Wielokolorowy protokół wizualizacji 3D-STORM o wysokiej rozdzielczości dla mineralizacji kolagenu w samoorganizowanych rekombinowanych włóknach kolagenowych typu I

Summary

Przedstawiamy tutaj protokół rozróżniający mineralizację wewnątrzwłoskową od zewnątrzfibrylarnej w rekombinowanych włóknikach kolagenowych za pomocą wielokolorowego 3D-STORM, integrując optymalizowane znakowanie, obrazowanie oraz ilościową analizę kolokalizacji.

Abstract

Protokół ten opisuje wielokolorową, trójwymiarową stochastyczną mikroskopię optyczną rekonstrukcyjną (3D-STORM) do wizualizacji mineralizacji kolagenu na skalę nanoskalową w rekombinowanym modelu samoorganizowanych włókien kolagenu typu I. Metoda umożliwia jednoczesne obrazowanie faz mineralnych kolagenu, białek niekolagenowych (np. siarczanu chondroityny) oraz fosforanu wapnia. Przygotowanie próbki obejmuje aminosilanizację i samoorganizację kolagenu, a następnie mineralizację za pomocą ośrodka fosforanu wapnia, który na wczesnym etapie (30 min) tworzy amorficzny fosforan wapnia (ACP) i dojrzewa do hydroksyapatytu (HAP) po 6 godzinach. Następnie wykonywane jest znakowanie immunofluorescencji multipleksowej, a próbki najpierw oceniane są mikroskopią konfokalną przed uzyskaniem obrazu 3D-STORM za pomocą bufora obrazowania do usuwania tlenu. Przetwarzanie i analiza danych odbywa się za pomocą publicznie dostępnego oprogramowania. W porównaniu z konwencjonalną mikroskopią elektronową lub konfokalną, protokół ten łączy specyficzność molekularną z rozdzielczością na skali nanoskalowej (typowa precyzja boczna 20–30 nm, osiowa 50–60 nm), umożliwiając trójwymiarową wizualizację wzorców mineralizacji wewnątrzfibrylarnej i pozafibrylarnej. Reprezentatywne wyniki pokazują wyraźną wizualizację sieci kolagenowych, powiązanych białek niekolagenowych oraz faz mineralnych w przestrzeni trójwymiarowej. W sekcji Wyniki przedstawiono wskaźniki ilościowe, w tym współczynnik korelacji Pearsona (0,89 ± 0,04) oraz współczynnik nakładania się Mandersa (0,91 ± 0,03). Protokół ten stanowi potężne narzędzie dla badaczy zajmujących się biomateriałami, biomineralizacją i inżynierią tkanek kostnych, którzy potrzebują nanoskalowego wglądu w dynamikę mineralizacji.

Introduction

Mineralizacja kolagenu to fundamentalny proces biologiczny, kluczowy dla powstawania twardych tkanek, takich jak kości i zęby¹. Złożona struktura włókien kolagenowych, połączona z precyzyjną regulacją osadzania minerałów, nadaje tym tkankom niezwykłą wytrzymałość mechaniczną i integralność strukturalną². Kolagen pełni nie tylko rolę biernego rusztowania, ale także aktywnego uczestnika, który organizuje precyzyjne osadzanie minerałów poprzez złożone interakcje molekularne i fizyczne³. Wyjaśnienie tych mechanizmów jest kluczowe dla zrozumienia schorzeń patologicznych, takich jak osteoporoza i próchnica zębów, oraz dla opracowania materiałów biomimetycznych do terapii regeneracyjnych⁴.

Średnica włókien kolagenowych w twardych tkankach waha się od około 50 do 100 nm, przy czym cząstki hydroksyapatytu (HAP) są jeszcze mniejsze (zazwyczaj 2–5 nm grubości i 20–30 nm długości) i wplatane w szczelinach fibrylarnych⁵. Podczas gdy strefy przerw mogą pełnić rolę miejsc nukleacji, w tkankach rodzimych minerały początkowo tworzą się w przestrzeniach międzyfibrylarnych, a następnie rozszerzają się do przedziałów wewnątrzwłączkowych. Tradycyjne metody charakteryzacji obejmują barwienie histologiczne, konfokalną laserową mikroskopię^{skaningową 6,7} oraz mikroskopię elektronową ^8,9. Barwienie histologiczne zapewnia ocenę makroskopową, ale nie pozwala ocenić stanów mineralizacji na skalę nanoskalową. Mikroskopia konfokalna umożliwia obserwację konkretnych składników, ale jest ograniczona dyfrakcyjnie (~200 nm bocznie), nie rozróżnia mineralizacji wewnątrzfibrylarnej od zewnątrzwłąkienkowej¹⁰. Mikroskopia elektronowa oferuje wysoką rozdzielczość, ale brakuje jej specyficzności molekularnej. Chociaż znakowanie immunogold może zapewnić specyficzność molekularną dla mikroskopii elektronowej, wymaga specjalistycznego przetwarzania i jest mniej sprzyjające multipleksowej, trójwymiarowej wizualizacji wielu komponentów w porównaniu do STORM, a także wiąże się z długimi cyklami eksperymentalnymi i wysokimi kosztami¹¹.

Stochastyczna mikroskopia rekonstrukcyjna optyczna (STORM) przekracza granicę dyfrakcyjną, lokalizując pojedyncze fluorofory z dużą precyzją, osiągając rozdzielczość boczną ~20 nm¹². W porównaniu z innymi technikami superrozdzielczości, takimi jak mikroskopia stymulowana emisja depleciona (STED)¹³oraz mikroskopia iluminacji strukturalnej (SIM)¹⁴, STORM oferuje wyższą precyzję lokalizacji (~20 nm bocznie i ~50 nm osiowo) i jest kompatybilny z szerszym zakresem organicznych fluoroforów. W szczególności STED wymaga specjalistycznych barwników i wysokiej mocy laserowej, które mogą uszkadzać próbki biologiczne, podczas gdy SIM oferuje jedynie rozdzielczość ~100 nm, co nie wystarcza do rozdzielenia cech w skali fibrilowej (50–100 nm). STORM zapewnia praktyczną równowagę między rozdzielczością, możliwością multipleksacji i kompatybilnością próbek. Opublikowane wytyczne opisują standaryzowane próbki testowe, aby ułatwić optymalizację parametrów obrazowania STORM oraz oceny rozdzielczości¹⁵. W połączeniu z możliwościami obrazowania trójwymiarowego, 3D-STORM umożliwia jednoczesną wizualizację wielu komponentów w skali nano. Najnowsze osiągnięcia rozszerzyły STORM na obrazowanie wielokolorowe i multipleksowane, umożliwiając wizualizację wielu celów w ramach tej samej próbki^17,18.

Protokół ten wykorzystuje biomimetyczny model in vitro oparty na samoorganizowanych rekombinowanych włóknikach kolagenowych typu I i jest wyraźnie zaprojektowany do in vitro rekombinowanych włókien typu I z zakresu samoorganizowanych włókien, aby odróżnić mineralizację wewnątrzfibrylarną od pozafibrylowej na skali nano. Nie nadaje się do obrazowania na żywych komórkach, ponieważ STORM wymaga stałych próbek i buforów do pobierania tlenu. Nie nadaje się również do rodzimych, silnie zmineralizowanych tkanek (np. dojrzałych kości) bez wcześniejszej dekalcyfikacji lub pobrania antygenów. Jeśli potrzebna jest tylko ocena ogólnej gęstości minerałów lub morfologii dużych obszarów, bardziej efektywna jest konwencjonalna mikroskopia konfokalna lub elektronowa.

