Protokół z oddzieleniem półkul dla obserwacji morfologicznych oraz połączonej ekstrakcji RNA i białek z obszarów mózgu myszy

Xinyu Zhu; Yukun Li; Lianjun Zhang; Yiyun Zou; Shanxiang Gao; Yuan Tian; Jing Xu; Chunqing Liu

doi:10.3791/71465

Artykuł metodologiczny

Protokół z oddzieleniem półkul dla obserwacji morfologicznych oraz połączonej ekstrakcji RNA i białek z obszarów mózgu myszy

2 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71465

⸱

1 września 2026

Xinyu Zhu^*¹^,² , Yukun Li^*³ , Lianjun Zhang³ , Yiyun Zou³ , Shanxiang Gao³ , Yuan Tian³ , Jing Xu⁴ , Chunqing Liu¹

¹College of Medical Laboratory, Dalian Medical University, ²The Transvascular Implant Instrument Research Institute, ³The Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, ⁴College of Basic Medical Sciences of Dalian Medical University

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje sposób przecinania mózgów myszy na pół. Jedna półkula jest wykorzystywana do barwienia morfologicznego, a druga do ekstrakcji RNA i białek. Strategia ta pozwala na zmniejszenie liczby wykorzystywanych zwierząt, jest zgodna z zasadami 3R i minimalizuje zmienność międzyosobniczą.

Streszczenie

W codziennych badaniach z zakresu neuronauki barwienie morfologiczne oraz molekularne analizy kwasów nukleinowych i białek zazwyczaj wymagają oddzielnych zwierząt doświadczalnych, co zwiększa liczbę wykorzystywanych zwierząt i jest niezgodne z zasadą 3R w zakresie dobrostanu zwierząt. Niniejszy protokół wprowadza schemat alokacji tkanki mózgowej myszy, który umożliwia przeprowadzenie parowanych analiz morfologicznych i molekularnych z jednego zwierzęcia. Po perfuzji przezsercowej 0,9% solą fizjologiczną mózg zostaje podzielony na dwie półkule. Jedna półkule jest utrwalana w 4% paraformaldehydzie do immunohistochemii i immunofluorescencji; skrawki przechowywane w roztworze sacharozy, glikolu etylenowego i poliwinylo-pirolidonu (PVP) zachowują niezawodną jakość barwienia przez okres do siedmiu lat. Przeciwległa półkula jest kriosprzechowywana w temperaturze -80 °C w celu połączonej ekstrakcji RNA i białek, z wydajnością wystarczającą do późniejszej analizy qPCR i Western Blot. Metoda ta, przetestowana na wycinkach kory entorynalnej o masie 9–10 mg, daje niższe wydajności RNA i białek niż oddzielna ekstrakcja RNA lub białka, jednak odzyskane biomolekuły pozostają wystarczające do detekcji molekularnej. Taki schemat postępowania zmniejsza zużycie zwierząt i eliminuje różnice międzyosobnicze pomiędzy parowanymi analizami morfologicznymi i molekularnymi. Stanowi on praktyczną metodę przygotowania tkanki do wielowymiarowego profilowania odizolowanych podregionów mózgu myszy.

Wprowadzenie

Badania nad neuronauką rozwinęły się gwałtownie w ostatnich dziesięcioleciach, odkrywając kluczowe mechanizmy sterujące fizjologią ludzkiego mózgu, początkiem chorób neurologicznych oraz rozwojem terapii. Modele zwierzęce pozostają niezbędne w badaniach neuronaukowych, zapewniając kontrolowalne i powtarzalne platformy do badania rozwoju układu nerwowego, funkcji fizjologicznych oraz procesów patologicznych. Manipulacje eksperymentalne i obserwacje histologiczne u myszy pozwalają badaczom na charakteryzację sygnalizacji neuronalnej, tworzenia obwodów neuronalnych oraz powiązań między neuronami a zachowaniem. Równolegle do postępu technicznego kwestie etyki eksperymentów na zwierzętach stały się centralnym punktem uwagi. Zasady 3R (Replacement – zastąpienie, Reduction – redukcja i Refinement – udoskonalenie) są obecnie uznanymi na całym świecie standardami dla wszystkich badań na zwierzętach¹^,², wymagającymi od badaczy minimalizacji liczby wykorzystywanych zwierząt przy jednoczesnym zachowaniu wiarygodnych wyników eksperymentalnych.

Innowacyjne narzędzia, takie jak systemy warunkowego wyciszania genów (conditional knockout), umożliwiają precyzyjną manipulację genetyczną w obrębie poszczególnych podregionów mózgu myszy³. Postępy te przyczyniły się do intensywnych badań nad mikroskalowymi przedziałami mózgowymi, takimi jak obszary CA1, CA3 i DG hipokampa, które regulują procesy uczenia się, pamięć oraz nastrój⁴. Dekodowanie funkcji wyższego rzędu tych niewielkich obszarów mózgu wymaga skoordynowanych pomiarów na poziomie morfologicznym, transkrypcyjnym i białkowym. Niestety, niewielka objętość tkanki stanowi istotną przeszkodę techniczną w przypadku równoległej detekcji wielu indeksów.

Barwienie morfologiczne, kwantyfikacja RNA i immunodetekcja białek to trzy rutynowe podstawowe analizy w neuronauce. Tradycyjne plany badawcze wymagają trzech oddzielnych kohort zwierząt mysich do przeprowadzenia tych trzech rodzajów testów. Praktyka ta drastycznie zwiększa liczbę wykorzystywanych zwierząt i wprowadza znaczną biologiczną zmienność międzyosobniczą, co osłabia porównywalność między zestawami danych histologicznych i molekularnych. Ujednolicony schemat pracy, który pozwala na pozyskanie dopasowanych sygnałów morfologicznych i molekularnych z jednego zwierzęcia, w znacznym stopniu rozwiązałby te dwa krytyczne ograniczenia i lepiej realizował zasadę Redukcji (Reduction) z koncepcji 3R.

W niniejszej pracy przedstawiamy powtarzalny protokół separacji półkulowej tkanki mózgu myszy. Po systemowej perfuzji solą fizjologiczną cały mózg zostaje podzielony na dwie półkule: jedna półkula jest utrwalana do badań morfologicznych, a półkula przeciwległa zostaje kriokonserwowana w celu jednoczesnej koekstrakcji RNA i białek. Tkanki utrwalone i przechowywane w buforze ochronnym sacharoza-glikol etylenowy-poliwinylopirolidon (PVP) zachowują stabilne, wysokiej jakości sygnały barwienia w immunohistochemii i immunofluorescencji przez okres do siedmiu lat. Zwalidowaliśmy tę metodę, wykorzystując niewielkie wycinki o masie 9–10 mg z kory entorynalnej — tkanki lżejszej niż powszechnie badane obszary, takie jak hipokamp i kora przedczołowa. Pomyślna detekcja tak małej próbki tkanki wskazuje, że mniejsze podregiony mózgu, takie jak podwzgórze i ciało migdałowate, są również kompatybilne z tym schematem postępowania. Chociaż protokół ten pozwala uzyskać niższe stężenia RNA i białek niż specjalistyczne zestawy do ekstrakcji o pojedynczym zastosowaniu, wyizolowane biomolekuły posiadają odpowiednią jakość, aby wspierać standardowe analizy qPCR i Western blot. Taki schemat postępowania ogranicza liczbę wykorzystywanych zwierząt i eliminuje różnice międzyosobnicze pomiędzy sparowanymi analizami morfologicznymi i molekularnymi. Stanowi on wykonalną metodę przygotowania tkanki do wielowymiarowego profilowania dyskretnych podregionów mózgu myszy.

