastościanowym pudełku symulacyjnym, z co najmniej 1,2 nm między powierzchnią białka a krawędzią pudełka. Dodano cząsteczki wody TIP3P, aby rozpuścić układ, a jony Na⁺ i Cl⁻ zostały wprowadzone, aby zneutralizować ładunek układu i ustawić wytrzymałość jonową na 0,15 M. Minimalizację energii wykonano algorytmem najstromszego opadu aż do momentu, gdy maksymalna siła spadła poniżej 1 000 kJ^·mol−1·^nm−1. System był następnie wyważony na 100 ps pod zespołem NVT przy 298 K i 1 bar. Po wyważeniu przeprowadzono symulację produkcji o długości 100 ns pod zespołem NPT z krokiem czasowym 2 fs. Interakcje niezwiązane były obsługiwane za pomocą schematu odcięcia Verlet. Oddziaływania elektrostatyczne obliczono metodą siatki cząstek Ewalda (PME), a cutoff 1,2 nm zastosowano zarówno dla oddziaływań van der Waalsa, jak i Coulomba. Wiązania zawierające wodór były ograniczone algorytmem LINCS. Temperatura była kontrolowana termostatem Nosé-Hoover, a ciśnienie za pomocą barostatu Parrinello-Rahmana, utrzymując system na poziomie 298 K i 1 bar. Trajektorie były zapisywane co 10 ps. Analizowano dynamikę strukturalną i interakcje międzycząsteczkowe przy użyciu wbudowanych narzędzi GROMACS, VMD i PyMOL. Szacowano wolną energię wiązania z gmx_MMPBSA tam, gdzie to dotyczy.

Badania nad zwierzętami

Hodowla zwierząt
Siedemdziesięciu samców szczurów Sprague-Dawley (SD) w wieku 3–8 tygodni zostało losowo przydzielonych do siedmiu grup eksperymentalnych (n = 10 na grupę) przy użyciu komputerowo generowanych liczb losowych, co zapewniło brak statystycznie istotnych różnic w bazowej masie ciała między grupami. Wszystkie zwierzęta były trzymane w warunkach kontrolowanych (22 ± 1 °C, 55 ± 10% wilgotności względnej, 12-godzinny cykl światła/ciemności) z swobodnym dostępem do jedzenia i wody. Pozycje klatki były losowo zmieniane przy każdej zmianie, aby zminimalizować stronniczość środowiskowa. Po tygodniu aklimatyzacji szczury z grup modelowych przeszły nakłucie IVD ogonowe, aby wywołać degenerację. Miejscowa insesja znieczulenia z bupiwakainą była podawana przed operacją, aby zmniejszyć ból. Zwierzęta były ściśle monitorowane podczas operacji i przez cały okres pooperacyjnej rekonwalescencji. Obserwacje pooperacyjne obejmowały czas rekonwalescencji, przywrócenie aktywności samoistnej, spożycie jedzenia i wody oraz zmiany masy ciała. Tydzień po utworzeniu modelu losowo wybrano dwa szczury z każdej grupy do pooperacyjnego cyfrowego obrazowania radiologicznego (DR) oraz barwienia hematoksyliny i eozyny (HE). Analiza radiologiczna wykazała obniżoną wysokość IVD ogonowego, natomiast barwienie HE wykazało wyraźne zmniejszenie liczby komórek notochordalnych jądra mięczaka (NP) oraz dezorganizację struktury lamelowej pierścienia włóknistego¹⁸, co potwierdzało pomyślne ustalenie modelu. Osiem tygodni po operacji szczury zostały uśpione przez wdychanie przedawkowania izofluranu, a także pobrano tkanki ogonowe i próbki krwi. Po wstępnej walidacji do końcowej analizy histologicznej, ELISA, PCR oraz western blot użyto trzech niezależnych próbek na grupę spełniających określone kryteria jakości. Badania histologiczne przekroju były oceniane w warunkach pojedynczej ślepej, a preparaty oznaczono jedynie numerami identyfikacji zwierząt. W testach ELISA, PCR i western blot podczas alicytatu i oznaczania próbek stosowano kodowanie zaślepione, a kolejność testów wszystkich próbek była losowo ustalana przed eksperymentami. Surowe dane, w tym wartości absorpcji, wartości C_t oraz intensywności pasm, były dekodowane do tożsamości grup przez statystyka niezaangażowanego w grupowanie eksperymentalne ani przetwarzanie próbek, a następnie analizowane przez personel statystyczny. Wszystkie analizy statystyczne były przeprowadzane przez statystyków, którzy nie uczestniczyli w grupowaniu eksperymentalnym ani przetwarzaniu próbek. Wszelkie niepożądane zdarzenia, takie jak infekcja rany, rozchod rany, krwawienie czy silna ospałość, były natychmiast rejestrowane i oceniane. Łagodne schorzenia były ściśle monitorowane z rozszerzoną opieką wspierającą. Humanitarne metody końcowe stosowano, jeśli szczury wykazywały utratę masy ciała przekraczającej 20% wartości wyjściowej, silny ból nieustępliwy lekami przeciwbólowymi, utratę ruchomości, brak dostępu do jedzenia lub wody, infekcje, martwicę, inne poważne powikłania pooperacyjne, niedociąganie oddechowe lub jakiekolwiek schorzenia zagrażające życiu. W takich przypadkach zwierzęta były humanitarnie uśpione przez wdychanie przedawkowania izofluranu.

