Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie time-lapse fagocytozy komórek trzykrotnie ujemnego raka piersi znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym przez makrofagi indukowaną przeciwciałami

160 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71461

⸱

14 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, National Taiwan University Hospital, 2School of Chinese Medicine, China Medical University, 3Graduate Institute of Biomedical Science, China Medical University, 4Chinese Medicine Research Center, China Medical University, 5Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje metodę obrazowania żywych komórek w technice time-lapse w celu wizualizacji zależnej od przeciwciał fagocytozy komórek raka piersi potrójnie ujemnego znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym, z wykorzystaniem makrofagów pochodzących z monocytów krwi obwodowej oraz mikroskopu zautomatyzowanego.

Streszczenie

Przeciwciałozależna fagocytoza komórkowa jest kluczowym mechanizmem, dzięki któremu makrofagi pochłaniają upropzonizowane przeciwciałami komórki nowotworowe. Niniejszy protokół opisuje metodę obrazowania żywych komórek w czasie (time-lapse), służącą do wizualizacji przeciwciałozależnej fagocytozy przez makrofagi komórek potrójnie ujemnego raka piersi wykazujących ekspresję CD24 i znakowanych zieloną białkiem fluorescencyjnym. Makrofagi są otrzymywane z mononuklearnych komórek krwi obwodowej człowieka, różnicowane przy użyciu czynnika stymulującego kolonie makrofagów oraz polaryzowane za pomocą interferonu gamma i lipopolisacharydu w celu uzyskania fenotypu prozapalnego. Komórki nowotworowe są upsonizowane przeciwciałem monoklonalnym anty-CD24 przed kokulturą z makrofagami w określonym stosunku efektor do celu. Zdarzenia fagocytarne są rejestrowane przez okres 16 h przy użyciu zautomatyzowanego mikroskopu wyposażonego w system kontroli środowiskowej w celu utrzymania warunków fizjologicznych. Obrazowanie przeprowadzane jest w kanałach jasnego pola i fluorescencji, co umożliwia identyfikację komórek nowotworowych oraz monitorowanie ich internalizacji przez makrofagi. Reprezentatywne obrazy time-lapse demonstrują postępujące pochłanianie fluorescencyjnych komórek nowotworowych w czasie. W celu umożliwienia oceny ilościowej przeprowadzany jest równolegle test końcowy w identycznych warunkach kokultury, w którym przed obrazowaniem usuwane są niezinternalizowane komórki nowotworowe, co pozwala na dokładny pomiar zdarzeń fagocytarnych. Metoda ta zapewnia standaryzowane i powtarzalne podejście do wizualizacji przeciwciałozależnej fagocytozy makrofagów in vitro. Co istotne, integracja obrazowania time-lapse z kwantyfikacją opartą na punkcie końcowym umożliwia komplementarną ocenę kinetyki i skali fagocytozy. Protokół ten wspomaga ocenę przeciwciał terapeutycznych oraz immunoterapii nowotworów skierowanych przeciwko makrofagom w kontrolowanych warunkach in vitro.

Wprowadzenie

Rak piersi jest najczęściej diagnozowanym nowotworem złośliwym wśród kobiet na całym świecie, odpowiadając za około 2,3 miliona nowych przypadków rocznie1. Choroba ta jest klinicznie heterogenna i klasyfikowana jest na co najmniej cztery główne podtypy molekularne w zależności od statusu receptorów hormonalnych — receptora estrogenowego (ER) i receptora progesteronowego (PR) — oraz ekspresji onkogenu ludzkiego receptora czynnika wzrostu naskórkowego 2 (HER2)2. Guzy luminalne A wykazują ekspresję ER i/lub PR bez nadekspresji HER2 (ER/PR+ i HER2−); guzy luminalne B współwykazują ekspresję ER/PR i HER2 (ER/PR+ i HER2+); guzy HER2+ charakteryzują się wysoką ekspresją HER2 niezależnie od statusu receptorów hormonalnych; natomiast potrójnie ujemny rak piersi (TNBC) nie wykazuje ekspresji żadnego z trzech markerów (ER−, PR− i HER2−)2,3. Wśród tych podtypów TNBC stanowi najtrudniejszą klinicznie formę i odpowiada za około 15%–20% wszystkich raków piersi. Pacjentki z TNBC wykazują najbardziej agresywny przebieg choroby, z najgorszym rokowaniem i najkrótszym 5-letnim przeżyciem całkowitym, co wynika ze słabej odpowiedzi na konwencjonalną chemioterapię oraz braku skutecznych terapii celowanych3,4. Ponadto TNBC wykazuje znacznie wysoką skłonność do przerzutów do narządów wewnętrznych, szczególnie do płuc w ciągu 5 lat od diagnozy, a pacjentki z zaawansowanym lub przerzutowym TNBC (mTNBC) mają medianę przeżycia, która rzadko przekracza 2 lata5,6. Statystyki te podkreślają krytyczną i niezaspokojoną potrzebę opracowania nowych strategii terapeutycznych dla TNBC.

Mikrośrodowisko guza (TME) odgrywa kluczową rolę w progresji raka piersi i ucieczce immunologicznej. Makrofagi związane z nowotworem należą do najliczniejszych komórek odpornościowych w TME i zostały ostatnio uznane za krytycznych mediatorów wrodzonej odporności przeciwnowotworowej7,8,9. Chociaż historycznie TAMy dzielono na prozapalne stany „M1” i pronowotworowe stany „M2”, ten model binarny nie oddaje rzeczywistego zakresu heterogeniczności makrofagów. Zamiast tego TAMy zajmują dynamiczne spektrum funkcjonalne, ewoluując w odpowiedzi na różnorodne sygnały biochemiczne w TME. W tym złożonym krajobrazie komórki nowotworowe aktywnie zaburzają aktywność makrofagów poprzez różne strategie ucieczki immunologicznej, w szczególności poprzez nadekspresję sygnałów „nie jedz mnie”. Oś CD47/SIRPα była pierwszym zidentyfikowanym w tym kontekście wrodzonym punktem kontrolnym odporności6,10, a ostatnio CD24 wyłonił się jako nowy i silny sygnał antyfagocytyczny1,12. CD24 jest małym i silnie glikozylowanym glikoproteiną typu mucyny zakotwiczoną w błonie komórkowej za pomocą wiązania glikozylofosfatydyloinozytoli13. Jest on ekspresjonowany w różnych liniach komórek odpornościowych w warunkach fizjologicznych, ale często wykazuje nadekspresję w guzach litych, w tym w raku piersi, jajnika, trzustki i jelita grubego14. Na komórkach nowotworowych CD24 wiąże się z receptorami hamującymi lektyny wiążące kwas sialowy typu immunoglobuliny 10 (Siglec-10) ekspresjonowanymi na makrofagach. Oddziaływanie to wyzwala fosforylację domen immunoreceptora z motywem hamującym opartym na tyrozynie w ogonie cytoplazmatycznym Siglec-10, aktywując fosfatazy SHP-1 i SHP-2, które tłumią dalsze sygnały fagocytyczne1. Wykazano, że blokada oddziaływania CD24/Siglec-10 za pomocą przeciwciała monoklonalnego znacząco zwiększa fagocytozę ludzkich guzów wykazujących ekspresję CD24 przez makrofagi. Nasze niedawne badanie wykazało również, że knockout CD24a w komórkach raka piersi zwiększa ich podatność na fagocytozę przez makrofagi w mysim modelu potrójnie ujemnego raka piersi9.

