W niniejszym badaniu sprawdzono, czy akupotomia wspomaga regenerację chrząstki w króliczym modelu choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego. Pięćdziesiąt królików podzielono na pięć grup. Akupotomii poddawano zwierzęta raz w tygodniu przez 4 tygodnie. W celu zbadania mechanizmu działania oceniano obrzęk stawów, obraz histopatologiczny, poziom cytokin zapalnych oraz markery związane z osią circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK.
Artykuł badawczy
Akupotomia reguluje oś RIC8A/P38 MAPK w oparciu o rusztowanie circRNA w celu promowania regeneracji chrząstki w chorobie zwyrodnieniowej stawów kolanowych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Choroba zwyrodnieniowa stawów kolanowych (KOA) charakteryzuje się postępującą degeneracją chrząstki i stanem zapalnym. W niniejszym badaniu zbadano terapeutyczne efekty akupotomii w króliczym modelu KOA oraz jej powiązanie z osią sygnałową cyrkularnego RNA fosfodiesterazy 4B (circPDE4B)/oporności na inhibitory cholinesterazy 8A (RIC8A)/p38 kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK). Pięćdziesiąt królików rasy Nowozelandzkiej Białej randomly przydzielono do pięciu grup (n = 10 na grupę): kontrolnej, modelu KOA, celekoksybu, akupotomii oraz pozornej akupotomii. KOA indukowano za pomocą zmodyfikowanej metody Videmana. Począwszy od 6 tygodni po stworzeniu modelu, akupotomietę przeprowadzano raz w tygodniu przez 4 tygodnie, natomiast celekoksyb podawano codziennie doustnie w dawce 24 mg/kg przez 4 tygodnie. Oceniano obrzęk kolana oraz histopatologię chrząstki. Poziomy interleukiny-1β (IL-1β), czynnika martwicy nowotworów-α (TNF-α) oraz interleukiny-6 (IL-6) w homogenatach tkanki chrząstki mierzono za pomocą testu ELISA. Ekspresję genów i białek związanych z metabolizmem chrząstki oraz osią circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK oceniano za pomocą ilościowej odwróconej transkrypcji polimerazy łańcuchowej (qRT-PCR) i techniki Western blotting. W porównaniu z grupą modelu KOA, akupotomia zmniejszyła obrzęk kolana, poprawiła wyniki histopatologiczne, obniżyła poziomy cytokin zapalnych, spowodowała downregulację metaloproteinazy macierzy-3 (MMP-3), metaloproteinazy macierzy-13 (MMP-13), RIC8A oraz fosforylowanej p38 MAPK, a także upregulację czynnika transkrypcyjnego SRY-box 9 (SOX9), agrekanu i względnego poziomu circPDE4B. Efekty te były porównywalne z efektami celekoksybu, podczas gdy pozorna akupotomia nie przyniosła istotnej poprawy. Wyniki te wskazują, że akupotomia łagodzi stan zapalny i degenerację chrząstki w króliczym modelu KOA i jest związana z modulacją osi circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK.
Wprowadzenie
Choroba zwyrodnieniowa stawu kolanowego (KOA) jest powszechną degeneracyjną chorobą stawów, charakteryzującą się postępującą degradacją chrząstki, zapaleniem błony maziowej, sklerozą kości podchrzęstnej oraz tworzeniem się osteofitów1,2,3. W związku ze starzeniem się populacji światowej zapadalność na KOA nadal rośnie, co czyni ją główną przyczyną dysfunkcji stawów i przewlekłego bólu u osób w średnim wieku i seniorów na całym świecie4,5,6. Obecne metody leczenia klinicznego koncentrują się przede wszystkim na łagodzeniu objawów za pomocą środków farmakologicznych, takich jak niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) i dokanałowe wstrzyknięcia kortykosteroidów. Jednak terapie modyfikujące przebieg choroby, zdolne do zatrzymania jej postępu lub promowania regeneracji chrząstki, pozostają ograniczone7,8.
Nowe dowody wskazują na istotną rolę regulacyjną niekodujących RNA (ncRNA) w patogenezie i progresji KOA9,10,11. Wśród tych ncRNA szczególną uwagę zwracają koliste RNA (circRNA) ze względu na ich unikalną, kowalencyjnie zamkniętą strukturę pętli, która zapewnia większą stabilność niż w przypadku liniowych RNA, a także ze względu na ich różnorodne funkcje biologiczne12,13. Shen i współpracownicy wykazali, że circPDE4B działa jako rusztowanie molekularne regulujące oporność na inhibitory szlaku sygnałowego RIC8A (resistance to cholinesterase 8A)/p38 MAPK (mitogen-activated protein kinase), wpływając tym samym na metabolizm macierzy zewnątrzkomórkowej chondrocytów oraz odpowiedzi zapalne14. Szlak RIC8A/p38 MAPK odgrywa ważną rolę w regulacji stanu zapalnego, katabolizmu, apoptozy i starzenia się chondrocytów, co w konsekwencji przyczynia się do patogenezy choroby zwyrodnieniowej stawów15.
Akupotomia jest małoinwazyjnym podejściem terapeutycznym, które integruje teorię tradycyjnej medycyny chińskiej z nowoczesnymi zasadami anatomicznymi i wykazuje obiecującą skuteczność w klinicznym leczeniu KOA16,17. Technika ta wykorzystuje specjalistyczne urządzenie w postaci igły-noża do uwalniania zrostów tkanek miękkich, poprawy lokalnego krążenia i przywrócenia równowagi biomechanicznej wokół dotkniętych stawów, co łagodzi ból i poprawia funkcjonalność u pacjentów z KOA18. Pomimo tych zgłaszanych korzyści klinicznych, mechanizmy molekularne leżące u podstaw efektów terapeutycznych akupotomii, w szczególności jej potencjalna regulacja szlaków sygnałowych zależnych od circRNA uczestniczących w naprawie chrząstki, pozostają w dużej mierze niezbadane.
Mechanistycznie akupotomia generuje lokalne bodźce mechaniczne poprzez uwolnienie tkanek miękkich wokół stawu. Chondrocyty są komórkami mechanowrażliwymi, które reagują na sygnały biomechaniczne, a wykazano, że circRNA uczestniczą w odpowiedziach mechanotransdukcyjnych chondrocytów19,20. Chociaż brakuje bezpośrednich dowodów łączących akupotomię z regulacją specyficznych dla chrząstki stawowej circRNA, jest biologicznie prawdopodobne, że sygnały mechaniczne generowane przez akupotomię mogą modulować mechanowrażliwe circRNA, takie jak circPDE4B. Ta możliwość stała się podstawą niniejszego badania.
