Dostarczanie edytorów genomu jako RNA jest szczególnie skuteczną metodą modyfikacji genomów komórek pierwotnych ssaków i linii komórkowych. Celem tego protokołu jest dostarczenie edytorów genomu jako mRNA do pierwotnych komórek ssaków i linii komórkowych, po którym następuje ukierunkowane sekwencjonowanie i analiza Illumina w celu ilościowego określenia wyników edycji.
Artykuł metodologiczny
Edycja genomu w pierwotnych komórkach ssaków poprzez elektroporację edytora RNA
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Edytory CRISPR, w tym nukleazy, edytory bazowe i edytory primerowe, mogą skutecznie korygować warianty genetyczne powodujące choroby lub niszczyć docelowe geny. Wyniki edycji są zwykle oceniane w hodowlach komórek pierwotnych, komórek pochodzących od pacjentów lub inżynieryjnych linii komórkowych, aby badać wpływ zmian genetycznych lub jako pierwszy krok przed rozpoczęciem badań na zwierzętach lub translacji klinicznej. Dostarczenie edytorów jako mRNA wraz z syntetycznymi RNA przewodnikami do komórek ssaków może poprawić efektywność edycji w porównaniu do podejść opartych na plazmidach i zapobiec problemom takim jak integracja DNA lub edycja poza docelowym zakresem z utrzymanej ekspresji. Ten artykuł przedstawia przepływ pracy do przygotowania mRNA edytora genomu przez transkrypcję in vitro (IVT), w tym ko-transkrypcyjne zamknięcie i chemicznie zmodyfikowane nukleotydy, elektroporację mRNA edytora i RNA przewodników do pierwotnych ludzkich fibroblastów, indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) lub linii komórek limfoblastoidalnych (LCL) oraz ilościową ocenę wyników edycji przez sekwencjonowanie ukierunkowanych amplikonów na platformie Illumina, następnie analizę za pomocą CRISPResso2. Ten przepływ pracy umożliwia ilościową porównywalność RNA przewodników, parametrów elektroporacji i wariantów edytora oraz wspiera zastosowania dalekosiężne, w tym klonowanie pojedynczych komórek, testy fenotypowe, badania przedkliniczne na zwierzętach i rozwój terapii.
Wprowadzenie
Efektywne edytowanie genomu w pierwotnych komórkach ssaków wspiera generowanie modeli genetycznych oraz przedkliniczną ocenę kandydujących strategii terapeutycznych. Ostatnie osiągnięcia w technologiach opartych na CRISPR, w tym edycja baz i edycja pierwotna, umożliwiają precyzyjne modyfikacje nukleotydów bez wprowadzania podwójnych rozrywań DNA, poprawiając tym samym czystość rezultatów edycji1,2. Technologie te zostały z powodzeniem zastosowane w modelowaniu chorób i badaniach edycji genomu terapeutycznego, w tym w strategiach korekcji wariantów prowadzących do choroby sierpowatej krwinek3 i mukowiscydozy4.
Particularnie efektywną strategią dostarczania komponentów edycji genomu do komórek ssaków jest elektroporacja in vitro przetranskrybowanego (IVT) mRNA kodującego enzym edytujący w połączeniu z syntetycznymi RNA przewodnikowymi (gRNAs). Dostarczenie mRNA umożliwia przejściową ekspresję edytorów genomu, minimalizując przedłużającą się aktywność nukleazy i zmniejszając prawdopodobieństwo niepożądanych zdarzeń edycji. Postęp w technologii IVT poprawił efektywność, wydajność i jakość syntezy mRNA4,5,6. Szablony DNA plasmidowego i szablony DNA pochodzące z PCR są powszechnie używane do transkrypcji in vitro i każdy z nich ma odrębne zalety i ograniczenia. W tym protokole preferowane są szablony wygenerowane metodą PCR, aby uniknąć problemów związanych z propagowaniem długich ciągów poli(A) w plazmidach, które są podatne na rekombinację i zmienność długości. Jednak użycie szablonów PCR, jak opisano w tym protokole, wymaga drogiego primera odwrotnego zawierającego 120-nukleotydowy ogon poli(A), a PCR może być bardziej podatny na błędy niż bakteria propagacji plazmidów dla sekwencji niezakodowanych w primerach. Jako alternatywa, dostawcy komercyjni tacy jak Elegen i 4basebio mogą dostarczyć wysokowiernościowe szablony DNA, oferując niezawodną, choć droższą opcję generowania szablonów transkrypcyjnych.
