Dużoskalowowa Produkcja Wezykuł Pozakomórkowych z Gęstych 3D Kultur Komórkowych w Bioreaktorach Perfuzyjnych z Włóknami Pustkowymi

Podsumowanie

Podane są instrukcje dotyczące konfiguracji i używania 3D bioreaktora z przepływowymi włóknami do produkcji pęcherzyków pozakomórkowych z MSC i innych typów komórek. Ten protokół opisuje metodę produkcji pęcherzyków pozakomórkowych w wysokich stężeniach w sposób ciągły, kontrolując jednocześnie gęstość komórek w bioreaktorach z przepływowymi włóknami.

Streszczenie

Postęp w dziedzinie badań nad egozomami jest utrudniony przez małą liczbę komórek i niską produktywność wydzielanych egzosomów w tradycyjnej 2-D kulturze komórkowej. Kultury komórek o wysokiej gęstości w bioreaktorach z dziurkowanych włóknach (HFBR) pozwalają na ciągłą produkcję wydzielonych biocząstek i zewnątrzkomórkowych pęcherzyków (EV) z dużej liczby komórek, przez dłuższy okres czasu, w wysokich stężeniach w 3D kulturze. Ten protokół opisuje metodę zbierania skoncentrowanych wydzielanych egzosomów przy zachowaniu optymalnej masy komórkowej i warunków 3D perfuzyjnej kultury, które wspierają wzrost komórek o wysokiej gęstości przez kilka tygodni lub miesięcy ciągłej produkcji w komercyjnie dostępnym HFBR. System jest kompaktowy, zamknięty, jednorazowego użytku, może być zgodny z cGMP, prosty w użyciu i pasuje do standardowego inkubatora CO² . Niektóre komórki, takie jak komórki macierzyste mezenchymalne (MSC) i ludzkie komórki macierzyste płynu owodniowego (HAFSC), mogą wykazywać zmniejszoną proliferację w tych warunkach, co może potencjalnie wpływać na różnicowanie i fenotyp w ciągu czasu. Przedstawione wyniki pokazują typowe wydajności EV i żywotność komórek przez tygodnie lub dłużej ciągłej produkcji. Ta metoda zapewnia reproduktyjne, wysokiej jakości zbiory EV nadające się zarówno do zastosowań badawczych, jak i klinicznych.

Wprowadzenie

Wezyki dostęczne są coraz częściej rozpoznawane za ich role w komunikacji międzykomórkowej i zastosowaniach terapeutycznych, w tym w medycynie regeneracyjnej. Tradycyjne metody 2-D kultury komórkowej są pracochłonne i o ograniczonym wydajności, czasami wymagające setek kolb do kultury, aby uzyskać wystarczającą liczbę EV do eksperymentów lub badań na zwierzętach^1,2. Skala przekładu klinicznego ogólnie wykorzystuje tradycyjne zamknięte bioreaktory z mikronośnikami lub innymi podpórkami. Systemy te są z natury niefizjologiczne, nieefektywne i mogą mieć zmienne wyniki. Bioreaktory z dziurawą włóknem zapewniają trójwymiarowe środowisko oparte na perfuzyjnym, które wspiera kultury komórek o wysokiej gęstości w kompaktowej podstawie i w skali potencjalnie odpowiedniej dla zastosowań klinicznych^3,4.