Modelowanie eksperymentalne
Szczury były znieczulone inhalowaną izofluranem i ustawiane na brzuchu. IVD z ogonem Co6/7, Co7/8 i Co8/9 były umieszczone pod nadzorem fluoroskopowym rentgenowskim. Igła 21 G była pionowo wsuwana do IVD, aż dotarła do przeciwległej strony skóry, po czym końcówka igły była wycofywana w kierunku środka ogona. Druga igła służyła jako odniesienie pozycji. Aby wywołać długotrwałą degenerację IVD, igła była obracana o 360°, utrzymywana na miejscu przez 30 sekund, a następnie usuwana. W grupie Sham głębokość wkłucia przez skórę i mięśnie wynosiła około 2 mm, bez uszkodzenia IVD. W pozostałych grupach igła była wprowadzana 5 mm w kierunku środka IVD, omijając naczynia krwionośne. Po włożeniu igła była obracana o 360° i pozostawiana na miejscu przez 30 sekund. Miejsce wbicia zostało zdezynfekowane, oznaczone i zabezpieczone sterylną gazą. Tydzień po modelowaniu rentgenowskie obrazowanie kręgosłupa ogonowego wykazało zmniejszenie wysokości IVD. Barwienie HE wykazało istotną redukcję komórek notochordalnych NP oraz zaburzenia struktury lameli pierścieniowej, co potwierdzało pomyślne ustanowienie modelu. Po pomyślnym modelowaniu grupy otrzymujące leczenie TCM oraz grupa z pozytywną kontrolą (PC) otrzymały odpowiednie dawki, obliczone na podstawie stosunku powierzchni ciała między ludźmi a szczurami.

Grupowanie i interwencja
W eksperymencie wzięto udział w 70 samcach szczurów SD w wieku 3–8 tygodni, podzielonych na siedem grup:
(1) Grupa kontrolna (Ctrl): Szczury z tej grupy zostały losowo przydzielone w tym samym czasie i w tych samych warunkach co grupy eksperymentalne. Były trzymane w indywidualnych klatkach w ośrodku zwierzęcym na poziomie SPF, z bezpłatnym dostępem do standardowego jedzenia i wody pitnej.
(2) Grupa pozorowa: Szczury zostały znieczulone przez wdychanie izofluranu. Po znieczuleniu skóra ogona była dezynfekowana jodem povidonem, a szczury leżały na brzuchu. IVD Co6/7 i Co7/8 były umieszczone pod nadzorem fluoroskopowym rentgenowskim. Igła została przesunięta o około 2 mm przez skórę i mięśnie, nie uszkadzając IVD. Woda destylowana (10 mL/kg) była podawana raz dziennie przez gavage przez 8 tygodni.

(3) Grupa modelowa: Szczury zostały znieczulone inhalowanym izofluranem. Po znieczuleniu skóra ogona była dezynfekowana jodem povidonem, a szczury leżały na brzuchu. Pod nadzorem fluoroskopowym rentgenowskim zlokalizowano IVD Co6/7, Co7/8 i Co8/9. Igła 21 G była pionowo przesuwana do IVD, aż dotarła do przeciwległej strony skóry, a końcówka igły była następnie wysuwana w kierunku środka ogona.

