Multiplex fluorescencyjna mRNA in situ hybrydyzacja rozwijających się tkanek czaszkowo-twarzowych w próbkach myszy FFPE

Podsumowanie

Konwencjonalna hybrydyzacja in situ ma trudności z wizualizacją mRNA w tkankach czaszkowo-twarzowych ze względu na złożoną architekturę, wysokie tło, ograniczoną specyficzność sondy oraz czułość. Protokół ten opisuje multipleksową fluorescencyjną metodę in situ hybrydyzacji in situ do czułego, specyficznego wykrywania wielu celów mRNA w tkankach zarodkowych myszy FFPE, przezwyciężając wcześniejsze ograniczenia.

Streszczenie

Rozwój czaszkowo-twarzowy zależy od skoordynowanej aktywności różnorodnych, wyspecjalizowanych populacji komórek, które oddziałują w złożonych strukturach tkanek, tworząc i utrzymując prawidłową strukturę i funkcjonowanie tkanek. Zrozumienie, jak te komórki komunikują się ze sobą oraz ze swoim lokalnym mikrośrodowiskiem, jest kluczowe dla określenia mechanizmów molekularnych regulujących ich powstawanie i homeostazę. Zakłócenie tych procesów może prowadzić do wrodzonych schorzeń czaszkowo-twarzowych, w tym rozszczepu zęba, rozszczepu podniebienia i rozszczepu wargi, zarówno samodzielnie, jak i w wyniku zaburzeń zespołowych. Chociaż techniki ilościowe, takie jak RT-PCR, oferują wysoką czułość i zakres dynamiczny, wymagają ekstrakcji RNA z ujednoliconej tkanki, co skutkuje utratą kontekstu przestrzennego i komórkowego, co jest szczególnie istotnym ograniczeniem dla heterogenicznych tkanek czaszkowo-twarzowych, gdzie pochodzenie komórkowe transkryptów nie jest jednoznaczne. Wielofluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA pokonuje to ograniczenie, umożliwiając czułe i specyficzne wykrywanie wielu transkryptów mRNA, przy jednoczesnym zachowaniu architektury tkankowej. To zaawansowane podejście umożliwia precyzyjną lokalizację ekspresji genów na poziomie komórkowym, dostarczając cennych informacji o przestrzennej regulacji procesów rozwojowych i mechanizmów chorób w biologii czaszkowo-twarzowej.

Wprowadzenie

Reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR) jest złotym standardem analizy ekspresji genów ze względu na wysoką czułość i szeroki zakres dynamiczny; jednak wymaga to ekstrahacji RNA z ujednoliconych tkanek, co skutkuje utratą kontekstu przestrzennego i komórkowego¹. To ograniczenie jest szczególnie problematyczne dla tkanek heterogenicznych, takich jak tkanki czaszkowo-twarzowe, podczas rozwoju embrionalnego, gdzie źródło komórkowe wykrytych transkryptów nie może zostać rozstrzygnięte. Hybrydyzacja RNA in situ (ISH), technika opracowana w 1968 roku przez Josepha Galla i Mary Lou Pardue, przełamuje to ograniczenie, umożliwiając lokalizację ekspresji mRNA w architekturze nienaruszonej tkanki². Niemniej jednak konwencjonalna metoda RNA ISH jest technicznie wymagająca i w dużej mierze zależna od optymalnej fiksacji tkanek oraz przygotowania próbki, aby zachować integralność RNA³. Problemy te są nasilone w silnie zwapnionych tkankach, które wymagają procedur odwapnienia, często obejmujących silne chemikalia lub długotrwałe przetwarzanie, prowadzące do degradacji RNA. W konsekwencji RNA ISH w tkankach czaszkowo-twarzowych, które składają się ze złożonych mieszanin typów komórek, wymaga starannej optymalizacji i wiedzy technicznej, jest czasochłonna i niesie ze sobą znaczne ryzyko suboptymalnego barwienia. Wyzwanie wizualizacji ekspresji mRNA jest jeszcze większe w tkankach zębów, które mają bardzo złożoną strukturę i skład. Zęby składają się z mineralizowanych składników, takich jak szkliwo, zębina, cement i otaczająca ich kość, a także z miękkich tkanek, takich jak miazga i więzadło przyzębia. Tkanki te są zasiedlone przez różnorodne typy komórek, które odgrywają kluczową rolę w rozwoju zębów⁴. Te cechy wymagają starannej standaryzacji, aby zapewnić niezawodne wykrywanie sygnału. W rezultacie opisany protokół jest szczególnie dobrze przystosowany do badania ekspresji genów w fazach rozwojowych i poporodowych formowania się zębów.