HFBR oferują kompaktowy, wysokogęstościowy system kultury komórkowej, umożliwiający ciągłą produkcję skoncentrowanych EV z zmniejszonym wysiłkiem, czasem i przestrzenią w porównaniu z tradycyjną 2-D kulturą⁵. Umożliwiają wysokogęstościowe kultury komórek w kompaktowej przestrzeni, wspierając dużą skalę produkcji EV w dowolnym laboratorium. HFBR hoduje duże liczby komórek (1X10⁹ do 1×10¹⁰) w małej objętości (20–60 mL), w standardowym inkubatorze CO₂ i nie wymagają żadnego specjalistycznego sprzętu. Systemy te umożliwiają ciągłe, skoncentrowane zbiory EV przez tygodnie lub miesiące, ułatwiając jednocześnie użycie zredukowanego surowicy lub chemicznie określonych mediów. W HFBR komórki są zatrzymywane w małej objętości przestrzeni pozakapilarnej (ECS) oddzielonej od recylkulującego medium półprzepuszczalną membraną z dziurawą włóknem o określonym przekroju cięć molekularnych (MWCO) (Rysunek 1). Małe cząsteczki takie jak glukoza i mleczan mogą łatwo przenikać przez włókna, podczas gdy większe elementy takie jak przeciwciała czy zewnątrzkomórkowe wezyki są zatrzymywane i skoncentrowane w ECS, gdzie mogą być zbierane.

Trzy fundamentalne cechy odróżniają kulturę komórek z dziurawą włóknem od każdej innej metody: 1) wysoki stosunek powierzchni do objętości (200 cm²/mL) pozwala na podobne do in vivo gęstości komórek, 1–2 × 10⁸komórek na mL. 2) Komórki są związane z porowatym podłożem, a nie z nieporowatym plastikowym naczyniem. Dzielenie komórek nie jest wymagane³. Przecięcie molekularne (MWCO) włókna można kontrolować. Wydzielane produkty są zatrzymywane i skoncentrowane 10–100X w porównaniu do 2-D kultury flakońskiej wewnątrz ECS kartridżu. Ponadto, specyficzne matryce białkowe, takie jak fibronektyna czy kolagen, mogą być łatwo nałożone na powierzchnię włókna bez wpływu na przepływ przez włókna.

HFBR zapewnia 3D środowisko kultury oparte na perfuzyjnym, które jest bardziej podobne do in vivo niż 2-D kultura⁶ i unikalnie zmniejsza zależność komórek od wsparcia surowicą i upraszcza wymagania dotyczące mediów. To wysokogęstościowe środowisko kultury może wspierać różnice w przetwarzaniu białek w porównaniu do 2-D kultury, wraz z zgłaszanymi zwiększoną bioaktywnością EV^7,8,9. Bioreaktory z dziurawą włóknem są “histocentryczne”; próbują naśladować właściwości podobne do tkanki in vivo fizjologii komórek¹⁰. Dwie kluczowe cechy bioreaktora histocentrycznego to 1) wysoka gęstość komórek, pozwalająca komórkom generować własne specyficzne mikrośrodowisko oraz 2) dzielenie lub przeszczepianie komórek nie jest wymagane, pozwalając na interakcje komórka-komórka i 3D struktury takie jak sferoidy, aby rozwijać się organicznie z czasem. Ta metoda umożliwia gęstości komórek, które są trudne do osiągnięcia z konwencjonalnymi systemami 2-D kultury i może ułatwić użycie uproszczonych, wolnych od białek i chemicznie określonych mediów.

Każdy rodzaj komórek, który może być hodowany w flakonach może być hodowany w bioreaktorze z dziurawą włóknem. Linie komórek transformowanych będą proliferacyjne¹¹. Kluczowym parametrem do monitorowania jest tempo pobierania glukozy. Monitorowanie glukozy zapewnia bezpośrednie miarę aktywności metabolicznej, umożliwiając optymalizację czasu zbioru i kontrolę gęstości komórek¹². Ważne jest kontrolowanie masy komórek w kartridżu, aby tempo pobierania glukozy nie przekraczało zdolności systemu do dostarczania tlenu i usuwania CO². Osiąga się to poprzez proste usuwanie masy komórek podczas zbioru. MSC i HA

Protokół

Wszystkie procedury są zgodne ze standardowymi wytycznymi Good Laboratory Practice (GLP) i Good Cell and Tissue Culture Practice.

