Artykuł metodologiczny

Oznaczenie ilościowe fluorków w surowicy, kościach i zębach w modelu mysim z wykorzystaniem dyfuzji wspomaganej heksametylodizyloksanem oraz pomiarów elektrodą jonoselektywną

81 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71488

⸱

28 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral Science and Translational Research, College of Dental Medicine, Nova Southeastern University, 2Department of Biological Sciences, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo, 3Department of Restorative Dentistry and Endodontology, Osaka University Graduate School of Dentistry, 4Unit of Dentistry, Osaka University Hospital, 5Department of Biomedical Sciences, Adams School of Dentistry, The University of North Carolina at Chapel Hill

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie naczyń dyfuzyjnych wspomaganych heksametylodisiloksanem (HMDS), a następnie pomiary za pomocą elektrody jonowo-selektywnej w celu ilościowego oznaczenia masy jonów fluorkowych w surowicy, kościach i zębach myszy. Metoda ta stanowi czułe, oparte na kalibracji podejście do oceny akumulacji fluorków w próbkach biologicznych.

Streszczenie

Ilościowe oznaczenie poziomu fluorków w tkankach biologicznych jest niezbędne do zrozumienia ekspozycji, metabolizmu i toksyczności fluorków. Niniejszy protokół opisuje czułą i powtarzalną metodę pomiaru masy jonów fluorkowych w surowicy, kościach i zębach z wykorzystaniem dyfuzji wspomaganej heksametyldisiloksanem (HMDS), a następnie analizy za pomocą elektrody jonoselektywnej (ISE). Próbki biologiczne, w tym surowica, kość udowa i siekacze żuchwy, są pobierane od myszy poddanych kontrolowanym zabiegom z użyciem fluorków. Próbki kości i zębów są popielane, mielone i nawadniane, natomiast surowica jest przetwarzana bezpośrednio. Każda próbka jest przenoszona do naczynia dyfuzyjnego zawierającego wodę ultraczystą i uszczelniana pokrywką wyłożoną wazeliną, na której znajdują się krople wodorotlenku sodu służące jako pułapki na fluorki. Wstrzyknięcie kwasu siarkowego nasyconego HMDS inicjuje uwalnianie i dyfuzję fluorków, co pozwala na ilościowe wychwycenie uwolnionych jonów fluorkowych w pułapkach. Po całonocnej dyfuzji krople z pułapek na fluorki są łączone w jedną próbkę, zakwaszane do wymaganego zakresu pH i doprowadzane do określonej objętości w celu pomiaru ISE. Naczynia dyfuzyjne do kalibracji, przygotowane z zastosowaniem znanych mas fluorków, służą do wygenerowania krzywej wzorcowej dla kwantyfikacji, a próbki kontroli jakości weryfikują stabilność elektrody. Reprezentatywne wyniki uzyskane od młodocianych i dojrzałych myszy eksponowanych na 0 lub 125 ppm fluorków demonstrują zdolność metody do wykrywania różnic w poziomach fluorków w surowicy, kościach i zębach, zależnych od wieku i dawki. Niniejszy protokół zapewnia solidne, oparte na kalibracji podejście do ilościowego oznaczania fluorków w różnorodnych macierzach biologicznych i jest odpowiedni do badań nad ekspozycją na fluorki, ich odkładaniem się w tkankach oraz skutkami toksykologicznymi w modelach mysich. Kluczową zaletą tej metody jest możliwość dokładnej kwantyfikacji fluorków w niezwykle małych próbkach, w tym w 3–5 mg popiołu uzyskanego z pojedynczych siekaczy mysich, ponieważ proces dyfuzji koncentruje wszystkie uwolnione fluorki w mierzalnej objętości próbki mniejszej niż 100 µL.

Wprowadzenie

Fluorek jest naturalnie występującym anionem, a jego optymalny poziom jest skuteczny w zapobieganiu próchnicy zębów1,2,3,4,5. W Stanach Zjednoczonych (U.S.) fluoryzacja wody w społecznościach na poziomie 0,7 ppm została wprowadzona jako strategia zdrowia publicznego w celu zmniejszenia zapadalności na próchnicę i poprawy zdrowia jamy ustnej6. Jednakże przedłużone spożywanie nadmiernych ilości fluorków może niekorzystnie wpływać na wiele tkanek. Wysoka ekspozycja na fluorki zaburza tworzenie się szkliwa7,8,9, zmienia proces kostnienia10 i upośledza integralność szkieletu11.

Na poziomie komórkowym ekspozycja na fluor wywołuje szereg zaburzeń metabolicznych, w tym stres oksydacyjny12, stres retikulum endoplazmatycznego13, modyfikacje epigenetyczne zmieniające ekspresję genów14 oraz apoptozę w ameloblastach15,16,17,18. W skali globalnej podwyższone stężenia fluorków w wodach gruntowych (>1.5 ppm) stanowią istotny problem zdrowotny. Niedawne badanie z wykorzystaniem modelowania predykcyjnego wykazało, że około 180 milionów ludzi na całym świecie jest potencjalnie narażonych na nadmierną ekspozycję na fluor, przy czym największe obciążenie występuje w Azji i Afryce1. Poza wodą pitną ekspozycja na fluor następuje również poprzez żywność (np. owoce morza; ~1.9 ppm), napoje (np. herbata; 0.5–6 ppm19) oraz produkty stomatologiczne, takie jak pasta do zębów20 (1,000–1,500 ppm).

Zrozumienie ekspozycji na fluor, jego metabolizmu i depozycji w tkankach jest zatem niezbędne do oceny zarówno korzyści terapeutycznych, jak i potencjalnych skutków toksykologicznych. Precyzyjne oznaczenie ilości fluoru w próbkach biologicznych — w tym w moczu, surowicy, kościach i zębach — stanowi krytyczny element tych badań. Pomiar ten jest jednak trudny analitycznie ze względu na właściwości chemiczne fluoru oraz jego silne powinowactwo do macierzy bogatych w wapń. Około 99% fluoru w organizmie znajduje się w tkankach zmineralizowanych, takich jak kości i zęby21. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowano szereg technik analitycznych, w tym potencjometrię z użyciem elektrody jonoselektywnej (ISE), chromatografię jonową, testy kolorymetryczne, procedury miareczkowe oraz metody jądrowe lub aktywacyjne22. Wśród nich technika dyfuzji wspomaganej heksametyldisiloksanem (HMDS) w połączeniu z pomiarem za pomocą elektrody selektywnej wobec jonów fluorkowych stała się jednym z najniezawodniejszych i najszerzej stosowanych podejść w przypadku macierzy biologicznych ze względu na swoją czułość, powtarzalność i kompatybilność z różnymi typami próbek23,24,25,26,27,28,29.

Mimo dostępności wielu metod analitycznych, każde podejście posiada ograniczenia, które mogą zawężać jego zastosowanie w badaniach eksperymentalnych lub klinicznych. Chromatografia jonowa zapewnia wysoką czułość i selektywność, lecz wymaga specjalistycznej aparatury i rozbudowanego przygotowania próbek30,31. Metody kolorymetryczne, takie jak metoda SPADNS (sód 2‑(parasulfofenyloazo)‑1,8-dihydroksynaftaleno-3,6‑disulfonian), są proste i niedrogie, ale są podatne na interferencje wywołane mętnością i endogennymi chromoforami, co ogranicza ich wiarygodność w złożonych próbkach biologicznych22,32,33. Metody miareczkowe są kosztowo efektywne i proste, lecz brakuje im czułości wymaganej do wykrywania śladowych ilości fluorków w większości preparatów biologicznych34. Techniki jądrowe lub oparte na aktywacji oferują wyjątkową czułość, ale wymagają dostępu do reaktorów lub źródeł neutronów opartych na akceleratorach, co czyni je niepraktycznymi do rutynowego użytku laboratoryjnego35. W przeciwieństwie do nich, dyfuzja wspomagana przez HMDS, a następnie pomiar ISE, zapewnia praktyczną równowagę między czułością, kosztem a dostępnością, zapewniając jednocześnie całkowite uwolnienie fluorków zarówno z tkanek miękkich, jak i zmineralizowanych. Jest to szczególnie korzystne w badaniach z udziałem małych zwierząt, gdzie dostępność tkanek jest ograniczona, a struktury zmineralizowane, takie jak siekacze myszy, dostarczają jedynie 3–5 mg popiołu na ząb.

Zdolność metody dyfuzyjno-ISE do koncentracji całego uwolnionego fluorku w małej, określonej objętości umożliwia dokładne oznaczanie ilościowe nawet w niezwykle małych próbkach. Dzięki temu metoda ta jest dobrze dostosowana do badań toksykokinetycznych, eksperymentów dawka-odpowiedź oraz badań metabolizmu fluorków na różnych etapach rozwoju. Małe gryzonie, w szczególności myszy C57BL/6J, są szeroko stosowane jako modele zwierzęce do badania efektów działania fluorków7,9,12,29,36.