Istnieją techniki oparte na wielofluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do detekcji przestrzennej RNA, w tym amplifikowane RNA FISH 5,6,7,8,9, reakcja łańcuchowa hybrydyzacji FISH 6, jednocząsteczkowe RNA FISH ¹⁰, amplifikacja sygnału przez reakcję wymiany FISH 5 oraz wysoce multipleksowane platformy FISH, takie jak MERFISH¹¹ i seqFISH^12,13. Wśród nich multipleksowe fluorescencyjne RNA ISH ^7,8,9 jest szeroko stosowane ze względu na wysoką czułość na wykrywanie pojedynczej cząsteczki RNA, wynikającej z konstrukcji podwójnej sondy Z, w której dwie sąsiednie sondy muszą się hybrydyzować z sekwencją docelową, aby zainicjować amplifikację sygnału. Ten podwójny projekt rozpoznania znacznie poprawia specyficzność i redukuje sygnał poza celem. Metoda umożliwia multipleksową detekcję 2–4 celów (rozszerzalnych do 12 lub więcej celów przy użyciu podobnych technik), zachowuje morfologię tkanek i jest kompatybilna z formaliną utrwalonymi w parafinę (FFPE)^7,8,9, świeżo zamrożonymi oraz wybranymi zwapnienymi tkankami, co czyni ją odpowiednią dla złożonych próbek, takich jak te spotykane w rozwoju czaszkowo-twarzowym i stomatologicznym. Metoda jest standaryzowana, powtarzalna, wspierana przez dobrze znane biblioteki sond i szeroko walidowana, co zapewnia dostępne i wiarygodne wyniki w różnych laboratoriach.

Multiplex fluorescencyjnego RNA ISH wykorzystuje wiele sond celujących w różne obszary tego samego transkryptu, połączonych z rozszerzoną amplifikacją sygnału, umożliwiając wysoce czułe i specyficzne wykrywanie nawet dla mRNA o niskiej ilości lub częściowo zdegradowanych^14,15. Chociaż multiplex fluorescencyjny RNA ISH został z powodzeniem zastosowany do zdewapnifikowanych próbek kości¹⁶, a jego zastosowanie w złożonych tkankach czaszkowo-twarzowych było wcześniej zgłaszane ^7,8,9; Jednak szczegółowy, krok po kroku protokół opisujący jego zastosowanie w tym kontekście nie został jeszcze opublikowany.

Struktury czaszkowo-twarzowe składają się z złożonych struktur tkanek o różnorodnych typach komórek, w tym osteoblastów, osteoklastow, osteocytów, ameloblastów, odontoblastów, fibroblastów, komórek macierzystych, komórek odpornościowych, naczyń oraz neuronów czuciowych, których przestrzennie skoordynowane interakcje są niezbędne dla formowania tkanek, funkcji, regeneracji i ochrony immunologicznej⁴. Badanie zlokalizowanej ekspresji genów w tych tkankach jest zatem kluczowe, a multipleksowe fluorescencyjne RNA ISH stanowi wiodące podejście do takich analiz.

W tym badaniu opisaliśmy, jak multipleksowe fluorescencyjne RNA ISH oparte na sondach RNAscope i technologii mogą być stosowane do badania złożonych tkanek czaszkowo-twarzowych (Rysunek 1). Ponadto ustanowiliśmy zoptymalizowany workflow sekcjonowania FFPE, który zachowuje integralność RNA i umożliwia wysokiej jakości, przestrzennie rozdzieloną analizę ekspresji genów.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development Animal Care and Use Committee (IACUC) na podstawie Protokołu Badań Zwierząt #24-031.