UWAGA: Wkładka jest wstępnie złożona i wysterylizowana metodą gamma. Jest podwójnie zapakowana, a na każdym połączeniu znajdują się nakrętki luer, więc jest całkowicie zamknięta i pozostanie sterylna poza torebkami. Zobacz Rysunek 2 dla identyfikacji portu wkładki. Wszystkie kroki wykonywano w temperaturze pokojowej w komorze przepływowej.

1. Przygotowanie i sterylizacja naczynia z nakrętką zbiornika.

1. Wyjmij dwa krótkie kawałki wężyka z podwójnie zapakowanej wkładki.
2. Przymocuj wężyk do kolców wężyka na stalowej rurze z naczynia z nakrętką zbiornika.
3. Owinąć krótki wężyk i odsłonięte końce stalowej rury folią aluminiową, aby zachować sterylność po sterylizacji. Umieść złożone elementy do worka autoklawowego.
4. Sterylizuj autoklawem za pomocą cyklu suchego w temperaturze 121 °C przez 15–30 min. Pozostaw nakrywkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej przed użyciem.

2. Przymocowanie wkładki z dziurkami do butelki zbiornika

1. Przenieś 50 ml PBS z 1-litrowej butelki do 50-mililitrowej stożkowej probówki na późniejsze użycie.
2. Wyjmij nakrywkę zbiornika z worka autoklawowego i usuń folię ochronną z długich stalowych rurek.
3. Zdejmij nakrywkę z butelki z PBS i wkręć nakrywkę zbiornika na jej miejsce. Wyjmij wkładkę z wewnętrznej sterylnej torebki.
4. Zdejmij folię aluminiową z jednego z kawałków wężyka na górze nakrywki zbiornika.
5. Zdejmij nakrętkę luer z jednego z długich kawałków wężyka wkładki i przymocuj ją do wężyka zbiornika na nakrywce zbiornika. Użyj odrobiny obrotu wstecznego, aby zapobiec zaciśnięciu.
6. Powtórz dla drugiego połączenia wężyka.
7. Delikatnie ściśnij brązowy wężyk pompy, aby przepompować PBS przez system, aż wszystkie bąbelki powietrza zostaną usunięte.

3. Wypełnienie dodatkowej przestrzeni kapilarnej (ECS)

1. Napełnij 20 ml PBS do sterylnej strzykawki za pomocą igły o dużej grubości o długości co najmniej 1,5 cala; dla bezpieczeństwa preferowana jest igla stępiona.
2. Dezynfekuj oba boczne złącza luer za pomocą alkoholu i pozwól im wyschnąć.
3. Przymocuj wypełnioną PBS strzykawkę do jednego bocznego portu i pustą sterylną strzykawkę do przeciwległego portu. Zamknij oba końcowe porty i otwórz oba boczne porty.
4. Powoli wstrzykuj PBS do ECS, trzymając wkładkę pod lekko nachylonym kątem, aby zminimalizować bąbelki powietrza. Pusta strzykawka na przeciwległym bocznym porcie wypełni się powietrzem.
5. Jeśli w ECS znajduje się powietrze, otwórz prawy końcowy port i wyciągnij płyn do pustej strzykawki, aż ECS wypełni się płynem (to wyciąga PBS z butelki zbiornika, przez włókna i do ECS).
6. Zamknij oba suwaki bocznych portów, otwórz oba suwaki końcowych portów i sprawdź przepływ delikatnie ściskając palcami wężyk pompy.
7. Pozostaw puste strzykawki przymocowanie do bocznych portów, aby służyły jako nakrywki. Wymień strzykawki na nowe za każdym razem, gdy były poza komorą przepływową.