Protokół

Oświadczenie etyczne

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzone w niniejszym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Dalian (numer zatwierdzenia AEE18026 dla eksperymentów na szczurach oraz AEE24261 dla eksperymentów na myszach), Chińska Republika Ludowa. Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały wdrożone zgodnie z wytycznymi etycznymi dotyczącymi zwierząt laboratoryjnych i w pełni zgodne z zasadami 3R (Reduction, Replacement, and Refinement) w eksperymentach na zwierzętach. Przez cały proces eksperymentalny stosowano rygorystyczne środki w celu skutecznego złagodzenia cierpienia i stresu zwierząt. Jednocześnie liczba zwierząt eksperymentalnych została ograniczona do minimalnej ilości niezbędnej do zapewnienia wiarygodności i poprawności wyników analizy statystycznej. Pełną listę odczynników, materiałów eksploatacyjnych i sprzętu użytych w tym protokole znajduje się w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie zwierząt doświadczalnych i operacja perfuzji transkardialnej

Znieczulenie i przygotowanie przedoperacyjne
1. W tym protokole należy wykorzystać dorosłe samce szczurów Sprague-Dawley lub myszy C57BL/6 klasy SPF (wolne od specyficznych patogenów). Zwierzęta należy utrzymywać w środowisku o kontrolowanej temperaturze (22 ± 2 °C) z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności. Zwierzęta powinny mieć dostęp ad libitum do sterylnej karmy i wody.
2. W celu zniesienia czujności i wprowadzenia w stan znieczulenia należy podać zwierzętom pentobarbital sodu drogą dosytrytonową w dawce 80 mg/kg dla szczurów lub 50 mg/kg dla myszy (patrz Rycina 1).
Procedura perfuzji transkardialnej
1. Znieczulone zwierzęta należy unieruchomić w pozycji grzbietnej na stole chirurgicznym.
2. Za pomocą prostych nożyczek należy naciąć ścianę brzuszną wzdłuż linii środkowej od wyrostka mieczowatego do spojenia łonowego. Należy naciąć boczne ściany klatki piersiowej obustronnie, aby w pełni odsłonić serce.
3. Zwierzę należy poddać perfuzji lodowatym 0,9% roztworem soli fizjologicznej przy stałej szybkości przepływu: 100–150 mL w ciągu 10–15 min dla szczurów oraz 20–30 mL w ciągu 5–8 min dla myszy.
Pobieranie mózgu i separacja półkul
1. Po zakończeniu perfuzji zwierzęta należy zdekapitować dużymi nożyczkami chirurgicznymi. Należy naciąć skórę głowy wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić czaszkę.
2. Za pomocą sterylnej szpatułki należy delikatnie wyjąć mózg z jamy czaszki. Cały mózg należy szybko przenieść do sterylnej płytki Petriego umieszczonej na lodzie.
3. Używając sterylnego, wolnego od RNazy ostrza żyletki, należy symetrycznie podzielić mózg na lewą i prawą półkule wzdłuż szwu strzałkowego.
4. Lewą półkulę należy niezwłocznie przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL zawierającej 10 mL lodowatego 4% roztworu paraformaldehydu w celu utrwalenia. Prawą półkulę należy przenieść do oznakowanej, wolnej od RNazy probówki do krio konserwacji, błyskawicznie zamrozić w ciekłym azotenie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA i białek.

2. Fixacja, sekcjonowanie i długoterminowe przechowywanie tkanki mózgowej

Fiksacja i odwodnienie
1. Całkowicie zanurzyć lewą półkulę w 4% roztworze paraformaldehydu i utrwalać tkankę w temperaturze 4 °C przez 24 h. Po zakończeniu fiksacji przenieść półkulę mózgu do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL zawierającej 30% roztwór sacharozy i odwodnić tkankę w temperaturze 4 °C.
2. Wymieniać 30% roztwór sacharozy co 24 h, aż tkanka mózgowa opadnie na dno probówki.
Przygotowanie kriosiekcji
1. Wyjąć odwodnioną półkulę mózgu z roztworu sacharozy i delikatnie osuszyć nadmiar cieczy za pomocą sterylnego papieru filtracyjnego.
2. Zamocować półkulę mózgu na stole preparatowym kriotomatu, używając medium do zatapiania OCT (optimal cutting temperature).
3. Wyciąć seryjne przekroje koronalne mózgu o grubości 30 µm za pomocą kriotomatu. Kolejne sekcje zbierać na płytce 24-dołkowej zawierającej sterylny 0,01 M PBS.
Długoterminowe przechowywanie sekcji mózgu
1. Przygotować wcześniej krioprotekcyjny roztwór konserwujący do skrawków mózgu: do 100 mL 0,01 M PBS dodać 2 g PVP400, 60 g sacharozy oraz 60 mL glikolu etylenowego. Mieszać roztwór w temperaturze pokojowej do całkowitego rozpuszczenia wszystkich składników i przechowywać w 4 °C do momentu użycia.

3. Izolacja RNA przy użyciu TRIzol

Homogenizacja tkanki i rozdział faz
1. Tkankę kory entorynalnej homogenizować w 1 mL odczynnika TRIzol przy użyciu homogenizatora ultraprecyzyjnego i inkubować homogenat na lodzie przez 15 min. Odwirować przy 8,000 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
2. Dodać 200 µL chloroformu i mieszać w wortexie przez 10 s. Odwirować przy 5,600 × g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Następnie przenieść górną fazę wodną do probówki wolnej od RNaz. Dodać 500 µL izopropanolu i inkubować w temperaturze -20 °C przez noc w celu wytrącenia RNA. Ponownie odwirować.
Wytrącanie, przemywanie i ocena jakości RNA
1. Odlać supernatant i przemyć osad RNA za pomocą 1 mL 75% etanolu. Odwirować przy 5,600 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant, suszyć osad na powietrzu przez 10 min, a następnie rozpuścić RNA w 20 µL wody traktowanej DEPC przez 10 min.
2. Zmierzyć stężenie i czystość RNA (A₂₆₀/A₂₈₀) za pomocą spektrofotometru. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.