Druga igła była używana jako odniesienie pozycji. Igła była obracana o 360° i utrzymywana przez 30 sekund, aby wywołać ciągłą degenerację IVD przed usunięciem. Woda destylowana (10 mL/kg) była podawana codziennie przez gavage przez 8 tygodni, a rekonwalescencja szczurów była ściśle monitorowana po operacji.
(4) Grupa PC: Grupa pozytywnej kontroli była poddawana tej samej procedurze modelowania co grupa modelowa, a następnie otrzymała doustną dawkę celekoksybu (20 mg/kg/dzień), przygotowaną jako zawiesina w 0,5% karboksymetylocelulozie sodu (CMC-Na), przez 8 kolejnych tygodni, z objętością gavage 10 mL/kg masy ciała.
(5) Grupa niskodawkowa YQHXD [YQHXD(L)]: Modelowanie przeprowadzono podobnie jak w grupie modelowej. Szczury otrzymywały YQHXD w dawce 3,87 g/kg/dzień przez gavage przez 8 tygodni, z objętością gavage 10 mL/kg i stężeniem roboczym 0,387 g/mL.
(6) Grupa średniej dawki YQHXD [YQHXD(M)]: Modelowanie przeprowadzono podobnie jak w grupie modelowej. Szczury otrzymywały YQHXD w wysokości 7,74 g/kg/dzień przez gavage przez 8 tygodni, z objętością gavage 10 mL/kg i stężeniem roboczym 0,774 g/mL.
(7) Grupa YQHXD z wysoką dawką [YQHXD(H)]: Modelowanie przeprowadzono podobnie jak w grupie modelowej. Szczury otrzymywały YQHXD w wysokości 15,48 g/kg/dzień przez gavage przez 8 tygodni, z objętością gavage 10 mL/kg i stężeniem roboczym 1,548 g/mL.

Zmiany patologiczne
Tkanka ogonowa szczura została chirurgicznie wyizolowana, a zaobserwowano zmiany w tkankach mięśniowych i otaczających je mięśniach. Zebrana tkanka była następnie przetwarzana na przekroje patologiczne, a okazy przygotowywano w przekrojach podłużnych do obserwacji morfologicznych. IVD kręgów ogonowo-ogonownych, utrwalony w formaldehydzie przez 96 godzin, został szybko odwapniony za pomocą roztworu odwapniającym, odwodniony przez serię alkoholową stopniowanych i oczyszczony ksylenem. Po osadzeniu w parafinie przygotowano sekcje o pojemności 5 μm. Po deparafinizacji ksylenem i odwodnieniu przez serię gradientów alkoholowych, przekroje zostały barwione hematoksyliną i eozyną. Następnie były odwodniane, oczyszczane i montowane. Próbki były obserwowane pod mikroskopem optycznym, aby zbadać zmiany morfologiczne w strukturze IVD ogonowej w obu grupach. Następnie wykonano barwienie trójchromowe Masson. Fragmenty barwiono kolejno roztworem dichromianu potasu i hematoksyliną przez 3 minuty każda, następnie różnicowano kwaśnym etanolem, a następnie barwiłem Picrosirius Red przez 10 minut. Po 10 minutach leczenia kwasem fosforungstycznym, fragmenty były barwione błękitem toluidynowym przez 5 minut. Po odwodnieniu przekroje były oczyszczane ksylenem, montowane i obserwowane pod mikroskopem w celu obserwacji zmian w IVD ogona.

Wykrywanie białek docelowych w surowicy ELISA
Osiem tygodni po operacji szczury zostały znieczulone inhalowanym izofluranem, a następnie pobrano krew z aorty brzusznej. Próbki krwi obwodowej przechowywano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę i wirowano w 1 400 × g przez 10 minut. Serum było oddzielane i przechowywane w temperaturze −80 °C do czasu użycia. Poziomy surowicy AKT1, STAT3 i Bcl-2 zostały zmierzone za pomocą enzymatycznego immunosorbentnego testu (ELISA). Testy przeprowadzano zgodnie z protokołami producenta. Absorpcja została odczytana na 450 nm, a stężenia wyznaczano na podstawie standardowych krzywych. Zakresy wykrywania dla AKT1, STAT3 i BCL-2 wynosiły odpowiednio 0,625–40 ng/mL, 31,25–1000 pg/mL oraz 0,16–10 ng/mL, z czułością 0,1 ng/mL, 10 pg/mL i 0,1 ng/mL. Wszystkie próbki surowicy zostały przeanalizowane bez rozcieńczenia, a wszystkie wyniki mieściły się w odpowiednich standardowych zakresach krzywych. Wszystkie próbki i standardy zostały przebadane w duplikacie, a normalizacja została przeprowadzona na podstawie równych objętości surowicy.