Opierając się na wcześniejszych odkryciach dotyczących roli regulacyjnej circPDE4B w osi sygnałowej RIC8A/p38 MAPK, w niniejszym badaniu wykorzystano króliczy model OA indukowanej zmodyfikowaną metodą Videmana, aby sprawdzić hipotezę, że akupotomia wspomaga regenerację chrząstki poprzez modulację ścieżki sygnałowej circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK. Akupotomia została wybrana do tego badania spośród innych interwencji w OA z kilku powodów. Po pierwsze, w porównaniu ze środkami farmakologicznymi, takimi jak niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) i celekoksyb, które przede wszystkim łagodzą objawy i wiążą się z ograniczonymi efektami modyfikującymi przebieg choroby oraz potencjalnymi długofalowymi działaniami niepożądanymi7,8, akupotomia oferuje niefarmakologiczne podejście, które odnosi się zarówno do miejscowych czynników mechanicznych, jak i biologicznych szlaków sygnałowych. Po drugie, w przeciwieństwie do dostawców kortykosteroidów lub kwasu hialuronowego do stawu, które wymagają wielokrotnej podaży wewnątrzstawowej i niosą ryzyko infekcji oraz uszkodzenia stawu, akupotomia celuje w okołstawowe tkanki miękkie i może wywierać trwałe efekty biomechaniczne i biochemiczne21. Po trzecie, dowody kliniczne wykazały, że akupotomia daje porównywalne lub lepsze wyniki niż terapie konwencjonalne w redukcji bólu i poprawie funkcji stawów u pacjentów z OA, a badania eksperymentalne zasugerowały, że akupotomia moduluje odpowiedzi zapalne i metabolizm chondrocytów21,22. Jednakże specyficzne szlaki molekularne, poprzez które akupotomia wywiera swoje działanie chondroprotekcyjne, pozostają słabo scharakteryzowane, szczególnie w odniesieniu do sygnalizacji pośredniczonej przez circRNA. Zatem badanie związku między akupotomią a osią circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK może dostarczyć nowych wglądów mechanistycznych i wesprzeć stosowanie akupotomii jako interwencji modyfikującej przebieg OA16,18. Głównymi punktami końcowymi były obrzęk stawu kolanowego, histopatologiczna degeneracja chrząstki (skale Mankina i Morana), poziomy cytokin zapalnych (interleukina-1β, czynnik martwiczy nowotworu-α i interleukina-6), ekspresja markerów związanych z metabolizmem chrząstki (metaloproteinaza macierzy-3, metaloproteinaza macierzy-13, czynnik transkrypcyjny SRY-box 9 i agrekan) oraz ekspresja circPDE4B i RIC8A, a także fosforylacja p38 MAPK. Akupotomię stosowano raz w tygodniu przez 4 tygodnie w wybranych punktach okołstawowych przy użyciu techniki czterostopniowej (uwolnienie podłużne, separacja poprzeczna i nacięcie guzków). Do scharakteryzowania efektów akupotomii i zbadania jej potencjalnych podstaw molekularnych w OA wykorzystano ocenę histopatologiczną, pomiar cytokin zapalnych oraz analizy ekspresji genów i białek.
Protokół
Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Zwierząt Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Anhui (numer zatwierdzenia AHUCM-rabbits-2023195). Odczynniki, substancje chemiczne, oprogramowanie i narzędzia użyte w niniejszym protokole zostały wymienione w Tabeli materiałów.
1. Zwierzęta doświadczalne i podział na grupy
Pięćdziesiąt zdrowych dorosłych samców królików Nowozelandzkich Białych (w wieku 6 miesięcy, o masie 2,0–2,5 kg) pozyskano z fermy hodowlanej Nanjing Pukou District Laifu (licencja produkcji zwierząt nr: SCXK (Su) 2024-07). Wszystkie zwierzęta przeszły 1-tygodniowy okres aklimatyzacji i karmienia przed rozpoczęciem eksperymentu. Prawy staw kolanowy wyznaczono do oceny obrzęku, a lewy staw kolanowy do pobrania tkanki chrząstki, zgodnie ze stałą konwencją proceduralną, a nie w oparciu o konkretną hipotezę badawczą. Po aklimatyzacji króliki zostały losowo przydzielone do pięciu grup (n = 10 na grupę): grupy kontrolnej, która nie została poddana procedurze modelowania ani leczeniu; grupy modelu KOA, w której indukowano KOA zmodyfikowaną metodą Videmana; grupy celekoksybu, w której leczenie farmakologiczne rozpoczęto 6 tygodni po modelowaniu; grupy akupotomii, w której zabieg akupotomii rozpoczęto 6 tygodni po modelowaniu; oraz grupy pozornej akupotomii, w której wprowadzanie igieł bez nacinania lub rozluźniania rozpoczęto 6 tygodni po modelowaniu.
2. Ustanowienie modelu KOA
Wszystkie króliki, z wyjątkiem osobników z grupy kontrolnej, zostały poddane zmodyfikowanej procedurze Videmana w celu wywołania KOA. Zwierzęta pozostawiono na czczo przez 12 h przed operacją. Znieczulenie wprowadzono poprzez dożylną administrację 3% pentobarbitalu sodowego w dawce 30 mg/kg przez brzeżną żyłę uszną. Po rutynowym przygotowaniu miejsca operacyjnego, dezynfekcji i założeniu sterylnych pól, wykonano cięcie wzdłuż przyśrodkowej strony stawu kolanowego. Następnie kolejno przecięto więzadło poboczne przyśrodkowe oraz więzadło krzyżowe przednie, a łąkotkę przyśrodkową usunięto całkowicie. Następnie rano cięcia zamknięto warstwowo.
Aby zmniejszyć ryzyko infekcji pooperacyjnej, podawano penicylinę domięśniowo w dawce 40 00 U/kg/dobę przez 3 kolejne dni. Po operacji króliki wróciły do klatek, gdzie zapewniono im swobodę ruchu bez unieruchamiania stawów.
3. Zabieg pozornej akupotomii
W 6. tygodniu po indukcji KOA króliki w grupie pozornej akupotomii poddano tym samym procedurom palpacyjnym i wyznaczaniu punktów, co w przypadku aktywnego leczenia akupotomią. Sterylną jednorazową igłę do akupotomii o wymiarach 0,35 mm × 25 mm wprowadzono prostopadle przez skórę w każdym wyznaczonym punkcie, aż do osiągnięcia tkanki podskórnej. Nie wykonywano nacinania, rozluźniania, manipulacji poprzecznych ani żadnych innych manewrów mechanicznego uwalniania tkanek. Igłę wycofano natychmiast po wprowadzeniu, bez manipulacji w tkankach. Zabieg pozorny przeprowadzano raz w tygodniu przez 4 kolejne tygodnie.
4. Zabieg akupotomii
W 6. tygodniu po stworzeniu modelu KOA króliki z grupy akupotomii unieruchomiono na stole zabiegowym. Przeprowadzono palpację tkanek okołostawowych w obrębie dotkniętego kolana, szczególnie wokół rzepki oraz w przyśrodkowej i bocznej szczelinie stawowej, aby zidentyfikować struktury przypominające sznury lub twarde guzki. Na podstawie wyników palpacji wybrano od czterech do sześciu punktów zabiegowych i zaznaczono je na skórze.
Obszar zabiegowy zostanie ogolony i zdezynfekowany zgodnie ze standardowymi procedurami sterylnymi. Sterylną jednorazową igłę do akupotomii o wymiarach 0,35 mm × 25 mm wprowadzono powoli i prostopadle w każdym zaznaczonym punkcie, aż do osiągnięcia powierzchni kości. Procedurę wykonano zgodnie z czterostopniową techniką akupotomii. W pierwszej kolejności wykonano zwolnienie podłużne, a następnie separację poprzeczną. W przypadku napotkania twardego guzka, nacinano go do momentu odczucia wyraźnego zwolnienia oporu za pomocą igły-noża. Po zakończeniu procedury igłę wycofano, a każde miejsce wkłucia krótko uciśnięto sterylną gazą i przykryto plastrem z opatrunkiem. Zabiegi przeprowadzano raz w tygodniu przez 4 kolejne tygodnie.
5. Leczenie farmakologiczne
W 6. tygodniu po stworzeniu modelu KOA, króliki w grupie celekoksybu otrzymywały zawiesinę celekoksybu drogą doustną w dawce 24 mg/kg raz dziennie przez 4 kolejne tygodnie. Zawiesinę przygotowywano każdego dnia na świeżo w soli fizjologicznej. Informacje o dostawcy i numerach katalogowych znajdują się w Tabeli Materiałów.
6. Ocena obrzęku stawu kolanowego
Po zakończeniu okresu interwencji, czyli 10 tygodni po wywołaniu modelu KOA, oceniono obrzęk stawu kolanowego. Wokół najbardziej obrzękniętego obszaru prawego stawu kolanowego, zazwyczaj na poziomie plateau kości piszczelowej, owinięto miękką jedwabną nitkę. Nitkę zdjęto i zmierzono linijką z dokładnością do 1 mm, a zarejestrowaną długość zdefiniowano jako obwód kolana.
Względny stopień pęcznienia obliczono za pomocą następującego równania:
7. Pobieranie próbek
Po zakończeniu okresu interwencji króliki zanieczulono poprzez dożylne podanie 3% pentobarbitalu sodu w dawce 30 mg/kg przez brzeżną żyłę uszną. Lewy staw kolanowy otwarto za pomocą skalpela z ostrzem nr 23, aby odsłonić powierzchnie stawowe plateau kości piszczelowej i kłykci kości udowej. Z tych obszarów pobrano tkankę chrząstki stawowej.