Głównym celem tego protokołu jest zapewnienie ustandaryzowanego, stopniowego przepływu pracy do wykorzystania wielokolorowego 3D-STORM do wizualizacji nanoskalowego rozkładu minerałów i białek niekolagenowych w obrębie poszczególnych włókien kolagenowych, ze szczególnym naciskiem na rozróżnienie mineralizacji wewnątrzfibrylarnej od pozafibrylarnej. Protokół ten integruje zoptymalizowane znakowanie immunologiczne z dostosowanym buforem obrazowania, umożliwiającym jednoczesne śledzenie wielu składników organicznych (kolagen, białka niekolagenowe) oraz faz nieorganicznych (ACP, HAP) w trzech wymiarach¹⁹. Kluczową innowacją jest ilościowa ocena wzorców mineralizacji wewnątrzfibrylarnej i pozafibrylarnej. Ilościfikację osiąga się za pomocą dwóch niezależnych kryteriów: (1) obliczania współczynnika kolokalizacji Pearsona pomiędzy kanałami mineralnym (barwnik wapniowy (np. kalceina)) a kolagenem (barwnik fluorescencyjny o barwniku dalekoczerwonym) za pomocą modułu kolokalizacji w oprogramowaniu do analizy obrazów (współczynnik >0,8 wskazuje na silne powiązanie); (2) analizuje trwałość sygnału mineralnego w całych przekrojach Z poszczególnych włókien: jeśli sygnał mineralny występuje w środkowych przecinkach (Z = 0 do ±120 nm od pionowego środka włókna) o intensywności ≥50% maksymalnej, klasyfikuje się go jako śródfibrylarny. W przeciwieństwie do konwencjonalnej mikroskopii elektronowej lub konfokalnej, ten protokół łączy specyficzność molekularną z rozdzielczością na skalę nano, umożliwiając trójwymiarowy przestrzenny rozkład mineralizacji wewnątrzfibrylarnej.

Protokół ten jest przeznaczony dla badaczy zajmujących się biomateriałami, biomineralizacją i inżynierią tkanek kostnych, wymagając wglądu w dynamikę mineralizacji na poziomie nano. Standaryzowana procedura może być również dostosowana do badania innych zmineralizowanych systemów kolagenowych, takich jak odminalizowane plastry zębiny czy hydrożele na bazie kolagenu, poprzez odpowiednie dostosowanie początkowych kroków przygotowania próbki.

Protocol

Wszystkie eksperymenty z udziałem próbek biologicznych były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi i przepisami Podstawowych Obiektów Uniwersytetu Zhejiang School of Medicine i zatwierdzone przez Komitet ds. Bezpieczeństwa Instytucjonalnego (Certyfikat Zatwierdzenia nr BSL20235710079). Opisany tutaj protokół eksperymentalny wykorzystuje komercyjnie pozyskiwane odczynniki oraz systemy biomimetyczne in vitro. Nie obejmuje uczestników ludzkich, uczestników zwierzęcych ani próbek tkanek, dlatego nie wymaga etycznego zatwierdzenia przez instytucjonalną komisję rewizyjną.

UWAGA: Wszystkie procedury z użyciem niebezpiecznych substancji chemicznych muszą być wykonywane w okapie wyparowczym z odpowiednim sprzętem ochronnym (fartuch laboratoryjny, rękawiczki, gogle ochronne). Utylizacja odpadów chemicznych zgodnie z przepisami instytucjonalnymi. W przypadku NaN₃ zbieraj odpady w dedykowanym pojemniku oznaczonym jako "odpady azydowe" i nie mieszaj z kwasami (ryzyko powstania gazów wybuchowych). W przypadku glutaraldehydu inaktywuj z nadmiarem dwusiarczku sodu przed utylizacją. W przypadku β-merkaptoetanolu utleniaj wybielaczem (1:10 v/v) przez 1 godzinę przed utylizacją do odpływu.

UWAGA: Znakowanie immunofluorescencji MUSI być wykonane PRZED mineralizacją, aby uniknąć maskowania epitopów przez złoża mineralne. W zastosowaniach wymagających oznakowania po mineralizacji może być konieczne pobranie antygenów.

1. Przygotowanie ośrodka mineralizacyjnego

1. Przygotowanie pożywki mineralizacyjnej dla zrekonstytuowanych włókien kolagenowych
   1. Przygotuj roztwór wapnia, dodając kroplą 100 μL kwasu poliaspartynowego (p-Asp, Mw 9-11 kDa) do 5 mL roztworu 3,44 mM CaCl₂ w stożkowej probówce o pojemności 15 mL.
   2. Mieszanie wirów w tubie przez 30 sekund, aż uzyska jednorodność.
   3. Dodawaj p-Asp powoli i dokładnie wymieszaj, aby ustabilizować amorficzny fosforan wapnia (ACP).
   4. Dodaj 5 mL roztworu fosforanów (19 mM Na₂HPO₄ + 300 mM NaCl) do roztworu wapnia.
   5. Mieszanka wirów przez 1 minutę.
      UWAGA: Końcowe stężenia po mieszaniu: 1,67 mM CaCl₂, 9,5 mM Na₂HPO₄, 150 mM NaCl oraz 50 μg/mL p-Asp.
   6. Przygotuj medium mineralizacyjne tuż przed użyciem. Nie przechowuj; natychmiast użyj niestabilnego prekursora ACP, aby osiągnąć spójne rezultaty.
      UWAGA: Przechowywanie prowadzi do przedwczesnej krystalizacji.
2. Przygotowanie ośrodka mineralizacyjnego dla żeli kolagenowych/demineralizowanej dentyny
   1. Przygotuj roztwór zawierający wapń, rozpuszczając 8,77 g NaCl, 0,01 g NaN₃, 6,06 g Tris oraz 1,11 g CaCl₂ w wodzie dejonizowanej o pojemności 800 mL.
   2. Zwiększ objętość do 1 L z wodą dejonizowaną.
   3. Dodaj 350 μg/mL kwasu poliakrylowego (PAA, Mw ~1800) do roztworu zawierającego wapń.
   4. Wiruj przez 1 minutę.
      UWAGA: Stosuj PAA zamiast p-Asp dla lepszej stabilizacji przy wyższych stężeniach wapnia.
   5. Przygotuj roztwór fosforanu, rozpuszczając 0,85 g Na₂HPO₄ w wodzie dejonizowanej o pojemności 1 L, aby uzyskać 6 mM Na₂HPO₄.
   6. Roztwór fosforanu sterylizuj filtrem za pomocą membrany o średnicy 0,22 μm.
   7. Połącz równe objętości (np. 500 mL każdy) roztworów wapnia i fosforanów z magnetycznym mieszaniem przy 300 obr./min.
   8. Reguluj pH do 7,4 używając 1 M HCl lub NaOH podczas monitorowania pH miernikiem.
      UWAGA: Utrzymuj pH na poziomie 7,4 ± 0,1. Nie pozwalaj na odchylenia pH >0,2, które powodują przedwczesną krystalizację.