W niniejszym protokole autorzy stosują technikę dyfuzji wspomaganej przez HMDS, a następnie pomiar za pomocą elektrody selektywnej wobec fluorków w celu ilościowego oznaczenia poziomu fluorków w surowicy, kościach i zębach pobranych od myszy eksponowanych na wysoką dawkę fluorków (125 ppm) w porównaniu z nieleczoną grupą kontrolną. Autorzy porównują ponadto akumulację fluorków u myszy w wieku młodzieńczym (6 tygodni w momencie rozpoczęcia leczenia) i dojrzałym (18 tygodni w momencie rozpoczęcia leczenia), aby ocenić zależne od wieku różnice w metabolizmie fluorków i ich odkładaniu się w tkankach. Jako reprezentatywną tkankę zębną wybrano siekacze żuchwy, ponieważ siekacze gryzoni wyrastają w sposób ciągły i osiągają stan równowagi między wyrastaniem a ścieraniem okluzyjnym mniej więcej w 7. tygodniu życia. Ten wzorzec ciągłego wzrostu zapewnia spójny i dostępny gradient rozwoju szkliwa, co czyni siekacze mysie powszechnie stosowanym i dobrze zwalidowanym modelem do badania formowania się szkliwa oraz fluorozy zębów.

Protokół

Wszystkie procedury opisane w niniejszym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami dotyczącymi wykorzystania kręgowców, zatwierdzonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Nova Southeastern University (protokół nr 2023.02.MSuz1), które posiada akredytację Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Wszystkie prace z udziałem zwierząt były zgodne z przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz wytycznymi American Veterinary Medical Association (AVMA) w zakresie eutanazji zwierząt. Wszystkie materiały użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Zwierzęta oraz przygotowanie i podawanie fluorku sodu w modelu mysim

  1. Zwierzęta: Przydziel samce myszy C57BL/6J do dwóch grup wiekowych: młodzieńczych (6 tygodni w momencie rozpoczęcia leczenia) oraz dojrzałych (18 tygodni w momencie rozpoczęcia leczenia).
    1. Zapewnij każdej grupie dostęp do wody dejonizowanej wolnej od fluorków (0 ppm F⁻) lub wody pitnej uzupełnionej fluorkiem sodu (125 ppm F⁻) przez 6-tygodniowy okres ekspozycji.
    2. W każdej grupie wiekowej i warunkach leczenia uwzględnij pięć zwierząt (N = 5/grupa).
    3. Po zakończeniu okresu ekspozycji pobierz surowicę, kości udowe oraz siekacze żuchwy, a następnie przygotuj wszystkie zebrane próbki do dalszych analiz.
      UWAGA: Próbka: Przetworzony materiał, taki jak popiół z kości, popiół z zęba oraz surowica.
  2. Zakwaterowanie i dieta zwierząt: Utrzymuj myszy w standardowych warunkach laboratoryjnych z dostępem ad libitum do pożywienia i wody.
    1. Zapewnij dietę wolną od fluorków na tydzień przed pobraniem zębów, kości i surowicy, aby zminimalizować tło stężenia fluorków.
  3. Woda pitna z fluorkiem sodu
    1. Aby przygotować wodę pitną uzupełnioną fluorkiem, rozpuść fluorek sodu (NaF) w wodzie dejonizowanej, aby uzyskać pożądane stężenie fluorków (np. 125 ppm F⁻).
    2. Przefiltruj roztwór przez filtr próżniowy 0,2 µm do autoklawowanej butelki. Przygotowuj świeży roztwór co 2 dni.
      OSTRZEŻENIE: NaF jest toksyczny w przypadku połknięcia i może powodować podrażnienia skóry i oczu. Pracuj pod wyciągiem, nosząc fartuch laboratoryjny, rękawice nitrylowe i okulary ochronne.
  4. W przypadku wody kontrolnej wolnej od fluorków, przefiltruj wodę dejonizowaną przez filtr próżniowy 0,2 µm do autoklawowanej butelki. Przygotowuj świeżą wodę co 2 dni.
  5. Zapewnij wodę pitną uzupełnioną fluorkiem lub wolną od fluorków ad libitum przez wymagany czas leczenia fluorkami. Codziennie monitoruj poziom wody i wymieniaj butelki co 2 dni.
  6. Po zakończeniu okresu ekspozycji uśmierć zwierzęta poprzez inhalację dwutlenkiem węgla (CO₂) z następującą po niej dekapitacją. Procedury eutanazji przeprowadzono zgodnie z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji zwierząt i zostały one zatwierdzone w ramach instytucjonalnego protokołu IACUC.
    OSTRZEŻENIE: CO2 jest środkiem duszącym. Procedury wykonuj w dobrze wentylowanym pomieszczeniu i upewnij się, że komora działa prawidłowo. Unikaj bezpośredniego wdychania gazu.

2. Przygotowanie próbek do pomiaru fluorków

  1. Pobieranie krwi
    1. Myszy należy uśmiercić poprzez inhalację CO₂ i niezwłocznie pobrać krew za pomocą terminalnej punkcji serca, używając strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 mL. Krew należy przenieść do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Wszystkie zużyte igły i strzykawki należy zutylizować w zatwierdzonym przez instytucję pojemniku na odpady ostre.
      OSTRZEŻENIE: Igły strzykawek są ostre i mogą spowodować rany kłute; należy z nimi obchodzić się ostrożnie.
    2. Krew należy przechowywać przez 30 min w temperaturze pokojowej, a następnie wirować przez 10 min przy 2,000 × g.
    3. Nadtłocz (serum) należy przenieść do probówki do mikrocentryfugi i przechowywać w temperaturze −80 °C.
      OSTRZEŻENIE: Zamrażarki niskotemperaturowe stwarzają ryzyko odmrożeń. Podczas pracy z probówkami należy nosić rękawice izolacyjne i unikać przedłużanego kontaktu skóry z zimnymi powierzchniami.
  2. Kości
    1. Ekstrakcja kości udowych: Po uśmierceniu zwierząt należy wypreparować kończyny tylne w stawach biodrowych.
    2. Należy ostrożnie usunąć wszystkie tkanki miękkie z kości udowych. Tkanki należy przemyć trzy razy wodą dejonizowaną. Kości należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej obróbki. Usunięte tkanki miękkie oraz wszelkie zanieczyszczone materiały należy zutylizować w instytucjonalnym strumieniu odpadów biologicznych.
      UWAGA: Tkanki można utrwalić w 4% paraformaldehydzie z 2% sacharozą przez 12–16 h w celu długoterminowego przechowywania w 70% etanolu. Ta procedura utrwalania nie wpływa na dokładność późniejszej kwantyfikacji fluorków.
    3. Kości należy dokładnie wypłukać wodą dejonizowaną. Nadmiar wilgoci należy osuszyć ręcznikiem papierowym niepozostawiającym włókien.
    4. Kości należy przenieść do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL z otwartymi zakrętkami, aby umożliwić odparowanie, i umieścić w suszarce w temperaturze 60 °C na 12–16 h.
      OSTRZEŻENIE: Suszarka może spowodować oparzenia. Podczas pracy z próbkami należy używać rękawic odpornych na wysoką temperaturę.
    5. Opopielanie kości: Wysuszone kości należy przenieść do tygli z tlenku glinu. Tygle należy umieścić w piecu muflowym i nagrzać do 600 °C z szybkością 150 °C/h, a następnie utrzymać tę temperaturę przez 6 h. Przed wyjęciem tygli należy poczekać, aż piec ochłodzi się do temperatury poniżej 200 °C. Pozostałe fragmenty kości lub zanieczyszczone materiały eksploatacyjne należy zutylizować w instytucjonalnym strumieniu odpadów biologicznych.
      OSTRZEŻENIE: Piec muflowy i tygle osiągają ekstremalnie wysokie temperatury, co stwarza poważne ryzyko oparzeń. Zawsze należy odczekać do ostygnięcia pieca przed wyjęciem tygli. Podczas wyjmowania tygli należy nosić fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice odporne na wysoką temperaturę oraz używać długich pincet, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z gorącymi powierzchniami.
      KROK KRYTYCZNY: Niepełne opopielanie wpłynie negatywnie na późniejsze analizy. Przed kontynuacją należy upewnić się, że materiał kostny osiągnął stan pełnego utlenienia; obecność resztkowego węgla będzie zakłócać kolejne pomiary.
      UWAGA: Prawidłowo opopielona kość powinna mieć jednolity kolor od jasnoszarego do białego. Ciemniejsze drobiny — zwłaszcza czarne lub przypominające węgiel osady — wskazują na niepełne spalanie. W przypadku wystąpienia przebarwień należy wydłużyć czas opopielania, aby umożliwić całkowite usunięcie materiału organicznego.
    6. Przechowywanie opopielonych kości: Bezpośrednio po opopieleniu kości należy przenieść do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Probówki należy uszczelnić Parafilmem i przechowywać w eksykatorze próżniowym do czasu użycia.
  3. Zęby
    1. Ekstrakcja siekaczy dolnych: Należy wykonać cięcie poziome na wysokości stawu skroniowo-żuchwowego, aby oddzielić żuchwę od szczęki.
    2. Należy wykonać cięcia w płaszczyźnie strzałkowej, aby podzielić zarówno szczękę, jak i żuchwę na połowy lewą i prawą.
    3. Tkanki należy przemyć trzy razy wodą dejonizowaną i ostrożnie wyekstrahować siekacze dolne. Wyekstrahowane siekacze należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia. Wyekstrahowane tkanki miękkie oraz wszelkie zanieczyszczone materiały eksploatacyjne należy zutylizować w instytucjonalnym strumieniu odpadów biologicznych.
      OSTRZEŻENIE: Podczas wykonywania cięć w obrębie stawu skroniowo-żuchwowego i w płaszczyźnie strzałkowej należy ostrożnie posługiwać się ostrymi narzędziami chirurgicznymi, aby uniknąć obrażeń. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne.
      UWAGA: Tkanki można utrwalić w 4% paraformaldehydzie z 2% sacharozą przez 12–16 h w celu długoterminowego przechowywania w 70% etanolu. Ta procedura utrwalania nie wpływa na dokładność późniejszej kwantyfikacji fluorków.
    4. Przygotowanie zębów do opopielania: Zęby należy dokładnie wypłukać wodą dejonizowaną i umieścić w 1% nadtlenku wodoru (H₂O₂) na 12–16 h. Zużyte roztwory nadtlenku wodoru należy zutylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne.
    5. Zęby należy ponownie wypłukać wodą dejonizowaną, krótko osuszyć chusteczką niepozostawiającą włókien i przenieść do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL z otwartymi zakrętkami. Probówki należy umieścić w suszarce w temperaturze 60 °C na 12–16 h.
      OSTRZEŻENIE: Nadtlenek wodoru jest utleniaczem i może powodować podrażnienia skóry i oczu. Należy go używać w dygestorium, nosząc fartuch laboratoryjny, rękawice nitrylowe i okulary ochronne. Należy unikać kontaktu z materiałami łatwopalnymi.
    6. Opopielanie zębów: Wysuszone zęby należy przenieść do tygli z tlenku glinu i opopielić w piecu muflowym w temperaturze 600 °C przez 20 h, stosując szybkość nagrzewania 150 °C/h.
    7. Tygle należy wyjmować dopiero po ochłodzeniu się pieca poniżej 200 °C.
      OSTRZEŻENIE: Piec muflowy i tygle osiągają ekstremalnie wysokie temperatury, co stwarza poważne ryzyko oparzeń. Należy odczekać, aż piec ochłodzi się poniżej 200 °C przed wyjęciem tygli. Podczas wyjmowania tygli należy nosić fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice odporne na wysoką temperaturę oraz używać długich pincet, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z gorącymi powierzchniami.
      KROK KRYTYCZNY: Należy zapewnić pełne utlenienie; resztkowy węgiel będzie zakłócać późniejsze analizy.
      UWAGA: Opopielony materiał zębowy powinien mieć jednolity kolor od jasnoszarego do białego. Jeśli pozostaną czarne osady, należy powtórzyć proces opopielania.
    8. Przechowywanie opopielonych próbek zębów: Bezpośrednio po opopieleniu zęby należy przenieść do okrągłodennych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL.
    9. Probówki należy uszczelnić Parafilmem i przechowywać w eksykatorze próżniowym do czasu użycia.