Wykrywanie poziomów ekspresji genów PCR
Tkanki międzykręgowych dysków zostały rozdzielone od kręgów ogonowych szczurów, a z każdej próbki pobrano około 20 mg. Tkanki zostały rozdrobnione w ciekłym azocie i zlikwidowane w 500 μL nieenzymatycznego buforu lizyzowego przez 15 minut. Następnie wyekstrahowano całkowite RNA, a jego stężenie i czystość mierzono spektrofotometrem. Próbki o wartościach A₂₆₀/_{A 280} 1,8–2,0 zostały zaakceptowane do analizy, a stężenia RNA zostały dostosowane do 500 ng/μL. Transkrypcja odwrotna przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta. Ilościowe PCR (qPCR) przeprowadzono na systemie PCR w czasie rzeczywistym w celu pomiaru ekspresji mRNA Akt1, Bcl-2 i Stat3 . Sekwencje pierwsze przedstawiono w Tabeli 1. Program PCR polegał na początkowej denaturacji w 95 °C przez 30 s, następnie 40 cyklach 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 30 s. Analiza krzywej topnienia została przeprowadzona po amplifikacji w celu zweryfikowania specyficzności produktu. Gapdh został użyty jako gen referencyjny, a wszystkie próbki zostały przeanalizowane w trzech egzemplarzach. Efektywność wzmacniania sprężyny wynosiła 90%–110%. Relatywną ekspresję genów obliczono metodą 2^−ΔΔCt .

Western blotting do wykrywania poziomu ekspresji białek
Całkowite białko zostało wyizolowane z tkanek międzykręgowych szczurów z każdej grupy. Tkanki były lizowane w buforze RIPA uzupełnionym inhibitorami proteazy. Stężenie białka zmierzono za pomocą zestawu do analizy białek BCA i dostosowano do 2 μg/μL. Równe ilości białka (15 μg na próbkę) zostały rozdzielone przez 10% SDS-PAGE i przeniesione do błon poliwinylinofluorku (PVDF) przy stałym prądzie 300 mA przez 90 minut za pomocą systemu transferu na mokro. Błony były następnie blokowane 5% mlekiem beztłuszczowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C z głównymi przeciwciałami przeciwko AKT1 (1:5 000), STAT3 (1:6 000), Bcl-2 (1:1 500) oraz β-aktynie (1:4 000). Po płukaniu TBST błony były inkubowane przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z nadkrzezanem chrzanowym (HRP) w rozcieńczeniu 1:5 000 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Pasma białkowe wykryto za pomocą odczynnika o zwiększonej chemiluminescencji (ECL), a obrazy uzyskano za pomocą żelowego systemu obrazowania w identycznych warunkach ekspozycji. Intensywności pasmowe zmierzono za pomocą ImageJ i znormalizowano do β-aktyny, aby określić względną ekspresję białek. Każdy eksperyment przeprowadzono niezależnie w trzech egzemplarzach, przy czym każda próbka pochodziła z innego zwierzęcia.

Statystyki
Wyniki wyraża się jako średnia ± odchyleniu standardowym (SD). Różnice między grupami oceniono za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu po dokontekcie najmniejszej istotnej różnicy (LSD). Istotność statystyczna została zdefiniowana jako P < 0,05.

Wyniki

Wnioski wyciągnięte z badania
Badanie to łączyło farmakologię sieci, dokowanie molekularne, symulacje dynamiki molekularnej oraz eksperymenty in vivo , aby zbadać potencjalne efekty ochronne YQHXD przeciwko LDD. Wyniki sugerują, że YQHXD może działać przynajmniej częściowo poprzez regulację osi sygnalizacji AKT1/STAT3/BCL-2, charakteryzującej się obniżoną ekspresją STAT3 oraz zwiększoną ekspresją AKT1 i Bcl-2. Analizy histologiczne i molekularne wykazały, że leczenie YQHXD wiązało się z pop...