Staranne projektowanie RNA przewodnickiego jest kolejnym krytycznym komponentem sukcesu w eksperymentach edycji genomu. Opracowano kilka narzędzi komputerowych, które pomagają badaczom w identyfikacji optymalnych sekwencji gRNA na podstawie przewidywanej efektywności on-target i minimalnej aktywności off-target. Szeroko stosowane platformy obejmują CHOPCHOP i CRISPOR, które umożliwiają identyfikację sekwencji przewodnich zgodnych z wymaganiami motywu sąsiedniego protospaceru (PAM) enzymów Cas i zapewniają metryki oceny, aby priorytetyzować kandydatów z przewidywaną wysoką aktywnością i specyficznością7,8. Podstawowe zasady i najlepsze praktyki projektowania RNA przewodnickiego zostały szczegółowo opisane w literaturze CRISPR9,10,11,12,13.
Elektroporacja jest powszechnie stosowana do dostarczania reagentów edycji genomu do komórek ssaków, ponieważ może osiągnąć wysoką efektywność dostarczania w typach komórek, które są zazwyczaj odporne na metody transfekcji oparte na lipidach. Elektroporacja przejściowo permeabilizuje błonę komórkową, umożliwiając wejście kwasom nukleinowym taki jak mRNA i gRNA do cytoplazmy. Zoptymalizowane protokoły elektroporacji zostały opracowane dla wielu typów komórek ssaków, w tym komórek pierwotnych, fibroblastów, linii komórek limfoblastoidalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych14. Komercyjne platformy elektroporacji takie jak Lonza 4D i systemy Amaxa oferują programy i reagenty specyficzne dla typu komórki, zaprojektowane w celu poprawy efektywności dostarczania przy zachowaniu żywotności komórek. Systemy elektroporacji wysokowydajne, takie jak platforma Amaxa 96-well Shuttle, umożliwiają ponadto skalowalne eksperymenty edycji genomu w wielu warunkach eksperymentalnych. System elektroporacji Neon jest również często stosowany, ale nie jest przedmiotem tego protokołu.
Po dostarczeniu komponentów edycji genomu, wyniki edycji są zazwyczaj oceniane za pomocą ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji (NGS) regionu genomowego otaczającego miejsce edycji. Biblioteki sekwencjonowania są generowane przez amplifikację PCR miejsca docelowego, następnie indeksowane i przeprowadzane sekwencjonowanie wysokowydajne. Wyniki sekwencjonowania są analizowane za pomocą specjalistycznych pipelineów bioinformatycznych zaprojektowanych do eksperymentów edycji genomu. W tym protokole, wyniki edycji są ilościowo oceniane za pomocą CRISPResso2, szeroko stosowanej platformy komputerowej, która umożliwia szczegółową analizę wyników edycji genomu na podstawie danych sekwencjonowania15. CRISPResso2 wyrównuje odczyty sekwencjonowania do sekwencji referencyjnej i ilościowo określa wyniki edycji, w tym ogólną efektywność edycji, częstotliwość wstawienia-delecji (indel), precyzyjne zastępstwa nukleotydów i dystrybucję edycji w całym regionie docelowym. Oprogramowanie zapewnia również graficzne wizualizacje i podsumowania statystyczne, które ułatwiają porównanie między warunkami eksperymentalnymi i optymalizację parametrów edycji.
Wszystko
Protokół
Oświadczenie etyczne:
Wszystkie procedury związane z liniami komórkowymi pochodzenia ludzkiego zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzonymi protokołami.
1. Generowanie liniowego szablonu DNA za pomocą PCR
Uwaga: Przeprowadź wszystkie kroki związane z RNA przy użyciu materiałów jednorazowych i powierzchni roboczych wolnych od RNazy. Weź pod uwagę wymienione edytory mRNA i ich różne warianty podczas wybierania odpowiedniego edytora do zamierzonej modyfikacji genomowej (Tabela 1).
- Zmontuj reakcję PCR na DNA plastydowym, który został wyekstrahowany z bakterii za pomocą zestawu miniprep lub midiprep. Użyj 20 ng DNA plastydowego na 50 μL reakcji PCR z enzymem NEBNext Ultra II Q5 Master Mix, montując PCR zgodnie z opisem w Tabeli 2.
- Użyj do przodu primera, który koryguje nieaktywnego promotora T7 na plazmidzie, co zapobiega kolistej transkrypcji.
- Użyj reverse primera, który wprowadza 120-nt ogon poli(A)₁₂₀ w celu wspierania efektywnej transkrypcji i stabilności mRNA.
- Użyj N1-metylo-pseudourydyny zamiast uracylu i dodaj CleanCap AG w celu poprawy translacji mRNA i zmniejszenia aktywacji odporności wrodzonej1,2,3,4 (Rysunek 1).
UWAGA: Dostępne są inne analogi nukleotydów i reagenty do zakręcania, ale te wykazały spójnie wysoką aktywność w edycji genomowej mRNA. Dostarczanie oparte na nanocząstkach jest odpowiednią alternatywą, ale nie jest omówione w tym protokole.