4. Pokrywanie włókien i inokulacja komórek

UWAGA: Procedury dotyczące pokrywania włókien określonym białkiem matrycy i inokulacją komórek są zasadniczo takie same. Nadmiar płynu przepłynie przez włókna i do zbiornika, podczas gdy komórki lub materiał powlekający pozostaną na zewnątrz włókien w ECS. Zaleca się 1 x 10⁸ komórek do wysiewu. Zaleca się 100–500 μg białka matrycy w 20 ml PBS dla 4 000 cm² HFBR. Białka matrycy związane z powierzchniami włókien nie wpływają na MWCO

1. Przygotuj roztwór powlekający lub zawiesinę komórek w sterylnej 50-mililitrowej stożkowej probówce. 1 X 108 komórek w pożywce warunkowej z rozszerzenia flakonu lub 100–500 ug białka matrycy w PBS. Objętość 20 ml.
2. Wyciągnij 20 ml komórek lub roztworu powlekającego do sterylnej strzykawki za pomocą igły o dużej grubości.
3. Przymocuj strzykawkę zawierającą roztwór do jednego bocznego portu i pustą sterylną strzykawkę do drugiego bocznego portu.
4. Zamknij oba końcowe porty i otwórz oba boczne porty.
5. Delikatnie wymieszaj roztwór, przenosząc płyn między dwiema strzykawkami. Pozostaw 1/2 roztworu w każdej strzykawce. Zamknij oba boczne porty.
6. Otwórz prawy końcowy

Wyniki

Według tego protokołu, 4000 cm² wkład z proliferacją linii komórkowych zużywa zazwyczaj 1–2 g glukozy dziennie. Oznacza to 1 L pożywki co 2–3 dni przy użyciu pożywki o wysokiej zawartości glukozy, takiej jak DMEM. Komórki osiągają maksymalną gęstość w ciągu tygodnia po wysiewie. Zbiór należy rozpocząć po 5–7 dniach lub kiedy tempo poboru glukozy osiągnie 1 g na dobę i powinien być wykonywany codziennie, jeśli to możliwe. W pierwszym tygodniu hodowli pożywkę zawierającą surowicę w ECS można zastąpić pożywką podstawową bez surowicy, zachowując surowicę w krążącej pożywce, jeśli jest to wymagane. Gdy tempo poboru glukozy osiągnie 1 g/dzień, można łatwo przejść do pożywki z zmniejszoną zawartością surowicy lub innej chemicznie zdefiniowanej pożywki. MSC i HAFSC zużywają glukozę w znacznie niższym tempie niż przemianowane linie komórkowe, takie jak CHO, 293 lub hybrydomy. Tworzenie sfroidów jest typowe dla MSC i HAFSC, wraz z innymi typami komórek (Rysunek 3). Codzienna kontrola glukozy daje wiarygodną miarę zdrowia kultury i aktywności metabolicznej. Standardowe, dostępne komercyjnie środki bezksenowe zostały pomyślnie zastosowane z MSC i HAFSC. Objętości zbiorów wynoszą około 20 ml. 24-godzinne przerwy między zbiorami są optymalne, ponieważ stężenia EV osiągają maksimum po 24 h (Rysunek 4). Typowe stężenia egzosomów w pobranej pożywce zawierają się w zakresie 1–5 × 10¹² cząstek/ml, w zależności od rodzaju komórek, liczby komórek po wysiewie i innych czynników, i mogą prowadzić do widoczności pelletów po wirowaniu (Rysunek 5). Można wysiewać duże liczby komórek i powinno to opierać się na liczbie komórek, a nie na powierzchni kultury (Rysunek 6).

Wyniki pokazują, że produkcja EV korelują z aktywnością metaboliczną mierzoną za pomocą poboru glukozy, zapewniając praktyczny parametr monitorowania i optymalizacji wydajności kultury. Codzienny zbiór w 24-godzinnych odstępach maksymalizuje stężenie EV, zachowując stabilność kultury. Te ustalenia wspierają stosowanie monitorowania glukozy i kontrolowanej częstotliwości zbiorów jako kluczowych parametrów do reprodukowalnej produkcji EV w bioreaktorach z dziurawkami.