Przeciwciałozależna fagocytoza komórkowa (ADCP) jest kluczowym mechanizmem, dzięki któremu przeciwciała kierują makrofagi do fagocytowania komórek nowotworowych15,16. Po związaniu z antygenami wykazującymi ekspresję w guzie, region Fc przeciwciała oddziałuje z receptorami Fcγ (FcγRs) na makrofagach, wyzwalając wewnątrzkomórkowe kaskady sygnałowe, które prowadzą do reorganizacji cytoszkieletu, tworzenia kubka fagocytatywnego i pochłonięcia komórki docelowej17.

W niniejszym badaniu opracowano i zwalidowano protokół obrazowania żywych komórek w technice time-lapse do pomiaru fagocytozy komórek raka piersi przez makrofagi indukowanej przeciwciałami. Metoda wykorzystuje makrofagi pochodzące z monocytycznych komórek krwi obwodowej (PBMC) zdrowych dawców ludzkich, różnicowane za pomocą czynnika stymulującego kolonie makrofagów (M-CSF), a następnie stymulowane lipopolisarydem (LPS) i interferonem gamma (IFN-γ). Analiza cytometryczna potwierdziła upregulację CD80 w populacji CD1b⁺ po stymulacji (Rycina 1), co potwierdza klasycznie aktywowany fenotyp. Ten stan aktywacji zapewnia silną zdolność do fagocytozy zapośredniczonej przez przeciwciała, co czyni go odpowiednim do oceny fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCP). Komórki raka piersi CD24-dodatnie z markerem GFP służą jako komórki docelowe i są opsonizowane terapeutycznym przeciwciałem monoklonalnym anty-CD24 przed kokulturą. Zdarzenia fagocytarne są rejestrowane przez okres 16 h przy użyciu automatycznego mikroskopu w kontrolowanych warunkach środowiskowych. Aby umożliwić ilościową ocenę równolegle z dynamiczną wizualizacją, w identycznych warunkach kokultury przeprowadza się osobny test końcowy, co pozwala na rygorystyczny pomiar fagocytozy po usunięciu niezinternalizowanych komórek docelowych. Niniejszy protokół zapewnia zestandaryzowaną, powtarzalną i wizualnie informacyjną platformę do oceny ADCP zapośredniczonej przez przeciwciało anty-CD24. Co istotne, integracja obrazowania time-lapse z uzupełniającą strategią ilościową opartą na pomiarze końcowym umożliwia jednoczesną ocenę kinetyki i amplitudy fagocytozy. Metodę tę można dostosować do badania innych celów immunoterapeutycznych skierowanych przeciwko makrofagom. Protokół ten jest najbardziej odpowiedni do oceny ADCP zapośredniczonej przez terapeutyczne przeciwciała monoklonalne przeciwko antygenom powierzchniowym komórek nowotworowych. Nadaje się on do porównawczego przesiewu kandydatów na przeciwciała, charakteryzacji zależności dawka-odpowiedź oraz badań mechanistycznych nad oddziaływaniem Fc–FcγR, w tym efektów blokady sygnału „don’t-eat-me” (np. CD47–SIRPα). Ponieważ test wykorzystuje pierwotne ludzkie makrofagi, jest on również odpowiedni do badań translacyjnych wymagających oceny zmienności między dawcami przed rozwojem klinicznym.

Schemat izolacji mononuklearnych komórek krwi obwodowej z wykorzystaniem cytometrii przepływowej do analizy makrofagów.
Rysunek 1Generowanie i walidacja metodą cytometrii przepływowej makrofagów pochodzących z monocytów krwi obwodowej stymulowanych IFN-γ i LPS. Górny panel: Mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) izoluje się od zdrowych dawców metodą wirowania gradientowego w roztworze Ficoll przy 40 × g przez 30 min w 20°C, przy wszystkich odczynnikach uprzednio wyrównanych do 20°C ± 2°CWyizolowane PBMC hoduje się w medium ImmunoCult-SF uzupełnionym o czynnik stymulujący colony makrofagów (M-CSF) w stężeniu 10 ng/mL przez 7 dni w celu indukcji różnicowania makrofagów (dni 0–7), z uzupełnieniem medium w 5. dniu. W 8. dniu zróżnicowane makrofagi stymuluje się 10 ng/mL IFN-γ i 1 µg/mL LPS przez 48 h (dni 8–10). Następnie komórki poddano analizie cytometrycznej. Dolny panel: Analiza cytometryczna makrofagów. Komórki barwiono panelem powierzchniowym składającym się z CD1b-FITC, CD80-PE i CD206-PerCP-Cy5.5, a następnie dodano DAPI przed akwizycją w celu wykluczenia martwych komórek. Strategia bramkowania: W pierwszej kolejności wyselekcjonowano żywe komórki (DAPI⁻), a następnie zidentyfikowano komórki CD1b⁺ na wykresie CD1b-FITC względem FSC-A, aby potwierdzić tożsamość makrofagów. Żywe zdarzenia CD1b⁺ analizowano następnie na wykresie kropkowym CD80 względem CD206, aby potwierdzić obecność populacji CD80⁺CD206⁻ indukowanej stymulacją IFN-γ/LPS. Po prawej: Reprezentatywny wykres kropkowy CD1b-FITC względem FSC-A wykazujący, że 9,8% bramkowanych komórek było CD1b⁺, co potwierdza tożsamość makrofagów. Po lewej: Większość komórek CD1b⁺ znajdowała się w bramce CD80⁺CD206⁻ (Q1: 95,2%), co wskazuje na oczekiwany fenotyp prozapalny w zastosowanych warunkach stymulacji. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Stosując tę technikę, należy wziąć pod uwagę kilka ograniczeń. Po pierwsze, zmienność dawców w przypadku makrofagów pochodzących z PBMC może wprowadzać istotne różnice w wynikach fagocytozy; zaleca się zatem wykorzystanie wielu dawców (n ≥ 3) i raportowanie danych z poszczególnych dawców obok wyników zbiorczych. Po drugie, format dwuwymiarowej (2D) kokultury nie odwzorowuje mikrośrodowiska guza, dlatego wyniki powinny zostać zwalidowane w modelach 3D lub in vivo przed wyciągnięciem wniosków klinicznych. Po trzecie, 16-godzinne okno obrazowania pozwala uchwycić wczesne zdarzenia fagocytozy, ale nie odzwierciedla procesów długoterminowych, takich jak prezentacja antygenu czy wtórna aktywacja immunologiczna. Zatem połączone zastosowanie obrazowania w czasie rzeczywistym oraz ilościowej oceny końcowej zapewnia komplementarne podejście, które zwiększa zarówno interpretowalność, jak i powtarzalność pomiarów ADCP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejszy protokół obejmuje wykorzystanie pierwotnych makrofagów pochodzących z próbek krwi zdrowych dawców. Pobieranie i przetwarzanie próbek przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnej Rady Przeglądowej (IRB) China Medical University.