- Amplifikuj sekwencję kodującą edytora za pomocą PCR przez 30 cykli, używając primerów, które wprowadzają funkcjonalny promotor T7 w górę strumieniowego od regionu kodującego i sekwencję poli(A) w dół strumieniowego (Tabela 2 i Tabela 3).
UWAGA: Sekwencja nukleotydowa szablonu IVT jest podkreślona w tabeli 4. - Weryfikuj i oczyszczaj produkt PCR
- Uruchom 5 μL produktu PCR na żelu agarozy 1% w buforze TE przy 180 V przez 30 minut. Potwierdź obecność pojedynczej paski w przybliżeniu 4000-6500 bp (w zależności od transkrybowanego edytora) przed przejściem do czyszczenia produktu PCR.
- Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do czyszczenia PCR (Tabela materiałów).
UWAGA: Jeśli zauważysz wiele pasków lub słabą jakość produktu PCR, zoptymalizuj warunki termocyklingu (Tabela 5 – Tabela rozwiązywania problemów). - Zmierzyj zczyszczoną DNA za pomocą fluorometrycznego testu dsDNA. W przypadku analizy dsDNA Qubit przygotuj master mix buforu-barwnika łącząc 796 μL wysoce wrażliwego roztworu Qubit z 4 μL barwnika, oba dostarczone w zestawie.
- W oddzielnych probówkach zmieść 198 μL master mixu buforu-barwnika z 2 μL standardu niskiego stężenia S1, standardu wysokiego stężenia S2 i próbki. Wstaw każdy standard i próbkę zgodnie z instrukcjami w fluorometrze Qubit, aby zmierzyć stężenie stockowe.
UWAGA: Jeśli próbki są powyżej zakresu analizy, może być konieczne przygotowanie rozcieńczeń.
2. Transkrypcja mRNA
- Przygotuj reakcję IVT na lodzie za pomocą polimerazy RNA T7, NTP, analogu czapki do kotranskrypcyjnego zakręcania i N1-metylo-pseudourydyny trifosforanu jako substytutu urydyny, aby zmniejszyć aktywację odporności wrodzonej1˒5˒6.
- Przygotuj mieszaninę reakcji IVT zgodnie z Tabelą 4. Użyj zaadnotowanej sekwencji szablonu podanej w Tabeli 4. Zmontuj każdą reakcję transkrypcyjną w końcowej objętości 40 μL.
- Przygotuj 5-10 probówek reakcji, aby wygenerować wystarczającą ilość mRNA na wiele eksperymentów. Każda 40 μL reakcja generuje około 100 μg mRNA. Z 1 μg mRNA używanego do elektroporacji redagowania prime i 3 μg mRNA używanego do elektroporacji redagowania bazy, jest to wystarczająco dla ~33-100 elektroporacje.
- Transkrybuj RNA
- Dokładnie zmieść reakcję IVT za pomocą pipety. Inkubuj reakcję w 37 °C przez 2 h.
- Oczyść RNA
- Przenieś do 1,5 mL probówki i dodaj 7,5 M roztwór chlorku litu (LiCl) do reakcji IVT w objętości równej połowie całkowitej objętości reakcji, aby osiągnąć końcowe stężenie LiCl 2,5 M. Dla 40 μL reakcji IVT dodaj 20 μL 7,5 M LiCl. Dokładnie zmieść delikatnym pipetowaniem.
- Inkubować reakcję w -20 °C przez 30 minut. Wiruj próbkę w 16 000 x g w 4 °C przez 15 minut.
- Usuń nadstan z pipetą i wyrzuć. Umyj osadu z
Wyniki
Zastosowanie wydajnego edytora z łatwo dostępnym miejscem testowym, takiego jak edytor zasad ABE8e z miejscem kontrolnym HEK3, może często przynieść wydajność edycji powyżej 90%, pod warunkiem, że system dostarczania jest odpowiedni dla komórek wykorzystanych w eksperymencie. Niższa wydajność edycji może wynikać z problemów z mRNA edytora, gRNA, miejscem docelowym lub warunkami dostarczania, które czynią je mniej odpowiednimi do edycji. Wykorzystanie wariantów Cas9, które rozpoznają bardziej wszechstronne sekwencje PAM, ale wiążą je słabiej, lub kierowanie edytorów do nukleotydów znajdujących się poza ich optymalnym oknem edycji, może obniżyć wydajność procesu. Prawidłowo wygenerowane metodą IVT mRNA edytora zazwyczaj przejawia się jako pojedynczy dominujący prążek z minimalnym rozmazaniem lub niewielką ilością produktów degradacji o niskiej masie cząsteczkowej, co wskazuje na wysoką integralność transkryptu odpowiednią do późniejszej elektroporacji (Rysunek 2).