Dyskusja

Tradycyjne chińskie leki ziołowe wykazują działanie farmakologiczne w tym działanie przeciwzapalne, przeciwbólowe oraz wspomagające krążenie krwi¹⁹. Wcześniejsze badania sugerowały, że Xiaosui Huahe Decoction, formuła prekursorowa YQHXD, może sprzyjać resorpcji masowej przepukliny IVD poprzez wpływ na resorpcję jądra miączaka (NP) oraz absorpcję IVD²⁰; jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw pozostają niejasne. W niniejszym badaniu farmakologia sieciowa została wykor...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,5% karboksymetylocelulozy sodu (CMC-Na)	Nieokreślona		Pojazd używany do przygotowania zawieszenia celekoksybu do gavage.
Igła 21 G	Nieokreślona		Stosowane do nakłucia międzykręgowego krążka ogonowego.
2& razy; Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan	G3326	odczynnik wzmacniający qPCR.
30% roztwór żelu akryloamidowego/bis-akrylamidowego (29:1)	Solarbio Co., Ltd.		Roztwór żelowy do SDS-PAGE; W tabeli oryginalnych materiałów wymieniony jest roztwór żelowy 30%/29:1.
Maszyna do zamrażania 3D	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan		Używany do homogenizacji/mielenia tkanek.
4& razy; SDS-PAGE koncentrujący bufor żelowy (pH 6,8)	Solarbio Co., Ltd.		Przygotowanie żelu Western Blot.
Kwaśny etanol	Nieokreślona		Wykorzystywany do różnicowania barwienia histologicznego.
ACPYPE	Projekt ACPYPE		Używany do konwersji plików topologii ligandów na format zgodny z GROMACS.
Zestaw AKT1 ELISA	Hangzhou UpingBio Technology Co., Ltd.	SYP-R1928	Używany do pomiaru poziomu surowicy AKT1; Zasięg detekcji 0,625 i poduszka; 40 ng/mL.
Metoda ładowania AM1-BCC	Narzędzia przedsionkowe/AMBER		Używany do obliczania ładunku atomowego ligandów.
Pole siłowe Amber14SB	Pole siłowe BURSZTYNOWE		Pole siłowe białek stosowane w symulacji dynamiki molekularnej.
Korzeń Angelica sinensis	Apteka Jianshou, Nanning, Guangxi, Chiny	Partia nr 20250503	Komponent botaniczny YQHXD; 20 g za receptę.
Bezwodny etanol	Tianjin Aopusheng Chemical Co., Ltd.		Stosowane w przetwarzaniu tkanek/odwodnieniu.
Przedsionek	Narzędzia AMBER		Wykorzystywane do obliczania ładunku ligandów i typowania atomów.
Przeciwciało przeciw AKT1	Wuhan Sanying Co., Ltd.		Główne przeciwciało przeciwko western blottingowi; Rozcieńczenie 1:5 000.
Przeciwciało przeciw Bcl-2	Wuhan Sanying Co., Ltd.		Główne przeciwciało przeciwko western blottingowi; rozcieńczenie 1:1 500.
Przeciwciało anty-STAT3	Wuhan Sanying Co., Ltd.	10253-2-AP	Główne przeciwciało przeciwko western blottingowi; rozcieńczenie 1:6 000.
Odczynnik APS	Beyotime/Biyuntian Co.		Odczynnik polimeryzacyjny żelu Western Blot.
Korzeń Astragalus membranaceus	Apteka Jianshou, Nanning, Guangxi, Chiny	Partia nr 20250405	Komponent botaniczny YQHXD; 20 g za receptę.
Autoklaw	SANYO, Japonia		Sprzęt do sterylizacji.
Silnik AutoDock Vina	Projekt AutoDock/Vina		Silnik dokujący używany w CB-Dock2.
Zestaw do testowania białka BCA	Solarbio Co., Ltd.		Używany do określania stężenia białka przed Western blotting.
Zestaw Bcl-2 ELISA	Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.	PMK1545	Używany do pomiaru poziomu Bcl-2 w surowicy; Zakres detekcji 0,16 i poduszka; 10 ng/mL.
Bupivacaine	Nieokreślona		Miejscowy środek znieczulający stosowany przed operacją.
CB-Dock2	Serwer CB-Dock2		Automatyczna platforma do ślepego molekularnego dokowania.
