Modele zakażenia bakteryjnego we wcześniaków są niezbędne, jednak istniejące modele na gryzoniach nie mają znaczenia klinicznego. Wysoce translacyjny model noworodkowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych został opracowany z wykorzystaniem wcześniaków zakażonych żywym Staphylococcus epidermidis.
Artykuł metodologiczny
Model przedwczesnego szczenięcia translacyjnego dla noworodkowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wcześniaki są szczególnie podatne na infekcje bakteryjne, które mogą szybko progresować do groźnej dla życia sepsy, która to jest stanem nadmiernej inflamacji i dysfunkcji narządów. Aby zbadać mechanizmy chorobowe i rozwinąć rozwój terapii, krytycznie potrzebne są solidne translacyjne modele zwierzęce, które replikują złożoną patofizjologię i kliniczne objawy noworodkowej sepsy. Ten protokół przedstawia klinicznie istotny model wcześniaka świnki na sepsie noworodkowej, wywoływany poprzez dożylne wlewanie żywych Staphylococcus epidermidis wkrótce po urodzeniu lub w trzecim dniu po urodzeniu. Świnki są dostarczane w 90% ciąży przez cięcie cesarskie i są traktowane w warunkach intensywnej opieki neonatologicznej. Obejmują one inkubatory z kontrolowaną temperaturą i tlenem oraz przewód tętniczy pępowinowy, który umożliwia podawanie żywienia pozajelitowego i ciągłe pobieranie próbek krwi. Po infekcji S. epidermidis świnki są monitorowane przez 24–48 h. Częstość występowania i nasilenie sepsy można modulować poprzez dawkę bakterii i podaż glukozy dożylnej. Wyższe podawanie glukozy dożylnej przyspiesza pro-zapalne odpowiedzi immunologiczne, prowadząc do pogorszenia stanu klinicznego. Śmiertelna sepsa i humane endpointy są zdefiniowane przez parametry gazometrii krwi tętniczej (pH ≤ 7.1) w połączeniu z objawami klinicznymi zaburzeń hemodynamicznych takimi jak letarg, zmiany barwy skóry i tachypnoe. Ten model zapewnia unikalną platformę do badania, jak metabolizm energetyczny i interwencje immunomodulacyjne wpływają na usuwanie bakterii, ogólnoustrojową inflamację i uszkodzenie tkanek podczas infekcji noworodkowej. Posiada znaczny potencjał do informowania strategii klinicznych w zakresie zapobiegania i leczenia noworodkowej sepsy.
Wprowadzenie
Zakażenie noworodkowe jest jedną z głównych przyczyn zgonów i długotrwałej niepełnosprawności na całym świecie, szczególnie wśród niemowląt przedwczesnych, ale także wśród noworodków dojrzałych o niskiej masie urodzeniowej lub z powikłaniami dookołaporodowymi1,2. Wczesne rozpoznanie pozostaje wyzwaniem ze względu na niespecyficzne objawy kliniczne, niedojrzałe i bardzo zmienne reakcje odpornościowe oraz brak wrażliwych i specyficznych biomarkerów, które mogłyby odróżnić infekcję od niezakaźnego stanu zapalnego3,4. W rezultacie kliniccy często rozpoczynają empiryczną terapię antybiotykową o szerokim spektrum działania, często przed potwierdzeniem mikrobiologicznym, co przyczynia się do nadmiernego stosowania antybiotyków, zaburzenia wczesnej kolonizacji mikrobioty i rozwoju oporności na leki przeciwdrobnoustrojowe5.
Sepsa noworodkowa jest stanem zagrażającym życiu, spowodowanym dysregulowaną reakcją organizmu na infekcję, która prowadzi do niewydolności narządów4. Chociaż infekcja i sepsa reprezentują odrębne jednostki biologiczne i kliniczne, terminy te są często używane zamiennie w literaturze neontalologicznej. Klinicznie, sepsa noworodkowa jest zwykle klasyfikowana jako wczesna lub późna sepsa (EOS, LOS), występująca przed lub po 72. godzinie życia, odpowiednio1. EOS jest zazwyczaj spowodowana patogenami przenoszonymi podczas porodu, takimi jak Escherichia coli lub grupa B Streptococcus. W przeciwieństwie do tego, LOS często objawia się niespecyficznymi objawami, może być ujemny w hodowli i jest związana z czynnikami ryzyka, takimi jak zabiegi inwazyjne, żywienie dożylne i przedłużona hospitalizacja. Najczęstszymi patogenami są stapłokoki nieprodukujące koagulazę, szczególnie Staphylococcus epidermidis, a także bakterie Gram-ujemne, choć występują również infekcje grzybicze i polimikrobialne1,2,6. Niezależnie od etiologii, infekcje noworodkowe mogą prowadzić do wspólnego fenotypu sepsy1,2. Co ważne, niemowlęta przedwczesne wykazują niedojrzałość rozwojową zarówno odporności wrodzonej, jak i nabytej, wraz z ograniczonymi rezerwami metabolicznymi, co może wpływać na reaktywność na infekcję7.