4. Ekstrakcja białek całkowitych przy użyciu zestawu Minute

Lizja i homogenizacja tkanki
1. Wstępnie schłodzić kolumnę wirową i probówkę zbiorczą na lodzie. Homogenizować tkankę w 100 µL buforu do lizy komórek, używając homogenizatora ultradrobnego. Przepłukać homogenizator dodatkowymi 100 µL buforu do lizy komórek i połączyć lizaty.
Odzysk i oznaczanie ilości białka
1. Przenieść homogenat do kolumny wirowej i inkubować przez 2 min w temperaturze pokojowej.
2. Wirować przy 11,000–14,300 × g przez 2 min.
3. Niezwłocznie po wirowaniu umieścić probówkę zbiorczą na lodzie i usunąć kolumnę wirową. Określić stężenie białka za pomocą testu BCA.

5. Równoczesna ekstrakcja RNA i białek z kory entorynalnej (9–10 mg)

Przygotowanie przedeksperymentalne i przygotowanie odczynników
1. Do wszystkich etapów ekstrakcji należy użyć zestawu do izolacji DNA/RNA/białek. Należy stosować wyłącznie certyfikowane materiały eksploatacyjne wolne od RNaz i DNaz (patrz Rycina 2).
2. Bufor do lizy należy przygotować bezpośrednio przed użyciem: do dostarczonego w zestawie buforu do lizy należy dodać koktajl inhibitorów proteaz w rozcieńczeniu 1:100.
Liza tkanki i rozdział faz
1. Zamrożoną prawą półkulę mózgu należy wyjąć z przechowywania w -80 °C i umieścić na lodzie. Za pomocą sterylnego wycinaka wolnego od RNaz należy pobrać 9–10 mg tkanki z docelowego obszaru mózgu.
2. Tkankę należy całkowicie homogenizować na lodzie za pomocą elektrycznego homogenizatora do tkanki, aż do całkowitego zaniku widocznych fragmentów tkanki. Homogenizat należy inkubować na lodzie przez 10 min, aby zapewnić pełną lizę.
3. Do homogenizatu należy dodać 200 µL dostarczonego w zestawie odczynnika do rozdziału. Probówkę należy energicznie mieszać w wiruwarce (vortex) przez 30 s, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 min. Probówkę należy odwirować przy 8,000 × g przez 15 min w 4 °C, aby uzyskać całkowity rozdział faz.
Oczyszczanie i elucja RNA
1. Górną fazę wodną należy ostrożnie zebrać za pomocą końcówki pipety wolnej od RNaz. Zebraną fazę wodną należy przenieść do nowej probówki 1,5 mL wolnej od RNaz. Do zebranej fazy wodnej należy dodać taką samą objętość 100% etanolu i wymieszać.
2. 700 µL mieszaniny należy przenieść do kolumny do oczyszczania RNA dostarczonej w zestawie. Kolumnę należy wirować przy 5,600 × g przez 1 min w temperaturze pokojowej.
3. Do kolumny należy dodać 500 µL dostarczonego w zestawie buforu do przemywania RNA 1. Kolumnę należy wirować przy 5,600 × g przez 1 min w temperaturze pokojowej.
4. Następnie do kolumny należy dodać 500 µL dostarczonego w zestawie buforu do przemywania RNA 2 i ponownie wirować. Pustą kolumnę należy wirować przy 8,000 × g przez 2 min w temperaturze pokojowej, aby całkowicie usunąć resztkowy etanol z membrany kolumny.
5. Kolumnę należy przenieść do nowej probówki mikrocentryfugowej 1,5 mL wolnej od RNaz. Bezpośrednio na środek membrany kolumny należy dodać 30–50 µL wody wolnej od RNaz (podgrzanej do 60 °C). Kolumnę należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 min. Kolumnę należy wirować przy 8,000 × g przez 1 min w temperaturze pokojowej, aby przeprowadzić elucję RNA.
Wytrącanie i rozpuszczanie białek
1. Do pozostałej fazy organicznej i interfazy w pierwotnej probówce (po pobraniu fazy wodnej do ekstrakcji RNA) należy dodać 750 µL izopropanolu. Mieszaninę należy inkubować w -20 °C przez 30 min w celu wytrącenia białek.
2. Probówkę należy wirować przy 8,000 × g przez 10 min w 4 °C. Należy odrzucić nadsącz i zachować nienaruszony osad białkowy na dnie probówki.
3. Do osadu białkowego należy dodać 1 mL 95% etanolu. Probówkę należy krótko wymieszać w wiruwarce (vortex), aby przemyć osad. Probówkę należy wirować przy 8,000 × g przez 5 min w 4 °C i odrzucić nadsącz. Ten etap przemywania należy powtórzyć jeszcze dwukrotnie.
4. Osad białkowy należy suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 5–10 min, aż stanie się półprzezroczysty i nie będzie widocznego resztkowego etanolu.
5. Do wysuszonego osadu należy dodać 50–100 µL 5–10% roztworu SDS. Probówkę należy energicznie mieszać w wiruwarce (vortex) przez 1 min, a następnie inkubować na lodzie przez 10 min, aby całkowicie rozpuścić białko. Probówkę należy wirować przy 8,000 × g przez 5 min w 4 °C. Nadsącz należy zebrać jako końcowy ekstrakt białkowy.

6. Barwienie immunohistochemiczne (IHC)

Obróbka wstępna i inaktywacja enzymów endogennych
1. Wyjąć przekroje mózgu z przechowywania w krioprotekcie w temperaturze -20 °C. Za pomocą szklanej igły przenieść przekroje do płytki 24-dołkowej zawierającej 0,01 M PBS (pH 7,4).
2. Przemyć przekroje trzy razy 0,01 M PBS (5 min każdego płukania) w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
3. Inkubować przekroje z 3% blokerem peroksydazy (nadtlenkiem wodoru) w temperaturze pokojowej przez 10 min w celu inaktywacji endogennej aktywności peroksydazy. Po blokowaniu powtórzyć etapy płukania.
Permeabilizacja i blokowanie niespecyficzne
1. Inkubować przekroje w 0,5% Triton X-100 przez 30 min w temperaturze pokojowej na wytrząsarce w celu permeabilizacji błon komórkowych. Powtórzyć etapy płukania.
2. Inkubować przekroje w 4% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) przez 30 min w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować z inhibitorem barwienia niespecyficznego przez kolejne 30 min w temperaturze pokojowej.
Inkubacja z przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi
1. Rozcieńczyć przeciwciała pierwotne w 1% roztworze BSA w następujących zoptymalizowanych rozcieńczeniach: doublecortin (DCX, 1:4000), neuronal nuclear antigen (NeuN, 1:3000), ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba-1, 1:2000) oraz glial fibrillary acidic protein (GFAP, 1:2000).
2. Do każdego dołka dodać 200 µL rozcieńczonego roztworu przeciwciał pierwotnych, zapewniając pełne zanurzenie przekrojów.
3. Do każdego dołka dodać 200 µL znakowanego biotyną przeciwciała wtórnego. Inkubować przekroje w temperaturze pokojowej przez 30 min.
4. Przemyć przekroje trzy razy 0,01 M PBS (5 min każdego płukania). Do każdego dołka dodać 300 µL koniugatu streptawidyna-peroksydaza. Inkubować przekroje w temperaturze pokojowej przez 30 min. Po inkubacji powtórzyć etapy płukania.
Wywoływanie chromogeniczne 3,3′-diaminobenzydyną (DAB) i nakładanie szkiełek
1. Do każdego dołka dodać 200 µL roboczego roztworu DAB. Monitorować reakcję chromogeniczną pod mikroskopem świetlnym.
2. Przenieść przekroje na szklane laminki pokryte żelatyną za pomocą szklanej igły. Całkowicie wysuszyć laminki na powietrzu w temperaturze pokojowej.
3. Odwodnić laminki, przeprowadzając je przez szereg roztworów etanolu o rosnącym stężeniu (50%, 70%, 90%, 95%, 100%, 100% etanolu, po 5 min w każdym), a następnie oczyścić dwukrotnie w ksylenie, po 5 min za każdym razem.