Każdą próbkę chrząstki podzielono na dwie części. Jedną część utrwalono w 4% paraformaldehydzie do badania histopatologicznego. Drugą część umieszczono w probówkach kriogenicznych, szybko zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze −80 °C do czasu przeprowadzenia analiz molekularnych. Natychmiast po zakończeniu wszystkich procedur pobierania tkanek króliki uśpiono poprzez zator powietrzny, stosując szybki wtrysk powietrza dożylnie przez brzeżną żyłę uszną.
Barwienie histologiczne oraz ocena w skalach Mankina i Morana zostały przeprowadzone na próbkach chrząstki od wszystkich 10 królików w każdej grupie (n = 10). Reprezentatywne obrazy po barwieniu hematoksyliną i eozyną oraz Safranin O–Fast Green wybrano z trzech losowo wybranych królików na grupę. Immunohistochemię oraz Western blotting przeprowadzono z wykorzystaniem próbek od trzech losowo wybranych królików na grupę (n = 3). Ilościową reakcję polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją oraz test ELISA wykonano na próbkach od sześciu losowo wybranych królików na grupę (n = 6). Wszystkie wybory podzbiorów przeprowadzono losowo, bez uprzedniej wiedzy o przydziale do grup.
8. Barwienie hematoksyliną i eozyną
Tkankę chrzęstną utrwaloną w 4% paraformaldehydzie odwapniano w 10% roztworze kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) o pH 7,4 przez 4–6 tygodni. Roztwór odwapniający wymieniano co 3 dni. Po potwierdzeniu odwapnienia za pomocą badania penetracji igłą, tkankę odwodniono, przechodząc przez szereg stężeń etanolu: 70%, 80%, 90%, 95% i 10%, odbarwiono w ksylenie i zatopiono w parafinie. Zatopioną tkankę pocięto na skrawki o grubości 5 µm przy użyciu mikrotomu, a następnie naniesiono je na szkiełka przedmiotowe.
W przypadku barwienia hematoksyliną i eozyną preparaty poddawano działaniu temperatury 60 °C przez 60 min, odparafinowano w ksylenie (trzykrotna wymiana, każdorazowo przez 5 min), a następnie rehydratowano sekwencyjnie w etanolu o stężeniach 10%, 95%, 80% i 70%, kończąc wodą destylowaną. Preparaty barwiono hematoksyliną przez 5 min, płukano pod bieżącą wodą z kranu przez 10 min, różnicowano w 1% kwasie solnym przygotowanym w 70% etanolu przez 2–3 s i płukano wodą destylowaną. Następnie preparaty barwiono eozyną przez 2 min, płukano wodą destylowaną, odwadniano w etanolu o stężeniach 70%, 80%, 90%, 95% i 10%, odbarwiano w ksylenie i zamykano w neutralnej żywicy. Przebadano morfologię chrząstki i wykonano reprezentatywne zdjęcia przy użyciu mikroskopu świetlnego.
9. Barwienie safraniną O i Fast Green
Przekroje chrząstki zatopione w parafinie odparafinowano i rehydratowano zgodnie z opisem w punkcie 8. Przekroje barwiono hematoksyliną żelazową Weigerta przez 5 min, a następnie płukano wodą destylowaną. Następnie przekroje barwiono 0,05% roztworem Fast Green przez 3 min, krótko płukano w 1% kwasie octowym przez 10–15 s i barwiono 0,1% roztworem safraniny O przez 5 min.
Po barwieniu przekroje szybko odwodniono w 95% i 10% etanolu, przejrzystowano w ksylenie i zamontowano w żywicy neutralnej. Zabarwione przekroje zbadano za pomocą mikroskopu świetlnego. Intensywność barwienia safraniną O, odzwierciedlająca zawartość proteoglikanów, została przeanalizowana półilościowo przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu.
10. Ocena histologiczna
Dwóch patologów, nieznających przydziału grup eksperymentalnych, niezależnie oceniało barwione przekroje, stosując systemy punktacji Mankina i Morana w celu określenia stopnia degeneracji chrząstki. Przed oceną wszystkim przekrojom przypisano losowe kody identyfikacyjne. Informacje o przydziale do grup terapeutycznych nie zostały ujawnione patologom aż do zakończenia całego procesu punktacji23.
1. Test enzymoimmunologiczny (ELISA)
Zważoną zamrożoną tkankę chrząstki połączono z buforem fosforanowym o pH 7,4 i dokładnie homogenizowano na lodzie. Homogenat odwirowano przy 3,0 × g przez 20 min w temperaturze 4 °C, a następnie zebrano nadosad dla celów analizy. Stężenia interleukiny-1β (IL-1β), czynnika martwicy nowotworów-α (TNF-α) oraz interleukiny-6 (IL-6) w nadosadzie tkankowym zmierzono przy użyciu zestawów do testu ELISA specyficznych dla królika, zgodnie z instrukcjami producenta.
12. Ilościowa reakcja polimerazy w łańcuchu z odwrotną transkrypcją
Całkowity RNA wyekstrahowano z tkanki chrząstki, stosując metodę opartą na fenolu i chloroformie. W skrócie, tkankę lizo-wano w odczynniku do ekstrakcji RNA, a następnie dodano chloroform w celu rozdzielenia fazy wodnej i organicznej. Zebrano fazę wodną, a RNA wytrącono izopropanolem, przemyto 75% etanolem, wysuszono na powietrzu i rozpuścili w wodzie traktowanej piroweglanem dietylu. Stężenie i czystość RNA zmierzono za pomocą spektrofotometru.
Przed odwrotną transkrypcją pozostałości genomicznego DNA usunięto za pomocą odczynnika do eliminacji genomicznego DNA. Następnie zsyntetyzowano komplementarne DNA, korzystając z zestawu do odwrotnej transkrypcji zgodnie z instrukcją producenta. Ilościową reakcję łańcuchową polimerazy przeprowadzono z wykorzystaniem metody detekcji opartej na SYBR Green w systemie do polimerazy łańcuchowej w czasie rzeczywistym. Warunki cykliczne były następujące: wstępna denaturacja w 95 °C przez 1 min, a następnie 40 cykli denaturacji w 95 °C przez 20 s oraz przyłączania i elongacji w 60 °C przez 1 min. W celu oceny specyficzności amplifikacji przeprowadzono analizę krzywej dysocjacji.
Zmierzono poziomy ekspresji metaloproteinazy macierzy-3 (MMP-3), metaloproteinazy macierzy-13 (MMP-13), czynnika transkrypcyjnego SRY-box 9 (SOX9), agrekanu, RIC8A oraz circPDE4B. β-actin wykorzystano jako wewnętrzny gen referencyjny. Ekspresję względną obliczono przy użyciu opisanej metody. Sekwencje starterów znajdują się w Tabeli 1.
13. Analiza Western blot
Tkankę chrząstki poddano lizie w buforze do radioimmunoprecypitacji wzbogaconym o fluorek fenylometylosulfonylowy. Lizat wirowano przy 12,0 × g przez 15 min w temperaturze 4 °C, a nadfiltr zebrano jako frakcję białek całkowitych. Stężenie białka oznaczono za pomocą testu kwasu bicinchonowego.