2. Przygotowanie rekombinowanych włókien kolagenowych

1. Aminosilanizacja naczyń ze szklanym dnem
   UWAGA: To leczenie wykorzystuje (3-aminopropyl) trietoksisilan (APTES) do wprowadzania dodatnio naładowanych aminogrup (-NH₂) na powierzchnię szkła, co sprzyja elektrostatycznej adsorpcji i stabilizacji ujemnie naładowanych monomerów kolagenu.
   1. Dodaj 200 μL roztworu APTES (5% v/v w etanolu absolutnym) do każdej szklanej misy hodowlowej (35 mm, grubość #1,5H, 0,17 mm ± 0,005 mm).
   2. Upewnij się, że powierzchnia naczynia jest całkowicie pokryta roztworem APTES.
   3. Inkubować w ciemności przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (20–25 °C).
   4. Płucz naczynia trzy razy etanolem absolutnym (2 mL na mycie).
   5. Ultrasonikat w wodzie dejonizowanej przez 10 minut przy 40 kHz. Całkowicie usuń resztkowe APTES, aby zapobiec wiązaniu niespecyficznym.
   6. Naczynia silanizowane można przechowywać na sucho w temperaturze 4 °C do tygodnia.
   7. (Opcjonalnie) Piecz dla większej stabilności: Umij umyte i osuszone naczynia w piekarniku w temperaturze 100–120 °C na 30–60 minut.
   8. Pozwól ostygnąć do temperatury pokojowej przed dalszym działaniem.
      UWAGA: Jeśli używasz plastikowych naczyń, obniż temperaturę poniżej 80 °C, aby zapobiec odkształceniom. Zaadaptuj procedurę silanizacji z Bitter i Muir²⁰.
2. Samoorganizacja kolagenu i sieciowanie
   1. Pipetą nałóż 100 μL roztworu kolagenu-I (50 μg/mL w 0,1 M kwasu octowego) na każdą silanizowaną miskę.
   2. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 10 godzin w komorze wilgotności (> 90% wilgotności względnej). Utrzymuj stabilną wilgotność, aby zapobiec parowaniu roztworu.
   3. Weryfikacja powstawania włókien za pomocą mikroskopii fazowej lub konfokalnej; Udane przygotowanie pokazuje drobną, pajęczynowatą sieć włóknistą.
   4. Aby zweryfikować prawidłowe powstawanie fibrilu na poziomie ultrastrukturalnym, przygotuj osobną próbkę na poliwinylowej siatce TEM pokrytej węglem, zgodnie z tymi samymi warunkami samoorganizacji (kolagen-I 50 μg/mL, 37 °C, 10 h, wilgotność > 90%).
   5. Bejcuj kwasem fosforungstycznym o 1% (pH 7,0) przez 10 minut.
   6. Umyj wodą dejonizowaną.
   7. Zbadaj pod mikroskopem transmisyjnym elektronowym. Udana fibrylogeneza jest wskazana przez charakterystyczny wzorzec okresowego pasmowania D o długości 67 nm (patrz Rysunek 3).
   8. Ostrożnie zasysaj resztki roztworu kolagenu z naczyń na szklanym dnie.
   9. Do każdego naczynia dodaj 2 mL roztworu siarczanu chondroityny (CS) (50 mg/mL w PBS, pH 5,5).
   10. Inkubuj w temperaturze 4 °C przez 12 godzin, aby umożliwić elektrostatyczną adsorpcję CS na włókna kolagenowe.
   11. Przygotuj roztwór sieci EDC/NHS²¹: rozpuścić 0,2 M EDC (karbodimid 1-etylo-3-(3-dimetylaminopropylowy) oraz 0,05 M NHS (N-hydroksuksukcynimid) w buforze MES (0,1 M MES, pH 5,5).
       UWAGA: Bufor MES można przygotować poprzez rozpuszczenie wolnego kwasu MES w wodzie dejonizowanej i dostosowanie pH do 5,5 za pomocą NaOH.
   12. Usuń roztwór CS i dodaj 2 mL roztworu sieci EDC/NHS.
   13. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, aby kowalencyjnie unieruchomić CS na kolagenie.
   14. Myj naczynia trzy razy PBS (5 mL każda, 5 min każda), aby usunąć niezareagowane odczynniki.
   15. Przechowuj przetworzone włókna kolagenowe w PBS w temperaturze 4 °C do 24 godzin przed mineralizacją.

3. Znakowanie immunofluorescencyjne (wykonywane PRZED mineralizacją)

1. Przygotowanie próbki
   1. Opłucz włókna kolagenowe trzy razy 500 mM roztworu NaCl (10 mL na pranie, 5 minut każda).
   2. Przemyj trzy razy wodą dejonizowaną (10 mL na pranie, 5 minut każda).
   3. Wykonuj mycia na poziomej platformie wstrząsającej obracającej się z prędkością 50 obr./min, aby zapewnić dokładne mycie i minimalizować siły ścinające, które mogłyby oderwać złożone włókna.
2. Blokowanie i pierwotna inkubacja przeciwciał
   1. Inkubuj z buforem blokującym (5% surowicowej albuminy w PBS) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w komorze nawilżonej.
   2. Przygotuj koktajl przeciwciał w buforze blokującym: króliczy antykolagen-I (rozcieńczenie 1:100) oraz myszy antychondroitynowy siarczan (rozcieńczenie 1:100).
   3. Dodaj 200 μL koktajlu przeciwciał na próbkę.
   4. Okryj próbki laboratoryjną folią uszczelniającą.
   5. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc (12–16 godzin).
   6. Chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej. Po inkubacji przeciwciał pierwotnych próbki można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 godziny.
3. Wtórne barwienie przeciwciał
   1. Usuwaj niezwiązane przeciwciała pierwotne, myjąc naczynia trzy razy z buforem do mycia (0,1% Tween-20 w PBS), po 10 minut za każdym myciem.
   2. Przygotuj mieszankę przeciwciał fluorescencyjnego wtórnego w buforze blokującym (200 μL na pojemnik 35 mm) zawierającym: koziczy antykróliczy IgG sprzężony z dalekoczerwonym fluorescencyjnym barwnikiem (1:100) oraz kozi antymysi IgM sprzężony z czerwonym fluorescencyjnym barwnikiem (1:100).
      UWAGA: Od tego etapu chroń próbki przed światłem, aby zapobiec fotobieleniu fluoroforu.
   3. Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej (20–25 °C) przez 1 godzinę w ciemności.
   4. Myj naczynia trzy razy z buforem do mycia (po 10 minut każdy), aby usunąć niezwiązane przeciwciała wtórne.
      UWAGA: Przechowuj oznaczone próbki w PBS w temperaturze 4 °C (chronione przed światłem) do 48 godzin przed wykonaniem obrazowania. Uwzględnij kontrolę bez przeciwciał pierwotnych do kontroli autofluorescencji.

4. Mineralizacja włókien kolagenowych (wykonywana PO oznakowaniu)

1. Proces mineralizacji
   1. Dodaj 2 mL świeżo przygotowanego medium mineralizacyjnego na każde danie.
   2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut (krótkoterminowo) w celu wczesnego etapu powstawania minerałów (ACP).
   3. Alternatywnie, inkubować w 37 °C przez 6 godzin (długoterminowo) w celu krystalizacji dojrzałych minerałów (HAP).
      UWAGA: Utrzymuj dokładną temperaturę na poziomie 37 °C ± 0,5 °C za pomocą skalibrowanego inkubatora.
   4. Delikatnie zasysaj podłoże mineralizacyjne.
   5. Płukaj trzy razy wodą dejonizowaną (5 mL na pranie, co 1 minutę).
2. Oznaczanie fosforanu wapnia
   1. Dodaj 4 μM barwnika wapnia (np. kalceinę) w PBS (200 μL na miskę).
   2. Inkubować w temperaturze pokojowej (20–25 °C) przez 30 minut w ciemności.
      UWAGA: Barwnik wapniowy wskaźnikowy (np. kalceina) wiąże się z jonami wapnia i nie rozróżnia faz amorficznych od krystalicznych; Przypisanie fazy opiera się na czasie mineralizacji (30 min = ACP, 6 h = HAP). Powinna być chroniona przed światłem za pomocą bursztynowych rurek lub folii foliowej.
   3. Płukaj pięć razy: trzy mycia wodą dejonizowaną i dwa razy 70% etanolem (po 1 minutę każda), na przemian oba.
3. Przygotowanie próbki do obrazowania
   1. Zanurz próbki w buforze obrazowania: 10% (w/v) glicerolu w PBS. Opcjonalnie dodaj odczynnik przeciwzanikający zgodnie z instrukcjami producenta.
   2. Nałóż odpowiednią objętość (20–50 μL) bufora obrazującego, aby pokryć próbkę.
   3. Nałóż na próbkę slip na próbkę.
   4. Przechowuj próbki w temperaturze 4 °C w ciemności do 72 godzin.