1. Przygotowanie makrofagów pochodzących z PBMC

UWAGA: Wszystkie procedury z wykorzystaniem ludzkiej krwi należy przeprowadzać zgodnie z zatwierdzeniem instytucjonalnej komisji bioetycznej (np. CMUH IRB). Przed pobraniem krwi należy uzyskać świadomą zgodę od zdrowych dawców.

OSTRZEŻENIE: Wszystkie produkty ludzkiej krwi należy traktować w warunkach 2. poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2), stosując uniwersalne środki ostrożności.

  1. Pobieranie krwi
    1. Pobrać krew pełną od zdrowego dawcy do probótek typu vacutainer o pojemności 10 mL powlekanych kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA).
  2. Rozcieńczanie krwi
    1. Rozcieńczyć krew pełną w stosunku 1:1 lodowatym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS; wolnym od Ca2⁺/Mg2⁺) (np. 10 mL krwi + 10 mL PBS).
    2. Wymieszać przez odwrócenie probótki od trzech do pięciu razy.
      UWAGA: Przed użyciem przechowywać PBS w lodzie. Niska temperatura pomaga zachować żywotność komórek podczas przetwarzania.
  3. Nakładanie warstw gradientu gęstości
    1. Ostrożnie nałożyć rozcieńczoną krew na Ficoll–Paque PLUS w stosunku objętościowym 2:1 (v/v) w probówce stożkowej (np. 8 mL krwi na 4 mL Ficollu w probówce 15 mL lub 30 mL na 15 mL w probówce 50 mL).
    2. Przed nakładaniem doprowadzić zarówno rozcieńczoną krew, jak i Ficoll–Paque PLUS do temperatury 20°C ± 2°C.
    3. Wyjąć Ficoll–Paque PLUS z przechowywania w 4°C co najmniej 30 min przed użyciem lub krótko ogrzać w kąpieli wodnej o temperaturze 20°C ± 2°C.
    4. Nie używać zimnych odczynników, ponieważ gęstość Ficollu jest kalibrowana dla temperatury 20°C ± 2°C, a odchylenia od niej obniżą efektywność separacji i wydajność PBMC.
      UWAGA: Przechylić probówkę pod kątem 45° i powoli pipetować krew wzdłuż ścianki, aby zachować wyraźną granicę faz. Nie naruszać warstwy Ficollu.
  4. Wirowanie
    1. Wirować przy 40 × g przez 30 min w 20°C z wyłączonym hamulcem (Rysunek 1).
      UWAGA: Hamowanie zaburzy gradient gęstości i zmniejszy wydajność PBMC.
  5. Zbieranie PBMC
    1. Ostrożnie odessać za pomocą pipety serologicznej tylko warstwę białkruszonkową (białawą granicę między warstwą osocza a warstwą Ficollu), nie naruszając osocza powyżej ani warstwy Ficollu poniżej.
    2. Przenieść zebraną warstwę do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mL.
  6. Przemywanie PBMC
    1. Dodać PBS, aby zwiększyć całkowitą objętość do 25 mL w probówce stożkowej 50 mL.
    2. Użyć probówki 50 mL, aby zapewnić prawidłowe wirowanie i wyważenie.
    3. Wirować przy 30 × g przez 10 min.
  7. Liza erytrocytów
    1. Odlać supernatant.
    2. Resuspendować osad w 5 mL buforze do lizy erytrocytów (RBC) poprzez delikatne pipetowanie w górę i w dół pipetą serologiczną, aż osad zostanie całkowicie rozproszony i nie pozostaną żadne widoczne grudki.
    3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
      OSTRZEŻENIE: Całkowite rozproszenie jest niezbędne dla zapewnienia jednorodnej lizy; należy jednak unikać gwałtownego pipetowania lub wstrząsania na wortexie, co może uszkodzić PBMC. Nie przekraczać 5 min inkubacji z buforem do lizy RBC, ponieważ przedłużona ekspozycja może obniżyć żywotność PBMC.
  8. Wytrącanie osadu PBMC
    1. Wirować przy 50 × g przez 5 min w celu wytrącenia PBMC i usunięcia szczątków zlizowanych erytrocytów.
  9. Końcowa resuspensja
    1. Odlać supernatant.
    2. Resuspendować osad w 5 mL medium dla makrofagów ImmunoCult-SF.
      UWAGA: W warunkach standardowych 10 mL krwi pełnej zazwyczaj pozwala uzyskać 1,5–2,0 × 107 PBMC.

2. Różnicowanie makrofagów (dni 0–7)

UWAGA: Należy użyć szalek Petriego nieprzetraktowanych do hodowli tkankowej (non-TC), aby wyselekcjonować zróżnicowane makrofagi pochodzenia monocytarnego poprzez adhezję. Niezadherowane limfocyty zostaną usunięte podczas kolejnych etapów hodowli.

  1. Dzień 0: Wysiewanie komórek
    1. Przeprowadzić policzenie komórek i wysiać 1 × 107 PBMC do niepoddanej obróbce TC szalki Petriego o średnicy 10 cm.
    2. Uzupełnić całkowitą objętość do 10 mL, używając pożywki do makrofagów ImmunoCult-SF uzupełnionej o 10 ng/mL M-CSF (przygotowanej poprzez dodanie zapasu M-CSF bezpośrednio do pełnej pożywki bezpośrednio przed użyciem i wymieszanie przez delikatne odwracanie).
      UWAGA: Protokół można skalować proporcjonalnie, aby dostosować go do różnic w wydajności PBMC od dawcy, przyjmując gęstość wysiewu od 1 × 106 komórek/mL jako wartość bazową.
  2. Inkubacja i monitorowanie
    1. Inkubować w temperaturze 37°C przy 5% CO₂ w inkubatorze z nawilżaniem.
    2. Codziennie monitorować tworzenie się pływających skupisk monocytów oraz pojawianie się komórek adherentnych.
      UWAGA: W miarę postępowania różnicowania monocyty będą stopniowo zwiększać swoje rozmiary i tworzyć skupiska. Niektóre monocyty zaczną przytwierdzać się do płytki. Na tym etapie nie jest wymagana żadna interwencja.
  3. Dzień 5: Suplementacja pożywki
    1. Delikatnie dodać do szalki 5 mL świeżej pożywki do makrofagów ImmunoCult-SF uzupełnionej o 10 ng/mL M-CSF, uważając, aby nie naruszyć adherentnych makrofagów.
    2. Kontynuować hodowlę przez kolejne 2 dni (do Dnia 7).
      OSTRZEŻENIE: Świeżą pożywkę należy dodawać delikatnie wzdłuż ścianki szalki, aby uniknąć naruszenia adherentnych makrofagów, ponieważ zaburzenia mechaniczne mogą wpłynąć na wydajność różnicowania i liczbę uzyskanych komórek.
      UWAGA: Należy unikać wymiany pożywki, aby zachować czynniki autokrynne/parakrynne wspomagające różnicowanie makrofagów.
  4. Dzień 7: Ocena morfologiczna
    1. Ocenić wydajność różnicowania makrofagów pod mikroskopem odwróconym.
    2. Komórki adherentne wykazują charakterystyczną morfologię makrofagów: są duże, spłaszczone i mają nieregularny kształt z widocznymi pseudopodiami.
    3. W Dniu 7 powinny być widoczne dobrze zróżnicowane makrofagi.
      OSTRZEŻENIE: Ocena morfologiczna w Dniu 7 stanowi krytyczny warunek wstępny do późniejszej walidacji metodą cytometrii przepływowej. Dobrze zróżnicowane makrofagi powinny być wyraźnie widoczne pod mikroskopem, a wyższa proporcja komórek adherentnych o morfologii makrofagów odzwierciedla większą wydajność różnicowania (za wskaźnik udanego różnicowania uznaje się konfluencję adherentnych makrofagów o charakterystycznej morfologii na poziomie około 70%). Hodowle wykazujące słabą adhezję, przeważanie komórek okrągłych lub w inny sposób niskie zróżnicowanie morfologiczne prawdopodobnie nie Dadzą wiarygodnych wyników w cytometrii przepływowej i nie powinny być poddawane stymulacji i barwieniu.