Równe ilości białka (30 µg na ścieżkę) rozdzielono za pomocą 10% elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu, a następnie przeniesiono na membrany z polifluorku winylidenu, które uprzednio aktywowano w metanolu. Transfer przeprowadzono przy 30 mA w temperaturze 4 °C. Czasy transferu wynosiły: aggrecan (250 kDa) przez 90 min; MMP-3 (60 kDa), RIC8A (59 kDa), SOX9 (56 kDa) i MMP-13 (52 kDa) przez 50 min; oraz p38 MAPK (41 kDa) i GAPDH (36 kDa) przez 40 min. Membrany blokowano 5% odtłuszczonym mlekiem w proszku w buforze TBS-Tween 20 przez 2 h w temperaturze pokojowej. Następnie membrany inkubowano przez noc w 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko MMP-3 (1:2,0), MMP-13 (1:1,0), SOX9 (1:1,0), aggrecan (1:1,0), RIC8A (1:1,50), fosforylowanemu p38 MAPK (1:1,0) oraz całkowitemu p38 MAPK (1:2,00). Jako kontrolę załadunku wykorzystano GAPDH (1:2,0). Po trzech przemyciach w buforze TBS-Tween 20 (po 10 min każde), membrany inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi koniugowanymi z peroksydazą chrzanową (1:20,0) przez 1,2 h w temperaturze pokojowej. Po trzech dodatkowych przemyciach prążki białkowe wizualizowano przy użyciu substratu do wzmocnionej chemiluminescencji i obrazowano za pomocą systemu dokumentacji żeli. Intensywność prążków ilościowo określono przy użyciu oprogramowania ImageJ i znormalizowano do GAPDH.
14. Immunohistochemia
Przetoki chrząstki zatopione w parafinie poddano deparafinizacji i rehydratacji w szeregu rozcieńczeń etanolu (trzykrotna zmiana ksylenu, po 5 min każda; następnie etanol 100%, 95% i 80%, po 3 min każdy). Odzyskiwanie antygenu przeprowadzono poprzez podgrzewanie skrawków w buforze EDTA (pH 9,0) w szybkowarze. Bufor podgrzano do wrzenia, a po osiągnięciu odpowiedniego ciśnienia proces odzyskiwania kontynuowano przez 2 min, po czym schłodzono preparaty do temperatury pokojowej. Endogenną aktywność peroksydazy zablokowano za pomocą 3% nadtlenku wodoru przez 10 min w temperaturze pokojowej. Po przemyciu niespecyficzne wiązanie zablokowano surowicą kozią przez 20 min w temperaturze pokojowej, w ciemności.
Przekroje inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko fosforylowanej p38 MAPK (1:80) oraz fosforylowanemu jądrowemu czynnikowi kappa B (NF-κB) (1:30) przez 60 min w temperaturze 37 °C. Po trzech przemyciach solą fizjologiczną z buforem fosforanowym z dodatkiem Tween 20, przekroje inkubowano z odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową przez 30 min w temperaturze 37 °C. Po trzech kolejnych przemyciach zastosowano diaminobenzydynę do opracowania barwy (kontrolowanego pod mikroskopem), a następnie wykonano przeciwbarwienie hematoksyliną (2 min), różnicowanie w 1% kwasie solnym w 70% etanolu oraz niebieskie barwienie w roztworze węglanu litu (30 s). Następnie przekroje odwodniono, przejrzystowano, zamontowano i zbadano za pomocą mikroskopu świetlnego. Barwienie oceniono przy użyciu oprogramowania ImageJ, a do analizy półilościowej obliczono całkowitą gęstość optyczną.
15. Analiza statystyczna
Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Porównania wielu grup przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji, a następnie testu post hoc Tukeya. Wartość P < 0,05 uznano za istotną statystycznie.
Wyniki
Akupotomia łagodzi zmiany histologiczne w chrząstce stawowej
Jak pokazano na rysunku 1A,B, obwód kolana oraz względny wskaźnik obrzęku były znacznie zwiększone w grupie modelowej KOA w porównaniu z grupą kontrolną. Oba parametry uległy znacznemu zmniejszeniu po leczeniu akupotomią lub celekoksybem, podczas gdy pozorna akupotomia nie przyniosła istotnej poprawy w porównaniu z grupą modelową KOA.
Jak pokazano na rysunku 1C,D, wynik Mankina był znacznie wyższy w grupie modelu KOA niż w grupie kontrolnej i uległ znacznemu obniżeniu po leczeniu za pomocą akupotomii lub celekoksybu. W grupie pozornej akupotomii nie zaobserwowano istotnej redukcji. Wynik Moran wskazał przeciwny wzorzec.
Barwienie hematoksyliną i eozyną oraz Safranin O–Fast Green wykazało cieńczenie i przerwanie ciągłości powierzchni chrząstki stawowej, z lokalnymi nadżerkami w grupie modelu KOA w porównaniu z grupą kontrolną (Rysunek 1E,F). Akupotomia i celekoxyb złagodziły te zmiany patologiczne, co objawiło się wyraźniejszymi konturami chrząstki i zmniejszeniem uszkodzeń strukturalnych. W przeciwieństwie do nich, grupa z pozorowaną akupotomią wykazała cechy patologiczne podobne do tych w grupie modelu KOA. Wyniki te wskazują, że akupotomia wywarła działanie porównywalne z działaniem celekoxybu w zakresie zmniejszania obrzęku stawów i degeneracji chrząstki oraz poprawy wyników histologicznych w modelu KOA.
Akupotomia obniża poziom cytokin zapalnych
Jak pokazano na rysunkach 2A–C, stężenia interleukiny-1β (IL-1β), czynnika martwicy nowotworu-α (TNF-α) oraz interleukiny-6 (IL-6) w homogenatach tkanki chrzestnej były znacznie wyższe w grupie modelowej KOA niż w grupie kontrolnej. Leczenie akupotomią lub celekoksibem znacząco obniżyło poziomy wszystkich trzech cytokin zapalnych. W przeciwieństwie do nich, w grupie pozornej akupotomii nie odnotowano istotnej redukcji w porównaniu z grupą modelową KOA.
Akupotomia moduluje szlak sygnałowy RIC8A/p38 MAPK na poziomie białkowym
Analiza immunohistochemiczna wykazała, że ekspresja fosforylowanej kinazy białkowej aktywowanej przez mitogeny p38 (p-p38 MAPK) oraz fosforylowanego jądrowego czynnika kappa B (NF-κB) była znacząco niższa w grupach poddanych akupotomii oraz leczonych celekoksybem niż w grupie modelowej KOA (Rycina 3A). Nie zaobserwowano istotnych różnic między grupą z pozorowaną akupotomią a grupą modelową KOA.
Analiza Western blot wykazała, że poziomy białek metaloproteinazy macierzy-3 (MMP-3), metaloproteinazy macierzy-13 (MMP-13), białka RIC8A (resistance to inhibitors of cholinesterase 8A) oraz p-p38 MAPK były znacznie wyższe w grupie z modelem KOA niż w grupie kontrolnej, natomiast poziomy białek związanych z syntezą chrząstki – czynnika transkrypcyjnego SRY-box 9 (SOX9) i agrekanu – były znacznie niższe. W porównaniu z grupą z modelem KOA, w grupach poddanych akupotomii oraz leczeniu celekoksybem zaobserwowano zmniejszoną ekspresję MMP-3, MMP-13, RIC8A i p-p38 MAPK oraz zwiększoną ekspresję SOX9 i agrekanu. Grupa pozorowanej akupotomii wykazała wzorce ekspresji białek podobne do grupy z modelem KOA, bez istotnych zmian w poziomach mierzonych białek (Rysunek 3B–I). Wyniki te wskazują, że efekty akupotomii i celekoksybu w KOA były związane z modulacją szlaku sygnałowego RIC8A/p38 MAPK.
Akupotomia moduluje ścieżkę sygnałową RIC8A/p38 MAPK na poziomie transkrypcyjnym
Jak pokazano na Rysunku 4A–G, poziomy ekspresji MMP-3, MMP-13 i RIC8A były znacznie wyższe w grupie modelu KOA niż w grupie kontrolnej, natomiast ekspresja SOX9 i aggrecan była znacznie niższa. W porównaniu z grupą modelu KOA, akupotomia oraz celekoksyb zmniejszyły ekspresję MMP-3, MMP-13 i RIC8A oraz zwiększyły ekspresję SOX9 i aggrecan. W grupie z pozorowaną akupotomią nie odnotowano istotnych różnic w zmierzonych poziomach transkrypcji w porównaniu z grupą modelu KOA.
Akupotomia zwiększyła również względną ekspresję circPDE4B, co wskazuje, że jej efekty terapeutyczne były związane z modulacją osi sygnałowej circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK oraz z osłabieniem sygnalizacji zapalnej i katabolicznej.
DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:
Surowe dane potwierdzające wyniki niniejszego badania, w tym dane z testów ELISA, barwienia H&E, immunohistochemii, RT‑qPCR, barwienia Safranin O–Fast Green oraz western blot, są ogólnodostępne w repozytorium Figshare pod adresem https://doi.org/10.6084/m9.figshare.3090935.
Rycina 1. Akupotomia zmniejsza obrzęk kolana i degenerację chrząstki stawowej u królików z chorobą zwyrodnieniową stawów kolanowych. (A) Obwód kolana. (B) Względny wskaźnik obrzęku kolana. (C) skala histologiczna Mankina (D) skala histologiczna Morana. (E) Reprezentatywne przekroje chrząstki stawowej barwione hematoksyliną i eozyną z grup kontrolnej, modelu KOA, celekoksybu, akupotomii oraz sham-akupotomii. (F) Reprezentatywne przekroje barwione safraniną O i szybką zielenią (Fast Green) z pięciu grup eksperymentalnych. Ocena histologiczna (według skali Mankina i Morana) została przeprowadzona na próbkach od wszystkich 10 królików w grupie (n = 10), natomiast reprezentatywne obrazy dla H&Barwienie E i Safranin O–Fast Green przeprowadzono na próbkach pobranych od 3 losowo wybranych królików z każdej grupy. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Porównania statystyczne wykonano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji, po której zastosowano test post hoc Tukeya. Poziome paski wskazują porównywane grupy. P < 0.05, P < 0,01 oraz P < 0,01. Paski skali, 100 µmSkróty: KOA = choroba zwyrodnieniowa stawu kolanowego; SEM = standardowy błąd średniej. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2. Akupotomia obniża poziom cytokin zapalnych u królików z chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego. (A) Stężenie interleukiny-1β. (B) Stężenie interleukiny 6. (C) Stężenie czynnika martwicy nowotworów $\alpha$. Stężenia cytokin zmierzono za pomocą metody enzymatycznego immunoabsorpcyjnego testu (ELISA) w próbkach pobranych od sześciu królików w każdej grupie (n = 6). Dane przedstawiono jako średnią $\pm$ SEM. Porównania statystyczne przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji, a następnie testu post hoc Tukeya. Poziome paski wskazują grupy poddane porównaniu. P < 0.05, P < 0,01 oraz P < 0.01. Skróty: IL-1β = interleukina-1β; IL-6 = interleukina-6; KOA = choroba zwyrodnieniowa stawu kolanowego; SEM = standardowy błąd średniej; TNF-α = czynnik martwicy nowotworów-α. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rysunek 3. Acupotomia moduluje białka związane ze stanem zapalnym i metabolizmem chrząstki u królików z chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego. (AReprezentatywne obrazy immunohistochemiczne wykazujące ekspresję fosforylowanego jądrowego czynnika kappa B oraz fosforylowanej kinazy białkowej aktywowanej mitogenem p38 w chrząstce stawowej w grupach: kontrolnej, modelu KOA, celekoksybu, akupotomii oraz pozornej akupotomii. Paski skali, 100 µm. (B) Reprezentatywne analizy Western blot przedstawiające ekspresję białek SOX9, RIC8A, MMP-13, fosforylowanej p38 MAPK, całkowitej p38 MAPK, MMP-3, aggrecan oraz GAPDH. (C) Ilościowe oznaczenie densytometryczne aggrekanu z normalizacją względem GAPDH. (D) Ilościowe oznaczenie MMP-13 z normalizacją do GAPDH. (E) Ilościowe oznaczenie MMP-3 z normalizacją do GAPDH. (F) Ilościowe oznaczenie całkowitego poziomu p38 MAPK z normalizacją do GAPDH. (G) Ilościowe oznaczenie fosforylowanej p38 MAPK z normalizacją do GAPDH. (H) Ilościowe oznaczenie poziomu SOX9 znormalizowanego do GAPDH. (I) Ilościowe oznaczenie poziomu RIC8A znormalizowanego do GAPDH. Analizy Western blot przeprowadzono z wykorzystaniem próbek od trzech królików w każdej grupie (n = 3). Dane przedstawiono jako średnią ± SEM. Porównania statystyczne wykonano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji, a następnie testu post hoc Tukeya. Poziome paski wskazują porównywane grupy. P < 0.05, P < 0,01 oraz P < 0.01. Skróty: GAPDH = dehydrogenaza glikoldealdehydu-3-fosforanu; KOA = choroba zwyrodnieniowa stawu kolanowego; MAPK = kinaza białkowa aktywowana mitogenem; MMP-3 = metaloproteinaza macierzy-3; MMP-13 = metaloproteinaza macierzy-13; NF-κB = czynnik jądrowy kappa B; p-NF-κB = fosforylowany czynnik jądrowy kappa B; p-p38 MAPK = fosforylowana p38 MAPK; RIC8A = białko oporności na inhibitory cholinesterazy 8A; SEM = standardowy błąd średniej; SOX9 = czynnik transkrypcyjny SRY-box 9. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4. Acupotomia moduluje transkrypty związane z metabolizmem chrząstki oraz ekspresję circPDE4B u królików z chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego. (A) Względna ekspresja agrekanu. (B) Względna ekspresja MMP-3. (C) Względna ekspresja MMP-13. (D) Względnia ekspresja p38 MAPK. (E) Względna ekspresja SOX9. (F) Względna ekspresja circPDE4B. (G) Względna ekspresja RIC8A. Ekspresję zmierzono za pomocą ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją i znormalizowano do genu referencyjnego. Analizy przeprowadzono na próbkach od sześciu królików w każdej grupie (n = 6). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Porównania statystyczne wykonano przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji, a następnie testu post hoc Tukeya. Poziome paski wskazują grupy poddane porównaniu. P < 0.05, P < 0,01 i P < 0.01. Skróty: circPDE4B = koliste RNA fosfodiesterazy 4B; KOA = choroba zwyrodnieniowa stawów kolanowych; MAPK = kinaza białkowa aktywowana mitogenem; MMP-3 = metaloproteinaza macierzy 3; MMP-13 = metaloproteinaza macierzy 13; RIC8A = białko oporności na inhibitory cholineesterazy 8A; SEM = standardowy błąd średniej; SOX9 = czynnik transkrypcyjny SRY-box 9. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Gen | Wielkość amplikonu | Startery bezpośredni | Starter odwrotny |
| (bp) | （5'→3'） | （5'→3'） | |
| β-aktyna | 113 | CAGCCCTCCTTCATCGGTAT | GACATGACGTTGTTGGCGTA |
| MMP-3 | 108 | TGTGAGTTGAAGTGGCTCAT | CCTGTTTGAACACCCGTAAC |
| MMP-13 | 119 | GGCTCCTAGGCAAGTACAAT | GTACGCCCATCAGGATAA |
| SOX9 | 85 | GGAGGAAGTCGGTGAAGAAT | GCCTTGAAGATGGCGTTG |
| Agrekan | 70 | TTGATGAGTGCCTTTCAAGC | CATGTGAAAGAGTCGATGGC |
| RIC8A | 100 | ATAAACTTTCCAGAGGAGTTGC | TCGATGACAGTACTGGTTG |
| p38 MAPK | 103 | TGTTCAAGGTCTCCCACAAG | TGCAGCTCCCTTATGATCTG |
| CircPDE4B | 174 | GTCATTTTGCCGAACTCCC | CATTATCATCTGCCGTCACTG |
Tabela 1: Sekwencje starterów użytych do ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją. Tabela zawiera geny docelowe, oczekiwane wielkości amplikonów oraz sekwencje starterów forward i reverse w kierunku 5′ do 3′. Skróty: bp = pary zasad; circPDE4B = koliste RNA fosfodiesterazy 4B; MAPK = kinaza białkowa aktywowana mitogenem; MMP-3 = metaloproteinaza macierzy-3; MMP-13 = metaloproteinaza macierzy-13; RIC8A = białko oporności na inhibitory cholinesterazy 8A; SOX9 = czynnik transkrypcyjny SRY-box 9.