3. Przygotowanie szalek do dyfuzji wspomaganej HMDS

  1. Odczynniki i materiały
    1. Kwas siarkowy 6 N: Przynajmniej dwa dni przed przygotowaniem szalek do dyfuzji należy sporządzić roztwór zapasowy kwasu siarkowego 6 N.
      UWAGA: Płytka dyfuzyjna: szczelne naczynie zaprojektowane w celu stworzenia kontrolowanego zamkniętego środowiska, w którym składniki uwalniane z przetworzonego materiału biologicznego mogą zostać wychwycone przez pułapkę chemiczną przymocowaną do pokrywy. Szczelna konstrukcja zapobiega wymianie z powietrzem zewnętrznym i zapewnia, że uwalniane anality są kierowane do pułapki w celu późniejszego pomiaru.
    2. Umieścić plastikowy zlewka o pojemności 1 L z mieszadełkiem magnetycznym na mieszadle magnetycznym i dodać 416 ml wody ultrapure.
    3. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 50 ml powoli dodaj 84 ml 36 N H₂SO₄ do wody, cały czas mieszając. Roztwór stanie się gorący; należy odstawić go do wystygnięcia do temperatury pokojowej.. Nieużyte lub zużyte roztwory kwasu siarkowego należy utylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne w ramach instytucjonalnego systemu usuwania odpadów chemicznych.
      OSTROŻNIE: Kwas siarkowy jest silnie żrący. Należy z nim pracować w dygestorium, używając rękawic odpornych na kwasy, fartucha laboratoryjnego i okularów ochronnych. W przypadku kontaktu należy niezwłocznie przemyć miejsce narażenia obfitym strumieniem wody.
    4. Kwas siarkowy 6 N nasycony HMDS: Przenieść kwas siarkowy 6 N do rozdzielacza o pojemności 2 l i dodać 15 ml heksametylodisiloksanu (HMDS).
    5. Należy upewnić się, że korek i kran są szczelnie zamknięte, trzymać rozdzielacz w pozycji poziomej i energicznie wstrząsać do momentu pojawienia się drobnych kropli HMDS.
    6. Otwórz korek, aby uwolnić gaz rozwijający, i powtórz ten proces jeszcze dwa razy.
    7. Pozostaw korek uchylony przez kilka godzin. Zlew rozdzielający zawierający 6 N kwas siarkowy nasycony HMDS należy przechowywać w statywie wewnątrz dygestorium. Kwas siarkowy zawierający HMDS oraz materiały zanieczyszczone należy utylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne.
      UWAGA: HMDS jest łatwopalny i toksyczny w przypadku inhalacji. Należy z nim pracować w dygestorium, nosząc fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne. Przechowywać z dala od źródeł zapłonu.
    8. 0,05 N wodorotlenek sodu: Rozpuścić 1 g granulatu NaOH w 25 ml wody ultrapurej w celu przygotowania 1 N roztworu stokowego.
    9. Wymieszać 2 ml roztworu zapasowego NaOH o stężeniu 1 N z 38 ml wody ultrapure, aby otrzymać 0,05 N roztwór NaOH.
    10. Rozdziel 0,05 N NaOH do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml w ilościach na jednorazowe użycie, zabezpiecz nakrętki Parafilmem i przechowuj probówki w eksykatorze próżniowym, aby zminimalizować absorpcję CO₂. Nieużyte lub zużyte roztwory wodorotlenku sodu należy utylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne.
      UWAGA: Wodorotlenek sodu jest silnie żrący i może spowodować poważne oparzenia. Należy stosować fartuch laboratoryjny, rękawice oraz okulary ochronne. Z roztworami należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć rozprysków.
    11. 0,2 N kwas octowy: Dodać 575 µL dodaj lodowaty kwas octowy do wody ultrazczystej i uzupełnij do końcowej objętości 50 ml, aby przygotować 0,2 N kwas octowy. Roztwory kwasu octowego należy utylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne.
      UWAGA: Kwas octowy ma właściwości żrące i może podrażniać skórę, oczy oraz drogi oddechowe. Należy z nim pracować w dygestorium, nosząc fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne.
    12. Wazelina: Roztopić około 100 g wazeliny w temperaturze 60 °C w piekarniku. Naciągnąć płynną wazelinę do strzykawek 10 ml, a następnie pozostawić do ostygnięcia i zestalenia. Strzykawki wypełnione wazeliną można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni.
    13. Szalka Petriego: Do przygotowania szalek do dyfuzji należy użyć nieobrobionych szalek Petriego o wymiarach 60 × 15 mm.
    14. Wytop mały otwór w pokrywce szalki Petriego, używając rozgrzanej igły do strzykawki o rozmiarze 18 G.
    15. Nanieś ciągłą warstwę wazeliny na wewnętrzną krawędź pokrywki, używając strzykawki 10 mL z założoną tępa igłą 14 G. Wszystkie zużyte igły należy zutylizować w zatwierdzonym przez instytucję pojemniku na odpady ostre.
      UWAGA: Igły strzykawkowe są ostre i mogą spowodować zranienia kłute. Należy z nimi obchodzić się ostrożnie i utylizować je w zatwierdzonych pojemnikach na odpady ostre. Podczas podgrzewania igieł należy stosować rękawice odporne na wysoką temperaturę oraz ochronę oczu, aby zapobiec poparzeniom.
    16. Roztwory zapasowe NaF do kalibracji naczyń dyfuzyjnych. Rozpuścić 4,19 g NaF w 1 l wody ultrapurej w celu przygotowania 100 mM roztworu zapasowego. Przygotować 10 mM, 100 µMi 10 µM roztwory stokowe poprzez sekwencyjne rozcieńczenia 1:10 roztworu 100 mM.
      UWAGA: Jeden mol NaF dostarcza 19 g F⁻; zatem 1 µL z 10 µM NaF zawiera 0,19 ng F⁻ i 1 µL 10 mM NaF zawiera 190 ng F⁻.
      UWAGA: Szalki dyfuzyjne do kalibracji: Szalki dyfuzyjne stosowane specjalnie do kalibracji z użyciem znanej masy jonów fluorkowych (F¯).
  2. Przygotowanie szalek dyfuzyjnych specyficznych dla rodzaju próbki
    1. Szalka do dyfuzji surowicy: Do dna szalki Petri wpipetować 3 ml wody ultrapure i dodać 75 µL surowicę. Wszelkie materiały zanieczyszczone surowicą należy zutylizować zgodnie z instytucjonalnymi procedurami usuwania odpadów biologicznych. Przejdź do kroku 3.4.
    2. Szalka do dyfuzji kostnej
      1. Pulweryzacja popiołu kostnego: Za pomocą mikrospatułki rozetrzeć popiół kostny w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml na drobny proszek. Przystąpić do przetwarzania spulweryzowanego popiołu kostnego niezwłocznie. Zużyte materiały zanieczyszczone popiołem kostnym należy utylizować zgodnie z instytucjonalnymi procedurami usuwania odpadów chemicznych.
      2. Ważenie i nawadnianie popiołu kostnego
        1. Umieść pustą część dolną szalki Petriego na szalce wagi analitycznej o rozdzielczości co najmniej 0,1 mg.
        2. Przenieść zmielony popiół kostny z probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml do małej porcelanowej szalki, aby zminimalizować ładunek elektrostatyczny i zapobiec rozproszeniu proszku.
        3. Za pomocą mikroszpatułki należy przenieść około 5 mg popiołu kostnego do naczynia i niezwłocznie przykryć proszek 3 ml wody ultrapurej, a następnie zdjąć naczynie z wagi analitycznej, aby uniknąć rozprzestrzenienia się popiołu.
        4. Zanotuj dokładną masę każdej próbki popiołu kostnego. Przejdź do kroku 3.4.
    3. Szalka dyfuzyjna do zębów
      1. Frezowanie zpopiołowanych zębów
        1. Przenieść spopielone siekacze do probówek do mikrowirówki o dnie okrągłym o pojemności 2 mL i do każdej probówki dodać stalową kulkę o średnicy 5 mm. Zamknąć probówki i zabezpieczyć nakrętki Parafilmem.
        2. Sproszkować zpopiołe siekacze w homogenizatorze kuleczkowym przy 2500 obr./min przez 10 s. Bezzwłocznie przystąpić do dalszej obróbki zmielonych zębów.
      2. Ważenie i nawadnianie zpopiołowanych zębów
        1. Przelej całą zawartość probówki, w tym kulkę ze stali nierdzewnej, na dno szalki dyfuzyjnej umieszczonej na szali wagi analitycznej. Zużyte materiały zanieczyszczone popiołem z zębów należy zutylizować zgodnie z instytucjonalnymi zasadami usuwania odpadów chemicznych.
        2. Wyjmij stalową kulkę z naczynia i zapisz dokładną masę popiołu z zęba (zazwyczaj 3–4 mg na jeden siekacz dolny).
        3. Należy niezwłocznie dodać 3 ml wody ultrapure, aby przykryć popiół z zęba, a następnie zdjąć naczynie z wagi, co zapobiegnie rozproszeniu popiołu spowodowanemu wyładowaniami elektrostatycznymi. Należy kontynuować od kroku 3.4.
  3. Kalibracja i kontrola jakości szalek dyfuzyjnych
    1. Równolegle z szalkami do dyfuzji próbek należy przygotować dwa zestawy kalibracyjnych szalek do dyfuzji dla kalibracji 5–6 punktowej oraz jeden identyczny zestaw szalek do dyfuzji do kontroli jakości, w tym próbę ślepą.
      UWAGA: Szalki dyfuzyjne do kontroli jakości: Przygotowywane analogicznie do szalek dyfuzyjnych kalibracyjnych, lecz stosowane okresowo w celu weryfikacji stabilności elektrody i zapewnienia spójności wyników pomiarowych.
    2. Do każdej z 11 lub 13 szalek Petriego pipetuj 3 ml wody ultrapure i dodaj roztwór NaF z zapasu, tak aby objął on przewidywany zakres masy F¯ w próbkach preparatów. Kontynuuj od kroku 3.4., aby ukończyć montaż szalek do dyfuzji.37.
  4. Zakończenie montażu szalki dyfuzyjnej
    1. Aby przygotować osad pułapki fluorkowej, 50 µl trzy krople 0,05 N NaOH nanosi się na wewnętrzną powierzchnię pokrywki szalki Petriego, w znacznej odległości od jej krawędzi.
      UWAGA: Pułapka na fluorki (F¯ Trap): Komponent naczyń dyfuzyjnych służący do wychwytywania jonów F¯, a konkretnie wodorotlenek sodu (NaOH).
    2. Odwróć pokrywkę, uważając, aby nie naruszyć kropel NaOH, a następnie szczelnie przylep ją do dna szalki za pomocą wazeliny.
    3. Aby przygotować 3 N roztwór kwasu siarkowego nasyconego HMDS, należy zmieszać równe objętości 6 N kwasu siarkowego nasyconego HMDS oraz wody ultrapure. Roztwór należy przygotować bezpośrednio przed użyciem, ponieważ nie nadaje się on do przechowywania.
    4. Wstrzyknąć 3 ml przygotowanego 3 N kwasu siarkowego nasyconego HMDS przez otwór w pokrywie do wody znajdującej się na dnie naczynia dyfuzyjnego, używając strzykawki 10 ml z igłą 20 G. Należy uważać, aby podczas wkładania i wyjmowania igły strzykawki nie rozpryskać kwasu na wewnętrzną powierzchnię pokrywy.
    5. Dyfuzja fluorków wspomagana HMDS: Natychmiast uszczelnić otwór wtryskowy kroplą wazeliny całkowicie zakrywającej otwór, a następnie umieścić szalki dyfuzyjne na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na niskie obroty. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej (Rycina 1).