1. Kopulacja na czas i pobieranie tkanki embrionowej

1. Ustaw rozmowy na czas.
   1. Spójrzcie w parę zdrowego, płodnego samca i samicę Mus musculus późnym popołudniem. Następnego ranka sprawdź obecność korka pochwowego. Oznacz dzień obserwowania wtyczki jako dzień embrionalny (E) 0,5.
2. Uśpij ciężarną kobietę.
   1. Na pożądanym etapie rozwoju należy uśpić ciężarną samicę myszy poprzez wdychanie CO₂, a następnie zwichnięcie szyjki macicy, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnej opieki nad zwierzętami.
   2. Ustaw mysz na plecach na sterylnej, chłonnej powierzchni. Dezynfekuj okolice brzucha 70% etanolem w miejscu planowanego nacięcia.
3. Odsłonić i odizolować rogi macicy.
   1. Wykonaj nacięcie środkowe brzucha sterylnymi nożyczkami chirurgicznymi, a następnie otwórz ścianę otrzewnej nożyczkami mikrochirurgicznymi, aby odsłonić rogi macicy.
   2. Użyj tępych kleszczy, aby delikatnie zespolić łańcuch macicy. Uwolnij tkankę macicy wzdłuż mięśnia i przeciąć jajowód oraz przyłączenie rogu macicy pośrodkowej, aby wyizolować zarodki.
4. Przenieś całe zarodki.
   1. Natychmiast przenieś łańcuch macicy zawierający zarodki do 10-centymetrowej szalki Petriego zawierającej lodowatozim, bezpłodnym 1× PBS (pH 7,4).
5. Rozcina pojedyncze embriony.
   1. Ostrożnie oddziel każdy zarodek od otaczających błon macicy, owodniowych i kosmówkowych.
   2. Przenieś oczyszczone zarodki do świeżej misy o średnicy 10 cm zawierającej lodowate, sterylne PBS.
6. Rozcinać embrionalne głowy myszy.
   1. Używając sterylnego ostrza chirurgicznego, rozcięć głowice i raz je opłukać w lodowatym PBS przed dalszym przetwarzaniem.
      UWAGA: Zbierać i rozcinać noworodkowe myszy na pożądanym etapie rozwoju zgodnie z protokołem zwierzęcym.

2. Utrwalanie i przetwarzanie tkanek

1. Napraw tkankę.
   1. Natychmiast zanurz rozciętą tkankę w 10% neutralnej buforowanej formalinie i utrwal ją na noc w temperaturze pokojowej na shakerze.
      UWAGA: Prawidłowe zachowanie RNA jest kluczowe dla powodzenia analiz hybrydyzacji in situ. Liczne badania wykazały, że standardowe podejście — utrwalanie próbek tkanek w 10% neutralnej buforowanej formalinie przez okres od 6 do 48 godzin, w zależności od konkretnego rozmiaru i wieku tkanki — daje wiarygodne wyniki w zakresie zachowania RNA 16,17,18,19. W przypadku wcześniejszych stadij embrionalnych (E12.5 i niżej) penetracja utrwalającego jest szybka, a czas utrwalania powinien być odpowiednio skrócony, aby zapobiec nadmiernej fiksacji. Od dnia embrionalnego 17.5 (E17.5), a także w próbkach poporodowych, penetracja utrwalacza może być mniej efektywna ze względu na obecność skóry na głowie, która działa jako bariera fizyczna. Dlatego skóra powinna być usunięta z całej głowy, aby umożliwić efektywne przenikanie roztworu fiksacyjnego. Dewapnifikację można przeprowadzić w 0,5 M EDTA (pH 8,0) zawierającej 0,5% bezmetanolowego formaldehydu w temperaturze 4 °C⁷. Czas trwania odwapnienia można monitorować za pomocą szybkiego skanu mikroCT i można go dostosować w zależności od stopnia mineralizacji oraz konkretnego typu tkanki; dla zarodków E18.5 zwykle wystarcza 24–48 godzin.
2. Przepłucz i przetworz tkankę.
   1. Usuń utrwalacz i przepłucz próbki w PBS. Przelej tkankę do 70% etanolu i przechowuj w temperaturze 4 °C do dalszego przetwarzania (1–4 tygodnie)²⁰. Wykonaj odwodnienie tkanek, oczyszczanie i infiltrację parafiny za pomocą zautomatyzowanego procesora tkankowego zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Typowy protokół przetwarzania tkanek jest następujący: 70% etanolu przez 30 minut, następnie 95% etanolu przez 30 minut (2 razy) oraz 100% etanolu przez 30 minut (3 razy) w celu odwodnienia; oczyszczanie w ksylenie przez 1 godzinę (3 razy), a następnie infiltracja woskiem parafinowym w 60 °C przez 1 godzinę (3 razy) przed osadzeniem w blokach tkanek parafinowych.
3. Osadzaj tkankę.
   1. Osadzić głowice w parafinie i ukierunkować próbki w płaszczyźnie koronalnej lub strzałkowej, w zależności od wymagań eksperymentalnych.
   2. Przenieś osadzone bloki na zimną płytę z bloku parafinowego, aby wosk mógł stwardnieć przez około 30 minut, z dostosowywaniem czasu w zależności od rozmiaru bloku.
4. Przechowuj bloki FFPE.
   1. Pozwól parafinie całkowicie się zastygnąć. Wyjmij bloki z form, umieść je w oznaczonych, szczelnych pojemnikach lub woreczkach strunowych i przechowywaj w temperaturze 4 °C aż do momentu pokrojonowania.
      UWAGA: Bloki FFPE z dobrze zachowanym RNA mogą być przechowywane przez kilka lat przed przecięciem bez naruszania integralności tkanki.