Dyskusja
W niniejszym badaniu oceniono terapeutyczne efekty akupotomii w króliczym modelu choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego (KOA) oraz zidentyfikowano związek pomiędzy ekspresją circPDE4B a osią sygnałową RIC8A/p38 kinazy aktywowanej mitogenem (MAPK). Akupotomia zmniejszyła obrzęk stawów i poprawiła zmiany histopatologiczne, a także zmieniła poziom markerów zapalnych i związanych z metabolizmem chrząstki, zarówno na poziomie transkrypcyjnym, jak i białkowym.
Zmniejszenie poziomu interleukiny-1β, czynnika martwiczego nowotworu-α oraz interleukiny-6 po zastosowaniu akupotomii było zgodne z wcześniej opisanymi efektami immunomodulacyjnymi tej metody21. Cytokiny te przyczyniają się do degeneracji chrząstki poprzez promowanie enzymów degradujących macierz oraz hamowanie syntezy macierzy zewnątrzkomórkowej22,24,25. Równoczesne obniżenie poziomu metaloproteinazy macierzy-3 (MMP-3) i metaloproteinazy macierzy-13 (MMP-13) na poziomie transkrypcyjnym i białkowym sugeruje ponadto, że akupotomia hamuje aktywność kataboliczną związaną z KOA.
Godnym uwagi znaleziskiem był związek pomiędzy indukowanymi akupotomią zmianami w ekspresji circPDE4B a modulacją ścieżki RIC8A/p38 MAPK. Nieprawidłowa aktywacja tej ścieżki wiąże się ze stanami zapalnymi, stresem oksydacyjnym i degradacją macierzy zewnątrzkomórkowej. Zmniejszenie ekspresji RIC8A oraz fosforylacji p38 MAPK po akupotomii sugeruje, że zabieg ten może pomagać w przywróceniu równowagi sygnałowej w obrębie tej ścieżki. Skoordynowane zmiany w relatywnych poziomach circPDE4B oraz markerów związanych z RIC8A/p38 MAPK są zgodne z hipotezą, że circPDE4B może pełnić funkcję rusztowania molekularnego, co proponowano wcześniej26,27. Jednakże obecne wyniki mają charakter korelacyjny i nie dowodzą, że circPDE4B pośredniczy w efektach terapeutycznych akupotomii. Do ustalenia związku przyczynowo-skutkowego niezbędne są badania typu loss-of-function i gain-of-function.
Potencjalny związek między akupotomią a regulacją circRNA jest istotnym aspektem niniejszego badania. Wykazano, że stymulacja mechaniczna wpływa na ekspresję circRNA w kilku rodzajach tkanek28,29,30,31. Jednakże bezpośrednie dowody łączące indukowaną akupotomią stymulację mechaniczną z regulacją swoistych dla chrząstki stawowej circRNA pozostają ograniczone. Zaobserwowana zmiana względnej ekspresji circPDE4B po leczeniu może odzwierciedlać albo bezpośrednią odpowiedź na stymulację mechaniczną, albo pośrednią odpowiedź na zmniejszenie stanu zapalnego. Przyszłe badania łączące kontrolowaną stymulację mechaniczną z manipulacją circPDE4B specyficzną dla chondrocytów pomogłyby rozróżnić te dwie możliwości.
Acupotomia i celekoksyb wywołały podobne trendy w wielu mierzonych punktach końcowych, pomimo odmiennych mechanizmów działania. Konwergencję tę można wyjaśnić na kilka sposobów. Po pierwsze, obie metody leczenia mogą oddziaływać na wspólne szlaki efektorowe, w tym oś RIC8A/p38 MAPK oraz sygnalizację czynnika jądrowego kappa B. Po drugie, zaobserwowane podobieństwa mogą odzwierciedlać wspólne cechy ochrony chrząstki, a nie efekty specyficzne dla konkretnych szlaków. Po trzecie, wybrane markery mogą reprezentować wspólne punkty końcowe stanu zapalnego i metabolizmu chrząstki, przez co mogą być niewystarczające do rozróżnienia odmiennych mechanizmów nadrzędnych. Podobna skuteczność nie oznacza identycznych mechanizmów, lecz sugeruje, że obie interwencje mogą wpływać na wspólne komponenty sieci patologicznej choroby zwyrodnieniowej stawów26,32,33. Nieobciążone założeniami podejścia, takie jak profilowanie transkrypcyjne lub proteomiczne, mogą pomóc w zdefiniowaniu specyficznych dla danej metody leczenia sygnatur molekularnych.
Porównywalne efekty akupotomii i celekoksybu mogą mieć również znaczenie kliniczne. Akupotomia może stanowić niefarmakologiczną opcję leczenia, która oddziałuje na mechaniczne czynniki okołostawowe, pozwalając jednocześnie uniknąć niektórych działań niepożądanych związanych z długotrwałym stosowaniem leków. Należy jednak podchodzić do tej interpretacji z ostrożnością, ponieważ model króliczy nie oddaje w pełni złożoności choroby zwykłej kolana (KOA) u ludzi. Przed zastosowaniem tych wyników przedklinicznych w szerokiej praktyce klinicznej niezbędne są dalsze badania translacyjne i kliniczne.
Należy wskazać na kilka ograniczeń. Po pierwsze, powiązania między circPDE4B a osią RIC8A/p38 MAPK nie sprawdzono za pomocą eksperymentów z utratą lub wzmocnieniem funkcji. Po drugie, model królika oraz 4-tygodniowy okres leczenia ograniczają możliwość wyciągania wniosków dotyczących chorób ludzkich i długoterminowych wyników. Po trzecie, w analizach molekularnych wykorzystano stosunkowo małe podgrupy zwierząt, co mogło ograniczyć wykrycie subtelnych różnic między grupami. Po czwarte, wybrany panel markerów może nie pozwalać na odróżnienie specyficznych dla leczenia mechanizmów upstream. Wreszcie, podobne reakcje na akupotomie i celekoksyb wymagają dalszych badań w celu ustalenia, czy obie interwencje działają poprzez zbieżne, czy niezależne szlaki.
Wnioski
Akupotomia zmniejszyła obrzęk stawów, poziomy cytokin zapalnych, degenerację chrząstki oraz ekspresję markerów katabolicznych w króliczym modelu KOA. Efekty te były powiązane ze zmianami w względnej ekspresji circPDE4B oraz modulacją osi sygnalizacyjnej RIC8A/p38 MAPK. Ze względu na korelacyjny charakter obecnych wyników, wymagane są dalsze badania mechanistyczne, aby ustalić, czy circPDE4B bezpośrednio pośredniczy w działaniu terapeutycznym akupotomii.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych ani osobistych relacji, które mogłyby wpłynąć na pracę opisaną w niniejszym artykule.