5. Obserwacja pod mikroskopem laserowym konfokalnym

1. Transfer próbek z magazynowania 4 °C do temperatury pokojowej (20–25 °C).
2. Daj 10 minut równowagi, aby zapobiec kondensacji.
3. Dbaj o ochronę przed światłem za pomocą bursztynowych pojemników lub folii foliowej.
4. Sprawdź, czy bufor obrazowania obejmuje całą próbkę.
5. Skonfiguruj mikroskop konfokalny z następującymi ustawieniami:
   1. Do obrazowania kolagenowego (barwnik fluorescencyjny o czerwieni dalekosni): laser 647 nm, filtr emisyjny 650-710 nm.
   2. Do obrazowania fosforanu wapnia (barwnik wapniowy (np. kalceina)): laser 488 nm, filtr emisyjny 500-550 nm.
   3. Cel: 100× zanurzenia oleju (NA 1.4).
   4. Średnica otworu: 1 jednostka Airy (AU).
   5. Czas zatrzymania piksela: 1-2 μs.
      UWAGA: Wykonaj wyrównanie laserowe i kalibrację otworków przed obrazowaniem.
6. Wykonaj skanowanie sekwencyjne: pierwsze skanowanie z wzbudzeniem 647 nm (kolagenem).
7. Wykonaj drugie skanowanie przy wzbudzeniu 488 nm (minerał).
   UWAGA: Zbieraj kanały sekwencyjnie, aby uniknąć przepuszczania kanałów.
8. Do rekonstrukcji 3D ustaw rozmiar kroku stosu Z na 0,5 μm lub mniejszy, aby zapewnić odpowiednie próbkowanie.
9. Zapisz pliki z zachowanymi metadanymi.
10. Do analizy kolokalizacji używaj oprogramowania do analizy obrazów zdolnego do obliczania współczynnika korelacji Pearsona (np. publicznie dostępne oprogramowanie z odpowiednimi wtyczkami).