Postęp w diagnostyce i leczeniu był utrudniony przez ograniczenia istniejących systemów eksperymentalnych. Podejścia in vitro pozwalają na badania mechanizmu dróg odpornościowych, ale nie uwzględniają zintegrowanej fizjologii złożonych reakcji immunologicznych. Modele na gryzoniach, choć przydatne w badaniach genetycznych i molekularnych dotyczących odpowiedzi immunologicznych noworodków, różnią się znacznie od ludzi pod względem ontogenezy immunologicznej, metabolizmu i wielkości8,9. Leczenie kliniczne sepsy jest trudne do badania w tych modelach z powodu ograniczonych możliwości intensywnego monitorowania, wielokrotnego pobierania krwi i testowania klinicznie realistycznych metod wsparcia lub terapii.
Modele na dużych zwierzętach, szczególnie przedwcześnie urodzone świnki, oferują potężne, uzupełniające podejście. Świnie mają bliskie podobieństwo anatomiczne, fizjologiczne i immunologiczne do ludzi, w tym porównywalne populacje komórek immunologicznych, sygnalizację receptorów rozpoznawania wzorców i regulację metaboliczną10,11,12,13,14. Co ważne, świnie są szeroko stosowane jako modele sepsy u dorosłych13,15. Fizyczna skala świń pozwala na stosowanie narządów o znaczeniu klinicznym, ciągłą monitorowanie fizjologiczne, wielokrotne pobieranie próbek biologicznych i standaryzowane interwencje w intensywnej terapii, takie jak żywienie dożylne, terapia płynowa, antybiotyki i wsparcie oddechowe. Eksperymentalne zakażenie można również badać w kontekście niedojrzałości rozwojowej, umożliwiając badanie toru choroby, reakcji gospodarza i efektów leczenia w warunkach, które bliżej przypominają praktykę kliniczną.
Niniejszy artykuł opisuje standaryzowany model sepsy noworodkowej u przedwcześnie urodzonych świnek, zaprojektowany jako elastyczna platforma translacyjna. Model umożliwia kontrolowane wywołanie ogólnoustrojowej infekcji bakteryjnej oraz długotrwałą ocenę reakcji klinicznych, immunologicznych i metabolicznych, które mogą być wykorzystane do badania patofizjologii sepsy noworodkowej i oceny skuteczności nowatorskich interwencji prewencyjnych i terapeutycznych.
Protokół
Wszystkie szczegółowo opisane procedury przeprowadzono zgodnie z dyrektywą UE 2010/63/UE dotyczącą eksperymentów na zwierzętach i zatwierdzono przez Duńską Inspekcję Eksperymentów na Zwierzętach (numer licencji: 2020-15-0201-00520).
1. Procedury dotyczące porodu
- Przeprowadzić dobrowolną cesarską sekcję w celu urodzenia przedwcześnie narodzonych prosiąt w 90% ciąży (dni ciąży 106–107).
- Uzyskać ciężarną lochę (Landrace × Large White, trzecia lub czwarta parytet) z komercyjnej farmy bez specyficznych patogenów.
UWAGA: Lochę należy zapłodnić metodą sztucznego unasieniania (× Duroc), aby upewnić się, że dokładny dzień poczęcia jest znany. - Pogodzić lochę na noc (minimum 12 godzin) z dostępem ad libitum do wody przed operacją. Wywołać osaczenie za pomocą wstrzyknięcia domięśniowego koktajlu zawierającego atropinę (2 mL na lochę), butorfanol (2 mL/100 kg masy ciała; 10 mg/mL) i Zoletil 50 Vet (3,3 mL/100 kg masy ciała; tiletamina 25/mL i zolazepan 25 mg/mL).
- Po osaczeniu wprowadzić cewnik do żyły ucha i wywołać znieczulenie ogólne za pomocą propofolu (10 mg/mL), dostosowując dawkę do utraty odruchu powiekowego i napięcia żuchwy.
- Przeprowadzić intubacjętchawicępod kontrolą bezpośredniej laryngoskopii w celu zabezpieczenia drogi oddechowej. Przez cały czas trwania sekcji cesarskiej utrzymywać znieczulenie chirurgiczne za pomocą zgazowanego izofluranu dostarczanego w 100% tlenie (1–2 L/min) przez skalibrowany parownik.
- Rozpocząć od 5% i utrzymywać na poziomie 1,5–2,5%, dostosowując stężenie do najniższej efektywnej dawki na podstawie tętna i obwodowego nasycenia tlenem.