Podziękowania
Praca ta była finansowana przez National Natural Science Foundation of China (grant nr 81774436), Anhui Province Clinical Medical Research Transformation Project (grant nr 202427b10020136), Scientific Research Project of the Anhui Provincial Department of Education (grant nr 2023AH050824), Health Research Program of Anhui (grant nr AHWJ2023A30123) oraz Anhui Association of Traditional Chinese Medicine Inheritance and Innovation Research Project (grant nr 2024ZYYXH153).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 3% nadtlenek wodoru | Fuzhou Maixin Biotech | SP kit-A3 | Blokuje endogenną aktywność peroksydazy podczas immunohistochemii. |
| 4% paraformaldehyd | Biosharp | BL539A | Utrwala tkankę chrzestną przed dekalkcyzacją i opracowaniem histologicznym. |
| Kwas octowy | Merck | A6283 | Stosowany do przygotowania 1% kwasu solnego w 70% |
| Plastry przylepne | Zhejiang Renkang | RK-8802 | Stosowane po akupotomii. |
| Przeciwciało przeciwko aggrecanie | Proteintech | 13880-1-AP | Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane do wykrywania aggrecanu w ekstraktach białkowych z chrząstki. |
| Bezwodny etanol | Sinopharm Chemical Reagent | 10009228 | Stosowany do odwodnienia tkanek i rehydratacji skrawków podczas opracowania histologicznego. |
| Zestaw do oznaczania białek metodą BCA | Thermo Fisher Scientific | A55860 | Stosowany do wyznaczania stężenia białek. |
| Celekoksyb | Biochempartner | BCP02156 | Referencyjne leczenie farmakologiczne podawane przez zgłębnik żołądkowy. |
| Wirówka | Anhui Jiawen Instruments | JW-3021HR | Stosowana do klarowania lizatów i homogenatów tkankowych poprzez separację wirową. |
| Chloroform | Nanjing Reagent | 67-66-3 | Stosowany do separacji faz podczas ekstrakcji całkowitego RNA. |
| Bufor cytrynianowy, pH 6,0 | ZSGB-BIO | ZLI-9065 | Stosowany do indukowanego ciepłem odsłaniania antygenów przed immunohistochemią. |
| Kriotubule | NEST Biotechnology | 607001 | Stosowane do przechowywania zamrożonych próbek |
| Substrat DAB | Fuzhou Maixin Biotech | Kit-5230 | Substrat chromogenny stosowany do wizualizacji sygnałów immunohistochemicznych znakowanych HRP. |
| Woda traktowana DEPC | Generay Biotech | D1007 | Woda wolna od RNazy stosowana do rozpuszczania RNA i w procedurach biologii molekularnej. |
| Jednorazowa igła do akupotomii, 0,35 mm × 25 mm | Ma'anshan Bond Medical Equipment | GB3525R | Sterylny nóż igłowy stosowany w procedurach akupotomii i pozornej akupotomii. |
| EDTA | biosharp | BL617A | Stosowany do przygotowania roztworu do dekalkcyzacji tkanek zawierających chrząstkę. |
| Substrat do wzmocnionej chemiluminescencji | Thermo 340958 | 340958 | Stosowany do wizualizacji prążków w analizie Western blot. |
| Roztwór eozyny | Zhuhai Beso | BA4022 | Barwnik kontrastowy stosowany w barwieniu hematoksyliną i eozyną. |
| Roztwór Fast Green | Solarbio | G1371 | Barwnik kontrastowy stosowany w barwieniu Safraniną O–Fast Green. |
| Przeciwciało przeciwko GAPDH | Zsbio | TA-08 | Stosowane jako kontrola ładunku w Western blot, obecnie niewymienione. |
| System obrazowania żeli | Shanghai Peiqing Technology | JS-1070P | Rejestruje chemiluminescencyjne obrazy z analizy Western blot. |
| Szklane slidy mikroskopowe | CITOTEST | 188105 | Stosowane do montowania skrawków |
| Kozie przeciwciało anty-mysie IgG, sprzężone z HRP | ZSGB-BIO | ZB-2305 | Wtórne przeciwciało sprzężone z HRP dla mysich przeciwciał pierwszorzędowych. |
| Kozie przeciwciało anty-królicze IgG, sprzężone z HRP | ZSGB-BIO | ZB-2301 | Wtórne przeciwciało sprzężone z HRP dla króliczych przeciwciał pierwszorzędowych. |
| Surowica kozia | ZSGB-BIO | ZLI-9056 | Blokuje niespecyficzne wiązanie przeciwciał podczas immunohistochemii. |
| GraphPad Prism, wersja 10 | GraphPad Software | Not applicable | Stosowany do analizy statystycznej i przygotowywania wykresów. |
| Roztwór hematoksyliny | Zhuhai Beso | BA4041 | Barwnik jądrowy stosowany do barwienia hematoksyliną i eozyną oraz do kontrastowania w immunohistochemii. |
| Homogenizator | Witeg | SGCR-5-553-722 | Homogenizuje tkankę chrzęstną do analiz ELISA i testów molekularnych. |
| Kwas solny | Merck | 7607 | Stosowany do przygotowania 1% kwasu solnego w 70% |
| Oprogramowanie Image Lab | Bio-Rad | Not applicable | Stosowane do analizy densytometrycznej prążków Western blot. |
| Image-Pro Plus, wersja 6.0 | Media Cybernetics | Not applicable | Stosowane do półilościowej analizy intensywności barwienia Safraniną O. |
| Izopropanol | Sinopharm Chemical Reagent | SCR40007960 | Stosowany do wytrącania RNA podczas ekstrakcji całkowitego RNA. |
| Mikroskop świetlny | Olympus | CX41 | Stosowany do badania i obrazowania barwionych skrawków chrząstki. |
| Marker medyczny | edding | 497985 | Stosowany do zaznaczania punktów terapeutycznych |
| Metanol | Shanghai Suyi | 20180427 | Stosowany do aktywacji membrany PVDF |
| Mikrotom | Leica | RM2016 | Przecina tkankę zatopioną w parafinie w skrawki o grubości 5 µm. |
| Przeciwciało przeciwko MMP-13 | Bioss | bs-0575R | Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane do wykrywania metaloproteinazy macierzy 13. |
| Przeciwciało przeciwko MMP-3 | Bioss | bs-43017R | Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane do wykrywania metaloproteinazy macierzy 3. |
| Żywica neutralna | Wuxi Jiangyuan | ZLI-9516 | Medium montujące stosowane do trwałego przygotowania barwionych skrawków tkankowych. |
| Króliczki nowozelandzkie białe (samce, 6 miesięcy, waga 2,0–2,5 kg) | Nanjing Pukou District Laifu Breeding Farm | SCXK (Su) 2024-0007 | Zwierzęta doświadczalne stosowane do modelowania choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego i oceny leczenia. |
| Ostrze skalpela nr 23 | Caisson | SCX08-100PC | Stosowane podczas pobierania próbek. |
| Beztłuszczone mleko w proszku | Gene | 9999S | Stosowane jako odczyn blokujący. |
| Przeciwciało przeciwko p38 MAPK | Bioss | bs-0637R | Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane do wykrywania całkowitego p38 MAPK. |
| Parafina | Thermo | 8330 | Stosowana do zatapiania tkanek |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | Stosowany do homogenizacji tkanek, płukania i przygotowania odczynników. |
| Penicylina | Jilin Huamu Animal Health Products | Not applicable | Stosowana pooperacyjnie w dawce 40 000 J/kg/dobę |
| Pentobarbital sodu | Beijing Chemical Reagents | 61222 | Stosowany do znieczulenia w stężeniu 3%, 30 mg/kg. |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanowo | beyotime | ST448 | Stosowana do homogenizacji tkanek i płukania podczas immunohistochemii. |
| Sól fizjologiczna | servicevio | G4702 | Stosowana do przygotowania zawiesiny celekoksybu |
| PMSF | Beyotime | ST506 | Inhibitor proteaz dodawany do buforu lizującego podczas ekstrakcji białek. |
| Przeciwciało przeciwko p-NF-κB | Santa | sc-136548 | Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane do wykrywania p- NF-κB w analizie immunohistochemicznej. |
| Przeciwciało przeciwko p-p38 MAPK | Bioss | bs-5476R | Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane do wykrywania fosforylowanego p38 MAPK. |
| Zestaw PrimeScript RT Reagent z gDNA Eraser | TaKaRa | RR047A | Stosowany do usuwania genomowego DNA i odwrotnej transkrypcji RNA do cDNA. |
| Membrana PVDF | Millipore | IPVH00010 | Membrana stosowana do transferu białek podczas analizy Western blot. |
| Zestaw ELISA dla króliczego IL-1β | Jiyinmei | JYM0011Rb | Ilościowo określa poziom króliczej interleukiny-1β w analizowanej próbce. |
| Zestaw ELISA dla króliczego IL-6 | Jiyinmei | JYM0006Rb | Ilościowo określa poziom króliczej interleukiny-6 w analizowanej próbce. |
| Zestaw ELISA dla króliczego TNF-α | Jiyinmei | JYM0003Rb | Ilościowo określa poziom króliczego czynnika martwicyzacji nowotworów-α w analizowanej próbce. |
| System Real-time PCR | Thermo Fisher Scientific | PIKOREAL 96 | Przeprowadza ilościową amplifikację PCR opartą na fluorescencji. |
| Przeciwciało przeciwko RIC8A | Bioss | bs-11355R | Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane do wykrywania RIC8A. |
| Bufor lizujący RIPA | Beyotime | P0013B | Ekstrahuje całkowite białko z tkanki chrzęstnej. |
| Roztwór Safraniny O | Solarbio | G1371 | Barwi proteoglikany chrząstki w barwieniu histologicznym Safraniną O–Fast Green. |
| Odczynniki do SDS-PAGE lub gotowe żele | Solarbio | S8010 | Obejmują procentowe stężenie żelu lub produkt. |
| Przeciwciało przeciwko SOX9 | Bioss | bs-4177R | Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane do wykrywania SOX9. |
| Spektrofotometr | Nanjing Wuyi Technology | OD1000+ | Mierzy stężenie i czystość RNA. |
| Sterylna gaza | Zhende | V505463 | Stosowana do ucisku po wyjęciu igły. |
| SYBR Green Master Mix | Novoprotein | E096-01B | Odczynnik fluorescencyjny stosowany do ilościowego PCR. |
| Sól buforowana Trisem | Solarbio | T8060 | Stosowana do przygotowania buforu do płukania i blokowania w analizie Western blot. |
| Odczynnik TRIzol | Life Technologies | 15596018 | Odczynnik fenol–guanidynowy stosowany do ekstrakcji całkowitego RNA. |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | Niejonowy detergent dodawany do roztworów płuczących na bazie soli buforowanej Trisem i soli buforowanej fosforanowo. |
| Roztwór żelazowej hematoksyliny Weigerta | Merck | 1.15973 | Stosowany w barwieniu Safraniną O–Fast Green. |
| Ksylen | Sinopharm Chemical Reagent | 10023428 | Stosowany do odparafinizowania i klarowania tkanek. |
Bibliografia
- Mobasheri A, Batt M. An update on the pathophysiology of osteoarthritis. Ann Phys Rehabil Med. 2016;59(5):333-339.