3. Polaryzacja makrofagów (dni 8–10)

  1. Zbiór i klarowanie medium warunkowanego
    1. W dniu 8. ostrożnie odessać 15 mL medium z naczynia hodowlanego, nie naruszając przylegających makrofagów, i przenieść je do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 mL.
    2. Odwirować zebrane medium przy 40 × g przez 5 min w celu osadzenia szczątków komórkowych.
    3. Zachować klarowny supernatant do następnego etapu.
  2. Stymulacja interferonem gamma (IFN-γ) i lipopolisacharydem (LPS)
    1. Przenieść sklarowane 15 mL supernatantu do nowej sterylnej probówki i uzupełnić o 100 ng/mL IFN-γ oraz 1 µg/mL LPS.
    2. Dokładnie wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół (5–10 razy), aby zapewnić równomierne rozłożenie cytokin bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.
    3. Przenieść pełne 15 mL medium uzupełnionego cytokinami z powrotem do pierwotnego naczynia hodowlanego, delikatnie pipetując wzdłuż wewnętrznej ścianki, aby nie naruszyć przylegających makrofagów.
    4. Inkubować w temperaturze 37°C przy 5% CO₂ przez 48 h (od dnia 8. do dnia 10.).
      UWAGA: Należy stosować medium warunkowane (stare), aby zachować czynniki autokrynne/parakrynne. Ta kombinacja IFN-γ i LPS jest wykorzystywana do polaryzacji makrofagów w kierunku fenotypu prozapalnego. W warunkach stymulacji IFN-γ (10 ng/mL) i LPS (1 µg/mL) zastosowanych w tym protokole, makrofagi wykazują charakterystyczne zmiany morfologiczne, w tym wydłużone lamelipodia zgodne z aktywnym stanem prozapalnym, a także ekspresję CD1b i CD80.
      OSTRZEŻENIE: LPS należy obchodzić zgodnie z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa laboratoryjnego, ponieważ jest to bioaktywna endotoksyna, która po ekspozycji może wywołać reakcje zapalne.

4. Potwierdzenie markerów fenotypu zapalnego makrofagów stymulowanych IFN-γ i LPS za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Zbiór komórek
    1. W 10. dniu należy zebrać podgrupę spolaryzowanych makrofagów w celu przeprowadzenia fenotypowania.
    2. Dodać 10 mM EDTA w PBS i inkubować przez 10–15 min w temperaturze 37°C.
    3. Oddzielić komórki poprzez delikatne pipetowanie.
      UWAGA: Przedłużyć inkubację w EDTA o dodatkowe 30 min w temperaturze 37°C Jeśli komórki pozostają adherentne, należy powtórzyć delikatne pipetowanie. Należy unikać energicznego pipetowania lub mechanicznego zdrapywania, aby zachować żywotność komórek oraz integralność markerów powierzchniowych.
  2. Przygotowanie do barwienia przeciwciałami
    1. Obarwić komórki przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem przeciwko CD11b (marker linii panmakrofagowej), CD80 (marker zapalny) oraz CD206 (marker przeciwzapalny używany jako marker negatywny do wykluczania w celu identyfikacji fenotypu zapalnego).
  3. Procedura barwienia
    1. Przenieś 5 × 105 odseparowane makrofagi do probówki do cytometrii przepływowej zawierającej 100 µL zimnego buforu PBS.
    2. Dodaj przeciwciała CD11b-FITC, CD80-PE i CD206-PerCP-Cy5.5 do stężenia końcowego wynoszącego 1 µg/mL pojedynczo.
    3. Wymieszaj zawiesinę komórek, delikatnie pipetując.
    4. Inkubować próbki na lodzie przez 1 h, chroniąc je przed światłem.
    5. Wirować próbki z prędkością 30 × g przez 1 min w temperaturze 4°C.
    6. Ostrożnie odessaj supernatant.
    7. Dodać 0,5 ml zimnego PBS w celu przemycia osadu komórkowego.
    8. Wirować próbki przy 30 × g przez 1 min w temperaturze 4°C.
    9. Odlać nadnadkład.
    10. Resuspenduj osad komórkowy w 200 µL zimnego PBS.
    11. Dodać DAPI do stężenia końcowego wynoszącego 1 µg/mL.
      UWAGA: Należy uwzględnić odpowiednie kontrole izotypowe oraz barwnik do oceny żywotności (np. DAPI lub barwnik wiążący Viobility 405/452 Fixable Dye).
  4. Analiza cytometryczna
    1. Nabyć barwione próbki przy użyciu cytometru przepływowego.
    2. Potwierdzenie ekspresji CD1b i CD80 w populacji makrofagów.
    3. Przystąp do testu fagocytozy dopiero po potwierdzeniu ekspresji markerów zgodnej z fenotypem zapalnym.
  5. Nabywanie i konfiguracja danych w cytometrii przepływowej
    1. Konfiguracja urządzenia
      1. Skonfigurować cytometr przepływowy, korzystając z następujących kanałów: Pacific Blue/V450 (DAPI), FITC (CD11b), PE (CD80) oraz PerCP-Cy5.5 (CD206).
      2. Ustaw parametry akwizycji tak, aby zebrać 10 0 zdarzeń na próbkę w obrębie zdefiniowanego bramowania nadrzędnego.
    2. Kalibracja progu i wzmocnienia
      1. Otwórz cztery wykresy kropkowe, na których oś x przedstawia FSC, a oś y jeden z kanałów fluoroforów.
      2. Przygotować komórki barwione odpowiednimi przeciwciałami kontrolnymi izotypowymi, dopasowanymi do każdego fluoroforu.
      3. Należy pozyskać próbki kontroli izotypowej.
      4. Dostosuj wzmocnienie (gain) dla każdego kanału tak, aby populacja kontroli izotypowej znajdowała się poniżej 10.1 w skali logarytmicznej.
      5. Należy wykorzystać ten próg do zdefiniowania poziomów sygnału tła.
        UWAGA: Należy zastosować zakres skali logarytmicznej wynoszący 101 do 101·5 aby zapewnić wiarygodną separację sygnału specyficznego od tła.
    3. Kompensacja
      1. Do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml należy dodać jedną kroplę kulek kompensacyjnych.
      2. Dodać odpowiednie przeciwciało sprzężone z fluorophorem do stężenia końcowego wynoszącego 1 µg/mL.
      3. Inkubować przez 30 min w temperaturze 4°C, chroniąc przed światłem.
      4. Wirować przy 40 × g przez 1 min.
      5. Odlać supernatant.
      6. Resuspendować kuleczki w 200 µL zimnego PBS.
      7. Pozyskaj kontrole jednobarwne.
      8. Zastosuj kompensację spektralną w celu skorygowania przesączania fluoroforów.
    4. Strategia bramowania
      1. Selekcja żywych komórek
        1. Wyświetl Pacific Blue/V450 (DAPI) na osi Y oraz FSC na osi X.
        2. Ustaw bramkę na zdarzenia negatywne dla DAPI (poniżej 101) w celu wyselekcjonowania żywych komórek.
      2. Identyfikacja makrofagów
        1. Ustaw populację żywych komórek jako bramkę nadrzędną.
        2. Wyświetl FITC (CD1b) na osi y oraz FSC na osi x.
        3. Wyznacz bramkę dla zdarzeń CD1b⁺ (powyżej 101).
      3. Identyfikacja fenotypu zapalnego
        1. Ustaw populację CD1b⁺ jako bramkę nadrzędną.
        2. Wyświetl PE (CD80) na osi Y oraz PerCP-Cy5.5 (CD206) na osi X.
        3. Zastosuj bramkowanie kwadrantowe przy wartości 101.5 na obu osiach.
        4. Zidentyfikuj komórki CD80⁺CD206⁻ w górnym lewym kwadrancie (Q1).
  6. Kryteria akceptacji
    1. Potwierdź, że ≥90% komórek w bramce nadrzędnej CD1b⁺ jest CD80⁺CD206⁻.
    2. Przejdź do testu fagocytozy dopiero po osiągnięciu tego progu.
    3. Powtórzyć izolację PBMC, różnicowanie za pomocą M-CSF oraz stymulację IFN-γ/LPS, jeśli próbki nie spełnią tego kryterium.