3. Przetwarzanie tkanek FFPE dla multipleksowego fluorescencyjnego RNA ISH

1. Przygotuj miejsce pracy wolne od RNazy.
   1. Dezynfekuj wszystkie powierzchnie robocze i narzędzia 70% etanolem. Traktuj powierzchnie, narzędzia i rękawice roztworem dekontaminującym RNazy, aby zminimalizować degradację RNA.
   2. Ustaw mikrotom i zamontuj nowe ostrze. Ustaw kąt prześwitu na 10°. Przed użyciem należy traktować pęsetę i szczoteczki roztworzeniem dekontaminującym RNazą.
      UWAGA: Zawsze używaj nowego ostrza do cięcia tkanek, aby uzyskać precyzyjne cięcia tkanki. Kąt ostrza znacząco wpływa na jakość przekroju, integralność tkanek, jednolitość grubości oraz zachowanie cech morfologicznych.
2. Przygotuj kąpiel wodną.
   1. Napełnij kąpiel wodną do flotacji ultraczystą, laboratoryjną wodą.
   2. Dostosowuj temperaturę w zakresie 40–43 °C w zależności od stadium embrionalnego i cech tkanek.
3. Przytnij i zamontuj blok FFPE.
   1. Przytnij nadmiar parafiny wokół osadzonej tkanki. Schłodzić blok FFPE na lodzie i zamontować go na mikrotomowym zimnym stopniu.
4. Przytnij do interesującego Cię regionu.
   1. Wyrównaj powierzchnię bloku parafinowego z łopatką mikrotomu i przycinaj co 12 μm, aż obszar zainteresowania (np. sąsiedztwo zęba trzonowego lub siekacza) pojawi się w przekrojach koronowych.
   2. Przesuwaj blok i ostrze w razie potrzeby dla symetrycznych, prawidłowo ustawionych przekrojów koronalnych lub strzałkowych na całą głowę.
5. Ciąt na cięcie.
   1. Gdy osiągniesz interesujący obszar, tnij przekroje o pojemności 5–7 μm. Unieś fragmenty na kąpieli wodnej, aby umożliwić delikatne relaksowanie i spłaszczenie przed przeniesieniem ich na zjeżdżalnie.
6. Przymontuj i wysusz sekcje.
   1. Zamontuj sekcje na dodatnio naładowanych szklanych szkiełkach. Zbadaj preparaty pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić prawidłową orientację i integralność tkanki.
   2. Przed wykonaniem multipleksowego testu fluorescencyjnego RNA ISH susz na podgrzewaczu w 40 °C przez noc.

4. Dzień 1: Deparafinizacja i nawodnienie

1. Upiecz zjeżdżalnie.
   1. Piecz zjeżdżalnie z przekrojami FFPE przez godzinę w 60 °C.
      UWAGA: Jeśli preparat nie jest używany od razu, przechowuj go niepieczonego w temperaturze pokojowej (RT) z środkami do suszenia przez 1–4 tygodnie. Długotrwałe przechowywanie może prowadzić do degradacji RNA.
2. Wyrównaj zasuwki.
   1. Pozwól, by szkiełko tkankowe FFPE wyrównało się w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut.
3. Odparowuj i nawodnij te fragmenty.
   1. Zanurz szkiełka w ksylenie lub substytucie ksylenowym z delikatnym mieszaniem przez 5–10 minut w RT. Powtórz ten krok raz, aby zapewnić całkowite usunięcie parafiny.
      UWAGA: Praca z ksylenem powinna odbywać się w okapie chemicznym. Jeśli stosuje się niskotoksyczny substytut ksylenu, można go stosować poza okapem chemicznym.
   2. Przelej preparaty do 100% etanolu i inkubuj przez 2 minuty w RT. Powtórz raz, aby usunąć pozostałości ksylenu. Nawilżaj fragmenty w 70% etanolu przez 2 minuty.
   3. Przepłukaj te fragmenty trzy razy PBS. Następnie dodaj kroplę PBS wystarczającą, by całkowicie pokryć sekcje i natychmiast przejść do kolejnego kroku.

5. Multipleksowe fluorescencyjne RNA ISH na przekrojach tkanek FFPE

UWAGA: Badanie to postępowało zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi wykonania multipleksowego fluorescencyjnego RNA ISH na przekrojach tkanek FFPE z wykorzystaniem technologii RNAscope²¹.