Schemat szalki Petriego; pułapka na fluorki (F-Trap), uszczelnienie z wazeliny, popiół kostny, proces z wykorzystaniem kwasu siarkowego nasyconego HDMS.
Rycina 1: Schemat szalki do dyfuzji kostnej służącej do ekstrakcji i wychwytywania fluorków. Rycina 1 przedstawia konstrukcję szalki do dyfuzji kostnej złożonej w nieobrobionej szalce Petriego o wymiarach 60 × 15 mm. Pokrywka posiada niewielki otwór wtryskowy uszczelniony kuleczką wazeliny. Na wewnętrznej powierzchni pokrywki umieszczono trzy krople NaOH służące jako pułapki jonów fluorkowych (F⁻), zawieszone z pokrywki podczas procesu dyfuzji. Pokrywka jest szczelnie zamknięta przy podstawie szalki za pomocą wazeliny. W dnie szalki Petriego znajduje się woda ultrapure, kwas siarkowy nasycony heksametylodisiloksanem (HMDS) oraz popiół kostny, które wspólnie tworzą środowisko reakcyjne dla uwalniania i późniejszego wychwytywania fluorków. Rycina ta została stworzona przez autorów przy użyciu programu Biorender i jest udostępniona na licencji CC BY. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

4. Pomiar zawartości fluorków za pomocą ISE

  1. Konfiguracja ISE
    1. Napełnić dwukanałową elektrodę selektywną względem jonów fluorkowych odpowiednim roztworem wypełniającym, podłączyć ją do potencjometru i zamocować elektrodę w uchwycie.
    2. Umieścić nieobrobioną szalkę Petriego na podnośniku nożycowym pod powierzchnią pomiarową elektrody, upewniając się, że powierzchnia pomiarowa jest równoległa do dna szalki Petriego, a następnie podnieść blat podnośnika tak, aby szalka Petriego niemal dotykała elektrody (Rysunek 2).
  2. Przygotowanie próbek do pomiaru
    UWAGA: Próbki: W protokole mianem próbek określa się wyłącznie końcowe produkty mierzone elektrodą jon-selektywną (ISE), składające się z pułapki F¯ po dyfuzji, która została następnie połączona z kwasem octowym i wodą. 
    1. Aby dostosować pH próbki do wartości 5, wyjąć szalkę dyfuzyjną z wytrząsarki i po okresie inkubacji ostrożnie zdjąć pokrywkę, naruszając uszczelnienie z wazeliny. Odwrócić pokrywkę na płaskiej powierzchni, dbając o to, aby trzy krople pułapki F¯ pozostały nienaruszone.
    2. Za pomocą pipety P20 dodać 15–20 µL 0,2 N kwasu octowego do jednej kropli, a następnie połączyć wszystkie trzy krople w jedną, nie zmieniając końcówki pipety.
      UWAGA: Próbki o wysokich stężeniach F¯ mają tendencję do niższego pH początkowego i dlatego wymagają mniejszej ilości 0,2 N kwasu octowego do dostosowania pH do 5 w porównaniu z próbkami zawierającymi mniej F¯. Ponieważ pozostała objętość próbki po odczycie potencjału elektrody (krok 5.3) jest minimalna, należy wykorzystać resztkę dostępnej próbki do weryfikacji pH za pomocą papierka wskaźnikowego.
    3. Aby dostosować objętość próbki, ustawić pipetę P100 na 75 µL, odessać całą objętość pułapki F¯ bez wprowadzania powietrza i uzupełnić próbkę do dokładnie 75 µL za pomocą wody ultra-czystej.
    4. Krok ten należy wykonać ostrożnie, aby zapewnić dokładną objętość niezbędną do obliczeń stężenia fluorków. Próbkę należy pozostawić w końcówce pipety i niezwłocznie przejść do kroku 4.3.
  3. Pomiar próbek badawczych, wzorców kalibracyjnych i próbek kontroli jakości
    1. Aby zmierzyć potencjał elektrody próbki, nanieść ją pomiędzy powierzchnię pomiarową elektrody selektywnej względem jonów fluorkowych a szalkę Petriego. Należy upewnić się, że cała powierzchnia pomiarowa elektrody jest całkowicie zanurzona w cieczy, nie stykając się bezpośrednio z szalką Petriego. Odczekać do ustabilizowania się odczytu potencjometru i zapisać potencjał (mV) wyświetlony przez ISE.
    2. Wyznaczyć krzywą kalibracyjną poprzez sekwencyjny pomiar pierwszego zestawu wzorców kalibracyjnych, zaczynając od najniższego stężenia F¯ i przechodząc do najwyższego.
      1. Nanieść potencjał elektrody (mV) w funkcji logarytmu F¯ (ng), aby zbudować krzywą kalibracyjną (Rysunek 3). Zastosować regresję wykładniczą w celu uzyskania równania krzywej wzorcowej i współczynnika determinacji (R2). Akceptować krzywe kalibracyjne tylko wtedy, gdy R2 wynosi ≥ 0,99.
    3. Zmierzyć każdą próbkę badawczą i zapisać potencjał elektrody (mV).
    4. Aby monitorować stabilność elektrody i wykrywać potencjalny dryft analizy, mierzyć próbki kontroli jakości w odstępach czasu podczas każdego cyklu analitycznego.
      1. Porównać wartości próbek kontroli jakości bezpośrednio z odpowiadającymi im próbkami kalibracyjnymi i potwierdzić zgodność w granicach około 5%, aby zweryfikować stabilną pracę elektrody w czasie.
      2. Okresowo mierzyć pustą szalkę dyfuzyjną, aby potwierdzić brak zanieczyszczeń fluorkami podczas obchodzenia się z próbkami i dyfuzji.
  4. Aby obliczyć masę F¯(ng) w każdej próbce badawczej, należy użyć równania krzywej wzorcowej. Następnie masę tę podzielić przez objętość (µL) surowicy lub masę (mg) popiołu z kości lub zęba dodaną do szalki dyfuzyjnej.
    1. Przykład obliczenia stężenia F¯ w popiele kostnym (ng/mg)
      1. Masa popiołu kostnego dodana do szalki dyfuzyjnej: 5,1 mg; Potencjał elektrody dla 75 µL próbki badawczej: –31,6 mV
      2. Krok 1: Obliczanie masy fluorków przy użyciu równania kalibracyjnego
        1. Masa F⁻ (ng) = 3505,4 x e(-0,043x-31,6)
        2. Masa F⁻ (ng) = 13 641 ng
      3. Krok 2: Obliczanie stężenia fluorków w popiele kostnym
        1. Stężenie F⁻ = 13 641 ng / 5,1 mg
        2. Stężenie F⁻ = 2 675 ng / mg (ppm)