Celekoksyb	Sichuan New Ston Pharmaceutical Co., Ltd.	H20233911	Lek o pozytywnej kontroli; 20 mg/kg/dzień przez gavage.
Owoc Chaenomeles speciosa	Apteka Jianshou, Nanning, Guangxi, Chiny	Partia nr 231001	Komponent botaniczny YQHXD; 15 g za receptę.
Cytoscape	Konsorcjum Cytoscape	Wersja 3.9.0	Wykorzystywane do konstruowania i analizy diagramów sieci.
Zestaw chromogenicznych odczynników DAB (20& razy;)	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.		Wymienione w tabeli istniejących materiałów.
DAVID	Narodowy Instytut Onkologii	Wersja 6.8	Baza danych do adnotacji, wizualizacji i zintegrowanego odkrywania; wykorzystywane do analizy wzbogacania GO i KEGG.
Roztwór dekalcyfikacyjny	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.		Wykorzystywane do odwapniania tkanki IVD kręgów ogonowych.
Wstrząsanie odbarwiające	Liu Yi Biotechnology Co., Ltd., Pekin		Laboratoryjny shaker.
Woda DEPC	Wuhan Sanying Co., Ltd.		Praca RNA/przygotowanie reagentów.
System obrazowania cyfrowego do rentgenowania	Nieokreślona		Wykorzystywane do walidacji modeli radiograficznych po operacji.
Woda destylowana	Nieokreślona		Przygotowanie do wywaru YQHXD i gavage z pojazdu/sterowania.
Podłoże chemiluminescencyjne ECL	Biosharp Co.		Odczynnik do wykrywania sygnału Western blot.
Roztwór do pobierania antygenów EDTA (pH 8,0)	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.		Wymienione w tabeli istniejących materiałów.
Aparat elektroforezy	Nieokreślona		Używany do elektroforezy SDS-PAGE.
Bufor elektroforezy	Servicebio Co.		Roztwór elektroforezy Western Blot.
Kostkarka FM40	Changliu Scientific Instruments Co., Ltd., Pekin		Kostka do lodu.
Formaldehyd	Nieokreślona		Utrwalacz stosowany w tkance IVD kręgów ogonowych.
Typy atomów GAFF2	Narzędzia AMBER		Typy atomów ligandów używane do symulacji dynamiki molekularnej.
System obrazowania żelowego	Tianen Scientific, Szanghaj		Używany do robienia zdjęć zachodnich plam.
GeneCards	Instytut Nauki Weizmanna	Wersja 5.26	Baza danych ludzkich służąca do wyszukiwania celów związanych z chorobą.
gmx_MMPBSA	gmx_MMPBSA projekt		Wykorzystywane do szacowania wiązania energii wolnej MM-PBSA, gdzie to możliwe.
GraphPad Prism	Oprogramowanie GraphPad	Wersja 8.0	Oprogramowanie do statystyk/wykresów wymienione we wcześniejszej wersji rękopisu autorów.
Młynek	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan		Używany do szlifowania/homogenizacji tkanek.
GROMACOWIE	Zespół rozwojowy GROMACS	Wersja 2022.2	Wykorzystywane do symulacji dynamiki molekularnej.
Odczynniki barwiące hematoksylinę i eozynę	Nieokreślona		Używany do barwienia HE przekrojów ogonowych IVD.
Wirówka o dużych prędkościach	Eppendorf, Niemcy		Wirówka laboratoryjna.
Szybkoobrotowa maszynka do tkanek w niskiej temperaturze	Servicebio, Chiny		Używany do szlifowania tkanek w niskiej temperaturze.
Poziomy shaker	Firma Chirinbell		Laboratoryjny shaker.
Przeciwciało przeciw królikom dla kóz znakowane HRP	Servicebio Co.		Przeciwciało wtórne przeciwko western blottingowi; Rozcieńczenie 1:5 000.
HyperScript III RT SuperMix dla qPCR z gDNA Remover	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan		Odczynnik transkrypcji odwróconej wymieniony w tabeli istniejących materiałów.
Kostka lodu	SIMAG, Chiny		Kostka do lodu.
ImageJ	Narodowe Instytuty Zdrowia		Używany do ilościowej ilościowej intensywności pasma Western blot.