7. Barwienie immunofluorescencyjne (IF)

Obróbka wstępna i permeabilizacja przekrojów
1. Wyjąć przekroje mózgu z krioprotektora przechowywanego w temperaturze -20 °C. Przenieść przekroje do płytki 24-dołkowej zawierającej 0,01 M PBS (pH 7,4).
2. Przepłukać przekroje trzy razy 0,01 M PBS, przez 5 min każdego płukania, w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
3. Inkubować przekroje w 0,5% Triton X-100 przez 30 min w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
4. Po permeabilizacji przepłukać przekroje trzy razy 0,01 M PBS, przez 10 min każdego płukania.
Blokowanie i inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym
1. Inkubować przekroje w roztworze blokującym zawierającym 4% BSA oraz inhibitor niespecyficznego barwienia przez 1 h w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej.
2. Odssać roztwór blokujący. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w 1% roztworze BSA do zoptymalizowanych stężeń i dodać 300 µL rozcieńczonego roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do każdego dołka. Inkubować przekroje przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej, nieprzepuszczającej światła komorze.
Inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym
1. Następnego dnia ogrzać przekroje do temperatury pokojowej przez 1 h w ciemności. Odessać roztwór przeciwciał pierwszorzędowych i przepłukać przekroje trzy razy 0,01 M PBS, przez 10 min każdego płukania, na wytrząsarce w ciemności.
2. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluorochromem w 1% roztworze BSA zgodnie z zaleceniami producenta. Dodać 300 µL roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdego dołka. Inkubować przekroje w temperaturze pokojowej przez 1–2 h w ciemności.
3. Przepłukać przekroje pięć razy 0,01 M PBS, przez 5 min każdego płukania, w ciemności.

8. Ilościowa analiza PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Usuwanie gDNA z RNA i odwrotna transkrypcja
1. Przeprowadzić odwrotną transkrypcję w celu syntezy cDNA przy użyciu zestawu do odwrotnej transkrypcji, stosując 1 µg całkowitego RNA na 20 µL układu reakcyjnego. Zastosować zalecany przez producenta program termocyklery: 25 °C przez 5 min, 50 °C przez 15 min, 85 °C przez 5 min, a następnie przechowywanie w 4 °C.
2. Rozcieńczyć zsyntetyzowane cDNA w stosunku 1:5 wodą wolną od RNaz. cDNA przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu amplifikacji qPCR.
Przygotowanie układu qPCR i amplifikacja
1. Przygotować układ reakcyjny qPCR na lodzie w dedykowanym dygestorium do PCR wolnym od RNaz. Układ reakcyjny o objętości 20 µL zawiera: 10 µL qPCR Master Mix, 0,4 µL startera forward (10 µM), 0,4 µL startera reverse (10 µM), 2 µL rozcieńczonej matrycy cDNA, 7,2 µL wody wolnej od RNaz.
2. Przeprowadzić amplifikację qPCR według następującego programu: 95 °C przez 30 s (denaturacja wstępna); 40 cykli obejmujących 95 °C przez 10 s i 60 °C przez 30 s; następnie analiza krzywej dysocjacji od 60 °C do 95 °C z przyrostem 0,5 °C co 5 s.

9. Western blot

Oznaczanie ilości białka i przygotowanie próbek
1. Rozcieńczyć ekstrakty białkowe do równych stężeń przy użyciu 5–10% roztworu SDS, w oparciu o wyniki testu BCA.
Elektroforeza SDS-PAGE i transfer białek
1. Przygotować 10% żel rozdzielający SDS-PAGE oraz 5% żel koncentrujący zgodnie ze standardowymi protokołami biologii molekularnej.
2. Nanieść 20 µg całkowitego białka na każdą studzienkę żelu. W przypadku eksperymentów z gradientem stężeń nanieść odpowiednio 15 µg, 30 µg i 45 µg białka na każdą studzienkę.
3. Przeprowadzić elektroforezę przy napięciu 80 V przez 30 min, aż marker białkowy wejdzie do żelu rozdzielającego, następnie zwiększyć napięcie do 120 V na 60–90 min, aż barwnik błękit bromofenolowy dotrze do dołu żelu.
4. Złożyć kanapkę transferową w następującej kolejności (od katody do anody): gąbka, papier filtracyjny, żel, membrana PVDF, papier filtracyjny i gąbka. Upewnić się, że między żelem a membraną nie pozostały pęcherzyki powietrza.
5. Przeprowadzić transfer na mokro przy stałym prądzie 300 mA przez 90 min w łaźni lodowej.
Blokowanie membrany i inkubacja z przeciwciałami
1. Po zakończeniu transferu krótko opłukać membranę PVDF buforem TBST. Inkubować membranę w 5% BSA przez 2 h w temperaturze pokojowej na wytrząsarce, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania.
2. Rozcieńczyć przeciwciała pierwotne w 5% roztworze BSA do zoptymalizowanych stężeń. Inkubować membranę z roztworem przeciwciał pierwotnych przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.
3. Następnego dnia przemyć membranę trzykrotnie buforem TBST, po 10 min każdego mycia, na wytrząsarce.
4. Rozcieńczyć przeciwciało wtórne sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) w 5% roztworze odtłuszczonego mleka zgodnie z zalecanym przez producenta rozcieńczeniem. Inkubować membranę z roztworem przeciwciał wtórnych przez 2 h w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
5. Po inkubacji z przeciwciałem wtórnym przemyć membranę trzykrotnie buforem TBST, po 10 min każdego mycia. Inkubować membranę z roztworem substratu ECL przez 1–2 min w ciemności.