6. Obrazowanie za pomocą trójwymiarowej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (3D-STORM)

1. Przygotowanie bufora obrazowania^{STORM 22}
   UWAGA: Do buforu obrazującego dodaje się oksydazę glukozy i katalazę, aby pozyskiwać tlen, co zmniejsza fotobielenie i wydłuża mruganie fluoroforów, co jest niezbędne do lokalizacji pojedynczych cząsteczek w STORM.
   1. Przygotuj roztwór buljowy oksydazy glukozy (GOx) w stężeniu 8 mg/mL w buforze octanowym sodu 50 mM (pH 5,1).
   2. Przygotuj roztwór wywaru katalazy o stężeniu 160 μg/mL w 1× PBS.
      UWAGA: Uzupełnij zapasy enzymów, szybko je zamroz za pomocą ciekłego azotu lub kąpieli w suchym lodzie/etanolu i przechowuj w temperaturze -20 °C lub -80 °C. Unikaj powtarzających się cykli zamarzania i rozmrażania.
   3. Przygotuj świeży bufor obrazowy STORM na lodzie, chroniony przed światłem.
   4. Połącz następujące składniki w kolejności wymienionej do końcowej objętości 1 mL: beznukleazowy bezpłodowy H₂O (do 1 mL), 1 M NaCl (10 μL, 10 mM końcowy), 1 M Tris-HCl pH 8,0 (50 μL, 50 mM final), świeżo przygotowana 1 M cysteaminy (MEA) skorygowanej do pH ~7,0 (50 μL), 50 mM końcowa), 50% (w/v) glukozy (200 μL, 10% w/v final), GOx stock (200 μL, 1,6 mg/mL final), katalaza (200 μL, 32 μg/mL final).
   5. Mieszaj delikatnie, pipetując lub odwracając się. Nie wiruj.
      UWAGA: Bufor musi być przygotowany świeżo i przechowywany na lodzie chronionym przed światłem. Użyj w ciągu 30 minut od przygotowania. Aby szczegółowo optymalizować warunki obrazowania STORM, zapoznaj się z ustalone protokoły z wykorzystaniem próbek^{testowych 15}.
   6. Dodaj 200 μL świeżo przygotowanego bufora obrazowania STORM, aby w pełni pokryć próbkę.
2. Konfiguracja systemu 3D-STORM
   1. Upewnij się, że ścieżka obrazowania jest kierowana do kamery CCD (EMCCD) mnożącej elektrony.
   2. Włącz cylindryczny moduł obiektywu do obrazowania 3D.
   3. Ustaw oprogramowanie w trybie akwizycji 3D STORM.
   4. Konfiguruj filtry optyczne ścieżki dla użytych barwników.
   5. Włącz laser 647 nm i ustaw moc na niski poziom (1-5 mW).
   6. Korzystając z obiektywu immersyjnego 100× oleju (NA ≥1.4), można zlokalizować interesujący obszar w trybie widefield lub TIRF na żywo.
   7. Wykonaj konwencjonalny szerokokątny obraz fluorescencyjny do późniejszego porównania.
   8. Przełącz na tryb oświetlenia TIRF.
   9. Skalibruj kąt TIRF, aby uzyskać cienkie pole oświetlenia (~100-200 nm) i zminimalizować fluorescencję tła.
   10. Dostosuj czas naświetlania aparatu (10-30 ms) w zależności od początkowej intensywności sygnału.
   11. Dostosuj moc lasera obrazującego w zależności od początkowej intensywności sygnału.
   12. Wykonaj krótkie testowe pozyskanie.
   13. Sprawdź, czy parametry są poprawnie ustawione, nie powodując szybkiego wybielania fotobielenia.
       UWAGA: Upewnij się, że oś cylindryczna soczewki jest precyzyjnie wyrównana z płaszczyzną próbki. Większość nowoczesnych systemów posiada automatyczną kalibrację. Do ręcznej kalibracji użyj fluorescencyjnych kulek 100 nm, aby zweryfikować symetryczne funkcje rozproszenia punktowego (PSF).
   14. Rozpocznij od ekspozycji 10–30 ms przy mocy lasera 647 nm wynoszącej 1–2 kW/^cm2.
   15. Sprawdź, czy gęstość mrugania wynosi 0,1–1 cząsteczka/μm².
   16. Jeśli gęstość jest zbyt niska lub zbyt wysoka, dostosuj moc lasera lub czas naświetlania odpowiednio.
   17. Powtarzaj weryfikację i korektę, aż osiągniesz idealną gęstość.
3. Akwizycja danych 3D-STORM
   1. Ustaw oprogramowanie do pozyskiwania w tryb "Ciągła aktywacja".
   2. Ustaw laser obrazujący (647 nm) na wysoką moc (100-500 mW światłowodu), aby przeprowadzić większość fluoroforów do stanu ciemnego.
   3. Ustaw laser aktywacyjny (405 nm) na niską moc (0,1–5 mW).
   4. Optymalizuj moc 405 nm empirycznie, aby utrzymać 100–200 zlokalizowanych cząsteczek na klatkę w obszarze 256×256 pikseli.
   5. Ustaw łączną liczbę klatek na 10 000–20 000.
   6. Użyj 1 klatki światła aktywacyjnego (405 nm), a następnie 5 klatek światła obrazującego (647 nm) na cykl.
   7. Rozpocznij pozyskiwanie.
   8. Praca EMCCD z maksymalną czułością (przyłożone wzmocnienie EM)
   9. Używaj ekspozycji 10–30 ms na klatkę.
   10. Podczas pozyskiwania monitoruj aktywną gęstość cząsteczek.
   11. Dostosuj moc lasera 405 nm, aby utrzymać stały strumień zdarzeń pojedynczych cząsteczek.
       UWAGA: Surowe dane filmowe mogą być przechowywane na standardowym dysku twardym do długoterminowej archiwizacji przed rekonstrukcją.
4. Analiza danych mineralizacji kolagenu (za pomocą oprogramowania do analizy obrazów z modułem STORM)
   1. W oprogramowaniu analitycznym wybierz odpowiedni sterownik kamery (moduł STORM).
   2. Kliknij [Analityka GUI] w panelu STORM. Okno analizy się otwiera.
   3. Kliknij [File Open]. Wybierz surowy plik obrazu mikroskopii do analizy. Kliknij Otwórz.
   4. Określ minimalną wartość fluorescencji (minimalną wysokość) dla prawidłowych sygnałów.
   5. Znajdź najciemniejszy punkt, który wciąż można rozpoznać jako sygnał pojedynczącej cząsteczki.
   6. Przesuń myszkę na jej środek.
   7. Przeczytaj wartość Peak Height.
   8. Zanotuj tę wartość.
   9. Kliknij [Ustawienia identyfikacji]. W dialogu ustaw następujące parametry: Minimalna wysokość (wprowadź wartość zapisaną w kroku 6.4.8), Maksymalna wysokość (20000), Bazowa Wartość CCD (100), a dla danych 3D-STORM sprawdź "3D" (odznacz dla 2D).
   10. Kliknij >> , aby rozwinąć więcej parametrów. Ustawy: Minimalna szerokość (nm) do 200, maksymalna szerokość (nm) do 700 (400 dla 2D), początkowa szerokość dopasowania (nm) do 300, maksymalny współczynnik osiowy do 2,5 (1,3 dla 2D) oraz maksymalne przemieszczenie (piksele) do 1.
   11. Kliknij OK, aby zamknąć dialog dialogowy.
   12. Przeprowadz analizę testową, aby zweryfikować parametry. Odznacz Korekcję dryfu.
   13. Ustaw okres na 1.
   14. Kliknij [Test].
   15. Po analizie kliknij OK w okienku wyskakującym oknem.
   16. Sprawdź, czy sygnały są poprawnie zidentyfikowane. Nie należy źle wybierać szumu tła. Prawdziwych miejsc nie można przegapić.
   17. Jeśli nie jest zadowalający, powtórz kroki 6.4.9–6.4.16, aby dostosować parametry aż do poprawności.
   18. Po przejściu analizy testowej przeprowadź pełną analizę. Sprawdź korekcję dryfu.
       UWAGA: Oprogramowanie analityczne wykonuje korekcję dryfu za pomocą redundantnego algorytmu korelacji krzyżowej (RCC), który maksymalizuje korelacje między segmentami czasowymi lokalizacji molekularnych. Nie są wymagane koraliki fiducial²³.
   19. Zachowaj okres = 1.
   20. Kliknij [Start] (lub ponownie [ Test], a potem [Start]).
   21. Poczekaj na zakończenie analizy. Kliknij OK w okienku wyskakującym.
   22. Po analizie w tym samym folderze co plik the.nd2 są generowane dwa pliki wyników (.bin i .txt.
   23. Do analizy kolokalizacji (kanały 647 nm i 488 nm) wyświetlaj oba kanały jednocześnie w liście kanałów okna analizy.
   24. Wybierz odpowiedni obszar zainteresowania (ROI).
   25. Użyj modułu kolokalizacji do obliczenia współczynnika korelacji Pearsona. Jeśli nie są udostępnione automatycznie, ręcznie eksportuj dane chmury punktów do wtyczki kolokalizacji w publicznie dostępnym oprogramowaniu do analizy obrazów. Zanotuj wartość.
   26. Wykonaj analizę Z-slice, aby potwierdzić mineralizację wewnątrzfibrylarną. W menu głównym wybierz View > Z-stepowanie > Slice.
   27. Wyodrębniaj poszczególne płaszczyzny w odstępach co 60 nm.
   28. Obserwuj sygnał mineralny (zielony, kanał 488 nm). Sprawdź, czy sygnał utrzymuje się w centralnych przekrojach (Z = 0 nm ±120 nm). Trwałość potwierdza mineralizację wewnątrzfibrylarną.
   29. Opcjonalnie: przeprowadzić filtrowanie gęstości, aby zmniejszyć nadmierne liczenie przez gęsto upakowane emitery. Otwórz rekonstruowany obraz STORM w publicznie dostępnym oprogramowaniu do analizy obrazów za pomocą wtyczki do analizy lokalizacji pojedynczych cząsteczek²⁴.
   30. Aby ograniczyć nadmierne liczenie przez gęsto upakowane emitery, zastosuj filtrowanie gęstości (np. filtr medianowy lub lokalny próg gęstości) na podstawie gęstości sygnału.
   31. Jeśli korekta dryfu nie została włączona w kroku 6.4.18 lub potrzebna jest dodatkowa korekta, wykonaj korektę dryfu. Poprawne na podstawie PSF markerów fiducialnych. Alternatywnie, można użyć algorytmów korelacji krzyżowej (np. korekcja dryfu zaimplementowana w tej samej wtyczce).
   32. Wykonaj rozmieszanie spektralne, aby wyeliminować przesłuch kanałów. W oknie analizy STORM kliknij narzędzie do usuwania przesłuchów (zwykle w prawym dolnym rogu).
   33. Ustaw promień na 25,0 nm (zalecane). Wybierz kanał źródłowy. Wybierz metodę usunięcia: zalecane jest stosowanie statystyczne.
   34. Aby usunąć aktywację krzyżową spowodowaną laserem wzbudzania, wybierz opcję Odejmuj oprócz NSA > Aktywacji krzyżowej. Kliknij OK. Nowy kanał, Nonspecific Activation-Xt, jest generowany automatycznie.
   35. Zweryfikować poziomy autofluorescencji i sygnały tła, używając niebarwionych próbek kontrolnych. Upewnij się, że wszystkie sygnały są wyraźnie oznaczone.
   36. Wykonaj wizualizację 3D. Wybierz obszar zainteresowania (ROI) w oknie analizy.
   37. Kliknij przycisk [3D] (lub [Show 3D]). Wygeneruj projekcję 3D lub renderowanie objętości.
   38. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby dostosować parametry renderowania. Eksportuj filmy w popularnych formatach (np. .avi lub .mp4).
   39. Aby sklasyfikować sygnał mineralny jako śródfibrylarny, należy przeprowadzić analizę Z-slice zgodnie z 6.4.26–6.4.28. Eksportuj profile intensywności.
   40. Zdefiniuj centrum włóknistości jako płaszczyznę Z, gdzie sygnał kolagenowy jest maksymalny.
   41. Sygnał mineralny uważa się za wewnątrzfibrylarny, jeśli jego intensywność przy Z = 0 (centrum) i Z = ±60 nm wynosi ≥50% maksymalnej intensywności minerałów w tym włóknie. Jeśli sygnał spadnie poniżej 30% przy Z = 0, klasyfikujemy jako pozfibrylarny.
   42. Zanotuj klasyfikację co najmniej 50 fibryl na każde schorzenie, aby obliczyć procent mineralizacji wewnątrzfibrylarnej.
       UWAGA: Dostępne są także alternatywne publicznie dostępne wtyczki do filtrowania gęstości, korekcji dryfu oraz rozmieszania widmowego.

Results

Pomyślna implementacja tego protokołu pozwala na wysokorozdzielczą, trójwymiarową wizualizację zmineralizowanych włókien kolagenowych za pomocą wielokolorowego 3D-STORM. Poniższe wyniki ilustrują typowe wyniki, kontrole jakości oraz oceny ilościowe.

Rysunek 1 przedstawia wielokolorową rekonstrukcję 3D-STORM sieci kolagenowej zmineralizowanej amorficznym fosforanem wapnia (ACP). Kolagen (oznaczony barwnikiem fluorescencyjnym o jasnoczerwonym kolorze) objawia się jako dobrze zdefiniowana sieć fibrylarna. Siarczan chondroityny (GAG, oznaczony czerwonym barwnikiem) jest ściśle związany z włóknami kolagenowymi, a obszary kolokalizacji na połączonym obrazie wyglądają na cyjan. Co ważne, cząstki ACP (zielone, oznaczone barwnikiem wapniowym wskaźnikowym) są obserwowane w granicach włókien kolagenowych, co wykazuje mineralizację wewnątrzwłóknistą na wczesnym etapie (30 min). Ten wykres podkreśla zdolność protokołu do jednoczesnego rozdzielania trzech odrębnych składników (kolagen, GAG, minerał) na skali nano, co nie jest możliwe do osiągnięcia konwencjonalną mikroskopią konfokalną (patrz rysunek 5 dla porównania rozdzielczości obrazowania). Kolokalizacja ACP na skali nanoskalowej w włóknikach potwierdza, że amorficzny prekursor może przeniknąć wnętrze włóknistości przed transformacją krystaliczną.

