Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
Niniejsze badanie ma na celu zbadanie wpływu akupunktury skóry głowy połączonej z ćwiczeniami na plastyczność synaptyczną kory ruchowej w szczurzym modelu spastyczności kończyn po udarze oraz zbadanie związku między aktywnością szlaku PI3K/Akt a efektami terapeutycznymi.
Skuteczna terapia spastyczności po udarze (PSS) pozostaje ograniczona, a mechanizm, za pomocą którego akupunktura skóry głowy w połączeniu z ćwiczeniami (SAE) łagodzi PSS, nie jest w pełni zrozumiały. W niniejszym badaniu zbadano wpływ SAE na szczury z PSS oraz zbadano, czy SAE reguluje plastyczność synaptyczną poprzez ścieżkę PI3K/Akt. Utworzono model szczurów z zamknięciem środkowej tętnicy mózgowej (MCAO), a szczury zostały losowo przydzielone do pięciu grup: Blank, Sham, MCAO, SAE i Baklofen. Wszystkie interwencje były podawane przez 7 kolejnych dni. Następnie oceniono funkcję neurologiczną, objętość zawału mózgu, histopatologię, ultrastrukturę synaps i występowanie związanych białek. W porównaniu z grupą MCAO, SAE poprawiło niedobory neurologiczne, zmniejszyło nadmierną napięcie mięśni, zmniejszyło objętość zawału, złagodziło uszkodzenie neuronów, zwiększyło liczbę synaps i poprawiło morfologię synaps. SAE również zwiększyło ekspresję czynnika neurotroficznego pochodzenia komórek glejowych (GDNF), fosforylowanego PI3K (p-PI3K), fosforylowanego Akt (p-AKT) oraz białek synaptycznych, w tym synaptofyzyny (SYN), białka gęstości zagęszczenia postsynaptycznego 95 (PSD-95) i białka związanego z wzrostem 43 (GAP-43). Barwienie immunofluorescencyjne sugerowało również zwiększoną ekspresję SYN i p-Akt w korze ruchowej po leczeniu SAE. Te odkrycia sugerują, że SAE może być skorelowane z aktywacją sygnalizacji PI3K/Akt poprzez nadregulację GDNF, poprawiając w ten sposób plastyczność synaptyczną i łagodząc objawy PSS. To badanie zbadano wpływ SAE na szczury z PSS oraz zbadano potencjalne powiązanie między interwencją SAE, aktywnością ścieżki PI3K/Akt a plastycznością synaptyczną.
Udar mózgu pozostaje jedną z głównych przyczyn śmierci i niepełnosprawności na całym świecie. Niedokrwienie i niedotlenienie uszkadzają neurony, zakłócają równowagę wzbudzenie-hamowanie w obwodach ruchowych i prowadzą do dysfunkcji ruchowych1. Spastyczność po udar mózgu objawia się zwiększeniem napięcia mięśniowego i zmniejszeniem ruchomości stawów, co upośledza codzienną aktywność i zwiększa obciążenie opiekuna2. Chociaż środki przeciwspastyczne takie jak bakafen mogą zapewnić tymczasową ulgę w objawach, długotrwałe stosowanie może prowadzić do tolerancji na lek i działań niepożądanych, a także nie przywraca uszkodzonej funkcji neuronowej3. Konwencjonalna rehabilitacja ruchowa jest również ograniczona przez powolny początek korzyści i długotrwały okres leczenia. Dlatego pilnie potrzebne są bezpieczniejsze i skuteczniejsze strategie terapeutyczne, a podłoże mechanizmów tego procesu wymaga dalszych badań. Neuroplastyczność jest centralnym mechanizmem funkcjonalnego powrotu po udar mózgu i obejmuje remodelację synaps, regenerację aksonów i przetrwanie neuronów4. Po udarze niedokrwiennym mózgu neurony w rdzeniu zawału ulegają szybkiej śmierci, podczas gdy lokalne reakcje zapalne nasilają uszkodzenie tkanki w niedokrwiennym półcieniu; razem te procesy prowadzą do uszkodzenia mózgu5,6. Plastyczność synaptyczna, kluczowy element neuroplastyczności, może być oceniana na podstawie białek związanych ze synapsą, w tym markerów presynaptycznych takich jak synaptofizyna (SYN) i białko związane z wzrostem 43 (GAP-43), a także białka gęstości postsynaptycznej 95 (PSD-95)7,8,9.