Po elektroporacji mRNA edytora i syntetycznych gRNA, większość komórek regeneruje się w ciągu 24–48 h i zachowuje typową morfologię przy zastosowaniu odpowiednich programów elektroporacji (Rysunek 3–4). Warunki elektroporacji powinny być dostosowane do konkretnego typu komórek, ponieważ różne bufory mogą przynieść znacząco odmienne rezultaty. Internetowe centrum wiedzy Lonza Knowledge Center zawiera rekomendacje dotyczące buforów i kodów elektroporacji dla powszechnie stosowanych typów komórek, a firma Lonza oferuje oddzielne zestawy optymalizacyjne dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Empiryczne porównanie buforów może pomóc w zidentyfikowaniu optymalnych warunków dla efektywnego dostarczania. Nieodpowiednie programy mogą prowadzić do całkowitego braku dostarczenia materiału lub mogą być wysoce toksyczne dla komórek (powodując utratę ponad 50% komórek lub uniemożliwiając kontynuację cyklu komórkowego). Reprezentatywne eksperymenty optymalizacyjne wykazały istotne różnice w wynikach edycji w zależności od warunków elektroporacji, gdzie niektóre programy zapewniały wysoką wydajność edycji, podczas gdy inne dawały minimalne efekty, co podkreśla znaczenie optymalizacji empirycznej dla każdego typu komórek (Rysunek 3–4).
W przypadku iPSC, fibroblastów i LCL do ilościowego określenia wydajności edycji oraz produktów ubocznych wykorzystuje się ukierunkowane sekwencjonowanie amplikonów, a następnie analizę CRISPResso2 (Rysunek 4). Przedstawiono tutaj edycję zasad adeniny w locus testowym HEK3 (Rysunek 4), która doprowadziła do zamierzonych konwersji nukleotydów przy niskiej częstotliwości występowania indeli w analizowanych próbkach. Analiza CRISPResso2 umożliwia wizualizację alleli edytowanych i nieedytowanych w locus docelowym oraz ułatwia kwantyfikację zamierzonych konwersji nukleotydów, częstotliwości indeli oraz innych produktów ubocznych edycji, zapewniając kompleksową ocenę wyników edycji (Rysunek 5). Wydajność edycji jest określana poprzez pomiar częstotliwości tej precyzyjnej substytucji pojedynczego nukleotydu w miejscu docelowym. Locus HEK3 jest wykorzystywany jako locus modelowe ze względu na jego dobrze scharakteryzowany profil edycji i powtarzalność w różnych systemach eksperymentalnych, co umożliwia rzetelną ocenę wydajności edycji zasad w różnych warunkach. Zalecamy testowanie tego przewodnika jako kontroli pozytywnej w komórkach ludzkich podczas optymalizacji nowych procedur edycji. Edycja zasad zazwyczaj charakteryzuje się przewagą zamierzonych konwersji nukleotydów przy niskiej częstotliwości indeli, podczas gdy edycja typu prime (prime editing) daje mieszaninę precyzyjnych edycji i niskoczęstotliwościowych produktów ubocznych3,12. Wydajność edycji różniła się w zależności od warunków, przy czym wyraźne różnice zaobserwowano między typami komórek a programami elektroporacji (Rysunek 3-4,). Zróżnicowanie to prawdopodobnie odzwierciedla różnice w pobieraniu przez komórki, przeżywalności i aktywności naprawy DNA, a także wpływ parametrów elektroporacji na wydajność dostarczania. Wspólnie wyniki te podkreślają znaczenie optymalizacji ustawień elektroporacji specyficznych dla danego typu komórek w celu uzyskania spójnych i maksymalnych efektów edycji.
Rysunek 1Przygotowanie mRNA edytora poprzez transkrypcję in vitro.
Schematyczny przegląd generowania mRNA edytora. (Krok 1) Przygotowanie matrycy plazmidowej zawierającej sekwencję kodującą edytor oraz promotor T7. (Krok 2) Amplifikacja PCR w celu uzyskania liniowej matrycy DNA. (Krok 3) Transkrypcja in vitro z użyciem polimerazy RNA T7 w celu syntezy mRNA z czapką. (Krok 4) Oczyszczanie mRNA w celu usunięcia matrycy DNA, enzymów i wolnych nukleotydów. Otrzymane mRNA z czapką nadaje się do dalszego wprowadzenia do komórek ssaków poprzez elektroporację lub nanocząsteczki lipidowe. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rycina 2. Przykładowy obraz elektroforezy żelowej mRNA
Obraz elektroforezy trzech mRNA edytorów genomu przeprowadzony na 1% żelu agarozy z użyciem barwnika SYBR gold. Po lewej stronie pokazano drabinę ssRNA od NEB z zaznaczonymi markerami wielkości i ich długością. Brak znacznego rozmycia lub małych prążków wskazuje, że mRNA te mają odpowiednią jakość. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3. Optymalizacja warunków elektroporacji dla edycji genomu w indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (iPSCs).