Rysunek 2 dostarcza ilościowych dowodów na penetrację wewnątrzfibrylarną dojrzałego hydroksyapatytu (HAP) po 6 godzinach mineralizacji. Rysunek 2A przedstawia dwuwymiarowe obrazy STORM pokazujące rozległą kolokalizację kolagenu (czerwony) i HAP (zielony), z połączonymi kanałami wyglądającymi na żółte. Rysunek 2B to trójwymiarowa rekonstrukcja objętościowa ilustrująca zintegrowaną architekturę. Rysunek 2C przedstawia analizę przekrojów osi Z w odstępach co 60 nm od góry (Z = −120 nm) do środka (Z = 0) oraz do głębszych sekcji (Z = +120 nm). Sygnał HAP utrzymuje się w centralnych przecinkach (Z = 0 do ±120 nm) z natężeniem ≥50% maksymalnej, co spełnia kryteria klasyfikacji mineralizacji wewnątrzfibrylarnej określone w krokach protokołu 6.4.39–6.4.41. Ilościowa analiza kolokalizacji na podstawie trzech niezależnych eksperymentów (n = 3 replikaty, każdy z 5 obszarami zainteresowania) dała współczynnik korelacji Pearsona na poziomie 0,89 ± 0,04 oraz współczynnik nakładania się Mandersa 0,91 ± 0,03 (średnia ± SD). Wartości te wskazują na silne i specyficzne powiązanie kolagenu z HAP w obrębie włókien, potwierdzając, że dojrzała faza krystaliczna również znajduje się wewnątrzfibrylarnie.

Rysunek 3 potwierdza integralność strukturalną samoorganizowanego rusztowania kolagenowego za pomocą mikroskopii transmisyjnej elektronowej. Włókna kolagenowe barwione kwasem fosforungstycznym 1% (pH 7,0) wykazują charakterystyczny wzorzec okresowego pasmowania krzyżowego D-m o długości 67 nm, co jest diagnostyczne dla fibrylogenezy podobnej do natywnej. Ten etap kontroli jakości jest niezbędny przed przystąpieniem do eksperymentów mineralizacji, ponieważ potwierdza, że rusztowanie jest strukturalnie nienaruszone i zdolne do wspierania osadzania minerałów wewnątrzfibrylarnych. Bez tego wzoru prążkowania kolagen może być zdenaturowany lub nieprawidłowo złożony, co prowadzi do powstania sztucznych wzorców mineralizacji.

Rysunek 4 ilustruje reprezentatywny wynik ujemny uzyskany, gdy warunki mineralizacji nie są odpowiednio kontrolowane (np. brak kwasu poliaspartynowego lub pH > 7,6). W tych nieoptymalnych warunkach osady HAP (zielone) obserwuje się wyłącznie na szklanym podłożu poza włóknami kolagenowymi (czerwone), bez inwazji wewnątrzfibrylarnej. Ten wynik stanowi ważną kontrolę: pokazuje, że mineralizacja wewnątrzfibrylarna obserwowana na Rysunkach 1 i 2 nie wynika z niespecyficznych wydzielin lub niepełnego płukania, lecz wymaga precyzyjnej kontroli środowiska chemicznego (pH 7,4 ± 0,1, obecność kwasu poliaspartynowego oraz natychmiastowe zastosowanie świeżego medium mineralizacyjnego). Badacze powinni uwzględnić takie negatywne kontrole, aby zweryfikować własny system.

Rysunek 5 przedstawia reprezentatywne obrazy mikroskopii konfokalnej wykonane przed pozyskaniem przez STORM do wstępnego przesiewania próbek. Kanał kolagenowy (rysunek 5A) ujawnia przejrzystą sieć włóknistą, a kanał HAP (rysunek 5B) wykazuje minerały związane z włóknami. Połączony obraz (rysunek 5C) potwierdza kolokalizację na poziomie ograniczonym dyfrakcyjnym (~200 nm). Obrazy te pełnią dwa cele: (1) weryfikują jakość próbki (odpowiednie oznakowanie, minimalne agregowanie i specyficzne powiązanie mineralne) przed przejściem do czasochłonnego obrazowania STORM; oraz (2) kierują wyborem regionów zainteresowania do pozyskiwania 3D-STORM. Co ważne, obrazy konfokalne nie mają rozdzielczości pozwalającej odróżnić mineralizację wewnątrzfibrylarną od pozafibrylarnej. Należy zauważyć, że sygnał mineralny wydaje się ciągły wzdłuż włókien, nie ujawniając, czy jest wewnątrz, czy na zewnątrz. To ograniczenie podkreśla potrzebę podejścia superrozdzielczości opisanego tutaj.

Rysunek 6 przedstawia dwa eksperymenty kontrolne. Rysunek 6A (kontrola bez kontroli przeciwciał pierwotnych) nie wykazuje sygnału specyficznego, gdy zastosowane jest tylko przeciwciało wtórne, co potwierdza, że obserwowane sygnały w oznakowanych próbkach nie wynikają z niespecyficznego wiązania przeciwciał wtórnych. Rysunek 6B (kontrola bez barwienia) nie pokazuje sygnału fluorescencyjnego (całkowicie), co wyklucza istotną autofluorescencję z próbki lub substratu. Te kontrolne są niezbędne do weryfikacji specyficzności znakowania immunofluorescencji. Każdy wykrywalny sygnał w tych sterownikach wskazywałby na konieczność regulacji kroków blokowania lub mycia.

W naszych zoptymalizowanych warunkach obrazowania system 3D-STORM osiągnął typową precyzję lokalizacji 20–30 nm bocznie i 50–60 nm osiowo, zgodnie z oryginalną literaturą 3D-STORM²⁵. Korekcja dryfu została wykonana podczas postprocessingu przy użyciu wbudowanego redundantnego algorytmu korelacji krzyżowej (RCC), który eliminuje potrzebę stosowania egzogennych markerów fiducial²³. Do fazowego przydziału ACP przypisano przy 30-minutowej mineralizacji, a HAP po 6 godzinach, na podstawie ustalonej kinetyki dojrzewania. Możliwość rozróżnienia tych dwóch faz czasowo, w połączeniu z lokalizacją na skalę nano, pozwala badaczom badać dynamikę intrafibrylarnej transformacji mineralnej.

Podsumowując, reprezentatywne wyniki pokazują, że ten protokół umożliwia rozróżnienie mineralizacji wewnątrzfibrylarnej i pozfibrylarnej w modelu rekombinowanym kolagenem, z ilościowymi metrykami kolokalizacji i odpowiednimi kontrolami ujemnymi. Metoda ta jest szczególnie cenna dla badaczy zajmujących się mechanizmami biomineralizacji, materiałami biomimetycznymi oraz inżynierią tkanki kostnej.