UWAGA: W przypadku wystąpienia apnei, należy rozpocząć wentylację mechaniczną, aby zapewnić odpowiednie natlenienie. - Ułożyć lochę w leżącej pozycji bocznej prawej strony. Przeprowadzić aseptyczne przygotowanie miejsca operacji. Podać całkowitą objętość 120 mL lidokainy (10 mg/mL) poprzez iniekcję podskórną i śródmięśniową wzdłuż przewidzianej linii nacięcia na lewej flance.
- Przeprowadzić laparotomię lewej flanki za pomocą skalpela w celu ekspozycji i wyprowadzenia rogów macicy. Wyciąć rogi macicy wzdłuż krzywizny większej, aby urodzić pojedyncze prosięta.
- Przed przecięciem pępowiny, odmlecić pępowinę 2–3 razy w kierunku prosięcia, aby zwiększyć stężenie hemoglobiny i zapasy żelaza. Nałożyć na pępowinę klips oznaczony od A do Z wraz z gazikiem, aby zapobiec krwawieniu, i przeciąć pępowinę.
- Natychmiast po urodzeniu, umieścić każde prosię w polietylenowej torbie, pozostawiając głowę na zewnątrz. Torba minimalizuje utratę ciepła, zmniejszając tym samym ryzyko hipotermii.
- Podać stałą objętość 0,1 mL doksapram (20 mg/mL) i 0,1 mL flumazenil (0,1 mg/mL) domięśniowo w szyję. Doksapram stymuluje samoistne oddychanie, podczas gdy flumazenil, antagonista benzodiazepin, częściowo odwraca znieczulenie przeniesione z lochą podczas sekcji cesarskiej.
- Przeniesienie prosiąt do jednostki intensywnej opieki nad noworodkami.
- Uzyskać ciężarną lochę (Landrace × Large White, trzecia lub czwarta parytet) z komercyjnej farmy bez specyficznych patogenów.
- Resuscytacja, randomizacja i kateteryzowanie
- Na podstawie przeniesienia do jednostki intensywnej opieki nad noworodkami, ważyć i określić płeć każdego prosięcia.
- W przypadku prosiąt niezdolnych do samoistnego oddychania, przeprowadzić resuscytację indywidualnie. Powtórzyć dawki doksapram i/lub flumazenil oraz zapewnić wentylację o dodatnim ciśnieniu w razie potrzeby, aby ustabilizować oddychanie.
- Gdy prosięta są fizjologicznie stabilne i nadal są znieczulone z powodu przeniesionego znieczulenia z lochą, za pomocą techniki aseptycznej wprowadzić kateter tętnicy pępowinowej (4 Fr PVC cewnik do karmienia) do jednej z tętnic przeciętej pępowiny. Przesunąć końcówkę katetru do aorty grzbietowej. Zabezpieczyć kateter do skóry za pomocą szwów i podłączyć go do linii infuzyjnej w celu podawania żywienia dożylnego.
UWAGA: U przedwcześnie urodzonych prosiąt, podanie dożylne jest ustanowionym standardem w porównaniu z żyłą pępowiny, aby uniknąć potencjalnej martwicy wątroby wynikającej z wysokiego ryzyka niewłaściwego umiejscowienia końcówki katetru w parenchymie wątroby, a nie w przewodzie żylnym21. - Stratyfikować prosięta według wagi urodzeniowej i płci oraz losowo przydzielić je do grup leczenia.
- Warunki chowu
- Umieścić każde prosię osobno w ogrzewanej, wyściełanej inkubatorze z kontrolowanym wentylowaniem.
- Dostarczać tlenu uzupełniającego (1–
Wyniki
Przeprowadzono eksperyment zależności dawka-odpowiedź u przedwcześnie urodzonych prosiąt hodowanych do 5. dnia po urodzeniu (Rysunek 1). W 3. dniu po urodzeniu prosięta otrzymały infuzję niskiej dawki S. epidermidis (109 CFU/kg, n = 9), wysokiej dawki S. epidermidis (5 × 109 CFU/kg, n = 9) lub soli fizjologicznej jako kontroli (n = 3), a następnie były monitorowane przez 44 h.
Po infuzji S. epidermidis obciążenie krwi bakteriami pozostało wyższe przez cały 44 h okres obserwacji u prosiąt otrzymujących wysoką dawkę w porównaniu z grupą otrzymującą niską dawkę (Ryc. 2A, P < 0.05). Sepsę rozwinęły jedynie prosięta z grupy wysokiej dawki (3/9), a jej wystąpienie nastąpiło około 12–15 h po zakażeniu (Ryc. 2B). Zgodnie z tym, u prosiąt otrzymujących wysoką dawkę S. epidermidis stwierdzono niższe pH krwi w 12 h (Ryc. 2C, P < 0.001), czemu towarzyszył wyraźny wzrost ciśnienia parcjalnego dwutlenku węgla (pCO₂) (Ryc. 2D, P < 0.01) w porównaniu z grupą niskiej dawki.