5. Test fagocytozy zależnej od przeciwciał

UWAGA: Przed przygotowaniem testu należy zweryfikować stabilną ekspresję GFP w komórkach nowotworowych. Przed wykonaniem testu należy potwierdzić ekspresję CD24 na komórkach docelowych. W celu uzyskania optymalnych wyników należy użyć komórek nowotworowych z 50%–10% pozytywnością na CD24. Komórki MDA-MB-468 użyte w tym protokole wykazują 100% pozytywności na CD24.

  1. Wysiew makrofagów
    1. Wysiać makrofagi stymulowane IFN-γ i LPS, zwalidowane w Kroku 4, w zagęszczeniu 2 × 105 komórek na studzienkę w 24-dołkowej płytce hodowlanej.
    2. Inkubować płytkę w temperaturze 37°C w warunkach statycznych z 5% CO₂ przez 12–16 h, aby umożliwić adhezję komórek (Rysunek 2A).
      UWAGA: Przed kontynuacją należy upewnić się, że makrofagi dobrze przylegają do podłoża. Słabo przytwierdzone makrofagi mogą odkleić się podczas obrazowania, co zafałszuje wyniki.
  2. Przygotowanie komórek nowotworowych
    1. Hodować komórki raka piersi (MDA-MB-468) oznaczone GFP i wykazujące ekspresję CD24 do uzyskania 70%–80% konfluencji.
    2. Odssać medium hodowlane.
    3. Jednokrotnie przemyć monowarstwę komórek roztworem PBS.
  3. Odrywanie komórek nowotworowych
    1. Dodać do naczynia hodowlanego 10 mM EDTA w PBS.
    2. Inkubować komórki w temperaturze 37°C przez 5–10 min.
    3. Odrywać komórki poprzez delikatne pipetowanie, aby zapewnić ich całkowite uwolnienie.
      UWAGA: Do odrywania komórek nie należy używać trypsyny. Trawienie enzymatyczne może doprowadzić do odszczepienia CD24 z powierzchni komórek i upośledzić wiązanie przeciwciał.
  4. Zbieranie i liczenie komórek nowotworowych
    1. Zebrać odrywane komórki do probówki do wirowania.
    2. Wirować komórki przy 30 × g przez 5 min.
    3. Odlać supernatant.
    4. Resuspendować osad komórkowy w pełnym medium RPMI.
    5. Policzyć żywe komórki.
  5. Opsonizacja przeciwciałami komórek nowotworowych
    1. Resuspendować komórki nowotworowe do zagęszczenia 2 × 105 komórek/mL w 0,5 mL pełnego medium RPMI.
    2. Dodać monoklonalne przeciwciało anty-CD24 do stężenia końcowego 1 µg/mL.
    3. Wymieszać zawiesinę komórkową poprzez delikatne pipetowanie, aby zapewnić równomierny rozkład przeciwciał.
    4. Inkubować komórki w temperaturze 37°C przez 30 min w warunkach statycznych.
      UWAGA: W celu zastosowania kontroli negatywnej dla fagocytozy zależnej od przeciwciał należy uwzględnić izotypową kontrolę IgG w tym samym stężeniu.
  6. Przygotowanie do kokultury
    1. Nie przemywać komórek po opsonizacji.
    2. Przejść bezpośrednio do kokultury, aby zachować powłokę przeciwciał na powierzchni komórek.
  7. Ustawienie kokultury
    1. Dodać 1 × 105 opsonizowanych przeciwciałami komórek raka piersi oznaczonych GFP do każdej studzienki zawierającej makrofagi.
    2. Zachować stosunek efektorów do celu (E:T) na poziomie 2:1.
      UWAGA: Dostosować stosunek efektorów do celu zgodnie z planem eksperymentu. Stosowanie wyższych proporcji makrofagów do komórek nowotworowych niż opisany stosunek 2:1 (np. 3:1 lub 5:1) zwiększy częstotliwość kontaktów międzykomórkowych i ułatwi detekcję zdarzeń fagocytarnych.