Schemat analizy potencjometrycznej: ISE z potencjometrem mierzy próbkę na podnośniku nożycowym w celu detekcji jonów.
Rycina 2: Schemat układu pomiarowego ISE.Rycina 2 przedstawia konfigurację stosowaną do pomiarów jonów fluorkowych z użyciem dwukanałowej elektrody jonoselektywnej (ISE). Szalka Petriego jest umieszczona na podnośniku nożycowym, co umożliwia precyzyjną regulację jej wysokości względem elektrody. ISE jest podłączona do potencjometru i zorientowana tak, aby jej powierzchnia pomiarowa była równoległa do płaszczyzny szalki Petriego, zachowując odległość około 1–2 mm. Po ustawieniu odstępu, niewielka objętość próbki (75 µL) jest pipetowana w szczelinę między powierzchnią pomiarową a szalką Petriego, co zapewnia pełne pokrycie obszaru pomiarowego elektrody próbką podczas pomiaru. Rycina ta została stworzona przez autorów przy użyciu programu Biorender i jest udostępniona na licencji CC BY. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykres kalibracyjny jonów fluorkowych; regresja liniowa; potencjał elektrody względem stężenia w mV/nanogramach.
Rycina 3: Krzywa kalibracyjna i odpowiadająca jej tabela kalibracyjna do oznaczania ilościowego masy jonów fluorkowych w próbkach zębów. Górny panel: Przykładowa krzywa kalibracyjna użyta do wyznaczania masy jonów fluorkowych w próbkach zębów. Oś x przedstawia potencjał elektrody (mV, skala liniowa), a oś y odpowiadającą mu masę jonów fluorkowych (ng F⁻, skala logarytmiczna). Zmierzone punkty kalibracyjne naniesiono w postaci linii ciągłej, a dopasowaną regresję wykładniczą przedstawiono linią przerywaną. Wstawka zawiera równanie krzywej wzorcowej oraz współczynnik determinacji (R2 = 0,99). Dolny panel: Tabela zawierająca wartości liczbowe użyte do wygenerowania krzywej kalibracyjnej. Pierwszy wiersz wymienia pięć zarejestrowanych potencjałów elektrody (mV) dla próbek kalibracyjnych. Drugi wiersz podaje odpowiadające im masy jonów fluorkowych (ng F⁻) dla każdej próbki kalibracyjnej. Trzeci wiersz wymienia objętości (µL) roztworu stokowego NaF 10 mM dodane do kalibracyjnych naczyń dyfuzyjnych; ta dodana masa jonów fluorkowych jest równoważna masie uwięzionej w każdej próbce kalibracyjnej po dyfuzji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki

Aby zademonstrować zastosowanie niniejszego protokołu do pomiaru stężeń fluorków (F-) w materiałach biologicznych, przygotowano próbki z surowicy, kości oraz siekaczy żuchwy pobranych od myszy poddanych kontrolowanym działaniom fluorków. Samce myszy C57BL/6J przydzielono do dwóch kategorii wiekowych: młodocianych (6 tygodni) i dojrzałych (18 tygodni), a następnie podawano im albo bezzawierającą fluorki wodę dejonizowaną (0 ppm F⁻), albo wodę pitną z dodatkiem fluorku sodu (125 ppm F⁻) przez 6-tygodniowy okres ekspozycji. W każdej grupie wiekowej i warunkach traktowania znajdowało się pięć zwierząt. Po zakończeniu okresu ekspozycji pobrano surowicę, kości udowe oraz siekacze żuchwy, a próbki preparowano i analizowano zgodnie z protokołem. Reprezentatywne stężenia fluorków zmierzone w surowicy, kościach i zębach zestawiono poniżej.

Wykres słupkowy stężenia fluorków; surowica, kość udowa, siekacz; analiza osobników młodzieńczych i dojrzałych.
Rycina 4: Stężenia fluorków zmierzone w surowicy, kości udowej i siekaczach dolnych. Samce myszy C57BL/6J przydzielono do dwóch kategorii wiekowych: młodzieńczych (6 tygodni, biały słupek) i dojrzałych (18 tygodni, wypełniony słupek), a następnie podawano im albo zdejonizowaną wodę wolną od fluorków (0 ppm F⁻), albo wodę pitną uzupełnioną fluorkiem sodu (125 ppm F⁻) przez 6-tygodniowy okres ekspozycji. Po zakończeniu okresu ekspozycji zmierzono poziom fluorków w (A) surowicy, (B) kości udowej i (C) siekaczach dolnych u myszy z tych samych grup badawczych. Wartości surowicy poniżej granicy wykrywalności (<0.02 ppm) naniesiono na wykres w celu wizualizacji, lecz pominięto w analizie statystycznej. Dane przedstawiono jako średnie ± SD. Porównania między grupą młodzieńczą a dojrzałą przeprowadzono za pomocą testu U Manna–Whitneya z korektą Bonferroniego–Dunna dla porównań wielokrotnych. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/grupa). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Stężenia fluorków w surowicy
W obu grupach (młodzieńczych i dojrzałych) traktowanych 0 ppm fluorków, stężenia fluorków w surowicy znajdowały się poniżej granicy wykrywalności elektrody jonoselektywnej (<0.02 ppm). W grupach traktowanych 125 ppm, stężenie fluorków w surowicy wzrosło do 0,3 ± 0,2 ppm w grupie młodzieńczej oraz do 0,7 ± 0,2 ppm w grupie dojrzałej (p = 0,06). Porównanie między młodzieńczą a dojrzałą grupą traktowaną 125 ppm przeprowadzono za pomocą testu U Manna–Whitneya z korektą Bonferroniego–Dunna dla wielokrotnych porównań. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/grupa). Grupy traktowane 0 ppm zostały wykluczone z analizy statystycznej. (Rysunek 4A, Tabela 1).

Stężenia fluorków w kości udowej
W grupach traktowanych dawką 0 ppm stężenia fluorków w kości udowej były istotnie niższe u osobników młodocianych (292 ± 39 ppm) w porównaniu z osobnikami dojrzałymi (896 ± 55 ppm) (p < 0,01). Z kolei w grupach traktowanych dawką 125 ppm stężenia fluorków u osobników młodocianych (4 108 ± 482 ppm) były istotnie wyższe niż u osobników dojrzałych (2 966 ± 612 ppm) (p = 0,04). Porównania między grupą młodocianą a dojrzałą przeprowadzono za pomocą testu U Manna–Whitneya z korektą Bonferroniego–Dunna dla porównań wielokrotnych. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/grupa). (Rysunek 4B, Tabela 1). Rysunek 5A przedstawia krotność zmiany stężenia fluorków w kości udowej pomiędzy traktowaniem dawką 0 ppm a 125 ppm dla każdej grupy wiekowej. U osobników młodocianych odnotowano 14-krotny wzrost poziomu fluorków przy dawce 125 ppm, podczas gdy u myszy dojrzałych wzrost ten był 3-krotny.