Odwrócony mikroskop biologiczny	Olympus, Japonia		Używany do mikroskopii zabarwionych przekrojów.
Izofluran	Nieokreślona		Środek inhalacyjny znieczulający/eutanazji.
Odczynnik izopropanolowy	China National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.		Czynnik do ekstrakcji RNA.
Parametry jonów Joung-Cheathama	Nie dotyczy		Zestaw parametrów jonów używany do symulacji dynamiki molekularnej.
Kłącz Ligusticum chuanxiong	Apteka Jianshou, Nanning, Guangxi, Chiny	Seria nr 20250301	Komponent botaniczny YQHXD; 15 g za receptę.
Ciekły azot	Nieokreślona		Używany do mielenia tkanek przed ekstrakcją RNA.
Wirówka o niskich prędkościach	Eppendorf, Niemcy		Wykorzystywany do separacji surowicy i innych niskoprędkościowych etapów wirowania.
Roztwór barwienia trójchromowego Massona	Nieokreślona		Używany do barwienia Massona przekrojów IVD ogonowego.
Czytnik mikropłyt (TECAN)	TECAN, Szwajcaria		Używany do pomiaru absorpcji przy 450 nm; wymienione w tabeli istniejących materiałów.
Czytnik mikropłyt (Thermo Fisher Scientific)	Thermo Fisher Scientific, USA		Wielofunkcyjny czytnik mikropłyt wymieniony w tabeli istniejących materiałów.
Oprogramowanie Microsoft Excel/arkusze kalkulacyjne	Microsoft		Używany do usuwania duplikatów celów docelowych i zarządzania danymi tabelarczymi.
Spektrofotometr NanoDrop 2000	Thermo Fisher Scientific, USA		Używany do pomiaru stężenia i czystości RNA.
Nieenzymatyczny bufor lizy	Nieokreślona		Stosowany do lizy tkanek przed ekstrakcją RNA.
OMIM	Szkoła Medyczna Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa		Dziedziczenie Mendla w Internecie; używany do pozyskiwania celów związanych z chorobą.
Internetowa platforma do wykresów bioinformatycznych	Nieokreślona		Używany do generowania wykresów pasków GO i KEGG.
Środek polimeryzacji żelowy PAGE	Solarbio Co., Ltd.		Przygotowanie żelu Western Blot.
Parafina	Nieokreślona		Ośrodek osadzający przekroje histologiczne.
Zapalniki PCR dla Akt1, Bcl-2, Stat3 i Gapdh	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.		Sekwencje pierwsze są wymienione w Tabeli 1.
PDB	RCSB PDB		Bank Danych Białek; używany do uzyskiwania struktur 3D białek docelowych.
Inhibitory fosforylowane/proteazowe	Servicebio Co.		Dodane do buforu lizy RIPA do ekstrakcji białek.
Kwas fosforungstyczny	Nieokreślona		Stosowany w barwieniu Masson.
Picrosirius Red	Nieokreślona		Stosowany w barwieniu Masson.
Błona poliwinyleniden-difluorkowa (0,45 μ m)	Servicebio Co.		Membrana PVDF używana do transferu Western blot.
Preparat leku z dodatnim kontrolowaniem	Nieokreślona		Pojazd z zawieszeniem CMC-Na 0,5% do celekoksybu.
Povidone-jod	Nieokreślona		Stosowane do dezynfekcji miejsc chirurgicznych.
Marker białka	Thermo Fisher Scientific, USA		Marker masy cząsteczkowej dla western blotting.
Aparat transferu białek	Bio-Rad, USA		Sprzęt do mokrego transferu do western blotting.
Moduł transferu białek (transfer mokry)	Bio-Rad, USA		Moduł transferowy Western Blot na mokro.
PubChem	Narodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej (NCBI)		Używany do pobierania plików SMILES/SDF struktur złożonych.
System przygotowania wody czystej	Le Feng Biotechnology Co., Ltd., Szanghaj		Używany do przygotowania czystej wody.
PyMOL	Schrö dinger, LLC		Wykorzystywane do wizualizacji i analizy wyjść z dynamiki molekularnej/dokowania.