1. Dzień 1: Wstępne przygotowanie i hybrydyzacja sondowa
   1. Narysuj barierę hydrofobową.
      1. Za pomocą długopisu barierowego narysuj hydrofobową barierę wokół każdego fragmentu tkanki. Pozwól zjeżdżalniom wyschnąć na powietrzu przez około 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
      2. Upewnij się, że fragmenty tkanek są zawsze pokryte PBS, aby zapobiec wysychaniu.
         UWAGA: Użyj chusteczki bez kłaczków (soczewki), aby osuszyć szkiełko wokół chusteczki, jednocześnie utrzymując nawilżenie chusteczki. Upewnij się, że tusz barierowy nie styka się z tkanką w strukturze.
   2. Wykonaj przygotowanie do zabiegu.
      1. Nałóż niestandardowy odczynnik wstępny, aby całkowicie pokryć każdą sekcję. Inkubuj szkiełka przez 30 minut w temperaturze 40 °C w nawilżonej komorze umieszczonej wewnątrz pieca hybrydyzacyjnego.
         UWAGA: Do wszystkich odczynników dostarczanych w butelkach z zakraplaczaczem należy dodać tyle kropel, aby całkowicie pokryć sekcję wewnątrz bariery. Upewnij się, że wszystkie odczynniki zostaną dostarczone do RT przed użyciem.
   3. Przepłukaj fragmenty.
      1. Przepłucz przekroje kilka razy PBS, a następnie inkubuj w świeżym PBS przez 2 minuty w RT.
         UWAGA: Użyj pipety transferowej 5 mL, aby myć każde szkiełko osobno PBS. Podczas 2-minutowego mycia upewnij się, że sekcje pozostaną całkowicie pokryte PBS.
   4. Osłab aktywność endogennej peroksydazy.
      1. Nałóż 3% nadtlenku wodoru do każdej sekcji i inkubuj w RT przez 10 minut, aby zablokować endogenną aktywność nadoksydazy.
   5. Powtarzaj pranie.
      1. Myj slajdy w PBS przez 2 minuty w RT. Powtarzaj dwa razy.
   6. Przygotujcie sondy.
      1. Podgrzej sondy w temperaturze 40 °C przez 10 minut. Pozwól sondam ostygnąć do RT przed użyciem.
   7. Przygotuj mieszankę sondową.
      1. Sonda C1 jest dostarczana jako rozwiązanie robocze o wartości 1×; Użyj tego bezpośrednio.
      2. Dla porównania, sondy C2, C3 i C4 są dostarczane jako koncentraty 50×; rozcieńcz te sondy roztworem sondy C1. Jeśli sonda C1 nie jest używana, rozcieńczaj sondy C2, C3 i/lub C4 za pomocą rozcieńczalnika dostarczonego przez producenta.
   8. Hybrydyzuj sondy.
      1. Nałóż 30–40 μL mieszanki sondy na każdy przekrój tkanki, zapewniając pełne pokrycie. Inkubuj preparaty przez 2 godziny w temperaturze 40 °C w nawilżonej komorze w piecu hybrydyzacyjnym.
         UWAGA: Podczas nauki techniki RNAscope zaleca się stosowanie zarówno sond kontroli ujemnej, jak i dodatniej podczas testów. Takie podejście pomaga zweryfikować test i potwierdzić jakość zabiegu. Potencjalnym ograniczeniem, o którym warto pamiętać, jest to, że niektóre sondy pozytywnej kontroli dostarczone przez producenta mogą nie być wypuszczane w interesującej tkance. Aby temu zaradzić, można użyć sond specyficznych dla typu komórek. Na przykład Col1a1 jest wiarygodną kontrolą pozytywną dla tkanek łącznych. Barwienie na Col1a1 (lub inny gen o znanej wysokiej ekspresji) może być pierwszym krokiem oceny zachowania RNA i morfologii tkanek w próbkach. Po osiągnięciu biegłości w technice, negatywne kontrole są zazwyczaj realizowane przez obróbkę szkiełków bez sond, ale traktowanie ich wszystkimi innymi roztworami. Ta metoda dostarcza kluczowych informacji dotyczących sygnału tła we wszystkich kanałach detekcji. Standardowy zestaw Multiplex V2 umożliwia jednoczesne barwienie i obrazowanie do czterech różnych sond. Gdy poziomy ekspresji genów zostaną ustalone na podstawie wcześniejszych badań transkryptomicznych, zaleca się przypisanie genów o niskiej ekspresji do kanałów Cy5 i Cy7. Geny o wysokiej ekspresji powinny być umieszczone w kanałach GFP i RFP dla optymalnego wykrycia. W przypadkach, gdy żadna z sond nie celuje w geny o wysokiej ekspresji, kanał GFP powinien pozostać niewykorzystany. Pozwala to kanałowi GFP służyć jako odniesienie do odejmowania tła od kanału RFP, poprawiając dokładność wykrywania sygnału dla celów o niskim wyrażeniu.
   9. Spłukuj buforem do mycia.
      UWAGA: Dostępny komercyjnie bufor 20× Wash Buffer został rozcieńczony do 1× wodą wolną od RNazy przed użyciem.
      1. Myj zamki przez 2 minuty w RT w 1× Wash Buffer dołączonym do zestawu. Powtórz dwa razy.
   10. Inkubuj w 5x buforze soli fizjologicznej i cytrynianu sodu (SSC).
       UWAGA: Dostępny komercyjnie bufor SSC 20× (3 M NaCl, 0,3 M cytrynianu sodu, pH 7,0) został przed użyciem rozcieńczony do 5× wodą wolną od RNazy.
       1. Po umyciu inkubuj sekcje przez noc w buforze 5× SSC w RT.