Wyniki

Ocena stężenia RNA, elektroforeza w żelu agarozowym i qPCR

Jak pokazano, całkowite RNA i białkaa zostały wyekstrahowane jednocześnie z wycinków kory entorynalnej (9–10 mg) przy użyciu zestawu do izolacji DNA/RNA/białka. Próbki równoległe przetwarzane za pomocą TRIzol (RNA) lub zestawu do ekstrakcji białek posłużyły jako kontrole. Protokół pozwolił uzyskać 235 ± 12 ng µL⁻¹ RNA, co stanowiło o 36 % mniej niż w przypadku TRIzol (p < 0,05) (Rysunek 3A). Niemniej jednak żele agarozowe wykazały wyraźne prążki 28S i 18S rRNA oraz sygnały 5S, co wskazuje na nienaruszone RNA (Rysunek 3B). qPCR dla CD86, IL-1β, TNF-α oraz IL-6 wygenerował pojedyncze, symetryczne krzywe dysocjacji (Rysunek 3C), a w badanej grupie zaobserwowano niższe wartości Ct (Rysunek 3D); jednak wymagane są dalsze badania, w tym analizy integralności RNA, aby ustalić, czy różnice te odzwierciedlają lepszą jakość RNA czy wydajność ekstrakcji. Chociaż wydajność RNA była niższa niż uzyskana przy ekstrakcji TRIzol, wyraźne prążki 28S i 18S rRNA oraz specyficzne krzywe amplifikacji qPCR wskazały, że wyekstrahowane RNA było wystarczającej jakości do dalszych analiz qPCR.

Ocena stężenia białka, SDS-PAGE i analiza Western blot

Zgodnie z danymi dotyczącymi RNA, protokół podwójnej ekstrakcji przyniósł niższe całkowite stężenia białek niż zestaw do izolacji białek (p < 0,05). Niemniej jednak analizy Western blot wykazały wyraźnie silniejsze prążki immunoreaktywne dla każdego z badanych celów (Rysunek 4A). Zgodnie z wynikami kwantyfikacji RNA, protokół współekstrakcji RNA–białko odzyskuje mniej całkowitego białka niż dedykowany zestaw do izolacji białka, co można zaobserwować podczas barwienia wszystkich białek metodą CBB (Rysunek 4B–C). Białko konstytutywne β-Tubulina wykazało wyraźne i stabilne prążki w obu metodach ekstrakcji, przy porównywalnej intensywności sygnału. Białko ULK o niskiej obfitości zostało również z powodzeniem wykryte w próbkach po współekstrakcji. Co istotne, sygnały prążków PSD-95, p-ERK i p-NFκB p65 były znacznie silniejsze w grupie współekstrakcji w porównaniu z zastosowaniem pojedynczego zestawu do ekstrakcji białek. Seryjne nakładanie białek w ilościach od 15 µg do 45 µg wygenerowało zależne od dawki gradienty prążków dla wszystkich wykrytych celów w obu grupach. Podsumowując, mimo że całkowita wydajność białka w procesie podwójnej ekstrakcji jest niższa, jego jakość jest wystarczająca do standardowej analizy Western blot, a ogólna wydajność detekcji nie ustępuje konwencjonalnym zestawom do pojedynczej ekstrakcji białek.

Immunohistochemia i immunofluorescencja

Immunohistochemia przekrojów mózgu przechowywanych przez 0,5–7 lat wykazała silne znakowanie nowo powstałych neuronów DCX⁺, komórek wydzielniczych AVP⁺ oraz neuronów MAP2/NeuN⁺ z zachowaną morfologią i włóknami (Rycina 5A). Immunofluorescencja przekrojów w wieku 5–7 lat wykazała wyraźne astrocyty GFAP⁺, mikroglej Iba-1⁺ oraz aktywne neurony FosB⁺ (Rycina 5B). Reprezentatywne przekroje przechowywane przez 0,5–7 lat zachowały mierzalne sygnały immunohistochemiczne i immunofluorescencyjne w badanych warunkach. Zatem roztwór konserwujący utrzymuje integralność tkanki i antygenowość, umożliwiając niezawodne długoterminowe przechowywanie.

figure-results-1
Rysunek 1: Zintegrowany schemat procesu oddzielania półkul mózgu do detekcji morfologicznej i molekularnej. Ten schemat przedstawia pełną procedurę eksperymentalną, obejmującą transkardialną perfuzję solną gryzonia, podział wyizolowanego całego mózgu wzdłuż linii środkowej, utrwalenie i przygotowanie krioprzekrojów lewej półkuli do barwienia IHC/IF oraz kriokonserwację półkuli przeciwległej do późniejszej jednoczesnej ko-ekstrakcji RNA i białek, qPCR oraz analizy Western blot. Wszystkie ilustracje myszy zostały pierwotnie wygenerowane przez Jimeng AI. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Schemat jednoczesnej koekstrakcji RNA i białek z zamrożonej tkanki mózgu gryzoni. Na schemacie przedstawiono kolejne etapy obejmujące wycinanie fragmentów docelowej tkanki z zamrożonych półkul, lizę tkanki i rozdział trójfazowy, oczyszczanie i elucję RNA do qPCR, a także precypitację, przemywanie i rozpuszczanie białek w celu przygotowania próbek do detekcji metodą Western blot. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3: Ocena wydajności RNA, integralności RNA oraz kompatybilności z qPCR przy użyciu mikroskalowych próbek kory entorynalnej szczura. (A) Ilościowe stężenia RNA uzyskane za pomocą zestawu do ko-ekstrakcji w porównaniu z metodą TRIzol (średnia ± SEM). (B) Elektroforeza w żelu agarozowym wykazująca nienaruszone prążki rRNA 28S i 18S dla obu grup ekstrakcji. (C) Pojedyncze krzywe topnienia potwierdzają specyficzną amplifikację docelowych genów zapalnych oraz GAPDH jako genu referencyjnego. (D) Wartości Ct wykrytych genów zapalnych przy identycznej ilości wprowadzonego RNA dla dwóch metod ekstrakcji. *p < 0.05, **p < 0.01 w porównaniu z grupą TRIzol. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Ocena białek odzyskanych za pomocą protokołu współekstrakcji RNA/białek metodą Western blot. (A) Gradientowe nakładanie ilości białka (15/30/45 µg) wykazujący zależny od dawki sygnał prążków białek synaptycznych i sygnałowych. (B) Detekcja białka ULK1 o wysokiej masie cząsteczkowej z zastosowaniem barwienia białek całkowitych CBB jako referencji do nakładania. (C) Porównanie Western blot z równym nakładaniem białek docelowych dla dwóch schematów ekstrakcji. Aby zobaczyć większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