- Forestier R, et al. Prevalence of generalized osteoarthritis in a population with knee osteoarthritis. Joint Bone Spine. 2011;78(3):275-278.
- Motta F, Barone E, Sica A, Selmi C. Inflammaging and osteoarthritis. Clin Rev Allergy Immunol. 2023;64(2):222-238.
- Ghouri A, Conaghan PG. Prospects for therapies in osteoarthritis. Calcif Tissue Int. 2021;109(3):339-350.
- Roseti L, et al. Articular cartilage regeneration in osteoarthritis. Cells. 2019;8(11):1305. https://doi.org/10.3390/cells8111305
- Fujii Y, et al. Cartilage homeostasis and osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2022;23(12):6330. https://doi.org/10.3390/ijms23126330
- Kreutzinger V, et al. Limited effects of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) on imaging outcomes in osteoarthritis: observational data from the osteoarthritis initiative (OAI). BMC Musculoskelet Disord. 2025;26. https://doi.org/10.1186/s12891-025-08245-0
- Migliore A, et al. Low dose NSAIDs and sysadoas in the management of knee osteoarthritis. Aging Clin Exp Res. 2025;37(1):121. https://doi.org/10.1007/s40520-025-03015-6
- Fu M, et al. Expression profile of long noncoding RNAs in cartilage from knee osteoarthritis patients. Osteoarthritis Cartilage. 2015;23(3):423-432.
- Jiang SD, et al. Long noncoding RNAs in osteoarthritis. Joint Bone Spine. 2017;84(5):553-556.
- Xing D, et al. Identification of long noncoding RNA associated with osteoarthritis in humans. Orthop Surg. 2014;6(4):288-293.
- Wu W, Zou J, Yang Y. Studies on the role of circRNAs in osteoarthritis. BioMed Res Int. 2021;2021:6672322. https://doi.org/10.1155/2021/6672322
- Liu X, et al. Identification and comprehensive analysis of circRNA–miRNA–mRNA regulatory networks in osteoarthritis. Front Immunol. 2022;13:1018820. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1018820
- Shen S, et al. circPDE4B prevents articular cartilage degeneration and promotes repair by acting as a scaffold for RIC8A and MID1. Ann Rheum Dis. 2021;80(9):1209-1219.
- Cao M, et al. A peroxiredoxin-P38 MAPK scaffold increases MAPK activity by MAP3K-independent mechanisms. Mol Cell. 2023;83(17):3140-3154.
- Lu M, et al. Promotion and mechanism of acupotomy on chondrocyte autophagy in knee osteoarthritis rabbits. Chin J Integr Med. 2024;30(9):809-817.
- Chen C, et al. Clinical effects of ultrasound-guided acupotomy in knee osteoarthritis treatment. J Vis Exp. 2024;(208):e66587. https://doi.org/10.3791/66587
- Wang Y, et al. Effect of acupotomy modulation of NLRP3/Caspase-1/GSDMD pathway on chondrocyte pyroptosis in knee osteoarthritis. J Pain Res. 2025;18:4935-4945.
- Zhang J, et al. Whole transcriptome mapping identifies an immune- and metabolism-related non-coding RNA landscape remodeled by mechanical stress in IL-1β-induced rat OA-like chondrocytes. Front Genet. 2022;13:843187. https://doi.org/10.3389/fgene.2022.843187
- Liu Q, et al. Emerging roles of circRNA related to the mechanical stress in human cartilage degradation of osteoarthritis. Mol Ther Nucleic Acids. 2017;7:223-230.
- Guo Y, et al. Acupotomy improves synovial hypoxia, synovitis and angiogenesis in KOA rabbits. J Pain Res. 2023;16:749-760.
- Ma Y, et al. Acupotomy ameliorates KOA related chondrocyte premature senescence through YAP/FOXD1 pathway. J Pain Res. 2025;18:2011-2023.
- Wang Z,et al. Electroacupuncture ameliorates cartilage damage in a rat model of knee osteoarthritis and regulates expression of miRNAs and the TLR4/NF-κB pathway, Acupuncture in Medicine. 2025, 43(2025), 164-173.
- Feng S, Cong H, Ji L. Salvianolic acid A exhibits anti-inflammatory and antiarthritic effects via inhibiting NF-κB and p38/MAPK pathways. Drug Des Devel Ther. 2020;14:1771-1778.
- Abdallah AM, et al. Pyrazole derivatives ameliorate synovial inflammation in collagen-induced arthritis mice model via targeting p38 MAPK and COX-2. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(1):819-832.
- Alaaeldin E, et al. Topical nano-vesicular spanlastics of celecoxib: enhanced anti-inflammatory effect and down-regulation of TNF-α, NF-кB and COX-2 in complete Freund's adjuvant-induced arthritis model in rats. Int J Nanomedicine. 2021;16:133-145.
- Pamudurti NR, et al. Translation of CircRNAs. Mol Cell. 2017;66(1):9-21.
- Wang Z, et al. Electroacupuncture ameliorates cartilage damage in a rat model of knee osteoarthritis and regulates expression of miRNAs and the TLR4/NF-κB pathway. Acupunct Med. 2025;43(3):164-173.
- Shen J, et al. Circular RNA sequencing reveals the molecular mechanism of the effects of acupuncture and moxibustion on endometrial receptivity in patients undergoing infertility treatment. Mol Med Rep. 2019;20(2):1623-1633. https://doi.org/10.3892/mmr.2019.10386
- Wang Y, et al. Electroacupuncture alleviates perioperative hypothalamus-pituitary-adrenal axis dysfunction via circRNA-miRNA-mRNA networks. Front Mol Neurosci. 2023;16:1152861. https://doi.org/10.3389/fnmol.2023.1152861
- Xiao X, et al. Transcription profiling of a revealed the potential molecular mechanism of Governor Vessel electroacupuncture for spinal cord injury in rats. Neurospine. 2022;19(3):757-769.
- Xu C, Gu K, Yasen Y, Hou Y. Efficacy and safety of celecoxib therapy in osteoarthritis: a meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2016;95(20):e3585. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000003585
- 33. Jiang D, et al. Efficacy of intra-articular injection of celecoxib in a rabbit model of osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2010;11(10):4106-4113.