2. Dzień 2: Wzmocnienie sygnału, oznakowanie fluorescencyjne i montaż
   1. Umyj szkiełki.
      1. Przemyj szkiełki w 1× Wash Buffer przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT). Powtórz dwa razy.
   2. Wykonaj kroki wzmacniania.
      1. Na każdą sekcję nałóż odczynnik Amplification 1 i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 40 °C w komorze nawilżonej.
      2. Spłukuj dwa razy w 1× Wash Buffer przez 2 minuty w RT.
      3. Załóż odczynnik Amplification 2 i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 40 °C.
      4. Spłukuj dwa razy w 1× Wash Buffer przez 2 minuty w RT.
      5. Nakładaj odczynnik Amplification 3 i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 40 °C.
         UWAGA: Wszystkie trzy etapy wzmacniania są wymagane niezależnie od tego, które kanały (sondy) są rozwijane.
      6. Spłukuj dwa razy w 1× Wash Buffer przez 2 minuty w RT.
   3. Rozwijaj nadtlenek chrzanu (HRP) i fluorofor.
      1. Oblicz potrzebną objętość fluoroforu (zazwyczaj 100–200 μL na preparat) i rozcieńcz zapasy fluoroforu opalowego.
         UWAGA: Zalecany zakres rozcieńczenia fluoroforu to 1:300–1:1500. W tych eksperymentach Opal Polaris 780 (odczynnik fluoroforowy) był rozcieńczany w 1:500 w rozcieńczalniku przeciwciał, a wszystkie pozostałe barwniki rozcieńczano w 1:1000 w buforze TSA. Minimalizuj ekspozycję na slajdy światła, kiedy tylko to możliwe.
      2. Nakładaj odczynnik HRP-C1 i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 40 °C.
      3. Spłukuj dwa razy w 1× Wash Buffer przez 2 minuty w RT.
      4. Nałóż 30–40 μL barwnika opalu (np. Opal 570 lub Opal 690) na każdą sekcję. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze 40 °C.
      5. Spłukuj dwa razy w 1× Wash Buffer przez 2 minuty w RT.
      6. Aplikuj bloker HRP i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 40 °C.
      7. Spłukuj dwa razy w 1× Wash Buffer przez 2 minuty w RT.
      8. Należy nałożyć odczynnik HRP-C2 lub HRP-C3 i inkubować w temperaturze 40 °C przez 15 minut.
      9. Spłukuj dwa razy w 1× Wash Buffer przez 2 minuty w RT.
      10. Nałóż 30–40 μL drugiego barwnika opalu i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 40 °C.
      11. Spłukuj dwa razy w 1× Wash Buffer przez 2 minuty w RT.
      12. Aplikuj bloker HRP i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 40 °C.
      13. Spłukuj dwa razy w 1× Wash Buffer przez 2 minuty w RT.
      14. Należy stosować odczynnik HRP-C3 lub HRP-C4 i inkubować przez 15 minut w temperaturze 40 °C.
      15. Spłukuj dwa razy w 1× Wash Buffer przez 2 minuty w RT.
   4. Wykonaj amplifikację sygnału tyramidowego-digoksygeninę (TSA-DIG) oraz znakowanie fluoroforem (jeśli dotyczy).
      1. Nakładaj 30–40 μL rozcieńczonego odczynnika TSA-DIG na sekcję i inkubuj przez 30 minut w RT.
      2. Spłukuj dwa razy w 1× Wash Buffer przez 2 minuty w RT.
      3. Nałóż odczynnik blokujący i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 40 °C.
      4. Spłukuj dwa razy w 1× Wash Buffer przez 2 minuty w RT.
      5. Nałóż 30–40 μL rozcieńczonego odczynnika fluoroforowego i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 40 °C.
      6. Spłukuj dwa razy w 1× Wash Buffer przez 2 minuty w RT.
   5. Wykonaj barwienie i montaż.
      1. Stosuj 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i inkubuj przez 5 minut w RT w ciemności.
      2. Płucz DAPI i natychmiast zamontuj sekcje za pomocą zabezpieczenia anty-fade, delikatnie nałóż pokrywkę i unikaj zatrzymywania pęcherzyków powietrza. Wybierz rozmiar slipu, który odpowiada pokryciu tkanek.
      3. Susz szkiełki przez 2 godziny w stanie RT w ciemności, a następnie trzymaj je w 4 °C do długotrwałego przechowywania.
         UWAGA: Fluorescencję można zachować do roku, jeśli przechowywana jest w temperaturze 4 °C w ciemności i posiada odpowiednie zabezpieczenia anty-fade.
   6. Wykonaj obrazowanie.
      1. Wykonaj obrazowanie za pomocą wielokanałowego mikroskopu fluorescencyjnego z oświetleniem LED i filtrami do separacji spektralnej (Rysunek 2A). Używaj długości fal wzbudzenia i emisji w następujący sposób: DAPI (353/465 nm), FITC (495/519 nm), Cy3 (548/561 nm), Cy5 (650/673 nm) oraz Cy7 (747/773 nm). Filtry specyficzne minimalizują nakładanie się spektrum i rozróżniają sygnały niebieskie, zielone, pomarańczowe, czerwone oraz bliskie podczerwieni.
      2. Uzyskaj wszystkie zdjęcia przy użyciu identycznych ustawień ekspozycji i oświetlenia na wszystkich próbkach, zapewniając spójność i umożliwiając niezawodną analizę porównawczą.