Stężenia fluorków w siekaczach żuchwy
W grupach 0 ppm stężenia fluorków w siekaczach żuchwy były znacząco niższe u adolescentów (35 ± 4 ppm) w porównaniu z dojrzałymi zwierzętami (123 ± 23 ppm) (p = 0,03). W grupach leczonych dawką 125 ppm stężenia fluorków w siekaczach wzrosły do 5641 ± 955 ppm u adolescentów i 4392 ± 1694 ppm u dojrzałych zwierząt. Porównania między grupą adolescentów i grupą zwierząt dojrzałych przeprowadzono za pomocą testu U Manna–Whitneya z korektą Bonferroniego–Dunna dla porównań wielokrotnych. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/grupa). (Rysunek 4C, Tabela 1). Chociaż bezwzględne stężenia fluorków przy 125 ppm nie różniły się znacząco między grupami wiekowymi, krotność zmiany z 0 ppm do 125 ppm była znacząco większa u adolescentów (wzrost 161-krotny) niż u dojrzałych myszy (wzrost 36-krotny) (Rysunek 5B).

Wykres słupkowy przedstawiający wpływ fluorków na krotność zmiany w tkankach kości udowej i siekacza, u osobników młodocianych w porównaniu z dojrzałymi.
Rycina 5: U osobników młodocianych obserwuje się większy wzrost krotności akumulacji fluorków w kościach i siekaczach niż u myszy dojrzałych. Krotność zmiany stężeń fluorków przy przejściu z traktowania 0 ppm na 125 ppm fluorkami u myszy młodocianych (słupek pusty) i dojrzałych (słupek wypełniony). (A) Kość udowa i (B) siekacz żuchwy z tych samych grup traktowania. Dane przedstawiono jako średnie ± SD. Porównania między grupą młodocianą a dojrzałą przeprowadzono za pomocą nieparzystego testu t. * p < 0,05, (N = 5/grupa). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

PróbkaSurowicaKość udowaSiekacz żuchwy
Grupa wiekowaMłodocianaDojrzałaMłodocianaDojrzałaMłodocianaDojrzała
Grupa badawcza0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm
< 0.020.2< 0.020.8324457693330813748241613229
< 0.020.1< 0.020.8229377892433263954511272654
< 0.020.7< 0.021.0300468387737133155441126997
< 0.020.4< 0.020.5323383280725193551141034169
< 0.020.3< 0.020.528336699372192N/A72711114909
Średnia< 0.020.3< 0.020.7292410889629663556411234392
SDNA0.2NA0.239482556123955231694

Tabela 1: Indywidualne pomiary fluorków w surowicy, kości udowej i siekaczach żuchwy. Tabela 1 przedstawia indywidualne stężenia fluorków (ppm F⁻) zmierzone w próbkach surowicy, kości udowej i siekaczy żuchwy u myszy młodzieńczych i dorosłych, poddanych działaniu 0 ppm lub 125 ppm fluorków. Dla każdego rodzaju tkanki dane przedstawiono w kolumnach odpowiadających czterem grupom badawczym: młodzieńcze 0 ppm, młodzieńcze 125 ppm, dorosłe 0 ppm oraz dorosłe 125 ppm. Każda kolumna zawiera pięć indywidualnych wartości pomiarowych (N = 5), a następnie obliczoną średnią i odchylenie standardowe (SD). W grupie surowicy młodzieńczej 0 ppm wszystkie odnotowane wartości znajdowały się poniżej granicy wykrywalności elektrody jonoselektywnej (<0.02 ppm). Tabela zawiera surowe dane numeryczne, na których opierają się wartości podsumowujące i porównania statystyczne przedstawione na Rysunku 4.

Dyskusja

Pomiary fluorków przeprowadzono przy użyciu elektrody jonoselektywnej (ISE) selektywnej względem fluorków, zawierającej membranę z kryształu fluorku lantanu (LaF₃)38,39. Membrana ta tworzy wysoce stabilne wiązania La–F, co skutkuje silną preferencją jonów fluorkowych nad innymi halogenkami. Zgodnie z uznaną literaturą elektrochemiczną i specyfikacjami producenta, membrana LaF₃ wykazuje bardzo niskie współczynniki selektywności dla chlorków, co wskazuje, że jony chlorkowe nie powodują mierzalnych zakłóceń w warunkach zastosowanych w niniejszym protokole. Chociaż chlorek występuje naturalnie w zębach i kościach, jego aktywność nie wpływa na potencjał elektrody, a rejestrowany sygnał odzwierciedla specyficznie aktywność fluorków. Dolna granica wykrywalności 0,02 ppm odpowiada potwierdzonej przez producenta minimalnej mierzalnej koncentracji dla elektrody selektywnej względem fluorków marki Orion. Granica ta odzwierciedla najniższe stężenie fluorków, przy którym elektroda utrzymuje stabilną odpowiedź nernstowską i liniową zależność od krzywej kalibracyjnej. Ponieważ granica wykrywalności jest zdefiniowana przez właściwości membrany elektrody i została zwalidowana przez producenta, w niniejszym protokole nie było wymagane dodatkowe oznaczenie eksperymentalne; jednak w odniesieniu do górnego zakresu wykrywania autorzy zaobserwowali, że masy fluorków przekraczające około 38 000 ng w 50 µL pułapce NaOH prowadziły do nieliniowej odpowiedzi elektrody, co wskazuje, że krzywa kalibracyjna nie jest już wiarygodna przy bardzo wysokich ładunkach fluorków. Nieliniowość ta wynika prawdopodobnie z przekroczenia optymalnej siły jonowej i zakresu aktywności dla elektrody w danych warunkach eksperymentalnych, a nie odzwierciedla immanentnej górnej granicy samej elektrody ISE. W przypadku próbek, w których spodziewana jest masa fluorków powyżej tego progu, zaleca się zwiększenie objętości pułapki NaOH, aby utrzymać pomiary w liniowym zakresie dynamicznym elektrody.

Należy wziąć to pod uwagę przy stosowaniu protokołu do próbek o nietypowo wysokiej zawartości fluorków. Ponieważ etap dyfuzji zużywa całą objętość próbki, w przypadku próbek biologicznych nie można było przeprowadzić pomiarów powtórzonych ani eksperymentów z odzyskiem po dodaniu wzorca (spike‑and‑recovery). Aby zapewnić dokładność i precyzję analityczną, do każdej serii pomiarowej włączono standardy kontroli jakości (QC) o znanych stężeniach fluorków. Standardy QC były przetwarzane i mierzone w ten sam sposób, co próbki doświadczalne. we wszystkich seriach pomiarowych zmierzone stężenia fluorków w standardach QC konsekwentnie mieściły się w granicach 5% ich wartości oczekiwanych. Dla każdej serii 10–20 próbek materiału przygotowano równolegle dwa niezależne zestawy po 5–6 próbek kalibracyjnych, a krzywą kalibracyjną rejestrowano przed każdą sesją pomiarową. Zakres kalibracji dostosowywano dla każdego pomiaru tak, aby odpowiadał przewidywanej masie fluorków w próbkach materiału, co zależało od rodzaju materiału, masy materiału dodanego do naczynia dyfuzyjnego, a także grupy terapeutycznej i wieku zwierzęcia. W przypadku pomiarów surowicy standardy kalibracyjne odpowiadały stężeniom fluorków w materiale na poziomie około 0,06–1,20 ppm. W przypadku pomiarów kości i zębów standardy kalibracyjne odpowiadały stężeniom fluorków w materiale na poziomie około 19–7 600 ppm.

Niniejszy protokół przedstawia czułą i powtarzalną metodę ilościowego oznaczania masy jonów fluorkowych w surowicy, kościach i zębach z wykorzystaniem dyfuzji wspomaganej heksametyldisyloksanem, a następnie analizy metodą ISE. Metoda ta niezawodnie wychwytuje fluorek uwalniany z różnorodnych matryc biologicznych i umożliwia ilościową ocenę akumulacji fluorków po kontrolowanej ekspozycji. Reprezentatywne wyniki uzyskane od myszy młodzieńczych i dorosłych wykazują wyraźne różnice w depozycji fluorków w tkankach, zależne od wieku i dawki, co podkreśla użyteczność tego podejścia w badaniu metabolizmu i toksykokinetyki fluorków in vivo.