figure-results-5
Rysunek 5: Barwienie immunohistochemiczne i immunofluorescencyjne swobodnie pływających przekrojów mózgu przechowywanych przez 0,5–7 lat. (A) Mikrografie z barwienia immunohistochemicznego w polu jasnym wykonane przy powiększeniu 200× i 400×. Barwienie DCX i AVP przeprowadzono na próbkach tkanek mysich, natomiast barwienie MAP2 i NeuN wykonano na próbkach tkanek szczurzych. (B) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne uzyskane z próbek tkanek szczurzych. GFAP znakuje astrocyty, IBA-1 znakuje mikroglej, a FOSB wskazuje na aktywność neuronalną. Wszystkie eksperymenty z barwieniem immunofluorescencyjnym przedstawione na tym panelu przeprowadzono na próbkach szczurzych w celu oceny ekspresji markerów neuronalnych i lokalizacji komórkowej, mikrografie przy powiększeniu 200×. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W badaniach na myszach analizy morfologiczne oraz badania kwasów nukleinowych i białek często wymagają oddzielnych próbek zwierzęcych ze względu na odmienne procedury przygotowania. Zwiększa to liczbę wykorzystywanych zwierząt i wprowadza biologiczną zmienność międzyosobniczą, co może ograniczać porównywalność zestawów danych histologicznych i molekularnych. Aby rozwiązać te ograniczenia, opracowaliśmy schemat postępowania, który umożliwia pozyskanie danych histologicznych i molekularnych z tego samego zwierzęcia.

Głównym założeniem tego schematu postępowania jest półkulowy podział tkanki mózgowej po perfuzji przezserdecowej 0,9% solą fizjologiczną⁵^,⁶. Jedna półkula jest utrwalana w 4% paraformaldehydzie do analiz immunohistochemicznych i immunofluorescencyjnych, natomiast półkula przeciwległa jest przechowywana w temperaturze −80 °C do późniejszej koekstrakcji RNA–białka, qPCR oraz Western blottingu. Należy jednak pamiętać, że wybrane parametry mogą nie być w pełni porównywalne między dwiema półkulami mózgu. W mózgach gryzoni udokumentowano lateralizację strukturalną i funkcjonalną, a takie różnice półkulowe mogą wprowadzać zmienność, gdy analizy są przeprowadzane po przeciwnych stronach⁷^,⁸. W związku z tym badacze powinni konsekwentnie pobierać tkankę z tej samej półkuli mózgu, zgodnie z celami swoich badań.

Kluczową zaletą tej metody jest długotrwałe przechowywanie utrwalonych, swobodnych przekrojów mózgu. Po odwodnieniu w 30% sacharozie, coronalne przekroje o grubości 30 µm są przechowywane w roztworze konserwującym składającym się z sacharozy, glikolu etylowego i PVP. Wcześniejsze badania wykazały, że krioprotekcyjne roztwory sacharozy, glikolu etylowego i PVP pomagają zachować morfologię tkanki oraz antygenowość podczas długoterminowego przechowywania⁹^,¹⁰. Jednakże niewiele badań oceniało okresy przechowywania przekraczające kilka lat. Dane z naszego laboratorium rozszerzają te odkrycia: reprezentatywne przekroje przechowywane do siedmiu lat zachowały wykrywalne sygnały immunohistochemiczne i immunofluorescencyjne w testowanych warunkach. Obserwacje te potwierdzają możliwość przechowywania swobodnych przekrojów mózgu przez kilka lat w celu przeprowadzenia analiz retrospektywnych i eksperymentów uzupełniających.

Warto zauważyć, że ten schemat pracy oferuje kolejną kluczową zaletę w postaci podwójnej koekstrakcji RNA-białek z jednej zamrożonej półkuli mózgu. Choć protokół koekstrakcji pozwala na uzyskanie nieco mniejszych ilości RNA i białek niż konwencjonalne metody ekstrakcji pojedynczego celu, otrzymane biomateriały są nadal wystarczające do wiarygodnego wykrywania za pomocą qPCR i Western blot. Co krytyczne, koekstrakcja umożliwia kwantyfikację obfitości transkryptów i białek z identycznych próbek tkanek, co eliminuje zmienność biologiczną wynikającą z oddzielnego przetwarzania preparatów i pozwala na wysoce spójne, zintegrowane profilowanie molekularne¹¹^,¹². Ponadto podejście to wymaga jedynie niewielkiej masy tkanki, wynoszącej około 9–10 mg, co czyni je odpowiednim do analizy dyskretnych, specyficznych dla regionu subpopulacji mózgu przy ograniczonej dostępności próbek.

Pomimo tych istotnych zalet, metoda ta posiada również pewne ograniczenia, o których należy wspomnieć. Po pierwsze, stosunkowo niskie wydajności RNA i białek mogą ograniczać jej zastosowanie w eksperymentach wymagających dużych ilości kwasów nukleistowych lub białek, takich jak wielkoskalowe oczyszczanie białek czy głębokie sekwencjonowanie RNA. Po drugie, choć długoterminowe przechowywanie przekrojów jest skuteczne do siedmiu lat, w dłuższych okresach może nadal dochodzić do stopniowej degradacji niektórych labilnych antygenów lub kwasów nukleinowych, co może obniżyć intensywność barwienia lub czułość detekcji molekularnej. Po trzecie, metoda jest obecnie zoptymalizowana dla tkanki mózgowej myszy i może wymagać modyfikacji w przypadku zastosowania w innych tkankach lub alternatywnych modelach zwierzęcych, ponieważ skład tkanki i charakterystyka strukturalna różnią się w zależności od gatunku i narządu. Wreszcie, 5–10% SDS może zakłócać spektrometrię mas, testy aktywności enzymatycznej, badania oddziaływań białko-białko¹³^,¹⁴ oraz inne zastosowania wrażliwe na SDS. W związku z tym może być konieczne przeprowadzenie dodatkowych procedur usuwania detergentu lub wymiany buforu.

Podsumowując, ten schemat alokacji hemisferycznej umożliwia jednoczesne przeprowadzenie analiz morfologicznych i molekularnych z jednego zwierzęcia, ograniczając tym samym liczbę wykorzystywanych osobników oraz zmienność międzyosobniczą. Procedura ta będzie użyteczna w badaniach wymagających sparowanych analiz histologicznych i molekularnych, szczególnie w przypadku ograniczonej dostępności tkanki. Możliwość długoterminowego przechowywania skrawków może również ułatwić analizy retrospektywne i ustandaryzowane archiwizowanie próbek, natomiast wykorzystanie małych próbek z konkretnych obszarów mózgu wspiera badania specyficzne dla danych regionów. Głównymi ograniczeniami metody są niższe wydajności RNA i białek, potencjalna asymetria hemisferyczna, ograniczenie do tkanki mózgu myszy oraz ograniczona kompatybilność z zastosowaniami wrażliwymi na SDS. Przyszłe badania powinny zoptymalizować odzyskiwanie biomolekuł, zwalidować schemat w innych tkankach i gatunkach oraz ocenić długoterminową stabilność dodatkowych celów molekularnych.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych znanych konkurencyjnych interesów finansowych ani relacji osobistych, które mogłyby wpłynąć na pracę opisaną w niniejszej publikacji.