Wyniki

Korzystając z opisanego protokołu (Rysunek 1), demonstrujemy wielofluorescencyjną detekcję transkryptu mRNA ISH w całej głowie myszy obrazowanej na platformie mikroskopu Zeiss (Rysunek 2B). Konkretne widoki obrazu można wybrać za pomocą bocznej zakładki (żółte ramki), natomiast wiele kanałów można jednocześnie wizualizować za pomocą zakładki kanałów (czerwone ramki). Jasność, gamma i kontrast obrazu na żywo można bezpośrednio regulować za pomocą przycisków pod z...

Dyskusja

Hybrydyzacja in situ jest podstawowym narzędziem do badania ekspresji genów od ponad czterech dekad i przechodzi ciągłe udoskonalanie. Jednak konwencjonalne podejścia ISH często ograniczają niską czułość, wysoki sygnał tła oraz długotrwałe, pracochłonne procedury. Te ograniczenia ograniczyły ich szersze zastosowanie, szczególnie w złożonych tkankach czaszkowo-twarzowych, gdzie kluczowe są precyzyjne rozdzielczości przestrzenne i wykrywanie transkryptów o niskiej obfitości. Multiplex fluorescencyjny RNA ISH pokon...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1&razy; PBS	Thermo Fischer	10010023	Użycie  do wykonywania washów podczas pracy
20& razy; SSC	Thermo Fischer	J60839. K2	Użyj do wykonania 1´ Bufor płukania
50 mL stożkowe rurki (Ambion) wolne od RNAse	Thermo Fischer	AM12502	Używaj do przechowywania próbek w różnych roztworach
Zaawansowany orbitalny potrząsający	VWR	6683-470	Użyj do potrząsania tkanek w roztworze utrwalającym podczas inkubacji
Alkohol, 70%, Fisherbrand, HistoPrep	Fisher Scientific	HC-1000-1GL	Użyj do czyszczenia i dezynfekcji całego miejsca pracy
Rozcieńczalnik przeciwciał	Akoya Biosciences	ARD1001EA	Rozcieńczalnik dla TSA-DIG
Zautomatyzowany procesor tkanek próżniowych	Leica Biosystems	ASP300S	Używa się do oczyszczania, odwodnienia, nawilżania i infiltracji woskiem do próbek
Grubość szkła pokrywowego 1,5, 25 mm x 25 mm	Corning	2850-25	Zastosowanie do montażu suwaka w workflow Visium HD
Niestandardowy odczynnik wstępny	ACD, Bio-Techne	300040	Aby zoptymalizować przepuszczalność tkanek i dostępność docelową
EDTA	Millipore Sigma	03690	Zastosowanie do odwapnienia zmineralizowanych tkanek
Etanol 100%	Grupa AeroBase	6505001050000	Użyj do usuwania ksyliny i nawilżania próbek podczas przetwarzania
Kąpiel wodna HistoCore	Leica Biosystems	HIS2326	Używano do pływania sekcji pod kątem 40-43 stopni; C do usuwania zagnieceń z sekcji FFPE
Papier nawilżający HybEZ	ACD, Bio-Techne	310015	Używaj w piekarniku HybEZ, aby utrzymać wilgotność i zapobiec wysychaniu fragmentów tkanek podczas hybrydyzacji
Piekarnik, taca i kratka HybEZ	ACD, Bio-Techne	310011, 310012, 310014	Zastosowanie do zapewnienia kontrolowanej temperatury, wilgotności oraz prawidłowego ustawienia zjeżdżalni podczas etapów hybrydyzacji i inkubacji;