Kluczową zaletą niniejszego protokołu jest zastosowanie naczyń dyfuzyjnych, które fizycznie oddzielają reakcję uwalniania fluorków od środowiska ich wychwytywania. Konstrukcja uszczelniona wazeliną minimalizuje wymianę z atmosferą i zapewnia efektywne wychwytywanie uwolnionych jonów fluorkowych przez krople wodorotlenku sodu znajdujące się na pokrywie. Kwas siarkowy nasycony HMDS zapewnia silną i stałą siłę napędową dla uwalniania fluorków z tkanek zmineralizowanych, w tym ze struktur silnie zwapniałych, takich jak kości i zęby. Następczy pomiar ISE, skalibrowany za pomocą standardów dopasowanych do procesu dyfuzji, umożliwia dokładną kwantyfikację w szerokim zakresie dynamicznym. Inną zaletą tego podejścia jest możliwość oznaczania ilości fluorków w niezwykle małych próbkach biologicznych. Tkanki zmineralizowane myszy, w szczególności siekacze żuchwy, dają zaledwie 3–5 mg popiołu z jednego zęba. Konwencjonalne metody analityczne często wymagają większej masy próbki lub wyższej zawartości fluorków, aby osiągnąć wiarygodną detekcję. W przeciwieństwie do nich, konstrukcja oparta na dyfuzji koncentruje wszystkie fluorki uwolnione z całego preparatu w małej, określonej objętości, co pozwala na dokładną kwantyfikację nawet w bardzo małych próbkach o niskiej bezwzględnej masie fluorków. Cechą tą jest szczególna wartość w badaniach z wykorzystaniem małych zwierząt, przy ograniczonej dostępności tkanek lub w przypadku mikrosekcjonowanych struktur zmineralizowanych.

Głównym ograniczeniem tej metody jest granica wykrywalności elektrody jonoselektywnej (ISE) zastosowanej w niniejszym badaniu (0,02 ppm). Próbki surowicy od zwierząt kontrolnych, które nie otrzymywały fluorków, często znajdowały się poniżej tego progu, co uniemożliwiało ilościowe oznaczenie ekstremalnie niskich stężeń fluorków. W przypadku pomiaru śladowych stężeń w pobliżu lub poniżej granicy wykrywalności może być konieczne zastosowanie większej masy lub objętości próbki w naczyniu dyfuzyjnym (jeśli jest dostępna) lub wykorzystanie alternatywnych technik analitycznych. Ponadto metoda ta wymaga nocnej dyfuzji oraz ostrożnego obchodzenia się z żrącymi odczynnikami, co może ograniczać przepustowość w badaniach o dużej skali. Chociaż ISE zapewnia czułe ilościowe oznaczenie całkowitej zawartości fluorków, nie pozwala na ocenę ich rozkładu przestrzennego w tkankach. W celu wizualizacji i mapowania rozkładu fluorków w skali od mikro- do makro można zastosować podejścia komplementarne, takie jak skaningowa mikroskopia elektronowa sprzężona ze spektroskopią rentgenowską z detekcją energii (SEM-EDX) lub emisja promieniowania gamma indukowana cząstkami (PIGE). Te metody obrazowania pozwalają na ocenę lokalnej akumulacji fluorków w tkankach zmineralizowanych lub miękkich, uzupełniając tym samym pomiary ISE i zapewniając bardziej kompleksową ocenę zawartości fluorków w tkankach.

Kilka powtarzających się czynników technicznych może wpływać na dokładność i wiarygodność dyfuzji oraz pomiaru fluorków w tym protokole, a nasze obserwacje wskazują, jak przygotowanie kalibracji, uszczelnianie naczynia do dyfuzji, kontrola pH, wydajność elektrody oraz obchodzenie się z próbkami wspólnie kształtują jakość danych. Możliwymi przyczynami nieliniowej krzywej kalibracyjnej (R2 < 0,99) lub odczyty z próbek tkankowych poza oczekiwanym zakresem obejmują błędne obliczenia objętości roztworu zapasu NaF dodanego do naczynia dyfuzyjnego lub błędy pipetowania podczas przygotowywania standardów kalibracyjnych. Zalecane działanie: Przygotuj co najmniej dwa niezależne zestawy próbek kalibracyjnych dla każdego przebiegu, aby w razie wypadnięcia jednej krzywej kalibracyjnej poza oczekiwany zakres dostępny był zestaw zapasowy. Niedokładne uszczelnienie naczynia dyfuzyjnego może również spowodować utratę fluorków podczas dyfuzji, co prowadzi do sztucznie niskich odczytów. Dzieje się tak zazwyczaj, gdy na krawędź pokrywy naczynia dyfuzyjnego nałożono niewystarczającą ilość wazeliny.. Zalecane działanie: Nanieść obfitą ilość wazeliny na krawędź pokrywki naczynia dyfuzyjnego i mocno docisnąć, aby zapewnić szczelne zamknięcie. Błędy podczas pipetowania roztworu kwasu octowego do pułapki z NaOH mogą spowodować zmianę pH próbki poza optymalny zakres pH 5,0, co prowadzi do niedokładnego odzysku fluorków. Zalecane działanie: Należy sprawdzić pH każdej próbki za pomocą papierka lakmusowego i odrzucić każdą próbkę, której pH wykracza poza zakres pH 5. Próbki kalibracyjne mogą również wykraczać poza dopuszczalne granice pomiarowe elektrody selektywnej do fluorków. Stężenia poniżej 0,02 ppm znajdują się poniżej granicy wykrywalności elektrody. Zalecane działanie: Nie należy stosować próbek kalibracyjnych zawierających mniej niż 0,02 ppm fluorków. Z kolei próbki kalibracyjne z nadmiernie wysokimi stężeniami fluorków mogą zmienić siłę jonową roztworu i wywołać nieliniowe odpowiedzi elektrody. Zalecane działanie: Na początku projektu należy przygotować roztwory kalibracyjne obejmujące szeroki zakres stężeń fluorków, aby wyznaczyć liniowy zakres pracy używanej elektrody. Jeśli próbki tkanek przekraczają ten zakres liniowy, należy zmniejszyć masę tkanki lub zwiększyć objętość pułapki z NaOH, odpowiednio dostosowując objętość kwasu octowego w celu utrzymania pH 5. Trudności w uzyskaniu liniowych krzywych kalibracyjnych w zakresie 0,02–1 ppm: powszechną przyczyną jest starzenie się elektrody. Starsze elektrody selektywne na jony fluorkowe tracą czułość przy bardzo niskich stężeniach fluorków. Zalecane działanie: wymienić elektrodę selektywną na jony fluorkowe. Niestabilne odczyty potencjometru (dryfowanie lub skoki sygnału) występują zazwyczaj wtedy, gdy powierzchnia pomiarowa elektrody nie jest całkowicie zanurzona w roztworze próbki. Zalecane działanie: obniżyć elektrodę tak, aby powierzchnia pomiarowa była całkowicie przykryta ciekłą próbką.

Ogólnie rzecz biorąc, niniejszy protokół zapewnia solidne podejście oparte na kalibracji w celu ilościowego oznaczania fluorków w różnych macierzach biologicznych i jest odpowiedni do badań nad ekspozycją na fluorki, ich odkładaniem się w tkankach oraz skutkami toksykologicznymi w modelach mysich.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują żadnego konfliktu interesów.

Podziękowania

Badania opisane w niniejszej publikacji były wspierane przez Japan Society for the Promotion of Science; JSPS Overseas Research Fellowships 202560528 (S.Y.), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP); 2024/07452-9 (J.S.T.) oraz National Institute of Dental and Craniofacial Research z National Institutes of Health; R01DE027648 (M.S.) i K02DE029531 (M.S.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowy lodowatySigma-AldrichSupelco, GR ACSAX0073-6
Tygle tlenkoweAdvalue Technology12 mm średnicy zewnętrznej × 25 mm H, AL-6212AL-6212
Waga analitycznaVWRVWR 124B2, d = 0,1 mg—
Homogenizator kulowyWzorzec odniesieniaBeadBug 6—
Igła do strzykawki z tępym zakończeniemAmazonPrzemysłowa igła z tępym zakończeniem, 14 G × 0,5 calaX001TT8KX1
Dwutlenek węglaAirGas——
Dygestorium chemiczneMott ManufacturingModel 7421040—
D(+)-SacharozaThermo Scientific99,7% dla biochemii177142500
Roztwór wypełniający elektrodęThermo ScientificRoztwór wypełniający Orion IonPlus900061
Roztwór alkoholu etylowegoKoptec140 Proof2401
Zamrażarka, −80 °CThermo ScientificSeria Revco RDE—
Rękawice odporne na wysoką temperaturęFisher ScientificRękawice do autoklawa Bel-Art Clavies BiohazardH13201
Heksametylodysiloksan (HMDS)Fisher ScientificTCI H0091, >98%H0091
Nadtlenek wodoruVWRJ.T. Baker, 30%2204-01
Elektroda jonoselektywnaThermo ScientificDwukanałowa elektroda jonoselektywna (ISE) do fluorków Orion9609BNWP
Mieszadło magnetyczneVWRMieszadło 360—
MikroszpatułkaAmazonSzpatułka do rzeźbienia w wosku nr 7A, stal nierdzewna—
MikrowirówkaEppendorf5427R5404000131
Piec muflowyThermo ScientificMały piec muflowy laboratoryjny Thermolyne, 1,3 L, FB1315MFB1315M
Pieczarka/Inkubator (depending on context, typically "Piec" or "Inkubator" in a lab setting)Boekel ScientificBoekel RapidFISH240200
Roztwór paraformaldehydu w PBSThermo Scientific4% paraformaldehyd w PBSJ19943-K2
szalka PetriegoVWR60 × 15 mm, niepoddane działaniu czynnika25384-092
WazelinaThermo ScientificWazelina biała, czysta417090010
Papier wskaźnikowy pHFisher ScientificpH-Fix 4,5–10.092120.3
Tygiel porcelanowyFisher ScientificTygiel Fisherbrand, 5 ml, wysokość 20 mm, forma wysokaFB-965-B
PotencjometrThermo ScientificMiernik pH/ISE Orion Dual Star2115102
Statyw laboratoryjny z uchwytemVWRZacisk pierścieniowy, 15 cm470104-526
Dieta dla gryzoniBio-ServF1515, AIN-76A, ½ OsadyF1515
Podnośnik nożycowyAmazonLaboratoryjny podnośnik nożycowy—
Lejek rozdzielczyFisher ScientificEisco, szkło borokrzemowe, 2 lS89285
Chlorek soduFisher ScientificCertyfikowany ACS, krystalicznyS271-1
Fluorek soduFisher ScientificCertyfikowany ACS, proszekS299-100
Wodorotlenek soduFisher ScientificBiałe granulkiBP359-500
Kule ze stali nierdzewnejFisher ScientificScientific Industries, 5 mm, 100 szt.SI-CS05
Kwas siarkowyFisher Scientificczystość stopnia ACSA300-500
TISAB IIThermo ScientificRoztwór aplikacyjny Orion IonPlus940909
Eksykator próżniowyFisher ScientificPróżniowy deskryptor oszczędzający miejsce Bel-Art Space Saver, 10 caliF42010-0000
Filtr próżniowyFisher ScientificFiltr nakrętkowy Flow, PES, 90 mm, 0.2 µm597-4520
Wstrząsarka oscylacyjna z regulacją prędkościMidSciLabDoctor / Benchmark Scientific—