Przedstawiono wydajność edycji uzyskaną w różnych warunkach elektroporacji w iPSCs. Komórki poddano elektroporacji przy użyciu wielu kombinacji buforów i programów, w tym buforu CB-150 P4, buforu CD-118 P3, buforu DN-100 P3 oraz buforu DC-100 P3, we wszystkich przypadkach z wykorzystaniem urządzenia Lonza 4D Nucleofection. Edycję oceniano za pomocą urządzenia do elektroporacji Neon z parametrami (1600 V, 20 ms, 1 impuls). Wydajność edycji ilościowo określono za pomocą analizy sekwencjonowania celowanego locus poddanego edycji. N=1 na próbkę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4. Optymalizacja warunków elektroporacji dla edycji genomu w fibroblastach.
Wydajność edycji po elektroporacji z wykorzystaniem różnych programów nukleofekcji. Fibroblasty poddano elektroporacji przy użyciu wielu programów Lonza Nucleofector (CA-137, CM-138, DS-150, EH-100, EN-150, EO-114 oraz FF-113), a wyniki edycji określono ilościowo za pomocą sekwencjonowania celowanego. Wyniki przedstawiono dla dwóch powtórzeń (P2, P3). Uwzględniono kontrolę negatywną bez dostarczenia edytora. Porównanie kodów elektroporacji uwidacznia różnice w wydajności edycji w zależności od ustawień elektroporacji, co pozwala na zidentyfikowanie optymalnych parametrów dla edycji genomu fibroblastów. N=1 na próbkę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5. Charakterystyka wyników edycji genomu w docelowym locus.
Tabela częstotliwości alleli wygenerowana przez CRISPResso2, przedstawiająca względną liczebność alleli edytowanych i nieedytowanych wokół regionu docelowego sgRNA, określoną na podstawie analizy sekwencjonowania wysokoprzepływowego po edycji. Czerwone adnotacje wskazują okno edycji zasad oraz istniejący wcześniej polimorfizm heterozygotyczny obecny w użytej linii komórkowej. Sekwencja spacera sgRNA jest podkreślona na szaro. „Predicted cleavage position” (przewidywana pozycja cięcia) zaznaczona linią przerywaną jest przesunięta względem typowej pozycji „PAM minus 3” dla SpCas9 ze względu na modyfikację środka okna „wc” w naszym pliku wsadowym (przykład w Tabeli 8). Nie przesuwa to w rzeczywistości prawdziwej przewidywanej lokalizacji cięcia, ale wynik jest prezentowany w ten sposób, aby wskazać, że oceniane będą indels otaczające linię przerywaną w oknie 20 nukleotydów, obejmując zarówno indels centrowane w rzeczywistym miejscu nacięcia, jak i te centrowane na nukleotydach deaminowanych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Tabela 1. Edytory i sekwencje użyte w niniejszym badaniu
Kolumna 1: Edytory genomu dostępne w bazie AddGene do transkrypcji in vitro. Nazwy i numery ID Addgene dla dostępnych plazmidów nadających się do transkrypcji in vitro zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Kolumna 2: Sekwencje spacerów gRNA użytych w niniejszym badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Tabela 2. Odczynniki do PCR dla amplifikacji matrycy plazmidowej mRNA.
Lista odczynników i składników reakcji wykorzystanych do amplifikacji PCR matrycy plazmidowej w celu otrzymania linearnego DNA do dalszych zastosowań, a także sekwencje przednich i odwrotnych starterów transkrypcyjnych. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Tabela 3. Warunki cykli PCR dla amplifikacji matrycy mRNA.
W tabel tej przedstawiono warunki termocyklingu zastosowane do amplifikacji PCR matrycy mRNA z plazmidowego DNA przed dalszymi zastosowaniami. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Tabela 4. Odczynniki użyte do reakcji transkrypcji in vitro (IVT).
W tabeli wymieniono odczynniki i komponenty reakcji użyte do transkrypcji in vitro w celu syntezy mRNA edytora z liniowego szablonu DNA. Przedstawiono przykładową sekwencję szablonu (ABE8e) z elementami oznaczonymi kolorami. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Tabela 5. Przewodnik rozwiązywania problemów dla kluczowych etapów procesu edycji genomu.
Tabela ta podsumowuje częste problemy techniczne, które mogą wystąpić podczas przygotowania mRNA edytora poprzez transkrypcję in vitro (IVT) oraz analizę sekwencjonowania MiSeq. Dla każdego etapu procesu przedstawiono potencjalne problemy, możliwe przyczyny oraz zalecane rozwiązania, aby pomóc w optymalizacji wydajności edycji i zapewnieniu dokładnego wykrywania wyników edycji. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Tabela 6. Optymalne programy elektroporacji dla różnych typów komórek ssaków.