system PCR qPCR w czasie rzeczywistym	Applied Biosystems QuantStudio, USA		Wykorzystywany do ilościowego wzmacniania PCR.
Bufor do lizy tkanek/komórek RIPA	Solarbio Co., Ltd.		Wykorzystywane do całkowitej ekstrakcji białka.
Roztwór rozpuszczania RNA	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan		RNA obsługuje odczynnik.
Rotacyjny parownik	Nieokreślona		Używany do koncentrowania połączonych filtratów YQHXD pod obniżonym ciśnieniem.
Dojrzałe nasiona Sinapis alba	Apteka Jianshou, Nanning, Guangxi, Chiny	Partia nr 20240801	Komponent botaniczny YQHXD; 10 g za receptę.
Szczury Sprague-Dawley	Shanghai Slack Experimental Animal Co., Ltd.	SCXK (Szanghaj) 2022-0004	Siedemdziesiąt samców szczurów, lat 3 lat; 8 tygodni, stosowany w modelu nakłucia dysku ogonowo-ogonowego.
SPSS	IBM, USA	Wersja 21.0	Oprogramowanie statystyczne wymienione w wcześniejszej wersji rękopisu autorów.
Zestaw STAT3 ELISA	Hangzhou UpingBio Technology Co., Ltd.	SYP-R1555	Używany do pomiaru poziomu STAT3 w surowici; zakres detekcji 31,25 i dash; 1000 pg/mL.
Korzeń tetrandry Stephania	Apteka Jianshou, Nanning, Guangxi, Chiny	Partia nr 230301	Komponent botaniczny YQHXD; 6 g na receptę.
Gaza sterylna	Nieokreślona		Używa się do ochrony miejsca przebicia po modelowaniu.
STRING	Konsorcjum STRING	Wersja 12.0	Platforma sieci interakcji białko-białko.
SweScript All-in-One RT SuperMix dla qPCR	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan	G3337	Odczynnik transkrypcji odwróconej wymieniony w tabeli istniejących materiałów.
SwissTargetPrediction	SIB Szwajcarski Instytut Bioinformatyki		Używane do przewidywania potencjalnych celów związków.
Bufor TBST	Nieokreślona		Używany do mycia membran podczas western blotting.
TCMSP	Centrum Bioinformatyki, Wydział Nauk Przyrodniczych, Northwest A& F University	Wersja 2.3	Baza danych systemów medycyny tradycyjnej chińskiej; używa się do pozyskiwania aktywnych składników chińskich związków ziołowych.
Model wody TIP3P	Nie dotyczy		Model wody stosowany w symulacjach dynamiki molekularnej.
Błękit toluidynowy	Nieokreślona		Stosowany w barwieniu Masson.
Bufor transferowy	Servicebio Co.		Bufor transferowy Western Blot.
Odczynnik TriQuick	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan		Czynnik do ekstrakcji RNA.
Odczynnik TRIzol	Nieokreślona		Całkowity odczynnik z ekstrakcją RNA wspomniany w manuskrypcie.
TTD	Chiński Uniwersytet w Hongkongu (IDRBLab)		Therapeutic Target Database; używany do pozyskiwania celów związanych z chorobą.
Venny	BioinfoGP, CNB-CSIC	Wersja 2.1.0	Używany do identyfikacji nakładających się celów między YQHXD a LDD.
Schemat cięcia Verlet	GROMACOWIE		Schemat interakcji niewiązanych stosowany w symulacjach dynamiki molekularnej.
Aparat do pionowej elektroforezy	Bio-Rad, USA		Używany dla SDS-PAGE.
VMD	Uniwersytet Illinois w Urbana-Champaign		Wykorzystywane do wizualizacji i analizy wyników z dynamiki molekularnej.
System transferu na mokro	Bio-Rad, USA		Wykorzystywany do transferu białka w western blottingu.
System fluoroskopii rentgenowskiej	Nieokreślona		Używany do identyfikacji poziomów IVD w ogonie podczas modelowania nakłucia.
Ksylen	Nieokreślona		Wykorzystywane do deparafinizacji/oczyszczania podczas histologii.
β-przeciwciało podstawowe przeciwko aktynie	Wuhan Sanying Co., Ltd.		Przeciwciało kontrolujące ładowanie pierwotne przeciwciało przeciwko western blottingowi; Rozcieńczenie 1:4 000.