Rysunek 1: Przekrój bioreaktora z dziurawkami. Pożywka przepływa przez wnętrze włókien, a komórki przyczepiają się do ich zewnętrznych ścianek. Składniki o małej masie cząsteczkowej, takie jak glukoza i mleczan, mogą łatwo przenikać przez włókna. Wydzielane produkty, jak EV, nie mogą przenikać przez włókna i są skoncentrowane w obszarze na zewnątrz włókien, nazywanym ECS (przestrzenią zewnątrzkapilarna). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zdjęcie wkładu z zaznaczonymi portami i zaciśnięciami. Jednokierunkowe zawory zwrotne na ścieżce przepływu generuje przepływ recirculacyjny pożywki. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Mezenchymalne komórki macierzyste, ludzkie komórki macierzyste płynu owodniowego, przodkowie kardiomiocytów i niektóre inne typy komórek tworzą sfroidy, gdy są wysiewane do wkładu w wystarczającej liczbie. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Pomiar stężeń EV po zbiorach w różnych odstępach czasowych. Po 24 h stężenie EV osiąga maksymalne stężenie. Optymalny zbiór jest po 24 h. (Dane udostępnione przez Paolo Neviani, EV core, Children's Hospital of Los Angeles). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Bioreaktory z włóknami dziurawkowatymi nie są w stanie produkować białek czy przeciwciał w rzeczywistych ilościach komercyjnych. Mają jednak unikalną zdolność do hodowli stosunkowo dużej liczby komórek w wysokiej gęstości i wydzielania skoncentrowanego produktu EV w klinicznie istotnej skali. Dopiero w ostatnich latach uznano prawdziwe zalety bioreaktora histocentrycznego. Warunki wysokogatunkowej kultury perfuzyjnej prowadzą do skoncentrowanych EV, przy użyciu pożywki zgodnej z cGMP, w ilościach, które mogą być odpowiednie dla badań i potencjalnych zastosowań klinicznych. Pojedyncze zbiory z 4 000 cm² mogą zawierać od 5 × 10¹² do 1 × 10¹⁴ EV w objętości 10–20 ml. Te plony są w zakresie zgłaszanym w badaniach oceniających dawkowanie EV²².

Codzienna monitoryzacja wskaźnika poboru glukozy jest ważnym parametrem oceny wydajności kultury i jest bezpośrednim wskaźnikiem metabolizmu komórek, ich liczby i zdrowia. Ogólnie preferowane są wyższe stężenia glukozy, takie jak DMEM, które ma początkowe stężenie glukozy 4,5 g/l. Pożywkę należy wymienić na świeżą, gdy glukoza zostanie zużyta w 50%. Niektóre komórki, takie jak MSC, wydają się zużywać glukozę i wytwarzać mleczan przy stężeniach glukozy powyżej 3 g/l, a następnie przełączają się na zużywanie glutaminy i wytwarzanie amoniaku w stężeniach poniżej 3 g/l. Kompletne profilowanie metabolizmu MSC w kulturze 3D jeszcze nie zostało wykonane.

Najbardziej krytycznym parametrem dla udanej kultury w bioreaktorze jest liczba komórek inokulum. Minimalna liczba inokulum komórek dla bioreaktora C2011 o powierzchni 4000 cm² to 1 × 10⁸ komórek. Dla komórek nieproliferujących, takich jak MSC lub HAFSC, preferowana jest większa liczba, do 1 × 10⁹ łącznie. Objętość zbiornika powinna być proporcjonalna do liczby komórek w kasecie. 1 × 10⁸ komórek powinno używać zbiornika nie większego niż 125 ml. 1 × 10⁹ komórek powinno mieć zbiornik nie większy niż 1 l. Zbyt duży zbiornik może sprawić, że komórki wejdą w fazę opóźnienia. Charakteryzuje się to brakiem zużycia glukozy przez komórki, mimo że są one żywotne, jak określono za pomocą barwienia niebieskim trypanowym. W takim przypadku zmniejsz objętość zbiornika lub zasiej więcej komórek. By uzyskać wystarczającą liczbę komórek do skutecznej kultury w bioreaktorze, może być konieczne wielokrotne zasiewanie komórek. Po prostu zasiej więcej komórek na komórki już znajdujące się w kasecie. Oceniają bioreaktora wydajność, zwracaj uwagę na wielkość inokulum komórek. 10-krotne zwiększenie liczby zasiewanych komórek może skutkować 10-krotnie większą produkcją EV.