Schemat time-lapse przedstawiający interakcję makrofaga z komórką znakowaną GFP w eksperymencie obrazowym.
Rysunek 2Obrazowanie poklatkowe zależmnej od przeciwciał fagocytozy komórkowej. (A) Schematyczny przegląd systemu ko-kultury i konfiguracji obrazowania time-lapse. Parametry obrazowania obejmowały 10-minutowy interwał przy całkowitym czasie akwizycji wynoszącym 16 h (97 klatek), z użyciem obiektywu 10× z kanałami kontrastu fazowego i GFP. (B) Reprezentatywne obrazy time-lapse od 1 h do 16 h, ukazujące zdarzenia fagocytozy charakteryzujące się internalizacją komórek nowotworowych GFP-dodatnich przez makrofagi w czasie. Żółte przerywane okręgi zaznaczają reprezentatywne zdarzenia fagocytozy. W kanale kontrastu fazowego pochłonięte komórki nowotworowe widoczne są jako jasne w fazie struktury wewnątrzkomórkowe w cytoplazmie makrofaga (białe strzałki). W kanale GFP fluorescencja zlokalizowana wewnątrz makrofagów potwierdza internalizację. (C) Powiększone widoki reprezentatywnych zdarzeń fagocytozy w 0, 1, 4 i 16 h, ilustrujące sekwencyjny proces pochłaniania znakowanych GFP komórek nowotworowych przez makrofagi. Sekwencja obrazów została wybrana jako reprezentatywna na podstawie wyraźnej wizualizacji zdarzeń fagocytozy pośredniczonej przez makrofagi. Białe strzałki wskazują makrofagi wchodzące w interakcje z komórkami docelowymi i internalizujące je. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

6. Obrazowanie poklatkowe (Automatyczny system obrazowania żywych komórek)

UWAGA: Przed przystąpieniem do analizy należy skonfigurować protokół obrazowania, korzystając zautomatyzowanego systemu obrazowania żywych komórek Lionheart oraz oprogramowania do zautomatyzowanego obrazowania żywych komórek Gen5. Przed obsługą systemu obrazowania należy przejść odpowiednie szkolenie, aby zapewnić prawidłową konfigurację, optymalną wydajność i bezpieczne użytkowanie.

  1. Przygotowanie urządzenia
    1. Włączyć system obrazowania, moduł kontroli środowiskowej oraz zasilanie gazem CO₂ co najmniej 1 h przed obrazowaniem.
    2. Otworzyć panel Environment Control w oprogramowaniu do zautomatyzowanego obrazowania żywych komórek.
    3. Ustawić temperaturę na 37°C oraz stężenie CO₂ na 5%.
    4. Przed włożeniem płytki potwierdzić, że temperatura w komorze ustabilizowała się w zakresie ± 0,2°C, a stężenie CO₂ wynosi 5,0% ± 0,1%.
  2. Przygotowanie płytki
    1. Umieścić płytkę 24-dołkową w komorze obrazowania systemu.
  3. Konfiguracja początkowa
    1. Otworzyć Menedżera Zadań (Task Manager) w oprogramowaniu do zautomatyzowanego obrazowania żywych komórek.
    2. Wybrać [Imager manual mode].
    3. Kliknąć [Capture now], aby zainicjować parametry obrazowania.
    4. Wybrać obiektyw 10×.
    5. W ustawieniach filtrów wybrać microplate.
    6. Wybrać płytkę 24-dołkową z biblioteki płytek w oprogramowaniu do zautomatyzowanego obrazowania żywych komórek.
  4. Ustawianie ostrości i obrazowania
    1. Wybrać kanał kontrastu fazowego (Phase Contrast).
    2. Wybrać reprezentatywny dołek (np. A1).
    3. Aktywować autofocus przed rozpoczęciem akwizycji time-lapse.
    4. Przechwycić obraz, korzystając z ikony aparatu.
    5. Potwierdzić morfologię komórek oraz jakość ostrości.
    6. Przejść do sekcji [Process/Analyze].
    7. Wybrać [Create experiment from an image set], aby skonfigurować eksperyment.
  5. Parametry akwizycji time-lapse
    1. Otworzyć panel ustawień [Procedure].
    2. Ustawić temperaturę na 37°C i CO₂ na 5%.
    3. W sekcji [Start Kinetic] ustawić czas trwania pomiaru na 16:0:0.
    4. Ustawić interwał obrazowania na 0:10:0.
    5. Ustawić całkowitą liczbę odczytów na 97.
    6. Stosować interwał obrazowania od 10 do 15 min, aby zrównoważyć rozdzielczość czasową i fototoksyczność, jednocześnie rejestrując wczesne zdarzenia fagocytozy.
  6. Konfiguracja kanałów obrazowania
    1. Ustawić Kanał 1 na kontrast fazowy (Phase Contrast).
    2. Ustawić Kanał 2 na GFP (Ex 469/35, Em 525/39).
    3. Wybrać obiektyw 10× dla uzyskania optymalnego pola widzenia i rozdzielczości.
    4. Ustawić oświetlenie, czas integracji i wzmocnienie (gain) na [Auto] lub dostosować ręcznie.
    5. Stosować typowy czas ekspozycji dla GFP wynoszący 10–30 ms, aby uniknąć nasycenia sygnału.
    6. Zastosować identyczne ustawienia obrazowania dla wszystkich dołków.
  7. Ustawianie pozycji obrazowania
    1. Otworzyć menu [Define beacons].
    2. Wyłączyć akwizycję Z-stack.
    3. Wyłączyć akwizycję montażu (montage acquisition).
    4. Wykonować obrazowanie w jednej płaszczyźnie ogniskowej.
    5. Zdefiniować pozycje obrazowania ręcznie, wybierając reprezentatywne, niezachodzące na siebie obszary w każdym dołku za pomocą ikony mikroskopu.
    6. Zachować identyczne pozycje obrazowania dla wszystkich punktów czasowych.
    7. Wybrać co najmniej 4–6 pól widzenia na dołek.
  8. Akwizycja time-lapse
    1. Kliknąć [Play], aby rozpocząć zautomatyzowane obrazowanie time-lapse.
  9. Eksport i wizualizacja danych
    1. Otworzyć zapisany plik eksperymentu po zakończeniu akwizycji.
    2. Wybrać pozycje obrazowania.
    3. Wyeksportować dane time-lapse w formacie MP4.
    4. Otworzyć [Process Tool].
    5. W razie potrzeby zastosować dekonwolucję obrazu [Image Deconvolution], aby poprawić wizualizację i zidentyfikować reprezentatywne zdarzenia fagocytozy.
      UWAGA: Obrazowania time-lapse należy używać wyłącznie do wizualizacji jakościowej. Niepochłonięte komórki nowotworowe GFP-dodatnie mogą nakładać się na makrofagi lub przejściowo z nimi oddziaływać, co prowadzi do wyników fałszywie dodatnich. Analizę ilościową należy przeprowadzić za pomocą oddzielnego testu końcowego (endpoint assay).

7. Ilościowe oznaczanie fagocytozy w punkcie końcowym

  1. Usuwanie komórek niezinternalizowanych
    1. Przeprowadzić analizę w identycznych warunkach kokultury.
    2. Zakończyć eksperyment po 4 h.
    3. Usunąć pożywkę hodowlaną.
    4. Dodać EDTA w stężeniu 10 mM w PBS.
    5. Inkubować w temperaturze 37°C przez 5 min.
    6. Delikatnie przemyć buforem PBS, aby usunąć niezinternalizowane komórki GFP-dodatnie.
    7. Dodać świeżą pożywkę do makrofagów.
  2. Pozyskiwanie obrazów do celów ilościowych
    1. Należy pozyskać obrazy w kanale kontrastu fazowego oraz kanale GFP.
    2. Należy zarejestrować co najmniej 4–6 pól widzenia na każdą studzienkę.
    3. Przeanalizować co najmniej trzy studzienki dla każdego stanu.
  3. Definicja zdarzeń fagocytarnych
    1. Zidentyfikuj makrofagi zawierające sygnały GFP-dodatnie, które znajdują się całkowicie w obrębie granicy komórkowej.
  4. Analiza obrazu
    1. Otwórz obrazy w oprogramowaniu ImageJ.
    2. Użyj wtyczki Cell Counter.
    3. Policz całkowitą liczbę makrofagów.
    4. Należy policzyć makrofagi zawierające zinternalizowane komórki GFP-dodatnie.
  5. Obliczanie indeksu fagocytozy
    1. Oblicz: Wzór na indeks fagocytozy; stosunek pochłoniętych komórek GFP-dodatnich do całkowitej liczby makrofagów; równanie.
    2. Analizę należy przeprowadzić w sposób zaślepiony.
    3. Powtórzyć w co najmniej trzech niezależnych eksperymentach.
  6. Prezentacja danych
    1. Przedstaw chronologicznie reprezentatywne obrazy z sekwencji time-lapse (Rycina 2B i Rysunek 2C).
    2. Przedstaw reprezentatywne obrazy końcowe (Rycina 3A i Rysunek 3B).