Czynniki neurotroficzne zapewniają bazę molekularną dla plastyczności synaptycznej. Szczególnie ważny jest czynnik neurotroficzny pochodzenia komórek glejowych (GDNF), ponieważ promuje przetrwanie i naprawę neuronów, hamuje zapalenie i poprawia mikrośrodowisko synaptyczne10. Wiążąc się z receptorem Ret, GDNF może aktywować sygnalizację PI3K/Akt11. Kaskadę PI3K/Akt jest główną pro-przetrwalniczą ścieżką w układzie nerwowym, a jej aktywowanie hamuje apoptozę, jednocześnie wspierając syntezę białek niezbędną do remodelacji synaps12,13. Akupunktura skóry głowy w połączeniu z ćwiczeniami (SAE) jest integratywną strategią rehabilitacji, która łączy stymulację akupunktury skóry głowy z aktywnym treningiem ruchowym. Ogólnym celem tej metody jest jednoczesne modulowanie centralnej aktywności nerwowej i promowanie związanego z zadaniem powrotu ruchowego, zmniejszając w ten sposób hipertonię mięśniową i poprawiając wyniki funkcjonalne po udarze. SAE jest szeroko stosowany w Chinach w leczeniu spastyczności po udar mózgu (PSS). Podstawą tego połączonego podejścia jest to, że akupunktura skóry głowy może modulować pobudliwość kory i perfuzję mózgu, podczas gdy terapia ruchowa zapewnia zależne od aktywności trening ruchowy, który promuje powrót funkcjonalny i remodelację synaps. W porównaniu z samą terapią ruchowa, wcześniejsze dowody kliniczne wykazały, że akupunktura skóry głowy w punktach skóry głowy w połączeniu z terapią ruchową dalej zmniejsza spastyczność kończyn i poprawia funkcje ruchowe oraz aktywność codzienną u pacjentów z spastycznością kończyn po udar mózgu14.
Ostatnia przegląd systematyczny i metaanaliza sugerują również, że akupunktura skóry głowy w stylu ruchowym lub powiązane jednoczesne interwencje akupunktury skóry głowy i ćwiczeń zapewniają większe poprawy w spastyczności, funkcji ruchowej, równowagi i aktywności codziennej niż interwencje jednoskładnikowe lub sekwencyjne, co sugeruje potencjalną zaletę jednoczesnej neuromodulacji i treningu ruchowego15. Badania przedkliniczne wykazały, że SAE lub powiązane protokoły akupunktury skóry głowy w stylu ruchowym mogą poprawić przepływ krwi w mózgu i zmniejszyć spastyczność poprzez reaktywację KCC2 rdzenia kręgowego pośredniczoną przez receptor 5-HT₂A16,17. Niedawne badanie sugeruje ponadto, że akupunktura promuje neuroplastyczność poprzez sygnalizację PI3K/Akt18. Dlatego SAE może być szczególnie odpowiedni dla kontekstów eksperymentalnych i klinicznych, w których modulacja neuroplastyczności po udar mózgu, powrót ruchowy i zmniejszenie spastyczności są kluczowymi celami terapeutycznymi. Jednak potencjalne powiązanie między SAE, sygnalizacją GDNF/PI3K/Akt i plastycznością synaptyczną w łagodzeniu PSS pozostaje słabo zrozumiałe. Obecne badanie ustanowiło szczurzy model PSS w celu oceny wpływu SAE na niedobory neurologiczne i spastyczność mięśni oraz na określenie zmian w ekspresji GDNF, aktywności szlaku PI3K/Akt i białkach związanych z plastycznością synaptyczną po interwencji. To badanie może
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Zwierząt Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Changchun (Numer zgody 20251038) i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE 2.0) oraz NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Wszystkie materiały użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
Procedury eksperymentalne
Zwierzęta eksperymentalne i grupowanie
Osiemdziesiąt specyficznych, wolnych od patogenów (SPF) dorosłych samców szczurów Sprague–Dawley (220–250 g) zostało zakupionych od Hongda Animal Breeding Farm (Dzielnica Kuancheng, Changchun, Chiny). Zwierzęta były przetrzymywane w Centrum Zwierząt Eksperymentalnych Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Changchun w kontrolowanych warunkach 22–25 °C, wilgotności względnej 50–60% i 12-godzinnym cyklu światło/ciemność, z wolnym dostępem do żywności i wody. Po tygodniu aklimatyzacji szczury zostały losowo przydzielone do grupy świadków (n = 12), grupy Sham (n = 12) i grupy rezerwowej modelu (n = 56). Grupa świadków została dołączona jako normalna, nieleczona grupa kontrolna, aby zapewnić wartości bazowe dla wydajności behawioralnej, cech histopatologicznych i ekspresji markerów molekularnych u zdrowych szczurów. Grupa Sham przeszła taką samą anestezę i narażenie chirurgiczne jak grupa MCAO, z wyjątkiem tego, że nie wykonano zamknięcia tętnicy; dlatego ta grupa służyła jako kontrola dla potencjalnych efektów znieczulenia i manipulacji chirurgicznej. Włączenie zarówno grupy Blank jak i Sham pozwoliło na odróżnienie efektów uszkodzenia niedokrwiennego od tych związanych z samym zabiegiem chirurgicznym.