W tabeli tej wymieniono kody programów elektroporacji oraz warunki buforowe stosowane do wydajnego dostarczania mRNA edytora i przewodników RNA do różnych typów komórek ssaków. Wymienione parametry elektroporacji zostały przetestowane w celu zidentyfikowania warunków maksymalizujących wydajność edycji genomu przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek. Ten sam program może nie działać dla każdej linii komórkowej lub źródła komórek pierwotnych, dlatego w przypadku początkowego braku sukcesu w edycji zaleca się przetestowanie alternatyw z tej listy. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Tabela 7. Parametry analizy CRISPResso2 do kwantyfikacji wyników edycji genomu.
Pierwsza karta zawiera przykład projektu startera HTS1 wykorzystanego do amplifikacji locus docelowego. Druga karta przedstawia przykład starterów indeksujących użytych podczas przygotowania biblioteki. Trzecia karta ilustruje przykład rozmieszczenia indeksów wykorzystywany do przypisania unikalnych indeksów do każdej próbki podczas sekwencjonowania. Czwarta karta zawiera przykładowy plik wsadowy wejściowy do analizy CRISPResso2, a piąta karta dostarcza dodatkowy przykład pliku wsadowego wejściowego do analizy CRISPResso2. Należy zauważyć, że centrum okna „wc” jest dostosowane do edytorów zasad, aby ułatwić wykrywanie indeli centrowanych na zasadach deaminowanych, oprócz tych centrowanych na miejscu cięcia lub nacięcia nukleazy. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Tabela 8. Odczynniki do PCR1 (Tab 1) i PCR2 (Tab 2) dla przygotowania biblioteki MiSeq.
Tabela ta wymienia odczynniki i komponenty reakcji użyte w Tab 1 (PCR1) do amplifikacji docelowych loci genomicznych oraz w Tab 2 (PCR2) do wprowadzenia sekwencji indeksów specyficznych dla próbek i adapterów sekwencjonowania Illumina, co pozwala na wygenerowanie bibliotek gotowych do sekwencjonowania w analizie MiSeq. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Tabela 9. Warunki cykli PCR1 (Tab 1) i PCR2 (Tab 2) podczas przygotowywania biblioteki do MiSeq.
W poniższej tabeli przedstawiono warunki termocyklerowania zastosowane w Tab 1 (PCR1) w celu amplifikacji docelowych regionów genomowych oraz w Tab 2 (PCR2) w celu wprowadzenia sekwencji indeksujących specyficznych dla próbek oraz adapterów do sekwencjonowania Illumina, co pozwala na przygotowanie bibliotek gotowych do analizy MiSeq. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Dyskusja
Niniejszy protokół zapewnia przepływ pracy do edycji genomu w pierwotnych komórkach ssaczy przy użyciu elektroporacji mRNR edytora i syntetycznych kRNR przewodników. Dostarczanie jako mRNR ma tendencję do osiągania wyższej efektywności edycji w porównaniu z dostarczaniem plazmidowym, a mRNR jest zazwyczaj prostsza i bardziej jednolita pomiędzy partiami niż białko edytora lub rybonukleoproteina. Kiedy mRNR i rybonukleoproteinowe formy edytorów bazy były porównywane bezpośrednio w niektórych wcześniejszych pracach, mRNR osiągała lepszą efektywność edycji3. W porównaniu z metodami dostarczania plazmidowego lub wirusowego, dostarczanie oparte na mRNR umożliwia przejściową ekspresję i zmniejszone ryzyko integracji genomowej, choć może wymagać optymalizacji dla różnych typów komórek. Oprócz niższej efektywności edycji, użycie DNA plazmidowego do edycji genomu niesie ryzyko losowej integracji w genomie komórek docelowych i może zwiększać ryzyko edycji poza docelową sekwencją z powodu przedłużającej się ekspresji edytora. Połączenie sekwencjonowania ukierunkowanych amplifikonów i CRISPResso2 umożliwia standaryzowane kwantyfikowanie efektywności edycji i charakterystykę wszelkich allelicznych wyników3.