W fazie ostrej zakażenia (6 h) w obu grupach zakażonych stwierdzono niższą nadwyżkę zasad oraz wyższe poziomy mleczanów w porównaniu z kontrolami soliniowymi, przy czym bardziej wyraźne zmiany utrzymywały się do 12 h w grupie z wysoką dawką S. epidermidis (Rysunek 2E, F, P < 0,01 – 0,05). Poziomy glukozy we krwi nie różniły się między grupami (Rysunek 2G).
Po 6 h w obu grupach zakażonych zaobserwowano również wyraźną neutropenię we krwi w porównaniu z niezakażoną grupą kontrolną (Rycina 3A, oba P< 0,001). W późniejszym etapie zakażenia w obu grupach zakażonych odnotowano uzupełnianie liczby neutrofili, przy czym było ono większe w grupie otrzymującej niską dawkę S. epidermidis (Rycina 3A, P < 0,05). W obu grupach zakażonych w trakcie eksperymentu rozwinęła się małopłytkowość; jednak liczba trombocytów spadła wcześniej i bardziej znacząco w grupie otrzymującej wysoką dawkę S. epidermidis w porównaniu zarówno z grupą otrzymującą niską dawkę, jak i z niezakażoną grupą kontrolną (Rycina 3B, P < 0,01–0,05). Poziomy TNF-α, IL-6 i IL-10 w osoczu były podwyższone w obu grupach zakażonych w 6. i 12. godzinie po zakażeniu w porównaniu z grupami kontrolnymi (Rycina 3C, P < 0,001–0,05). Po 24 h poziomy TNF-α i IL-10 w osoczu pozostały podwyższone tylko w grupie otrzymującej wysoką dawkę S. epidermidis w porównaniu z niezakażoną grupą kontrolną (P < 0,05), natomiast do 44. godziny podwyższone pozostały jedynie poziomy TNF-α (P < 0,05).
Podczas eutanazji, gdy prosięta osiągnęły punkty końcowe z przyczyn humanitarnych lub zostały poddane eutanazji w zaplanowanym punkcie czasowym 44 h po zakażeniu, zmierzono poziom w osoczu negatywnych białek ostrej fazy oraz markerów uszkodzenia narządów (Rycina 4A–G). spośród nich jedynie poziom cholesterolu (negatywnego białka ostrej fazy) był istotnie niższy u prosiąt zakażonych wysoką dawką S. epidermidis w porównaniu z grupą z niską dawką (Rycina 4B, P < 0.05). Średnie poziomy markerów uszkodzenia wątroby, w tym aminotransferazy alaninowej i aminotransferazy asparaginianowej, a także markerów uszkodzenia nerek, takich jak kreatynina i azot mocznicowy krwi, były numerycznie wyższe w grupie z wysoką dawką S. epidermidis niż w niezinfekowanej grupie kontrolnej (Rycina 4D–G).
Rysunek 1: Projekt eksperymentalny. Przedwcześnie urodzone prosięta zostały dostarczone poprzez cięcie cesarskie przy 90% okresu gestacji. W 3. dobie po urodzeniu prosięta otrzymały dożylną infuzję żywych S. epidermidis w dawce 109 lub 5 × 109 CFU/kg lub sól fizjologiczną w grupie kontrolnej. Po zakażeniu prosięta były monitorowane przez 44 h, a podłużne pobieranie krwi przeprowadzano w określonych punktach czasowych. Rysunek stworzony za pomocą Biorender.com. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Obciążenie krwi bakteriami, przeżywalność i parametry gazometryczne krwi u przedwcześnie urodzonych prosiąt po wlewie tętniczym soli fizjologicznej (CON) lub zakażeniu żywymi S. epidermidis. (A) Gęstość S. epidermidis w próbkach krwi pobranych 6, 24 i 44 h po zakażeniu. (B) Krzywe przeżywalności wykazujące czas do osiągnięcia punktu końcowego humanitarnego lub planowanej eutanazji w 44 h po zakażeniu. (C–G) Parametry gazometryczne krwi tętniczej w 0, 6, 12, 24 i 44 h po zakażeniu. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. (A), krzywe przeżywalności (B) lub wykresy skrzypcowe z kropkami obejmujące medianę (linia ciągła) i IQR (linie przerywane) (C–G). n = 9 dla każdej grupy zakażonej; n = 3 dla kontroli niezakażonej. Dane analizowano przy użyciu liniowego modelu mieszanego z uwzględnieniem interakcji grupa × czas (A, C–G) lub modelu proporcjonalnych hazardów Coxa (B). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Skróty: CON = kontrola; pCO2 = ciśnienie parcjalne CO2; SE = S. epidermidis. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Krążące markery zapalne u przedwcześnie urodzonych prosiąt po infuzji tętniczej soli fizjologicznej (CON) lub infekcji żywymi S. epidermidis. (A, B) Liczba krążących neutrofili i płytek krwi w 6, 12, 24 i 44 h po infekcji. (C) Poziomy TNF-α, IL-6 i IL-10 w osoczu w 6, 12, 24 i 44 h po infekcji. Dane przedstawiono na wykresach skrzypcowych z punktami, zawierających medianę (linia ciągła) i IQR (linie przerywane) (A–C). n = 9 dla każdej grupy zainfekowanej; n = 3 dla niezinfekowanej grupy kontrolnej. Dane analizowano przy użyciu liniowego modelu mieszanego, uwzględniając interakcje grupa × czas (A–C). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Skróty: CON = grupa kontrolna; IL = interleukina; SE = S. epidermidis; TNF = czynnik martwicy nowotworów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Parametry biochemiczne osocza u przedwcześnie urodzonych prosiąt po wlewie tętniczym soli fizjologicznej (CON) lub zakażeniu żywymi S. epidermidis (109 lub 5× 109 CFU/kg). (A–G) Poziomy albumin, cholesterolu, ALP, ALAT, ASAT, kreatyniny i BUN w osoczu w punkcie końcowym (human endpoint) lub podczas zaplanowanej eutanazji 44 h po zakażeniu. Dane przedstawiono na wykresach pudełkowych z wąsami ukazującymi pełen zakres (minimum do maksimum) (A–G). Pojedyncze punkty danych w ciemnofioletowym kolorze oznaczają prosięta, u których rozwinęła się sepsa. n = 9 dla każdej grupy zakażonej; n = 3 dla kontroli niezakażonej. Dane analizowano przy użyciu modelu wielokrotnej regresji liniowej (A–G). *P < 0.05. Skróty: ALAT = aminotransferaza alaninowa; ALP = fosfataza alkaliczna; ASAT = aminotransferaza asparaginianowa; BUN = azot mocznika we krwi; CON = kontrola; SE = S. epidermidis. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Ilość całkowita | Stężenie | |||
| Energia | 7762 | kJ | 3525 | kJ/L |
| Makroskładniki | ||||
| Aminokwasy | 92 | g | 42 | g/L |
| Tłuszcz | 66 | g | 30 | g/L |
| Glukoza | 221 | g | 100 | g/L |
| Mikroskładniki | ||||
| Na | 64 | mmol | 29 | mmol/L |
| K | 48 | mmol | 22 | mmol/L |
| Mg | 8 | mmol | 4 | mmol/L |
| Ca | 4 | mmol | 2 | mmol/L |
| PO4 | 18 | mmol | 8 | mmol/L |
| SO4 | 8 | mmol | 4 | mmol/L |
| Cl | 93 | mmol | 42 | mmol/L |
| Octan | 78 | mmol | 35 | mmol/L |
Tabela 1: Skład zmodyfikowanego całkowitego żywienia pozajelitowego. Całkowite ilości i stężenia energii, makroskładników (aminokwasów, tłuszczów i glukozy) oraz mikroskładników w roztworze do żywienia pozajelitowego.
Rysunek uzupełniający 1: Kinetyka wzrostu S. epidermidis WT-1457. Bakterie hodowano w pożywce BHI (brain heart infusion) w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu orbitalnym z prędkością 180 rpm. Gęstość optyczną mierzono przy 600 nm w funkcji czasu. Dane przedstawiono w skali logarytmicznej (A) oraz liniowej (B) (n = 3 niezależne eksperymenty).Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Znormalizowany model noworodkowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u przedwcześnie urodzonych prosiąt został zaprojektowany w celu badania ogólnoustrojowej infekcji bakteryjnej w warunkach klinicznie istotnej niedojrzałości noworodków. Model łączy kontrolę wieku ciążowego, resuscytację i wsparcie intensywnej terapii, czas infekcji i longitudinalne pobieranie krwi. Takie podejście ma na celu zamknięcie luki między systemami eksperymentalnymi na gryzoniach i in vitro oraz złożoną fizjologią spotykaną u noworodków z zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych. Co ważne, ten model został wykorzystany do potwierdzenia znanego związku między płcią, niskim wskaźnikiem masy urodzeniowej i wiekiem ciążowym a wrażliwością na zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, obserwowaną u przedwcześnie urodzonych noworodków16,17,18.
Świnie są bardzo istotnym dużym modelem zwierzęcym do badań nad infekcjami ze względu na znaczne podobieństwa z ludźmi w funkcji układu odpornościowego i fizjologii. Kluczowe komponenty wrodzonego układu odpornościowego, w tym podzbiory leukocytów, sygnalizowanie receptorów rozpoznawania wzorców i odpowiedzi cytokinowe, wykazują bliskie odpowiedniki między świniami a ludźmi. Główne różnice immunologiczne między noworodkami prosiąt a ludźmi leżą w obrębie adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych. Ponieważ podczas ciąży u świń nie ma przeniesienia immunoglobulin G (IgG) przez łożysko, noworodki prosiąt są urodzone naiwne pod tym względem19. Podobnie, podczas gdy komórki B noworodków nie przechodzą przemiany izoformy od IgM do IgG przed ukończeniem 3–6 miesięcy życia, komórki B świń są zdolne do wywołania odpowiedzi IgG wkrótce po urodzeniu20.