Grupa rezerwowa modelu przeszła modelowanie MCAO. Pierwsze 3 dni po zabiegu zdefiniowano jako okres indukcji modelu. W tym okresie 8 z 56 szczurów zmarło, co odpowiada wskaźnikowi śmiertelności 14,29%, a 12 szczurów zostało wykluczonych ze względu na nieudane modelowanie. Pozostałych 36 szczurów, u których udało się stworzyć model, zostało losowo przydzielonych, z wykorzystaniem tabeli liczb losowych, do grup MCAO, SAE i Baclofen, po 12 szczurów w każdej grupie. Interwencje grupowe były następujące: (I) Grupa Blank: tylko rutynowe karmienie, bez żadnej interwencji. (II) Grupa Sham: chirurgiczne odsłonięcie tętnicy szyjnej wspólnej, tętnic szyjnych wewnętrznych i zewnętrznych oraz nerwu błędnego, bez uciążliwości ani wstawiania włókna. (III) Grupa MCAO: MCAO zostało ustanowione podczas znieczulenia dootrzewnowego z 3% pentobarbitalu sodu, bez późniejszego leczenia. (IV) Grupa SAE: po udanym modelowaniu MCAO i weryfikacji, szczury otrzymały akupunkturę skóry głowy w połączeniu z ćwiczeniami. Anestezja z użyciem inhalacji izofluranu w stężeniu 1,5%–2,0% była stosowana tylko podczas krótkiego etapu wstawiania igieł. Trening na bieżni został rozpoczęty dopiero po pełnym powrocie do świadomości i przywróceniu spontanicznej zdolności do chodzenia. Akupunktura była wykonywana w punktach GV20 i EX-HN1 po obu stronach. Igły wstawiano na głębokość 1 mm i pozostawiano podczas okresu treningu na bieżni. Standaryzowany 30-minutowy okres pozostawiania igieł/treningu był definiowany jako okres treningu na bieżni i składał się z 6 m/min przez 10 minut, a następnie 12 m/min przez 20 minut przy 0° nachyleniu. Interwencja była stosowana raz dziennie przez 7 kolejnych dni. (V) Grupa Baclofen: po udanym modelowaniu MCAO i weryfikacji, szczury otrzymywały baclofen przez gardło w dawce 0,4 mg/kg raz dziennie przez 7 kolejnych dni.