Modyfikacje protokołu mogą obejmować zmiany w składzie pożywki, powłokach powierzchniowych, liczbie komórek, objętości zbioru, częstotliwości zbioru lub wielkości strzykawki, w zależności od typu komórek i pożądanego plonu. Ciągła kultura umożliwia łatwą, bieżącą optymalizację warunków, ponieważ zmiany można wprowadzać w trakcie kultury, a wyniki uzyskać w czasie rzeczywistym²¹. Rozwiązywanie problemów powinno koncentrować się na utrzymaniu sterylności i monitorowaniu aktywności metabolicznej. Upewnij się, że nie ma blokad ani zgięć w przewodach, szczególnie wokół zaciskowych suwaków. Bakteryjne zakażenie skutkuje szybkim poborem glukozy i mętnością w butelce zbiornika. Grzybicze zakażenie wyznacza się przez puchatą białą akumulację na lewym końcu kapsuli, blokującą przepływ. Użycie systemu bioreaktora z włóknami dziurawkowatymi wymaga umiejętnego postępowania i ścisłego przestrzegania protokołów. Krytyczne kroki obejmują zasiewanie odpowiedniej liczby komórek, utrzymanie sterylności podczas zbioru i staranne monitorowanie zużycia glukozy, aby zapobiec nadmiernej proliferacji lub wyczerpania składników odżywczych. Większość komórek przyczepia się do włókien, czasami w zależności od pokrytej fibronektyną macierzy białkowej, która ułatwia szybkie przyczepianie komórek. Niektóre komórki, takie jak MSC, HAFSC i kardioprogenitorzy, pozostają przyczepione do włókien i tworzą 3D sferoidy.

System HFBR wspiera wysokogatunkowe, chemicznie określone i wolne odksenogene kultury większości typów komórek, ułatwiając dużo skalową produkcję EV²³. Codzienna monitoryzacja glukozy zapewnia wiarygodny wskaźnik wydajności bioreaktora. Zamknięty, perfuzyjny system jest zgodny ze standardami cGMP, a skalowanie jest możliwe za pomocą większych kaset lub nawet wielu kaset. Produkcja EV w skali gramów może być możliwa w zoptymalizowanych warunkach. Bioreaktor z włóknami dziurawkowatymi zapewnia reproduktywalną platformę dla utrzymanej produkcji i zbioru EV w kontrolowanych warunkach. Przedstawiony tutaj protokół kładzie nacisk na praktyczne rozważ

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
16 gauge 1.5" needle	Stellar Scientific	SOLM-111615
3-way stopcock, sterile	Cole-Parmer	UX-48523-28
20mL luer lock syringe	Becton Dickenson	302830
25mL serological pipette, sterile	Stellar Scientific	TC50-TAU-25
25mm syringe filter, sterile	Thomas Scientific	1162B74
38 mm reservoir cap	FiberCell Systems	A1006
50 mL conical centrifuge tubes	Stellar Scientific	T50-101-PK
500 mL Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
CVS Sterile Alcohol Prep Pads, 480 CT	CVS Pharmacy	Item # 376560
Hollow fiber bioreactor	FiberCell Systems	C2011
Human Fibronectin, 1 mg	Corning	354008