W tym systemie modelowym te różnice są łagodzone poprzez wywołanie infekcji wkrótce po urodzeniu, zanim mogą wystąpić adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne, oraz poprzez dostarczenie immunoglobulin matecznych poprzez transfuzję osocza. Takie podejście prowadzi do występowania poziomów IgG we krwi krążącej podobnych do tych u noworodków z bardzo przedwczesnym urodzeniem, u których dochodzi do przerwania przeniesienia IgG przez łożysko z powodu przedwczesnego porodu17. Ponadto, stosunkowo duża masa ciała przy urodzeniu (~800 g) dodatkowo wzmacnia model w porównaniu z noworodkami myszy (~3 g). W rezultacie, wpływy środowiskowe takie jak temperatura, wilgotność i ciśnienie tlenu bardziej przypominają te, które doświadczają ludzkie noworodki. Ta skala umożliwia również stosowanie sprzętu klasy klinicznej, inwazyjnego monitorowania i modalności wsparcia, takich jak dostęp naczyniowy, wsparcie oddechowe i ciągłe monitorowanie fizjologiczne, które nie są wykonalne w noworodkowych modelach gryzoni. W szczególności, dostęp naczyniowy do infuzji, takich jak odżywianie pozajelitowe, w modelu przedwcześnie urodzonych prosiąt jest osiągany poprzez cewnik tętniczy pępowiny. Chociaż to kontrastuje ze standardową drogą dożylną stosowaną w klinicznej neonatologii, jest to konieczne z powodu anatomicznych ograniczeń przedwcześnie urodzonych prosiąt, gdzie cewniki żyły pępowinowej rzadko przechodzą przez przewód żylny samoistnie i zamiast tego źle się umieszczają w miąższu wątroby21. Podawanie doarterialne zapewnia niezawodną i powtarzalną drogę dla ciągłej infuzji bez wysokiego ryzyka martwicy wątroby związanej z nieprawidłowym umieszczeniem żyły pępowinowej. Podobnie, to pozwala na pobieranie krwi tętniczej do analizy gazów we krwi.
Infekcja ogólnoustrojowa w tym modelu jest wywoływana przez doarterialną infuzję żywych S. epidermidis, jednej z głównych przyczyn późno występującego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych w jednostkach intensywnej terapii noworodków1,2. Jednak zbiór różnorodnych patogenów powoduje zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków, a koagulazo-negatywne paciorkowce, takie jak S. epidermidis, są również znane z powodowania mniej poważnych infekcji i niższego ryzyka zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych niż inne, bardziej wirulentne patogeny, takie jak E. coli1,2. Chociaż model wykorzystuje patogen o niskiej wirulencji, obserwowana klinicznie pogorszenie stanu, aktywacji zapalnej i niestabilności fizjologicznej odzwierciedla kluczowe cechy zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków. Niezakażona grupa kontrolna (n = 3) w tym badaniu służy jako referencyjna linia bazowa do wykazania stanu fizjologicznego "zdrowych" przedwcześnie urodzonych prosiąt w identycznych warunkach intensywnej terapii. Chociaż prowadzi to do braku równowagi w projekcie, porównania te mają na celu reprezentowanie odpowiedzi organizmu na infekcję. Jak pokazano na Rysunku 2, istniała wyraźna zależność dawka-odpowiedź wraz ze zwiększeniem dawek S. epidermidis, zgodnie z poprzednimi wynikami u prosiąt zakażonych w pierwszym dniu życia22. Ty
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez personel z grupy Porównawczej Pediatrii, Uniwersytetu Kopenhaskiego, oraz finansowana przez Fundację Novo Nordisk (NNF23OC0085457 i NNF22OC0078747).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,1–10 µL pipetowe końcówki “Optifit” | Sartorius | 790010 | |
| 1 mL jednorazowe strzykawka (sterylna) | e-power | 150001S | |
| 1 mL strzykawka z igłą 25 G X 16 mm (sterylna) | B. Braun Melsungen AG | 9161465V | |
| 1,5 mL probówki | Eppendorf | 30125215 | |
| 10 mL jednorazowe strzykawka (sterylna) | e-power | 150010S | |