Kilka czynników jest istotnych dla sukcesu. Kluczowe kroki w tym protokole obejmują utrzymanie integralności RNA poprzez ścisłe, wolne od RNazy prowadzenie, wybór optymalnych kRNR przewodników oraz staranne optymalizowanie warunków elektroporacji dla każdego typu komórki. Integralność RNA i staranne sterowanie RNazą silnie wpływają na wyniki, a wybór kRNR przewodników pozostaje podstawowym czynnikiem wpływającym na efektywność i profile produktów ubocznych. Ustawienia elektroporacji wymagają empirycznej optymalizacji dla każdego typu komórki, a niektóre programy, które dają wysoką edycję, mogą również powodować toksyczność. Jeśli zaobserwowano niską efektywność edycji, należy rozważyć optymalizację parametrów elektroporacji, jakości RNA lub projektu kRNR przewodników. Jeśli wystąpi nadmierna toksyczność, zmniejszenie siły elektroporacji lub ilości wejściowego RNA może poprawić żywotność komórek. Dodatkowe strategie optymalizacji obejmują testowanie alternatywnych buforów elektroporacji i programów dostosowanych do docelowego typu komórki lub modyfikowanie stężeń edytora lub kRNR przewodników. Ten przepływ pracy zapewnia praktyczną platformę do porównywania edytorów i produkcji zmodyfikowanych komórek przed dalszym klonowaniem pojedynczych komórek, fenotypową analizą, badaniami in vivo lub rozwojem translacyjnym. Ten przepływ pracy jest powszechnie stosowany do oceny strategii edycji genomu w pierwotnych komórkach, umożliwiając systematyczne porównanie modalności edycji w różnych kontekstach genomowych i typach komórek. Wspiera modelowanie chorób poprzez wprowadzanie lub korektę klinicznie istotnych wariantów, a także funkcjonalne badanie kodujących i niekodujących elementów regulacyjnych. Ponadto zapewnia platformę do optymalizacji terapeutycznych podejść edycyjnych, w tym ocenę efektywności na docelowej sekwency, aktywności poza docelową sekwency, i trwałości edycji. Przepływ pracy może również być stosowany do przesiewania i priorytetyzacji kRNR przewodników i systemów edycji, oceny strategii dostarczania, oraz testowania wariantów specyficznych dla pacjenta w ramach precyzyjnej medycyny. W sumie służy jako wszechstronny most między podstawową biologią genomu, badaniami translacyjnymi, a rozwojem przedklinicznym. Ograniczeniem tej metody jest to, że efektywność elektroporacji i żywotność komórek mogą znacznie różnić się między typami komórek, co wymaga empirycznej optymalizacji. Dodatkowo, wyniki edycji mogą zależeć od projektu i czystości kRNR przewodników oraz dostępności docelowego locus, co może ograniczać powtarzalność w różnych systemach eksperymentalnych. Pomimo tych ograniczeń, staranna optymalizacja parametrów eksperymentalnych i projektu przewodników może zmniejszyć zmienność, umożliwiając niezawodne i powtarzalne zastosowanie tego podejścia w różnorodnych systemach komórkowych.
Oświadczenia
N.W. i E.V.B. złożyli wnioski patentowe dotyczące technologii edycji genomu poprzez Johns Hopkins University. G.A.N. złożył wnioski patentowe związane z technologiami edycji genomu poprzez Broad Institute i Johns Hopkins University.
Wkład autorów:
M.V., J.N.W., E.V.B, D.M.E., J.D. i G.A.N. każdy przygotowali oddzielne sekcje tekstu. M.V. zebrał i edytował końcowy tekst, po czym wszyscy autorzy dokonali edycji.
Podziękowania
Dziękujemy Beatriz Olalla Sastre za pomocne dyskusje dotyczące tego protokołu. Ta praca była wspierana przez nagrodę Big Beat Challenge Fundacji British Heart Foundation dla CureHeart (numer referencyjny wniosku BBC/F/21/220106), Fundację Mukowiscydozy (wniosek NEWBY23XX0) oraz Narodowymi Instytutami Zdrowia USA (R00HL163805 i DP2OD038783 dla G.A.N.). J.N.W. z okazji wsparcia dziękuje za grant NIH nr. T32 GM148383.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1M Tris-HCl, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | R0491 | Agarose UltraPure 16500500 ThermoFisher 500g |
| AMPure XP SPRI Beads | Beckman Coulter | B23317 | A63880, AMPure XP Beads for DNA Cleanup, 5 mL, Beckman Coulter |
| ATP (100 mM) | New England Biolabs | N0450 | |
| CEPT Cocktail | Bio-Techne / Tocris | 7200 | |
| CleanCap AG Reagent | TriLink Biotechnologies | N-7113 | CleanCap AG 3′ OMe CleanScript IVT Kit, 125 x 20 µL rxns, |
| CTP (100 mM) | New England Biolabs | N0450 | |
| Custom DNA Primers | Integrated DNA Technologies | Custom | |
| DNA Loading Dye | New England Biolabs | B7024 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | D8537-100ML |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | DMEM High Glucose [4,500 mg/L] with [4.0 mM] L-Glutamine and [110 mg/L] Sodium Pyruvate, 500 mL |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| GTP (100 mM) | New England Biolabs | N0450 | |
| Illumina Indexing Primers | Illumina | FC-131-2001 | 10uM stocks |
| Illumina MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| Lithium Chloride RNA Precipitation Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9480 | |
| Lonza 4D Nucleofector System | Lonza | AAF-1002X | |
| ssRNA Ladder NEB | NEB | N0362S | 5ul/ reakcja |
| MiSeq Reagent Kit v3 (300 cycles) | Illumina | MS-102-3002 | |
| N1-Methyl-Pseudouridine-5′-Triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544 | |
| Nuclease-Free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| NucleoCounter NC Slide A8 | ChemoMetec | 941-0008 | |
| NucleoCounter NC-3000 | ChemoMetec | NC-3000 | 10ul of cell solution and 0.4167 μL of DAPI solution |
| Solution 15, Hoechst 33342, 1 mL 910-3015 Chemometec | Chemometec | 910-3013 | 500 μg/ml ~ 0.9 mM ~ 0.05% |
| Nucleocuvette Strips | Lonza | V4XP-3032 | |
| P3 Primary Cell Nucleofector Solution | Lonza | V4XP-3032 | 1 x 0.675 mL P3 Primary Cell Nucleofector® Solution |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530L | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | EO0491 | Quantity: 1mL, >600 U/mL (~20 mg/mL) |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491 | 2,000 units/ml 100 units |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q33230 | |
| Qubit RNA Broad Range Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q10211 | |
| Qubit™ Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | 5ul/ reakcja |
| RNA Purification Kit | Zymo Research | R1017 | |
| RNase Away | Thermo Fisher Scientific | 1236B62 | |
| SDS, 10% solution | Thermo Fisher Scientific | 15553027 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| Synthetic sgRNA / pegRNA | Synthego / IDT | Custom | 2ug |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit, 250 reactions | New England Biolabs | E2040L | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 100 mL |
| TE buffer (Tris-EDTA) | Thermo Fisher Scientific | AM9849 | TE, pH 8.0, RNase-free Thermo |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 1X |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Premium, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A5670701 | |
| mTSER PLUS | STEM cell Technologies | # 100-0276 | |
| Penicillin/Streptomycin Mixture 10,000 ug/mL, 100 mL, 4-pack | Quality Biological | 120-095-721 |
Bibliografia
- Gao H, Gao S, Kan G, Valentovich LN, An Y. Research progress of base editing and prime editing tools based on the CRISPR/Cas system. Mol Ther Nucleic Acids. 2025;36.
- Chen PJ, Hussmann JA, Yan J, et al. Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes. Cell. 2021;184(22):5635–5652. doi:10.1016/j.cell.2021.09.018.
- Newby GA, Yen JS, Woodard KJ, et al. Base editing of haematopoietic stem cells rescues sickle cell disease in mice. Nature. 2022;595(7866):295-302. doi:10.1038/s41586-021-03609-w.
- Sousa AA, Hemez C, Lei L, et al. Systematic optimization of prime editing for the efficient functional correction of CFTR F508del in human airway epithelial cells. Nat Biomed Eng. 2024;9(1):7. doi:10.1038/s41551-024-01233-3.
- Mayuranathan T, Newby GA, Feng R, et al. Potent and uniform fetal hemoglobin induction via base editing. Nat Genet. 2023;55(7):1210-1217.
- He W, Zhang X, Zou Y, et al. Effective synthesis of high-integrity mRNA using in vitro transcription. Molecules. 2024;29(11).
- Popova PG, Lagace MA, Tang G, Blakney AK. Effect of in vitro transcription conditions on yield of high-quality messenger and self-amplifying RNA. Eur J Pharm Biopharm. 2024;198.
- Zhang F, Wang Y, Wang X, et al. RT-IVT method allows multiplex real-time quantification of in vitro transcriptional mRNA production. Commun Biol. 2023;6(1).
- Montague TG, Cruz JM, Gagnon JA, Church GM, Valen E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 2014;42(W1)-W407.
- Concordet JP, Haeussler M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 2018;46(W1)-W245.
- Mohr SE, Hu Y, Ewen-Campen B, Housden BE, Viswanatha R, Perrimon N. CRISPR guide RNA design for research applications. FEBS J. 2016;283(17):3232-3245.
- Huang TP, Newby GA, Liu DR. Precision genome editing using cytosine and adenine base editors in mammalian cells. Nat Protoc. 2021;16(2):1089-1106. doi:10.1038/s41596-020-00450-9.
- Doman JL, Sousa AA, Randolph PB, Chen PJ, Liu DR. Designing and executing prime editing experiments in mammalian cells. Nat Protoc. 2023;18(6):1780-1818. doi:10.1038/s41596-022-00724-4.
- Chicaybam L, Barcelos C, Peixoto B, et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Front Bioeng Biotechnol. 2017;4:99.
- Clement K, Rees H, Canver MC, et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nat Biotechnol. 2019;37(3):224-230.
Przedruki i uprawnienia