ImmEdge Hydrofobowy Długopis Barierowy	Laboratorium Wektorów	H-4000	Używaj do rysowania granic hydrofobowych na preparatach, aby ograniczyć odczynniki do przekroju tkanki podczas procedur barwienia.
Niskoprofilowe jednorazowe ostrza DB80LX	Leica Biosystems	14035843496	Zastosowanie do sekcji bloków FFPE
Neutralna formalina buforowana 10%	Azer Scientific	NBF-4-G	Użyj do naprawy tkanek
PACZKA OPAL 520 ODCZYNNIKOWA	Akoya Biosciences, Inc.	FP1487001KT	Wzmacnianie i wykrywanie docelowych sygnałów RNA za pomocą znakowania fluorescencyjnego.
PACZKA ODCZYNNIKOWA OPAL 570	Akoya Biosciences, Inc.	FP1488001KT	Wzmacnianie i wykrywanie docelowych sygnałów RNA za pomocą znakowania fluorescencyjnego.
PAKIET ODCZYNNIKÓW OPAL 620	Akoya Biosciences, Inc.	FP1495001KT	Wzmacnianie i wykrywanie docelowych sygnałów RNA za pomocą znakowania fluorescencyjnego.
OPAKOWANIE ODCZYNNIKÓW OPAL 690	Akoya Biosciences, Inc.	FP1497001KT	Wzmacnianie i wykrywanie docelowych sygnałów RNA za pomocą znakowania fluorescencyjnego.
Pakiet Odczynników Opal Polaris 780	Akoya Biosciences, Inc.	FP1501001KT	Wzmacnianie i wykrywanie docelowych sygnałów RNA za pomocą znakowania fluorescencyjnego.
Prolong Diamond	Thermo Fischer	P36970	Nośnik antyfade do zachowania sygnałów fluorescencyjnego i ochrony sygnału RNAscope podczas obrazowania
RNAscope 4-Plex Zestaw pomocniczySPECYFICZNY UI	ACD, Bio-Techne	323120	Dodatkowe materiały użyte w testie fluorescencyjnym RNAscope Multiplex v2
RNAscope DAPI	ACD, Bio-Techne	320858	Fluorescencyjne barwienie jądrowe stosowane w testach RNAscope do wizualizacji jąder komórkowych
Zestaw Fluorescencyjnych Reagentów RNAscope multiplex v2	ACD, Bio-Techne	323100	Przeprowadzenie wielofluorescencyjnej hybrydyzacji in situ
Bufor TSA multipleksu RNAscope	ACD, Bio-Techne	322810	Bufor używany w RNAscope, aby rozcieńczać barwniki opalowe
Reagenty buforowe RNAscope Wash	ACD, Bio-Techne	310091	Używaj do mycia fragmentów tkanek na preparatach podczas testu
Roztwór RNazy RNaze RNaseZap	Thermo Fischer	AM9782	Używanie do czyszczenia i usuwania RNazy
Półautomatyczny mikrotom obrotowy	Leica Biosystems	RM2245	Używaj sekcjonowania bloków FFPE zgodnie z wytycznymi.
Slide Brite	Nauka o mikroskopii elektronowej	23401-01	Do etapu deparafinizacji przed przetwarzaniem RNAscope.
Ogrzewacz zjeżdżalni z osłoną	Premiere	XH2004	Zastosowanie do inkubacji preparatów w różnych temperaturach
Superfrost Plus slajdy	Fisher Scientific	12-550-15	Używanie do dołączania sekcji dla Vsium HD
Paraplast chirurgiczny	Leica Biosystems	39601006	Zastosowanie do infiltracji tkanek i ich osadzania
Hodowla tkanek DISH 100 x 20 MM 500/CS	Fisher Scientific	877222	Zastosowanie do pobierania i rozcinania próbek w 1´ PBS
Ksylen	Fisher Scientific	6.81001E+12	Używany jako środek oczyszczający do usuwania alkoholu i przejrzystości tkanek