Ustanowienie modelu MCAO
Model MCAO u szczurów został ustanowiony za pomocą zmodyfikowanej metody wtórnej fiksacji włókna19. Po 12 godzinach postu i pozbawienia wody, szczury zostały znieczulone przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 3% pentobarbitalu sodu i umieszczone w pozycji leżącej na plecach. Po dezynfekcji skóry, wykonano środkowy nacięcie szyi w celu odsłonięcia prawej tętnicy szyjnej wspólnej (CCA) oraz sąsiednich nerwów i mięśni. Zidentyfikowano i zwięzło zewnętrzną tętnicę szyjną (ECA), a następnie izolowano tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA). Na ICA i CCA umieszczono ściągacze, a dystalną CCA tymczasowo zaciśnięto. Następnie w CCA, tuż powyżej ściągacza, wykonano małe nacięcie ścięgna tętnicy. Włożono i wsunięto 0,26 mm nylonowe włókno 18–20 mm przez ICA, aby zablokować początek tętnicy mózgu środkowej. Następnie ICA i CCA zostały zwięzło i nacięcie zostało zamknięte szwem. Po zabiegu szczury były utrzymywane w cieple podczas powrotu do świadomości i otrzymywały dootrzewnowe wstrzyknięcie penicyliny (40 000 U) w celu zapobieżenia infekcjom. W grupie Sham wykonano tylko ekspozycję naczyń bez wstawiania włókna; zamknięcie rany i opieka pooperacyjna były ident
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
SAE poprawia funkcje neurologiczne i zmniejsza spastyczność mięśni u szczurów PSS
Terapeutyczne działanie SAE na dysfunkcję behawioralną u szczurów z spastycznością pourazową oceniono za pomocą punktacji Zea Longa, zmodyfikowanej skali nasilenia objawów neurologicznych i zmodyfikowanej skali Ashwortha w dniach 1, 3, 5 i 7 po zweryfikowaniu modelu (n = 12 na grupę). Punktacja Zea Longa i mNSS były używane do oceny niedoborów neurologicznych, podczas gdy skala MAS służyła do oceny napięcia mięśnioweg...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poprzednie badania kliniczne wykazały, że akupunktura skóry głowy w połączeniu z ćwiczeniami może łagodzić objawy spastyczności u pacjentów z spastycznością pourazową, poprawiając jednocześnie funkcje motoryczne i aktywności codziennego życia (ADL)14,24. Wyniki te potwierdzają jego wartość kliniczną. Obecne badanie potwierdziło dalej terapeutyczne działanie SAE w modelu na szczurach za pomocą trzech miar behawioralnych, w tym wskaźnika Zea Longa, mNSS i MAS. Powt...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.
WNIESIONE PRZEZ AUTORA WSTĘPNE:
Sainan Zhao: Konceptualizacja, Metodologia, Formalna analiza, Badania, Administracja projektem, Pisanie – oryginalny szkic, Pisanie – recenzja i edycja. Lingxu Li: Badania, Kuracja danych, Walidacja. Wenna Li: Kuracja danych, Formalna analiza, Wizualizacja. Chunmeng Wang: Badania, Zasoby. Yanlong Jin: Oprogramowanie, Walidacja, Pisanie – recenzja i edycja. Guangcheng Ji: Nadzór, Pozyskiwanie funduszy, Zasoby, Pisanie – recenzja i edycja.
Autorzy dziękują wszystkim uczestnikom, którzy wzięli udział w tym badaniu. Praca ta była wspierana przez Projekt Rozwoju Nauki i Technologii Prowincji Jilin [Nr. YDZJ202401122ZYTS].
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining solution | Beyotime | C0651 | TTC staining |
| 3MM Filter Paper | Whatman, UK | 3030861 | Western blot transfer |
| AKT Antibody | Affinity | AF0836 | Primary antibody |
| Acetone | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10000418 | Infiltration of electron microscopy specimens |
| Adobe Illustrator | Adobe Inc. | Version 29.5 (64-bit), https://www.adobe.com/products/illustrator.html | 64-bit version, used for graphic editing and scientific figure preparation |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 100092683 | Deparaffinization of paraffin sections |
| Anti-fade mounting medium | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C1020 | coverslipping |
| BCA Protein Assay Kit | MDL | MD913053 | Protein concentration determination |
| Bluishing solution | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C2104 | Hematoxylin staining |
| Chemiluminescence Imaging System | CLINX, China | ChemiScope6100 | System Detect target protein |
| Concentrated normal goat serum | Boster Biological Technology | AR1009 | serum blocking |
| DAPI | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C1030 | nuclear staining |
| Diamond Knife | Daitome | Ultra 45° | Slice ultrathin specimens |
| Differentiation solution | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C2104 | HE staining |