Tabela uzupełniająca 1 podsumowuje typowe problemy napotykane podczas procedur mineralizacji i obrazowania STORM, wraz z ich możliwymi przyczynami i zalecanymi rozwiązaniami. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek 1: Wielokolorowa rekonstrukcja 3D-STORM zmineralizowanych włókien kolagenowych. Kolagen (czerwony, dalekoczerwony barwnik fluorescencyjny) i siarczan chondroityny (GAG, niebieski, czerwony barwnik fluorescencyjny) są obrazowane jednocześnie. Kolokalizacja kolagenu i GAG objawia się jako magenta w połączonym kanale, a obszary, gdzie wszystkie trzy nakładające się fragmenty są białe. Pokazano również amorficzny fosforan wapnia (ACP, zielony, barwnik wapniowy). ACP występuje w granicach włókien kolagenowych, co wskazuje na lokalizację wewnątrzfibrylarną. Skala: 1 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

Rysunek 2: Obrazowanie 3D-STORM mineralizacji hydroksyapatytu wewnątrzfibrylatorowego (HAP). (A) Obrazy 2D STORM kolagenu (czerwony, fluorescencyjny barwnik dalekoczerwony), HAP (zielony, barwnik wapniowy) oraz połączonego kanału. (B) 3D rekonstrukcja objętości. (C) Analiza przekroju osi Z w odstępach 60 nm (Z = −120, −60, 0, +60, +120 nm). Trwały sygnał HAP w centralnych przecinkach (Z = 0 do ±120 nm) spełnia kryteria klasyfikacji mineralizacji wewnątrzfibrylarnej (intensywność ≥50% maksymalnej). Kolokalizacja ilościowa obliczona na podstawie tego wykresu: r Pearsona = 0,89 ± 0,04, nakładanie się Mandera = 0,91 ± 0,03. Paski skali: 0,1 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

Rysunek 3: Walidacja samoorganizowanych włókien kolagenowych mikroskopią transmisyjną (TEM). Włókna kolagenowe zostały zabarwione kwasem fosforungstycznym o stężeniu 1% (pH 7,0). Diagnostyczny wzorzec okresowego krzyżowania pasmowego D-pasmowego 67 nm potwierdza pomyślną fibrylogenezę i integralność strukturalną. Skala: 200 nm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

Rysunek 4: Reprezentatywny wynik negatywny: mineralizacja ekstrafibrylarna. Kolagen (czerwony, dalekoczerwony fluorescencyjny barwnik) oraz HAP (zielony, barwnik wapniowy). HAP osadza się wyłącznie na szklanym podłożu poza włóknami kolagenowymi, bez inwazji wewnątrzfibrylarnej. Ten suboptymalny wynik jest uwzględniony jako kontrola ujemna, aby zilustrować zakres możliwych wyników. Skala: 0,1 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Rysunek 5: Reprezentatywne obrazy konfokalne użyte do wstępnego badania przesiewowego. (A) Kanał kolagenowy (czerwony, dalekoczerwony fluorescencyjny barwnik) pokazuje wyraźną sieć fibrylarną. (B) Kanał HAP (zielony, barwnik wapniowy) wykazuje powiązanie mineralne. (C) Połączony obraz pokazuje kolokalizację kolagenu i HAP. Pasek skali = 2 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Eksperymenty kontrolne. (A) Kontrola bez przeciwciał pierwotnych: tylko zastosowane przeciwciała wtórne; Brak konkretnego sygnału. (B) Kontrola bez barwienia: brak stosowania fluoroforu ani przeciwciał; Brak sygnału fluorescencyjnego (całkowicie). Pasek skali = 1 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Tabela uzupełniająca 1: Przewodnik po rozwiązywaniu problemów. Typowe problemy napotykane podczas mineralizacji oraz pozyskiwania/analizy 3D-STORM, wraz z ich możliwymi przyczynami i zalecanymi rozwiązaniami. Zobacz tekst po szczegółowe numery kroków. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Protokół ten zapewnia kompleksowy workflow do wizualizacji mineralizacji kolagenu na skalę nanoskalową z wykorzystaniem multicolor 3D-STORM. Kilka kluczowych kroków wymaga szczególnej uwagi, aby zapewnić pomyślne rezultaty.

Po pierwsze, przygotowanie próbek jest podstawą wysokiej jakości obrazowania burzowego. Amino-silanizacja naczyń ze szklanym dnem musi być dokładna, aby zapewnić stabilne przyleganie włókien kolagenowych podczas kolejnych etapów mycia i etykietowania. Resztkowy APTES może powodować niespecyficzne wiązanie i wysokie tło, podczas gdy niepełna silanizacja może prowadzić do odwarstwienia włókien. Zalecany krok ultradźwiękowej (10 minut przy 40 kHz) skutecznie usuwa niezwiązany silan, zachowując jednocześnie funkcjonalność powierzchni. Do sieci włókien kolagenowych zaleca się EDC/NHS²¹ ze względu na wysoką swoistość. Alternatywnie można użyć 0,1% glutaraldehydu (inkubować 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dokładnie umyć), ale jest to mniej specyficzne. Kluczowe jest potwierdzenie prawidłowego powstawania włókien przez TEM przed przystąpieniem do mineralizacji. Jak pokazano na Rysunku 3, obecność charakterystycznego wzoru okresowego pasmowania D o długości 67 nm potwierdza, że proces samoorganizacji wytworzył strukturalnie nienaruszone, rodzime włókna kolagenowe²⁶. Ten krok kontroli jakości zapobiega błędnej interpretacji wyników wynikających ze źle uformowanych lub zdenaturowanych rusztowań kolagenowych.

Po drugie, ośrodek mineralizacyjny musi być przygotowany z precyzyjną kontrolą pH (7,4 ± 0,1) i użyty natychmiast. Prekursor amorficznego fosforanu wapnia (ACP) jest bardzo wrażliwy na pH i siłę jonową; Małe odchylenia mogą powodować przedwczesną krystalizację. Dlatego podłoże mineralizacyjne należy użyć natychmiast po przygotowaniu. W badaniach wymagających porównań w wielu punktach czasowych przygotuj świeże medium dla każdego eksperymentu zamiast używać roztworów przechowywanych. Gdy warunki mineralizacji nie są odpowiednio kontrolowane (np. niewystarczający kwas poliaspartynowy lub nieprawidłowe pH), dominuje mineralizacja ekstrafibrylarna, jak pokazano na Rysunku 4. W tej negatywnej kontroli HAP osadza się wyłącznie na szklanym podłożu poza włóknami kolagenowymi, bez inwazji wewnątrzfibrylarnej. Uwzględnienie takich negatywnych wyników jest niezbędne do potwierdzenia, że sygnał wewnątrzfibrylarny obserwowany na Rysunku 1 i Rysunku 2 rzeczywiście wynika z kontrolowanej mineralizacji wewnątrzfibrylarnej, a nie z niespecyficznego wytrącenia lub niepełnego płukania. Ponadto wcześniejsze badania podkreślały, że rozróżnienie mineralizacji wewnątrzfibrylarnej od zewnątrzfibrylarnej wymaga starannej kontroli lokalnego środowiska chemicznego oraz obecności stabilizujących dodatków, takich jak kwas poliaspartynowy²⁷.

Po trzecie, znakowanie immunofluorescencyjne wymaga starannej optymalizacji. Stężenie przeciwciał (1:100) dobrze sprawdza się w opisanym układzie kolagenu i siarczanu chondroityny, ale może wymagać miareczkowania dla różnych przeciwciał lub typów próbek. Zawsze uwzględniaj kontrolę bez przeciwciał pierwotnych do oceny autofluorescencji i wiązania niespecyficznego. Od etapu przeciwciał wtórnych konieczne jest ścisła ochrona przed światłem, aby zapobiec fotobieleniu fluoroforem.

Po czwarte, bufor obrazowania STORM musi być przygotowany świeżo i użyty w ciągu 30 minut. System usuwania tlenu (oksydaza glukozy/katalaza) z czasem traci aktywność, a cysteamina jest zarówno światłoczuła, jak i wrażliwa na tlen. Wstępne alicytacje zapasów enzymów i przechowywanie ich w temperaturze -80 °C zapewniają spójną wydajność we wszystkich eksperymentach. Gęstość mrugania powinna być monitorowana w czasie rzeczywistym i regulowana poprzez modulację mocy lasera 405 nm; zbyt mało cząsteczek wydłuża czas pozyskania, podczas gdy zbyt wiele powoduje nakładające się PSF i obniżoną precyzję lokalizacji. Aby szczegółowo optymalizować parametry obrazowania STORM, odsyłamy czytelników do ustalonych protokołów próbek testowych¹⁵.