Analiza fagocytozy: ko-kultura makrofagów, przeciwciało monoklonalne anty-CD24; obrazy mikroskopowe, porównanie wykresów danych.
Rycina 3Ilościowe oznaczenie fagocytozy makrofagów zależnej od przeciwciał za pomocą analizy punktu końcowego. (A) Reprezentatywne obrazy w kontraście fazowym i fluorescencji GFP makrofagów w kołturze z komórkami raka piersi znakowanymi GFP przez 4 h, po których nastąpiło usunięcie komórek niepochłoniętych za pomocą obróbki EDTA. Kanały kontrastu fazowego i GFP zostały połączone w celu identyfikacji makrofagów oraz zinternalizowanych celów GFP-dodatnich. Makrofagi (licznik 0) oraz pochłaniające makrofagi GFP-dodatnie (licznik 1) policzono przy użyciu wtyczki Cell Counter w programie ImageJ. W warunkach kontrolnych z zastosowaniem IgG nie zaobserwowano zdarzeń fagocytozy, natomiast zastosowanie przeciwciała monoklonalnego anty-CD24 doprowadziło do wyraźnych wewnątrzkomórkowych sygnałów GFP-dodatnich w makrofagach, co wskazuje na aktywną fagocytozę. Pasek skali = 200 µm(B) Ilościowe oznaczenie indeksu fagocytozy, zdefiniowanego jako procent makrofagów zawierających zinternalizowane komórki GFP-dodatnie w stosunku do całkowitej populacji makrofagów. Przeciwciało monoklonalne anty-CD24 znacząco zwiększyło indeks fagocytozy w porównaniu z kontrolą IgG (0,0 ± 0,0% vs 18,76 ± 4,01%, średnia ± SD; n = 6 pól na grupę; ***p < 0,01, nieparzysty test t Welcha). Dane są reprezentatywne dla co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Prawidłową generację i polaryzację makrofagów z PBMC potwierdzono za pomocą oceny morfologicznej oraz analizy cytometrycznej (Rycina 1). PBMC wyizolowane metodą wirowania w gradiencie gęstości hodowano w medium z dodatkiem M-CSF, co do 7. dnia doprowadziło do uzyskania komórek przylegających o charakterystycznej morfologii makrofagów. Po stymulacji IFN-γ oraz LPS komórki wykazały fenotyp zgodny z aktywacją w zastosowanych warunkach. Analiza cytometryczna wykazała, że 99,8% wybranych komórek ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kilka etapów w niniejszym protokole ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników. Po pierwsze, jakość i czystość izolacji PBMC bezpośrednio wpływają na wydajność uzyskiwania makrofagów oraz efektywność ich różnicowania. Staranne warstwowanie rozcieńczonej krwi nad gradientem Ficoll oraz wirowanie z wyłączonym hamulcem są niezbędne dla zachowania interfejsu warstwy leukocytarnej (buffy coat). Niepełna liza RBC lub zbyt długa inkubacja z buforem lizującym obniży żywotność PBMC. Po drugie, polary...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie wykazują żadnego konfliktu interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez Centrum Biologii Nowotworów i Terapii Precyzyjnej Uniwersytetu Medycznego w Chinach w ramach Programu Centra Badawczych Obszarów Priorytetowych w ramach Projektu Higher Education Sprout Ministerstwa Edukacji (MOE) na Tajwanie (CBPTC-PROJ-5-2).