| Drying Oven | Tianjin Labory Instruments Equipment Co., Ltd. | GFL-230 | Bake fixed tissue slices |
| EDTA (pH 9.0) antigen retrieval solution | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C1052 | Antigen retrieval |
| Electron microscopy fixative | ASPEN | AS1063 | Fixation of electron microscopy specimens |
| Electrophoresis Power Supply | Longfang | LF-2000 | Provide electrophoresis voltage |
| Embed 812 embedding medium | SPI | 90529-77-4 | Infiltration of electron microscopy specimens |
| EndNote X9 | Clarivate Analytics (US) LLC | Version X9, https://endnote.com/ | Used for reference management and academic citation formatting |
| Freezing Stage | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd. | JB-L5 | Freeze frozen tissue blocks |
| GAP-43 Antibody | Affinity | Df7766 | Primary antibody |
| GAPDH Antibody | Affinity | AF7021 | Primary antibody |
| GDNF Antibody | Biosynthesis | Bs-1024r | Primary antibody |
| Glacial acetic acid | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C2138 | Nissl staining |
| Glass Slides and Coverslips | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10212432C | Mount tissue sections |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 10.1.2 (324) for Windows 64-bit, https://www.graphpad.com/ | 64-bit version, used for statistical analysis and scientific plotting |
| Grinding machine | Beijing Herde | N.9548 | Grind tissue samples |
| HE staining solution | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C2103 | HE staining |
| HRP-Conjugated Goat Anti-Mouse Secondary Antibody | Servicebio | C030205 | Secondary Antibody |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | SeraCare | 5220-0336 | Secondary antibody |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C5101 | preparation of TSA reagents |
| IBM SPSS Statistics | IBM Corp. | Version 25, 64-bit, https://www.ibm.com/products/spss-statistics | 64-bit version, used for statistical data analysis and processing |
| Imaging System | Nikon, Japan | Nikon DS-U3 | Capture microscopic images |
| Metal Bath | COYOTE | H203-H | Constant temperature incubation |
| Microwave Oven | Galanz Microwave Electrical Appliance Co., Ltd. | P70D20TL-P4 | Antigen retrieval |
| NC Membrane (0.22 μm) | GVS, USA | ISEQ00010 | Protein blot transfer |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10004160 | dehydration and coverslipping |
| PBS buffer | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C0003 | decolorization and washing |
| PI3K Antibody | Affinity | AF6241 | Primary antibody |
| PSD-95 Antibody | Affinity | Af5283 | Primary antibody |
| Pathological Microtome | Leica Instruments (Shanghai) Co., Ltd. | RM2016 | Cut paraffin sections |
| Phospho-AKT Antibody | Affinity | Af0832 | Primary antibody |
| Phospho-PI3K Antibody | Affinity | Af3241 | Primary antibody |
| Pipette | Dragonlab | KE0003087/KA0056573 | Quantitative liquid transfer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Beyotime | P1005 | Protease inhibition |
| RIPA Lysis Buffer (Medium) | Beyotime | P0013C | Tissue lysis |
| Refrigerated Centrifuge | SEILOGEX, China | CF1524R | Low-speed sample separation |
| SDS-PAGE Electrophoresis System | Beyotime | MiniProGel™ Gel Casting, Electrophoresis and Western Blot Transfer System | Protein electrophoretic separation |
| SDS-PAGE Precast Gel Kit | MDL | MD911919 | SDS-PAGE electrophoresis |
| SYN (Synapsin) Antibody | Biosynthesis | bs-3501R | Primary antibody |
| Shaker | Qilinbeier | TS-8 | Sample oscillation washing |
| Tissue Dehydrator | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd. | JJ-12J | Dehydrate paraffin tissue |
| Tissue Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd. | JB-P5 | Embed tissue in paraffin |
| Tissue Spreading Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd. | KD-P | Unfold paraffin slices |
| Toluidine blue staining solution | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C2131 | Nissl staining |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G2 20 TWIN | Observe ultrastructure |
| Tri-Color Pre-Stained Broad Range Protein Molecular Weight Marker (10–180 kDa) | Servicebio | G2091 | SDS-PAGE electrophoresis |
| Tyramide-488 | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C6002 | TSA reagents |
| Tyramide-CY3 | Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd. | C6003 | TSA reagents |
| Ultramicrotome | Leica | Leica UC7 | Cut ultrathin EM sections |
| Ultrasonic Cell Disruptor |