| 100 mL kolby Erlenmeyer | Duran Wheaton Kimble | 212162403 | |
| 1000 µL pipeta | Sartorius | 46880171 | |
| 12 G “Intraflon 2” igły (sterylne) | Vygon | 122.27 | |
| 16 G X 40 mm “Microlance 3” igły (sterylne) | Becton Dickinson | 300637 | |
| 18 G X 40 mm “Microlance 3” igły (sterylne) | Becton Dickinson | 303262 | |
| 19 G X 40 mm “Sterican” igły (sterylne) | B. Braun Melsungen AG | 466 5112 | |
| 2 mL jednorazowe strzykawka (sterylna) | e-power | 150002S | |
| 2-0 70 cm szwy “Vicryl plus” (sterylne) | Johnson & Johnson | VCP453 | |
| 20 G X 25 mm “Microlance 3” igły (sterylne) | Becton Dickinson | 304827 | |
| 20 mL jednorazowe strzykawka (sterylna) | e-power | 150020S | |
| 20 µL pipeta | Sartorius | 46886095 | |
| 200 µL pipeta | Sartorius | 39486615 | |
| 20G Venflon "Pro" 1.1 x 32 mm | Beckton Dickinson | 393255 | |
| 21 G x 25 mm igiełki do pobierania krwi Vacutainer (sterylne) | Becton Dickinson | 301746 | |
| 21 G X 40 mm “Sterican” igły (sterylne) | B. Braun Melsungen AG | 4665643 | |
| 22 G X 50 mm “Microlance 3” igły (sterylne) | Becton Dickinson | 300094 | |
| 23 G X 25 mm “Medoject” igły (sterylne) | Chirana T. Injecta | CH23100 | |
| 25 G X 16 mm “Microlance 3” igły (sterylne) | Beckton Dickinson | 300600 | |
| 25 G X 25 mm “Sterican” igły (sterylne) | B. Braun Melsungen AG | 9186158 | |
| 25 mL plastikowe pipety (sterylne) | LP Italian Spa | 162510 | |
| 30 mL jednorazowe strzykawka (sterylne) | e-power | 150030S | |
| 4L plastikowe worki do zamrażarki | Cater.Line | ABN-105004 | |
| 5–350 µL pipetowe końcówki “Optifit” | Sartorius | 790350 | |
| 5 mL jednorazowe strzykawka (sterylna) | e-power | 150005S | |
| 5 mL strzykawka (sterylna) | B. Braun Melsungen AG | 4617053V | |
| 50–1200 µL pipetowe końcówki “Optifit” | Sartorius | 791200 | |
| 50 mL Luer Lock Original Perfusor Strzykawki | B. Braun Melsungen AG | 8728844F-06 | |
| 50 mL probówki (sterylne) | Sarstedt AG and Co. KG | 62.547.254 | |
| 82% etanol + 0,5% chlorhexydyna dezynfekujące ściereczki | Mediq | 527497 | |
| Atropina "ATROpin" 1 mg/mL | Amgros | 741124 | |
| Nożyczki opatrunkowe, stal nierdzewna, 180 mm | B. Braun Melsungen AG | BC849R | |
| Urządzenie do pomiaru gazów krwi ABL90 | Radiometer | 994-667 (podręcznik serwisowy) | |
| Podstawowy bulion Brain Heart Infusion (BHI/B) | Prowadzone wewnątrz firmy | N.A. | Komercyjnie dostępny odpowiednik produktu: Brain Heart Infusion Broth (Merck, Cat. No. 53286) |
| Butorfanol "Butomidor vet" 10 mg/mL | VetViva Richter | 53 19 43 | |
| Inkubator komórkowy “HeraCell 150i” | Thermo Fisher Scientific | 51032719 | |
| Wirówka, Rotina 380 R | Hettich | 1701 | |
| System do chemii klinicznej “Advia 2120i” | Siemens Healthcare GmbH | 10488923 | |
| Zamknięcia stożkowe “Combi-Stopper” (sterylne) | B. Braun Melsungen AG | 4495101 | |
| Płytki Columbia agar + 5% owcze krwi | BioRad | 63784 | |
| Jednorazowe miękkie podkładki, Abri-Soft classic | Abena | 4115 | |
| Doxapram-V 20 mg/mL | Dechra | 34144/G | |
| Rury pobierania krwi EDTA 3 mL (sterylne) | Becton Dickinson | 368856 | |
| Rura endotrachealna (12 mm x 55 cm, 150 cc), silikonowa, z mankietem |
Bibliografia
- Shane, A. L., Sánchez, P. J., Stoll, B. J. Neonatal sepsis. The Lancet. 390 (10104), 1770-1780 (2017).
- Strunk, T., Molloy, E. J., Mishra, A., Bhutta, Z. A. Neonatal bacterial sepsis. The Lancet. 404 (10449), 277-293 (2024).
- Wynn, J. L., et al. Time for a neonatal-specific consensus definition for sepsis. Pediatric critical care medicine : a journal of the Society of Critical Care Medicine and the World Federation of Pediatric Intensive and Critical Care Societies. 15 (6), 523-528 (2014).
- Schlapbach, L. J., et al. International Consensus Criteria for Pediatric Sepsis and Septic Shock. JAMA. 331 (8), 665-674 (2024).