Dziękujemy Centrum Biologii Nowotworów i Terapii Precyzyjnej za zapewnienie finansowania oraz wsparcia akademickiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór stokowy kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) 0,5 MSigma-Aldrich (lub odpowiednik)E7889 (lub odpowiednik)Stosowany do przygotowania 10 mM roboczego roztworu EDTA w PBS do odrywania komórek
płytki 24-dołkowe do hodowli tkanek (poddane obróbce TC)Corning (lub odpowiednik)3524Stosowane do kokultury makrofagów i komórek nowotworowych podczas testu fagocytozy
Przeciwciało anty-CD206 przeciwko ludzkiemu antygenowi (cytometria przepływowa)BioLegend (lub odpowiednik)321122 (lub odpowiednik)Marker alternatywnego fenotypu makrofagów
Przeciwciało monoklonalne anty-CD24 przeciwko ludzkiemu antygenowiThermo Fisher Scientific (lub odpowiednik)MA1-91384 (lub odpowiednik)Stosowane do opsonizacji komórek nowotworowych w celu wywołania fagocytozy zależnej od przeciwciał
Zautomatyzowany system obrazowania żywych komórek z komorą kontroli parametrów środowiskowych (np. Lionheart FX)Agilent Technologies (lub odpowiednik)Automatyczny mikroskop BioTek Lionheart FXUmożliwia długoterminowe obrazowanie time-lapse w kontrolowanej temperaturze i 2 warunki
Oprogramowanie do obrazowania służące do zautomatyzowanego obrazowania żywych komórek (np. Gen5)Agilent Technologies (lub odpowiednik)N/ASłuży do akwizycji i analizy danych obrazowania poklatkowego (time-lapse)
Wirówka (rotor z koszyczkami wahadłowymi)Thermo Fisher Scientific (lub odpowiednik)Wirówka Multifuge X4R Pro z rotorem TX-1000 (lub odpowiednikiem)Stosowane do izolacji PBMC oraz w etapach płukania komórek
2 inkubator (37°C, 5% 2)Thermo Fisher Scientific (lub odpowiednik)Forma Direct Heat 2 Inkubator (lub odpowiednik)Zapewnia warunki fizjologiczne dla hodowli komórkowych
2 zasilanie gazem z regulatoremAgilent Technologies (lub odpowiednik)Ze względu na brak treści źródłowej, nie mogę wykonać tłumaczenia. Proszę o dostarczenie tekstu do przetłumaczenia.Materiały i odczynniki 2 do kontroli warunków środowiskowych inkubatora i systemu obrazowania
Probówki stożkowe (15 ml i 50 ml)Corning (lub odpowiednik)352070 (lub odpowiednik)Stosowane do izolacji, przemywania i odwirkowywania PBMC
probówki do pobierania krwi powlekane EDTA (vacutainery)BD Biosciences (lub odpowiednik)367863 (lub odpowiednik)Stosowane do pobierania próbek krwi pełnej od dawców
Ficoll-Paque PLUSCytiva (lub odpowiednik)17144003 (lub odpowiednik)Medium do gradientowej wirowania w celu izolacji PBMC
Cytometr przepływowy (np. FACSCanto II)BD Biosciences (lub odpowiednik)BD FACSCanto II Stosowane do analizy fenotypowej makrofagów
Kulek kompensacyjnych (cytometria przepływowa)Biolegend (lub odpowiednik)424602Stosowane do kontroli kompensacji jednobarwnej
przeciwciało anty-CD11b przeciwko ludzkiemu białku znakowane FITC (cytometria przepływowa)BioLegend (lub odpowiednik)101205 (lub odpowiednik)Marker stosowany do identyfikacji makrofagów
przeciwciało przeciwko ludzkiemu CD80 znakowane PE (cytometria przepływowa)BioLegend (lub odpowiednik)375410 (lub odpowiednik)Marker związany z fenotypem aktywowanych makrofagów
linia komórkowa raka piersi (MDA-MB-468) wykazująca ekspresję GFPATCC (lub odpowiednik)HTB-132 (lub odpowiednik)Komórki docelowe użyte w teście fagocytozy; GFP umożliwia wizualizację
pożywka do makrofagów ImmunoCult-SFSTEMCELL Technologies (lub odpowiednik)10961 (lub ekwiwalent)Pożywka bezsurowicza stosowana do różnicowania makrofagów
Dulbecco’podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Thermo Fisher Scientific (lub odpowiednik)12100046Stosowane do hodowli i resuspensji komórek nowotworowych
Przeciwciało kontrolne izotypowe (IgG)Bio X Cell (lub odpowiednik)BE0297 (lub odpowiednik)Kontrola negatywna dla testu fagocytozy zależnej od przeciwciał
Lipopolisacharyd (LPS)Sigma-Aldrich (lub odpowiednik)L2630 (lub odpowiednik)Bodziec stosowany do aktywacji makrofagów w połączeniu z IFN-γ
Rekombinowany ludzki interferon gamma (IFN-γ)STEMCELL Technologies (lub odpowiednik)78020 (lub odpowiednik)Cytokina stosowana do aktywacji makrofagów
Rekombinowany ludzki czynnik stymulujący wzrost kolonii makrofagów (M-CSF)STEMCELL Technologies (lub odpowiednik)78057 (lub odpowiednik)Czynnik wzrostu stosowany do różnicowania makrofagów
Pipety Pasteura lub pipety serologiczneJetbiofil (lub odpowiednik)GSP010010 (lub odpowiednik)Stosowane do manipulacji cieczami podczas izolacji PBMC oraz hodowli komórkowej
PBS (bez Ca2+)2+-/Mg2+-wolny)Thermo Fisher Scientific (lub odpowiednik)BP399-500 (lub odpowiednik)Bufor stosowany do przemywania komórek i etapów rozcieńczania
szalki Petriego (100 mm, bez)–(przetraktowane w celu hodowli tkankowej)Corning (lub odpowiednik)430591Stosowane do różnicowania makrofagów poprzez selekcję przez adhezję
Bufor do lizy czerwonych krwinek (erytrocytów)BioLegend (lub odpowiednik)420301 (lub odpowiednik)Stosowane do usuwania erytrocytów podczas izolacji PBMC
Barwnik do utrwalania Viability 405/452Miltenyi Biotec (lub odpowiednik)130-130-404 (lub odpowiednik)Stosowane do oceny żywotności komórek podczas analizy cytometrycznej
DAPISigma-Aldrich (lub odpowiednik)D9542 (lub odpowiednik)Stosowane do wykluczania martwych komórek w cytometrii przepływowej

Bibliografia

  1. Sung H, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249.
  2. Perou CM, et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature. 2000;406(6797):747-752.
  3. Foulkes WD, Smith IE, Reis-Filho JS. Triple-negative breast cancer. N Engl J Med. 363(20):1938-1948.
  4. Dent R, et al. Triple-negative breast cancer: Clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 2007;13(15 Pt 1):4429-4434.
  5. Lin NU, et al. Sites of distant recurrence and clinical outcomes in patients with metastatic triple-negative breast cancer: High incidence of central nervous system metastases. Cancer. 2008;113(10):2638-2645.
  6. Bianchini G, De Angelis C, Licata L, Gianni L. Treatment landscape of triple-negative breast cancer - expanded options, evolving needs. Nat Rev Clin Oncol. 2022;19(2):91-113.
  7. Lecoultre M, Dutoit V, Walker PR. Phagocytic function of tumor-associated macrophages as a key determinant of tumor progression control: A review. J Immunother Cancer. 2020;8(2).
  8. Mantovani A, Allavena P, Marchesi F, Garlanda C. Macrophages as tools and targets in cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 2022;21(11):799-820.
  9. Chan SH, Lin CY, Tseng HJ, Wang LH. Cd24a knockout results in an enhanced macrophage- and cd8⁺ t cell-mediated anti-tumor immune responses in tumor microenvironment in a murine triple-negative breast cancer model. J Biomed Sci. 2025;32(1):73.
  10. Majeti R, et al. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell. 2009;138(2):286-299.
  11. Barkal AA, et al. CD24 signalling through macrophage siglec-10 is a target for cancer immunotherapy. Nature. 2019;572(7769):392-396.
  12. Wang X, et al. CD24-siglec axis is an innate immune checkpoint against metaflammation and metabolic disorder. Cell Metab. 2022;34(8):1088-1103.e1086.
  13. Chan SH, et al. Identification of the novel role of CD24 as an oncogenesis regulator and therapeutic target for triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 2019;18(1):147-161.
  14. Huang S, Zhang X, Wei Y, Xiao Y. Checkpoint CD24 function on tumor and immunotherapy. Front Immunol. 2024;15:1367959.
  15. Weiskopf K, Weissman IL. Macrophages are critical effectors of antibody therapies for cancer. MAbs. 2015;7(2):303-310.
  16. Cao X, et al. Promoting antibody-dependent cellular phagocytosis for effective macrophage-based cancer immunotherapy. Sci Adv. 2022;8(11):eabl9171.
  17. Aderem A, Underhill DM. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu Rev Immunol. 1999;17:593-623.
  18. Flannagan RS, Jaumouille V, Grinstein S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 2012;7:61-98.
  19. Denardo DG, Ruffell B. Macrophages as regulators of tumour immunity and immunotherapy. Nat Rev Immunol. 2019;19(6):369-382.
  20. Horsthemke M, Wilden J, Bachg AC, Hanley PJ. Time-lapse 3d imaging of phagocytosis by mouse macrophages. J Vis Exp. 2018;(140). doi:10.3791/57566.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Fagocytoza zale na od przeciwciazielone bia ko fluorescencyjnekom rki wykazuj ce ekspresj CD24obrazowanie ywych kom rekopsonizacja przeciwcia ami monoklonalnymitest ko cowyimmunoterapia nowotwor w

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.