Podziękowania

This work was supported by grants from the Education Department of Liaoning Province (General Research Project JYTMS20230571) and Dalian Medical University’s 2023 “Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Health and Wellness” initiative (H0.2XY2023KY10), both awarded to Prof. CQ Liu; and by the 2025 Liaoning Province Undergraduate Innovation & Entrepreneurship Training Program(S202510161061) and Dalian Medical University’s Undergraduate Innovative Talent Training and Teaching Reform Fund (112307010209), both awarded to YK Li.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki do mikrocentryfugi 1,5 mL wolne od RNazy	Axygen	MCT-150-C-S	Zbieranie wycinków tkankowych oraz frakcji ekstrakcji RNA/białek.
Stożkowe probówki do centryfugi 15 mL	Biofil	CFT010150	Fiksacja, odwodnienie sacharozą i przechowywanie roztworów.
Płytki do hodowli komórkowej z 24 dołkami	NEST	702001	Zbieranie, barwienie i długoterminowe przechowywanie wolno pływających przekrojów mózgu.
30% roztwór sacharozy	Przygotowano w laboratorium	N/A	Krioprotekcja utrwalonych półkul mózgu przed kriosekcjonowaniem.
4% roztwór paraformaldehydu	Biosharp	BL539A	Fiksacja przez imersję półkuli mózgu przeznaczonej do badań morfologicznych.
5× bufor do ładowania białek	Beyotime Biotechnology	DL101	Przygotowanie próbek białek do SDS-PAGE.
Agaroza	Solarbio	Cat: A8201	Ocena integralności RNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
Przeciwciało przeciwko doublecortynie	Abcam	ab18723	Przeciwciało pierwszorzędowe do immunohistochemii doublecortyny.
Przeciwciało przeciwko ERK	Beyotime	AB2014	Przeciwciało pierwszorzędowe do Western blottingu całkowitego ERK.
Przeciwciało przeciwko GFAP	Abcam	ab10062	Przeciwciało pierwszorzędowe do immunofluorescencji glialnego białka kwaśnego (GFAP).
Przeciwciało przeciwko Iba1	Wako	NCNP24	Przeciwciało pierwszorzędowe do immunofluorescencji cząsteczki adaptacyjnej wiążącej jony wapnia 1 (Iba1).
Przeciwciało przeciwko NeuN	Millipore	A60	Przeciwciało pierwszorzędowe do barwienia neuronalnego antygenu jądrowego.
Przeciwciało przeciwko NF-κB p65	HUABIO	ET1603-12	Przeciwciało pierwszorzędowe do Western blottingu NF-κB p65.
Przeciwciało przeciwko fosfo-ERK	Beyotime	ET1610-13	Przeciwciało pierwszorzędowe do Western blottingu fosforylowanego ERK.
Przeciwciało przeciwko PSD95	HUABIO	ET1602-20	Przeciwciało pierwszorzędowe do Western blottingu PSD95.
Przeciwciało przeciwko ULK1	HUABIO	ET1704-63	Przeciwciało pierwszorzędowe do Western blottingu ULK1.
Przeciwciało przeciwko β-tubulinie	ABclonal	AC021	Przeciwciało pierwszorzędowe do kontroli ładowania w Western blottingu.
Medium montażowe do immunofluorescencji Antifade	Beyotime	P0126-5	Medium montażowe dla przekrojów barwionych immunofluorescencyjnie.
Zestaw detekcyjny biotyna-streptawidyna peroksydaza	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Drugorzędny system detekcji dla immunohistochemii DAB.
Siarczkowo-albuminowy albuminy wołowej (BSA)	Qiansheng Biotech Co., Ltd.	QO3000	Bufor blokujący do immunobarwienia i Western blottingu.
Myszy C57BL/6	Liaoning Changsheng Biotechology Co.,LTD	Myszy C57BL/6 w wieku 4 tygodni	Zwierzęta doświadczalne do pobierania tkanek mózgu myszy, jeśli dotyczy.
System obrazowania chemiluminescencyjnego	Clinx Science Instruments Co., Ltd.	ChemiScope 6200 Touch	Detekcja sygnałów chemiluminescencyjnych Western blot.
Konfokalny skaningowy mikroskop laserowy	Leica Microsystems CMS GmbH	SN: 591974	Akwizycja obrazów dla przekrojów immunofluorescencyjnych.
Krioprotekcyjny roztwór konserwujący	Przygotowano w laboratorium	N/A	Długoterminowe przechowywanie wolno pływających przekrojów mózgu w temperaturze −20 °C.
Kriostat	Leica	CM1950	Przygotowanie 30 μm koronarnych przekrojów mózgu.
Zestaw substratu chromogennego DAB	Sigma	SLBP7387V	Rozwój chromogeniczny dla immunohistochemii.
Roztwór do barwienia jąder DAPI	Coolaber	SL7100	Przeciwbarwienie jąder dla immunofluorescencji.
Cyfrowy mikroskop świetlny	Ningbo Yongxin Optics Co., Ltd.	Model NE910+FL-900	Monitorowanie rozwoju DAB i obrazowanie przekrojów barwionych w polu jasnym.
DNaza I	Vazyme	R223-01	Usuwanie resztkowego DNA genomicznego przed odwrotną transkrypcją.
Osioł przeciw króliczym IgG, sprzężone z 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	Fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe do immunofluorescencji.
Osioł przeciw króliczym IgG, sprzężone z 594	Abcam	ab150076	Fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe do immunofluorescencji.
Zestaw E.Z.N.A. DNA/RNA/Białko	Omega Bio-Tek	D3892-01
Zasilacz do elektroforezy	Bio-Rad	1645050	Zasilacz do elektroforezy w żelu agarozowym i SDS-PAGE.
Glikol etylenowy	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10009828	Składnik krioprotekcyjnego roztworu konserwującego.
System obrazowania żeli	Clinx Science Instruments Co., Ltd.	ChemiScope 6200 Touch	Obrazowanie żeli agarozowych do oceny jakości RNA.
Szkiełka szklane powlekane żelatyną	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING CO.,LTD	REF: 10127105P P/N: 80312-2101	Montaż wolno pływających przekrojów mózgu barwionych DAB.
Oprogramowanie do analizy obrazu	National Institutes of Health	ImageJ/Fiji	Analiza densytometryczna prążków Western blot i przetwarzanie obrazu.
Izopropanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	80109218	Wytrącanie białek z frakcji organicznej/interfazowej.
Mikrocentryfuga, chłodzona	Yancheng Kaite Laboratory Instrument Co., Ltd.	TGL16M	Wirowanie podczas ekstrakcji RNA/białek i etapów płukania.
Zestaw do szybkiej ekstrakcji białek Minute Protein Extraction Kit	Invent	MS-026
Neutralne medium montażowe balsamowe	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, Chiny	Nr katalogowy S30509, CAS 96949-21-2	Przykrywanie szkiełkami odwodnionych przekrojów barwionych DAB.
Medium do zatapiania OCT	Sakura	4583	Medium do zatapiania dla kriosekcjonowania utrwalonych półkul mózgu.
Optyczne płytki lub probówki do qPCR	Axygen	PCR-0208-C	Naczynia reakcyjne do amplifikacji qPCR.
Parafilm	amcor	PM996	Uszczelnianie płytek wielodołkowych do długoterminowego przechowywania przekrojów.
Pentobarbital sodu	Hualan Bio	57-33-0	Środek anestetyczny przed perfuzją przezsercową.
Szalki Petriego	Biosharp	BS-90-D	Obsługa mózgu na lodzie i rozdzielanie półkul.
Odczynnik do ekstrakcji RNA fenol/guanidynian	Sparklade	AC0101-B	Odczynnik porównawczy dla eksperymentów kontrolnych ekstrakcji RNA.
Koktajl inhibitorów fosfataz	APExBIO	K1015-100	Zachowanie fosforylacji podczas ekstrakcji białek.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanowo (PBS)	Biosharp	BL601A	Bufor płuczący, rozpuszczalnik dla roztworu sacharozy i rozpuszczalnik dla krioprotektantu.
Membrana z polifluorku winylidenu (PVDF)	Millipore	IPVH08100	Membrana do transferu Western blot.
Poliwinilopirydona K40	Sigma	9003-39-8	Składnik krioprotekcyjnego roztworu konserwującego.
Koktajl inhibitorów proteaz	Beyotime	P1045	Zapobieganie degradacji białek podczas lizy tkanek.
Zestaw do ekstrakcji białek	Invent	MS-026	Zestaw porównawczy dla eksperymentów kontrolnych ekstrakcji białek całkowitych.
System Real-time PCR	Amolarray	MA6000	Ilościowa amplifikacja PCR i analiza krzywych topnienia.
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	BioFroxx	3250GR500	Rozpuszczanie osadu białkowego i przygotowanie próbek do SDS-PAGE.
Sterylne ostrza do żyletek	Biosharp	BS-RB-11	Rozdzielanie półkul i przycinanie tkanek na lodzie.
Koniugat streptawidyna-peroksydaza	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Odczynnik do wzmocnienia/detekcji sygnału w immunohistochemii DAB.
Sacharoza	Hushi	57-50-1	Roztwór krioprotekcyjny i krioprotekcyjny roztwór konserwujący.
SYBR qPCR master mix	Vazyme	Q711-02	Ilościowa amplifikacja PCR.
Aparat do transferu	Bio-Rad	1703930	Transfer mokry białek z żelu SDS-PAGE na membranę.
Bufor TBS z Tween 20	Przygotowano w laboratorium	N/A	Bufor do płukania membrany Western blot.
Triton X-100	Sinopharm	9002-93-1	Permeabilizacja przekrojów mózgu do immunobarwienia.
Trizol	Sparklade	AC0101-B
Zestaw detekcyjny do immunohistochemii UltraSensitive SP (dla przeciwciał pierwszorzędowych mysich/króliczych)	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Przeciwciało drugorzędowe/odczynnik detekcyjny dla immunohistochemii DAB.
Szczur Wistar	Liaoning Changsheng Biotechology Co.,LTD	280-320 g, samiec	Zwierzęta doświadczalne do pobierania tkanek mózgu szczura, jeśli dotyczy.
Ksylen	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10023418	Przejaśnianie szkiełek barwionych DAB przed przykryciem.
Neutralne medium montażowe balsamowe	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, Chiny	Nr katalogowy S30509, CAS 96949-21-2	Przykrywanie szkiełkami odwodnionych przekrojów barwionych DAB.
Koniugat streptawidyna-peroksydaza	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Odczynnik do wzmocnienia/detekcji sygnału w immunohistochemii DAB.
Triton X-100	Sinopharm	9002-93-1	Permeabilizacja przekrojów mózgu do immunobarwienia.
Zestaw detekcyjny do immunohistochemii UltraSensitive SP (dla przeciwciał pierwszorzędowych mysich/króliczych)	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Przeciwciało drugorzędowe/odczynnik detekcyjny dla immunohistochemii DAB.
Ksylen	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10023418	Przejaśnianie szkiełek barwionych DAB przed przykryciem.

Bibliografia

Lauwereyns J, et al. Toward a common interpretation of the 3Rs principles in animal research. Lab Anim. 2024;53(12):347-50.
Hubrecht RC, Carter E. The 3Rs and humane experimental technique: implementing change. Animals (Basel). 2019;9(10):754.
Gavériaux-Ruff C, Kieffer BL. Conditional gene targeting in the mouse nervous system: Insights into brain function and diseases. Pharmacol Ther. 2007;113(3):619-34.
Basu J, Siegelbaum SA. The corticohippocampal circuit, synaptic plasticity, and memory. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;7(11):a021733.
Wu J, et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 2021;11(5):e3988.
Taves MD, et al. Steroid concentrations in plasma, whole blood and brain: Effects of saline perfusion to remove blood contamination from brain. PLoS One. 2010;5(12):e15727.
Jordan JT. The rodent hippocampus as a bilateral structure: A review of hemispheric lateralization. Hippocampus. 2020;30(3):278-92.
Mundorf A, Ocklenburg S. Looking at both sides: Integrating data from both hemispheres is crucial in rodent neuroscience. Eur J Neurosci. 2025;62(5):e70249.
Watson RE, et al. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 1986;7(1):155-9.
Hoffman GE, Le WW. Just cool it! Cryoprotectant anti-freeze in immunocytochemistry and in situ hybridization. Peptides. 2004;25(3):425-31.
Rajput SK, et al. A column-based rapid method for the simultaneous isolation of DNA, RNA, miRNA and proteins. Cell Biol Int. 2012;36(9):779-83.
Morse SMJ, Shaw G, Larner SF. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 2006;40(1):54-8.
Puchades M, Westman A, Blennow K, Davidsson P. Removal of sodium dodecyl sulfate from protein samples prior to matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 1999;13(5):344-9.
Kachuk C, Stephen K, Doucette A. Comparison of sodium dodecyl sulfate depletion techniques for proteome analysis by mass spectrometry. J Chromatogr A. 2015;1418:158-66.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Separacja p kul barwienie morfologiczne immunohistochemia immunofluorescencja alokacja tkanek krio konserwacja m zgu Western Blot analiza qPCR