- Fleiss, N., Hooven, T. A., Polin, R. A. Can we back off using antibiotics in the NICU?. Seminars in Fetal and Neonatal Medicine. 26 (3), 101217 (2021).
- Strunk, T., et al. Impaired Cytokine Responses to Live Staphylococcus epidermidis in Preterm Infants Precede Gram-positive, Late-onset Sepsis. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 72 (2), 271-278 (2021).
- Collins, A., Weitkamp, J. H., Wynn, J. L. Why are preterm newborns at increased risk of infection?. Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 103 (4), F391-F394 (2018).
- Kowalski, G. M., Bruce, C. R. The regulation of glucose metabolism: implications and considerations for the assessment of glucose homeostasis in rodents. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (10), E859-E871 (2014).
- Bailey, M., Christoforidou, Z., Lewis, M. C. The evolutionary basis for differences between the immune systems of man, mouse, pig, and ruminants. Veterinary Immunology and Immunopathology. 152 (1-2), 13-19 (2013).
- Mair, K. H., et al. The porcine innate immune system: An update. Developmental & Comparative Immunology. 45 (2), 321-343 (2014).
- Ezquerra, A., et al. Porcine myelomonocytic markers and cell populations. Developmental & Comparative Immunology. 33 (3), 284-298 (2009).
- Gerner, W., Käser, T., Saalmüller, A. Porcine T lymphocytes and NK cells – An update. Developmental & Comparative Immunology. 33 (3), 310-320 (2009).
- Meurens, F., Summerfield, A., Nauwynck, H., Saif, L., Gerdts, V. The pig: a model for human infectious diseases. Trends in Microbiology. 20 (1), 50-57 (2012).
- Pabst, R. The pig as a model for immunology research. Cell and Tissue Research. 380 (2), 287-304 (2020).
- Goldfarb, R. D., Dellinger, R. P., Parrillo, J. E. Porcine models of severe sepsis: emphasis on porcine peritonitis. Shock (Augusta, Ga). 24 Suppl 1 (SUPPL. 1), 75-81 (2005).
- Bæk, O., Ren, S., Brunse, A., Sangild, P. T., Nguyen, D. N. Impaired neonatal immunity and infection resistance following fetal growth restriction in preterm pigs. Frontiers in Immunology. 11, 1808 (2020).
- Bæk, O., et al. Diet Modulates the High Sensitivity to Systemic Infection in Newborn Preterm Pigs. Frontiers in Immunology. 11, 1019 (2020).
- Bæk, O., et al. Sex-Specific Survival, Growth, Immunity, and Organ Development in Preterm Pigs as Models for Immature Newborns. Frontiers in Pediatrics. 9, (2021).
- Porter, P. Transfer of immunoglobulins IgG, IgA, and IgM to lacteal secretions in the parturient sow and their absorption by the neonatal piglet. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure. 181 (2), 381-392 (1969).
- Butler, J. E., et al. The piglet as a model for B-cell and immune system development. Veterinary immunology and immunopathology. 128 (1-3), 147-170 (2009).
- Sangild, P. T., et al. The preterm pig as a model in pediatric gastroenterology. Journal of Animal Science. 91, 4713-6359 (2013).
- Brunse, A., Worsøe, P., Pors, S. E., Skovgaard, K., Sangild, P. T. Oral Supplementation with Bovine Colostrum Prevents Septic Shock and Brain Barrier Disruption During Bloodstream Infection in Preterm Newborn Pigs. SHOCK. , 1 (2018).
- Krogh, A. K. H., Brunse, A., Thymann, T., Bochsen, L., Kristensen, A. T. Staphylococcus epidermidis sepsis induces hypercoagulability in preterm pigs. Research in veterinary science. 127, 122-129 (2019).
- Bæk, O., et al. Altered hepatic metabolism mediates sepsis preventive effects of reduced glucose supply in infected preterm newborns. eLife. 13, (2024).
- Wu, Z., et al. Regulation of host metabolism and defense strategies to survive neonatal infection. Biochimica et biophysica acta. Molecular basis of disease. 1870 (8), (2024).
- Muk, T., Brunse, A., Henriksen, N. L., Aasmul-Olsen, K., Nguyen, D. N. Glucose supply and glycolysis inhibition shape the clinical fate of Staphylococcus epidermidis–infected preterm newborns. JCI Insight. 7 (11), (2022).
- Zhong, J., et al. Reduced parenteral glucose supply during neonatal infection attenuates neurological and renal pathology associated with modulation of innate and Th1 immunity. Biochimica et biophysica acta. Molecular basis of disease. 1871 (4), (2025).
- Wu, Z., et al. Harnessing systemic glycolysis-TCA cycle axis to boost host defense against neonatal infection. EMBO Molecular Medicine. , (2026).
- Bæk, O., et al. Rethinking parenteral nutrition as supportive therapy for neonatal sepsis. Med. , (2026).
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie