Protokół śledzenia i automatycznej ilościowej oceny zachowania u Drosophila melanogaster

Summary

Ten protokół wykorzystuje estymację położenia przez Python do śledzenia kluczowych punktów ciała u par Drosophila, ułatwiając zautomatyzowane ilościowe określanie subtelnych zachowań społecznych, szczególnie w interakcji społecznej, a także tworzenie map cieplnych i trajektorii ruchowych.

Abstract

Aby opracować narzędzie analityczne open-source, które pozwala na pokonywanie ograniczeń tradycyjnych metod śledzenia opartych na centroidach, przedstawiamy protokół do dokładnej analizy interakcji społecznych w swobodnie zachowujących się parach Drosophila. Konkretnie, protokół ten jest inspirowany wysokorozdzielczymi sieciami (HRNet), które pozwalają na jednoczesne śledzenie pięciu kluczowych punktów anatomicznych – głowa, tułów, brzuch oraz końcówki lewego i prawego skrzydła – mając na celu generowanie danych współrzędnych o wysokiej rozdzielczości do późniejszej ilościowej analizy zachowań społecznych. Protokół ten zapewnia kompletny przepływ pracy oparty na Pythonie i graficznym interfejsie użytkownika (GUI), który zaprojektowaliśmy, obejmujący budowę zbioru danych, trenowanie modelu i automatyczne wyodrębnianie współrzędnych, wraz z zintegrowanymi modułami do generowania map cieplnych zajmowalności przestrzennej, trajektorii ruchowych i współczynników interakcji społecznych u muchówek. Aby zweryfikować ten framework, przeprowadzono testy z użyciem dwóch szeroko stosowanych szczepów, w1118 i Canton-S (CS). Nasze wyniki wykazały stabilność wykrywania kluczowych punktów oraz ujawniły różnice specyficzne dla genotypu w wykorzystaniu przestrzeni i strukturze lokomotorycznej. Ta metodologia zapewnia skalowalną podstawę dla ilościowej etologii i automatycznej analizy interakcji społecznych u Drosophila, zmniejszając jednocześnie wysiłek związany z manualną adnotacją i poprawiając powtarzalność.

Introduction

Drosophila melanogaster jest szeroko stosowanym organizmem modelowym z potężnymi narzędziami genetycznymi i dobrze przemapowanymi obwodami nerwowymi, które umożliwiają mechaniczne rozdzielenie zachowań¹. Posiada szeroki zakres zachowań społecznych, w tym zalotów i agresji, oraz silną zdolność uczenia się^{2,3,4,5,6,7,8}. Każde z tych zachowań składa się z odrębnych elementów motorycznych kontrolowanych przez zwarty, ale niezwykle dobrze zorganizowany układ nerwowy. Co ważne, dokładne pomiary postawy ciała są niezbędne do zrozumienia neurologicznych podstaw selekcji działań, ponieważ wiele z tych zachowań zawiera subtelne motywy postawy, które kodują informacje kontekstowe i wewnętrzne^9,10.

Mimo potrzeby rozdzielania danych na pojedyncze muchy, wiele wysokowydajnych badań behawioralnych na Drosophila nadal opiera się na wskaźnikach na poziomie populacji¹¹. Wysokowydajne badania behawioralne obejmują testy labiryntu T na preferencje społeczne^12,13, testy przestrzeni społecznej, które mierzą odległość między muszkami, lub paradygmaty agregowania/uniknięcia w warunkach stymulacji zmysłowej¹⁴, które mogą efektywnie uchwytywać trendy populacyjne. Jednak zawierają one średnie z wielu osób, co prowadzi do zacierania różnorodności w sekwencjach działań i struktury czasowej wymiany społecznej. Przez lata, próby przejścia do identyfikacji na jedną muszkę opierały się na funkcjonalnie ograniczanych metodach, takich jak wykrywanie zdarzeń na podstawie reguł z użyciem progów kinematycznych, wycinanie tła z użyciem śledzenia centroidów i ręcznej adnotacji wideo^15,16,17,18. W rezultacie, dyskretne zachowania takie jak rzucanie się, stukanie czy grożenie skrzydłami są często ignorowane lub błędnie opisane, co wymaga znaczącej manualnej korekty. Takie ograniczenia ograniczyły badania mechanistyczne, które wymagają precyzyjnego dopasowania czasowego między aktywnością nerwową a pojedynczymi działaniami.

Rewolucyjne rozwiązanie jest teraz dostępne dzięki ostatnim rozwojom w dziedzinie komputerowego widzenia i estymacji pozycji opartej na uczeniu maszynowym. Oprogramowanie typu open-source takie jak DeepLabCut¹⁹ i SLEAP²⁰ umożliwia nieinwazyjne wykrywanie części ciała, skalowalną klasyfikację dyskretnych działań i zachowanie tożsamości jednostek nawet podczas bliskich interakcji. Te funkcje pozwalają na przełamanie wad poprzednich podejść grupowych i opartych na regułach i umożliwiają powtarzalną kwantyfikację złożonych zachowań społecznych.

Indywidualne interakcje w Drosophila charakteryzują się unikalnymi cechami motorycznymi, które wskazują na postęp interakcji społecznych. Agresja na przykład obejmuje typowe zachowania takie jak rzucanie się, grożenie skrzydłami i walczenie, które reprezentują kolejne etapy wzrostu konfliktu^21,22. Zaloty są podobnie określone przez orientację, jednostronne rozciągnięcie skrzydeł z produkcją śpiewu, stukanie i próbę kopulacji, które łączą się, tworząc sekwencje czasowe interakcji godowych²³. Uchwycenie tych motywów zależy od dokładnego rozpoznawania postawy ciała i ruchów stawów^24,25. W praktyce, próbkowanie wymaga wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej przez dłuższe okresy nagrywania, aby zapewnić, że subtelne wzorce motoryczne mogą być precyzyjnie wykryte i dopasowane do aktywności nerwowej^25,26.

Przedstawiamy otwartą, opartą na widokach, ramę do zautomatyzowanego identyfikowania pięciu anatomicznych kluczowych punktów—głowa, tułów, brzuch, lewe i prawe końcówki skrzydeł²⁷. System obejmuje kompletny proces budowy zbioru danych, treningu modelu i wyodrębniania współrzędnych oraz generuje wysokiej rozdzielczości dane szeregowe czasowe, nadające się do dostosowywalnej klasyfikacji zachowań. Automatyzując procesy ręcznej adnotacji i standaryzując przepływy pracy analityczne, nasza metoda umożliwia precyzyjną analizę ilościową zachowań społecznych, zwiększając efektywność i powtarzalność, a jednocześnie znacznie zmniejszając czas i pracę wymaganą do analizy.

Aby zweryfikować niezawodność systemu, zastosowaliśmy go do dwóch powszechnie stosowanych szczepów laboratoryjnych, w1118 i Canton-S (CS), i obserwowaliśmy stabilne wykrywanie kluczowych punktów w klatkach, a także różnice specyficzne dla genotypu w zajmowaniu przestrzeni, cechach trajektorii i wskaź

Protocol

1. Przygotowanie much

1. Zbieraj i ustal płeć much w wieku około 3–4 dni pod krótkim znieczuleniem CO₂ przed eksperymentami.
   UWAGA: Czas trwania znieczulenia i prędkość przepływu CO₂ mogą się różnić w zależności od specyfikacji i ciśnienia butli z dwutlenkiem węgla używanej w każdym laboratorium. Muchy należy monitorować ciągle podczas znieczulenia, a ekspozycja na CO₂ powinna być utrzymywana tylko do momentu całkowitego znieczulenia much i całkowitego ustania ich ruchu.
2. Umieść każdą muchę indywidualnie w 50 mL probówce Falcon zawierającej standardowy medium kukurydzianego agaru, glukozy i drożdży.
3. Utrzymuj muchy w temperaturze 25 °C w cyklu 12 h światło/ciemność do momentu użycia.

2. Budowa areny

1. Przygotuj dwie 3 mm przezroczyste płyty akrylowe i jedną 3 mm polietylenową płytę.
2. Wytnij cztery okrągłe komory (każda o średnicy 35 mm) w środku polietylenowej płyty.
3. Za pomocą klipsów złącz jedną płytę akrylową z płytą polietylenową, aby utworzyć podstawę komory; zachowaj drugą płytę akrylową jako wyjmowalną pokrywę.

Rysunek 1: Schemat areny behawioralnej i konfiguracji obrazu. (A) Schemat konstrukcji niestandardowej komory obserwacyjnej przedstawiono na diagramie. Komora składa się z trzech głównych warstw: 3 mm przezroczystej akryłowej płyty bazowej; 3 mm polietylenowej płyty z czterema okrągłymi wycięciami o średnicy 35 mm służącymi jako pojedyncze komory; i drugiej akrylowej płyty, która służy jako wyjmowalna pokrywa. (B) Użyj 90° uchwytu mocującego, aby zamontować kamerę pionowo na 40 cm słupie optycznym. W przypadku obrazowania z góry kamera jest umieszczona bezpośrednio nad wielowarstwową arenę obserwacyjną, z jej osią optyczną prostopadłą do powierzchni komory. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

3. Konfiguracja obrazu

1. Zmontuj dwa 20 cm słupy optyczne i jeden 40 cm słup z 90° uchwytami mocującymi.
2. Zamontuj kamerę (1280 × 1024 piksele) pionowo na 40 cm słupie, wyrównując prostopadle do powierzchni areny i ustaw częstotliwość klatek na 150 kl/s.
3. Umieść arenę na 25 cm × 25 cm dimmable panelu LED świetlnym z dyfuzorem.
4. Dostosuj iluminację do około 1500 luksów na powierzchni areny.
   UWAGA: Upewnij się, że krawędzie skrzydeł pozostają widoczne w podglądzie binarnym. Unikaj wartości >2000 luksów, aby zapobiec powstawaniu artefaktów spowodowanych ciepłem, ponieważ muchy mogą zmienić swoją naturalną lokomocje lub rozkład z powodu stresu termicznego wynikającego ze źródła światła.

4. Procedura nagrywania

1. Umieść 3 cm poduszki piankowe pod każdym rogiem areny, aby ją ustabilizować.
2. Przenieś pary much pod znieczuleniem CO₂ do komór; uszczelnij górną akrylową płytą.
3. Pozwól muszom przystosować się przez 40 min przed nagraniem.
4. Rozpocznij akwizycję wideo za pomocą MIAS.exe²⁷: naciśnij q, aby rozpocząć, i c, aby zatrzymać.
   UWAGA: Dzięki temu otrzymasz ciągłe nagrania wideo swobodnie działających par much w znormalizowanych warunkach.

5. Zdefiniowanie panelu aktywności społecznej

1. Uruchom skrypt przetwarzania wstępnego: python SoAL_PreProcess.py [ścieżka_pliku_wideo]
   UWAGA: Wszystkie skrypty kodu są dostępne w Pliku uzupełniającym 1.
2. Zanotuuj obszar komory i przypisz metadane w postaci Genotype_wiek (dni) × 1 (liczba komór). (np. CS_3 × 1)
3. Dostosuj suwak progów wykrywania, aż skrzydła będą prawie niewidoczne na obrazie binarnym, aby zapewnić optymalne odejmowanie tła i widoczność skrzydeł.

6. Przygotowanie zestawu danych

1. Utwórz nowy folder z danymi, uruchomić:
   python tools/SoAL_DatasetGen.py NAZWA_ZESTAWU_DANYCH 10 (przedział próbkowania klatek)
   UWAGA: Parametr przedziału próbkowania klatek („10”) został zaadaptowany z wcześniej opublikowanego protokołu²⁷. Niższe wartości zwiększają gęstość próbkowania i obciążenie obliczeniowe, podczas gdy wyższe wartości zmniejszają zapotrzebowanie na obliczenia i mogą być dostosowane w oparciu o dostępne wydajność sprzętu i wymagania

Results

Rysunek 1 przedstawia geometrię aren, konfigurację oświetlenia i umiejscowienie kamery stosowaną do rejestracji naturalnych interakcji społecznych u Drosophila. Konfiguracja zapewnia jednolite oświetlenie i stabilne warunki obrazowania, nadające się do estymacji położenia i ekstrakcji współrzędnych.

Automatyczna estymacja położenia została zastosowana do wszystkich nagrań wideo w celu ekstrakcji dwuwymiarowych współrzędnych predefiniowanych kluczowych punktów anatomicznych każdego muchówki. Model konsekwentnie identyfikował głowę, tułów, brzuch i stawy skrzydeł w każdej klatce, nawet podczas interakcji na krótkich dystansach. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywną klatkę z nałożonymi punktami kluczowymi, demonstrującą dokładne śledzenie wielu muchówek i stabilne wykrywanie punktów kluczowych przez cały czas rejestracji. Niezawodność tego kroku zapewnia, że wyekstrahowany ciąg czasowy współrzędnych może służyć jako solidne podstawy dla dalszych ilościowych analiz. Rysunek 3 przedstawia przepływ analityczny.

Wykorzystując wyekstrahowanych współrzędnych i proporcję klatek dla każdej współrzędnej, stworzyliśmy heatmapy zajścia przestrzennego, aby wizualizować skumulowaną dystrybucję pozycji muchówek w arenie. Heatmapy te podsumowywały gęstość prawdopodobieństwa lokalizacji muchówek w czasie i podkreślały regiony preferowanego zajścia. Rysunek 4 i Rysunek 5 przedstawiają reprezentatywne heatmapy dla muchówek w1118 i Canton-S (CS). Różnice w wzorcach użytkowania przestrzeni między strefami centralnymi a obwodowymi w dwóch genotypach są łatwo zauważalne, co odzwierciedla różne skłonności do eksploracji aren i preferencji strefowych.

Oprócz wzorców zajścia, zrekonstruowaliśmy trajektorie ruchowe z ciągu czasowego współrzędnych, aby uchwycić dynamiki ruchu na drobne skale. Trajektorie zostały wygenerowane przez łączenie dwuwymiarowych współrzędnych muchówek z każdej kolejnej klatki bez żadnego wygładzania. Trajektorie przedstawione na Rysunku 4 i Rysunku 5 ilustrują indywidualne ścieżki ruchu dla muchówek w1118 i CS, ujawniając różnice specyficzne dla genotypu w zakresie ruchu, złożoności ścieżek i przejściach między strefami wysokiego zajścia. Razem, wyniki wykrywania punktów kluczowych, heatmapy i rekonstrukcje trajektorii pokazują, że połączona estymacja położenia i analiza oparta na współrzędnych efektywnie uchwycuje i rozróżnia strukturę behawioralną swobodnie współdziałających Drosophila w różnych genotypach.

Zdefiniowaliśmy również interakcje społeczne w każdej klatce na podstawie dwuwymiarowych współrzędnych pięciu kluczowych punktów anatomicznych. Para była uważana za zaangażowaną społecznie, gdy spełnione były jednocześnie oba kryteria: odległość głowa-głowa większa niż 0,5 mm, ale mniejsza niż 20 mm oraz różnica orientacji większa niż 30°^28,29,30,31. Zgodnie z tym, zmierzyliśmy proporcję czasu spędzonego w interakcji społecznej dla każdej pary (sześć par dla każdego genotypu). Nasza metoda może niezawodnie mierzyć zachowania społeczne u muchówek, jak pokazano na Rysunku 6. Średnie proporcje społeczne dla muchówek W1118 i CS wynosiły odpowiednio 0,270 ± 0,001 i 0,252 ± 0,005, w trakcie sześciu niezależnych powtórzeń eksperymentów, sugerując wysoką powtarzalność między różnymi grupami eksperymentalnymi. Jest to również zgodne z wynikiem, że nie ma istotnej różnicy w proporcji społecznej między dwoma szczepami dzikich muchówek.

Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki wykrywania punktów kluczowych. Automatyczna estymacja położenia zidentyfikowała wszystkie predefiniowane kluczowe punkty anatomiczne dla każdej muchówki w każdej klatce. Nałożone markery ilustrują dokładne śledzenie wielu muchówek podczas naturalnych interakcji społecznych. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przepływ analizy. Główny przepływ obejmuje przetwarzanie wstępne, przygotowanie danych, trenowanie modelu i walidację, a ostatecznie dostarcza dwuwymiarowe współrzędne Drosophila, po których następuje analiza GUI.

Discussion

Nasze badanie pokazuje, że estymacja postawy oparta na uczeniu maszynowym zapewnia skalowalną, niezawodną metodę pomiaru subtelnych interakcji społecznych u Drosophila. Przezwycięża ograniczenia podejść opartych na centroidzie^15,16,17,18 poprzez śledzenie pięciu anatomicznych punktów kluczowych w swobodnie współdziałających parach, co umożliwia pozyskanie informacji kątowych dostarczanych przez oś ciała i odległość głowa do głowy wnioskowaną na podstawie punktów głowy. Nasza technika może rekonstruować wzorce zajmowania przestrzeni i trajektorie ruchu poprzez śledzenie współrzędnych centroidu much w każdej klatce wideo w celu uzyskania tras ruchów i za pomocą pięciopunktowych punktów orientacyjnych do estymacji orientacji głowy. Stabilne wykrywanie punktów kluczowych obserwowane zarówno w szczepach w1118, jak i Canton‑S wskazuje, że pipeline jest odporny na naturalne zmiany w dynamice ruchu, zapewniając reprodukcyjną podstawę dla dalszej klasyfikacji zachowań. Te zdolności są niezbędne do analizowania subtelnych elementów motorycznych, które kodują stany wewnętrzne i informacje kontekstowe w zachowaniach społecznych^8,9.

Znaleziono kilka czynników metodologicznych, które są niezbędne dla zagwarantowania spójnych wyników. Ciepło i intensywność iluminacji systemu oświetleniowego znacząco wpływały na wyraz zachowań, co jest zgodne z wcześniejszymi odkryciami, że czynniki środowiskowe wpływają na aktywność społeczną i ruchowo-lokomocyjną much^32,33. Parametry obrazowania, w tym odległość ogniskowa, kontrast i gamma, które są dostosowywane empirycznie w naszych eksperymentach, również wpływały na dokładność estymacji postawy, co jest zgodne z poprzednimi odkryciami, że szybkie rejestrowanie zachowań wymaga starannej kalibracji optycznej, aby uchwycić szybkie ruchy^34,35. Na zmienność zachowań wpływały również procedury obsługi: anestezja CO₂ skutkowała ilościowymi zmianami w interakcji społecznej i lokomotorowaniu, co jest zgodne z poprzednimi publikajami pokazującymi zmiany zachowań indukowane anestezją^36,37,38. Ten krok jest szczególnie krytyczny, ponieważ gdy anestezja jest niewystarczająca, muchy mogą odzyskać świadomość i uciekać po umieszczeniu w komorze; odwrotnie, przy odpowiedniej anestezji, muszą być dawane wystarczająco dużo czasu na regenerację, ponieważ nieodpowiednia aklimatyzacja zmniejsza ich motywację do ruchu później, co poważnie wpłynie na późniejszą analizę.

Mimo siły pipeline, nadal istnieją pewne ograniczenia. Dokładność estymacji postawy jest wrażliwa na jakość adnotacji, więc nawet małe błędy w etykietowaniu mogą prowadzić do zniekształceń w zrekonstruowanych trajektoriach. Ten problem był wcześniej obserwowany w innych ramach estymacji postawy^20,34. Zmiany domen spowodowane zmianami w oświetleniu, teksturze tła lub szczepie much mogą obniżyć wydajność modelu, co wymaga okresowego ponownego trenowania lub rozszerzania zestawu danych. Ponadto eksperymenty, w których więcej niż 5% klatek nie wykrywa punktów kluczowych, powinny być wykluczone lub włączone do iteracyjnej refinacji modelu. Rygorystyczna kontrola wersji (jak określono w Pliku uzupełniającym 3) jest również konieczna dla reproduktywności obliczeniowej, ponieważ różnice w zależnościach programowych mogą prowadzić do niespójnych wyników.

Przyszłe ulepszenia mogą obejmować zautomatyzowane procedury kalibracji, strategie adaptacji domen w celu poprawy generalizacji modelu w różnych warunkach eksperymentalnych oraz integrację samouczenia się, aby zmniejszyć potrzebę ręcznej adnotacji. Reprodukcyjność między laboratoriami zostałaby dalej poprawiona poprzez standaryzację raportowania parametrów obrazu, czynników otoczenia i ustawień treningu modelu. Podsumowując, czynniki te podkreślają zalety i wady opartej na uczeniu maszynowym kwantyfikacji zachowań oraz oferują plan dalszego ulepszania podejść do estymacji postawy w badaniach nad zachowaniami społecznymi u Drosophila.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	BioFroxx	8211GR500
camera(MV-CU013-A0UC)	Hikvision	MV-CU013-A0UC
Carbon Dioxide	Messer	124-38-9
D(+)-Glucose anhydrous	BioFroxx	1179GR500
Drosophila Narrow Vials (Falcon tube)	Biolgix	51-0500
Ethanol	Chron Chemicals	64-17-5
LED panel	/	/	na zamówienie
Methylparaben	Sigma	99-76-3
polyethylene plate	/	/	na zamówienie
Python	/	wersja 3.6
Sucrose	DaMao	57-50-1
transparent acrylic plates	/	/	na zamówienie
Yeast	Angel	100004237033