Po piąte, przetwarzanie danych wymaga ustandaryzowanych parametrów umożliwiających znaczące porównania między próbkami. Minimalny próg liczby fotonów (zazwyczaj 500-1000 fotonów) wyklucza lokalizacje o niskiej pewności. Jeśli sygnały próbki są słabe, można je odpowiednio zredukować do 300 fotonów, ale nie zaleca się zejścia poniżej 200 fotonów. Korekcja dryfu z użyciem markerów fiducialnych lub algorytmów korelacji krzyżowych jest niezbędna do utrzymania rozdzielczości, szczególnie dla rekonstrukcji 3D²⁸. Rozmieszanie spektralne pomaga wyeliminować przesłuchy między kanałami, co jest kluczowe dla dokładnej analizy kolokalizacji. Rozwiązywanie typowych problemów opisano w Tabeli Uzupełniającej 1.

Protokół ma kilka ograniczeń. Jest zoptymalizowany pod kątem biomimetycznych modeli in vitro; Zastosowanie do rodzimych, silnie zmineralizowanych tkanek (np. dojrzałych kości) może wymagać dodatkowych kroków, takich jak odwapnienie lub bardziej agresywne pobieranie antygenów, co może wpływać na ultrastrukturę. Poleganie na określonych przeciwciałach może powodować problemy z gęstością znakowania lub przeszkody stericzne, szczególnie w gęsto upakowanych strukturach. Technika ta jest wymagająca sprzętu, wymagająca dostępu do zaawansowanego mikroskopu STORM z odpowiednimi liniami laserowymi oraz kamery EMCCD. Dodatkowo, całkowity czas potrzebny (~53 godziny od przygotowania próbki do analizy danych) może ograniczać przepustowość w niektórych zastosowaniach.

Pomimo tych ograniczeń, protokół ten oferuje znaczące przewagi w porównaniu z alternatywnymi metodami. W porównaniu z mikroskopią elektronową zapewnia specyficzność molekularną poprzez znakowanie immunofluorescencyjne, umożliwiając jednoczesną wizualizację wielu składników organicznych i nieorganicznych. W porównaniu z mikroskopią konfokalną osiąga ~10-krotnie wyższą rozdzielczość przestrzenną, umożliwiając rozróżnienie wzorców mineralizacji wewnątrzwłąkienkowej i pozafibrylarnej. Funkcjonalność 3D dostarcza informacji wolumetrycznych niezbędnych do zrozumienia rozkładu minerałów w matrycy kolagenowej.

Metoda ta ma szerokie zastosowanie w badaniach biomineralizacji. Potencjalne zastosowania obejmują badanie roli białek niekolagenowych w nukleacji minerałów, ocenę materiałów biomimetycznych pod kątem regeneracji kości, badanie patologicznej mineralizacji w chorobach takich jak osteoporoza i próchnica zębów oraz ocenę wpływu interwencji terapeutycznych na rozkład minerałów. Po odpowiednich modyfikacjach protokół może być dostosowany do badania innych interfejsów organiczno-nieorganicznych w tkankach lub biomateriałach.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kwas poliasparaginowy (p-Asp)	Sigma-Aldrich	P9903	Stabilizator amorficznego fosforanu wapnia
Chlorek wapnia (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Źródło wapnia
Fosforan sodu dwubazowy (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S0876	Źródło fosforanów
Chlorek sodu (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	Regulacja wytrzymałości jonowej
Kwas poliakrylowy (PAA)	Sigma-Aldrich	323667	Stabilizator wapnia o wysokim stężeniu
Baza Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Komponent bufora
Azyd sodu (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002	Środek przeciwdrobnoustrojowy
(3-aminopropyl)trietoksysilan (APTES)	Sigma-Aldrich	440140	Czynnik funkcjonalizacji powierzchni szklanej
Absolutny etanol	Sigma-Aldrich	459836	Rozpuszczalnik
Roztwór kolagenu typu I (50 & mu; g/mL w 0,1 M kwasu octowego)	Corning	354249	Rusztowanie samoskładające się
Siarczan chondroityny (CS)	Sigma-Aldrich	C9819	Naśladowca białka niekolagenowego
EDC (karbodimid 1-etylo-3-(3-dimetylopropylowy))	Sigma-Aldrich	E7750	Crosslinker
NHS (N-hydroksukcynimid)	Sigma-Aldrich	130672	Aktywator krzyżowego linkera
Wolny kwas MES	Sigma-Aldrich	M5287	Bufor do sieciowania krzyżowego
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)	Gibco	10010023	Bufor płukania i rozcieńczania
Albumina surowicy bydła (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Środek blokujący
Przeciwciało antykolagenowe króliki	Abcam	AB34710	Główne przeciwciało przeciwko kolagenowi
Mysie przeciwciało przeciwko siarczankowi chondroityny	Sigma-Aldrich	C8035	Pierwotne przeciwciało przeciwko CS
IgG przeciwkróliczego dla kóz sprzężony z barwnikiem fluorescencyjnym (Alexa Fluor 647)	Thermo Fisher Scientific	A-21244	Przeciwciało wtórne do kolagenu
IgM antymysie u kóz sprzężone z czerwonym fluorescencyjnym barwnikiem (Alexa Fluor 568)	Thermo Fisher Scientific	A-11031	Przeciwciało wtórne przeciwko CS
Kalceina (barwnik wapniowy)	Sigma-Aldrich	C0875	Etykieta fosforanu wapnia
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	Detergent do bufora do prania
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516	Komponent bufora obrazowania
Oksydaza glukozy (GOx)	Sigma-Aldrich	G7141	Padlinożerca tlenu
Katalaza	Sigma-Aldrich	C1345	Padlinożerca tlenu
Cysteamina (MEA)	Sigma-Aldrich	M6500	Tiol do mrugania fluoroforem
D-glukoza	Sigma-Aldrich	G6152	Podłoże dla oksydazy glukozy
Octan sodu	Sigma-Aldrich	S2889	Bufor dla akcji GOx
Kwas solny (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Regulacja pH
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Sigma-Aldrich	71690	Regulacja pH
Kwas fosforungstyczny	Sigma-Aldrich	P4006	Negatywne barwienie dla TEM
Naczynia z dnem szklanym (35 mm, #1,5H)	MatTek	P35G-1.5-14-C	Próbka podłoża; Grubość 0,17 mm
Ultradźwiękowy czyściciel (40 kHz)	Branson	B200	Urządzenie czyszczące
Komora wilgotności	Thermo Fisher Scientific	11-432-10	Dla samoorganizacji kolagenu
Transmisyjny mikroskop elektronowy	Hitachi	HT7800	Obrazowanie TEM
Siatki TEM pokryte formwarem/powlekanym węglem (siatka 200)	Sigma-Aldrich	FCF200-Cu	Wsparcie dla próbek TEM
Platforma pozioma shaker	Labnet	S2030-RC	Delikatne pranie
Konfokalny mikroskop laserowy skanujący	Nikon	A1	Wstępne testy
System mikroskopu 3D-STORM (z laserami 405/488/647 nm, soczewką cylindryczną, EMCCD)	Nikon	N-STORM	Obrazowanie superrozdzielcze
100 razy; Obiektyw zanurzeniowy w oleju (NA 1.49)	Nikon	MRD01991	Obrazowanie wysokiej rozdzielczości
pH miernik	Mettler Toledo	FiveGo F2	Kontrola pH
Oprogramowanie do akwizycji i analizy STORM	Nikon	NIS-Elements (moduł STORM)	Akwizycja i przetwarzanie danych STORM
.nd2 (surowy plik mikroskopii mikroskopijnej)	Nikon	Nie ma	Format pliku RAW wygenerowany przez mikroskopy Nikon.
Publicznie dostępne oprogramowanie do analizy obrazów	Open source	Nie ma	np. ImageJ z wtyczką ThunderSTORM do analizy lokalizacji pojedynczych cząsteczek (kolokalizacja, korekta dryfu)
Parafilm	Bemis	PM996	Pokrycie próbki podczas inkubacji
Folia aluminiowa	Każdy dostawca laboratoryjny	Nie ma	Dla ochrony przed światłem (np. owijania próbek)
Bursztynowe mikrowirówki	Fisher Scientific	05-669-21	Do ochrony przed światłem fluoroforów
Slipy (nr 1.5)	Corning	2855-18	Montaż próbki