Bibliografia

  1. Podgorski J, Berg M. Global analysis and prediction of fluoride in groundwater. Nat Commun. 2022;13(1):4232. doi:10.1038/s41467-022-31940-x
  2. Iheozor-Ejiofor Z, Worthington HV, Walsh T, O'Malley L, Clarkson JE, Macey R, et al. Water fluoridation for the prevention of dental caries. Cochrane Database Syst Rev. 2015;2015(6):Cd010856. doi:10.1002/14651858.CD010856.pub2
  3. Manchanda S, Sardana D, Liu P, Lee GH, Li KY, Lo EC, et al. Topical fluoride to prevent early childhood caries: Systematic review with network meta-analysis. J Dent. 2022;116:103885. doi:10.1016/j.jdent.2021.103885
  4. Chan AKY, Tamrakar M, Jiang CM, Tsang YC, Leung KCM, Chu CH. Clinical evidence for professionally applied fluoride therapy to prevent and arrest dental caries in older adults: A systematic review. J Dent. 2022;125:104273. doi:10.1016/j.jdent.2022.104273
  5. Zamperini CA, Bedran-Russo AK. Immediate and Sustained Root Caries Prevention of Fluoride Varnish Combined with Toothpastes. Caries Res. 2023;57(5-6):592-601. doi:10.1159/000533279
  6. Melough MM, Sathyanarayana S, Zohoori FV, Gustafsson HC, Sullivan EL, Chi DL, et al. Impact of Fluoride on Associations between Free Sugars Intake and Dental Caries in US Children. JDR Clin Trans Res. 2023;8(3):215-23. doi:10.1177/23800844221093038
  7. Suzuki M, Everett ET, Whitford GM, Bartlett JD. 4-phenylbutyrate Mitigates Fluoride-Induced Cytotoxicity in ALC Cells. Front Physiol. 2017;8:302. doi:10.3389/fphys.2017.00302
  8. Suzuki M, Shin M, Simmer JP, Bartlett JD. Fluoride affects enamel protein content via TGF-beta1-mediated KLK4 inhibition. J Dent Res. 2014;93(10):1022-7. doi:10.1177/0022034514545629
  9. Everett ET, McHenry MA, Reynolds N, Eggertsson H, Sullivan J, Kantmann C, et al. Dental fluorosis: variability among different inbred mouse strains. J Dent Res. 2002;81(11):794-8.
  10. Kong H, He Z, Li H, Xing D, Lin J. The association between fluoride and bone mineral density in US children and adolescents: a pilot study. Nutrients. 2024. doi:10.3390/nu16172948
  11. Mazzoli R, Filippini T, Iamandii I, De Pasquale L, Veneri F, Birnbaum LS, et al. The association of fluoride exposure with bone density and fracture risk: a dose-response meta-analysis. Environ Health. 2025;24(1):73.
  12. Suzuki M, Bandoski C, Bartlett JD. Fluoride induces oxidative damage and SIRT1/autophagy through ROS-mediated JNK signaling. Free Radic Biol Med. 2015;89:369-78.
  13. Kubota K, Lee DH, Tsuchiya M, Young CS, Everett ET, Martinez-Mier EA, et al. Fluoride induces endoplasmic reticulum stress in ameloblasts responsible for dental enamel formation. J Biol Chem. 2005;280(24):23194-202. doi:10.1074/jbc.M503288200
  14. Yamashita S, Okamoto M, Mendonca M. Fluoride alters gene expression via histone H3K27 acetylation in ameloblast-like LS8 cells. Int J Mol Sci. 2024. doi:10.3390/ijms25179600
  15. Deng H, Fujiwara N, Cui H, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Histone acetyltransferase promotes fluoride toxicity in LS8 cells. Chemosphere. 2020;247:125825.
  16. Deng H, Ikeda A, Cui H, Bartlett JD, Suzuki M. MDM2-Mediated p21 Proteasomal Degradation Promotes Fluoride Toxicity in Ameloblasts. Cells. 2019;8(5). doi:10.3390/cells8050436
  17. Fujiwara N, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Curcumin suppresses cell growth and attenuates fluoride-mediated Caspase-3 activation in ameloblast-like LS8 cells. Environ Pollut. 2021;273:116495. doi:10.1016/j.envpol.2021.116495
  18. Suzuki M, Ikeda A, Bartlett JD. Sirt1 overexpression suppresses fluoride-induced p53 acetylation to alleviate fluoride toxicity in ameloblasts responsible for enamel formation. Arch Toxicol. 2018;92(3):1283-93. doi:10.1007/s00204-017-2135-2
  19. Regelson S, Dehghan M, Tantbirojn D, Almoazen H. Evaluation of fluoride levels in commercially available tea in the United States. 2020/12/23 ed2021 Jan-Feb. 17-20 p.
  20. Cantoral A, Luna-Villa LC, Mantilla-Rodriguez AA, Mercado A, Lippert F, Liu Y, et al. Fluoride Content in Foods and Beverages From Mexico City Markets and Supermarkets. Food Nutr Bull. 2019;40(4):514-31. doi:10.1177/0379572119858486
  21. Institute of Medicine SCotSEoDRI. Dietary Reference Intakes for Calcium, Phosphorus, Magnesium, Vitamin D, and Fluoride. Washington, DC: National Academy Press; 1997.
  22. Otal E.H. KML, Kimura M. Fluoride Detection and Quantification, an Overview from Traditional to Innovative Material-Based Methods. In: Wambu E.W. LGJ, Kiplagat A., editor. Fluoride. London: IntechOpen; 2022.
  23. Whitford GM. Absorption and Plasma Concentrations of Fluoride, 1996.
  24. Taves DR. Determination of submicromolar concentrations of fluoride in biological samples. Talanta. 1968;15(10):1015-23. doi:10.1016/0039-9140(68)80109-2
  25. Buzalaf MA, Caroselli EE, de Carvalho JG, de Oliveira RC, da Silva Cardoso VE, Whitford GM. Bone surface and whole bone as biomarkers for acute fluoride exposure. J Anal Toxicol. 2005;29(8):810-3.
  26. Zohoori FV, Maguire A, Martinez-Mier EA, Buzalaf MAR, Sanderson R, Eckert GJ. A Comparison of Simple Analytical Methods for Determination of Fluoride in Microlitre-Volume Plasma Samples. Caries Res. 2019;53(3):275-83. doi:10.1159/000492339
  27. Martínez-Mier EA, Cury JA, Heilman JR, Katz BP, Levy SM, Li Y, et al. Development of gold standard ion-selective electrode-based methods for fluoride analysis. Caries Res. 2011;45(1):3-12. doi:10.1159/000321657
  28. Boivin G, Chapuy MC, Baud CA, Meunier PJ. Fluoride content in human iliac bone: results in controls, patients with fluorosis, and osteoporotic patients treated with fluoride. J Bone Miner Res. 1988;3(5):497-502.
  29. Yamashita S, Okamoto M, Fujiwara N, Achong-Bowe R, Brueckner S, Mendonca M, et al. Developmental vulnerability to fluoride toxicity: enamel and clearance differences in adolescent versus mature mice. Arch Toxicol. 2025.
  30. Chiba K, Hisamatsu, S., Takizawa, Y, Katsura, K. Determination of fluoride in biological materials by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1982;245:8.
  31. Ikenishi K, Chiba, K., Hisamatsu, S, Takizawa, Y. Determination of fluoride in biological samples by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1988;437:8.
  32. Venkateswarlu P, Reddy, D.S., Reddy, T.S. Spectrophotometric determination of fluoride using the SPADNS method. Analyst 1971;96:5.
  33. Kakabadse G. KN, Davies C.W. The Spectrophotometric Determination of Fluoride with SPDNS-Zirkonium Lake. Analyst. 1971;96:8.
  34. Mendham J, Denney RC, Barnes JD, Thomas MJK. Vogel's Textbook of Quantitative Chemical Analysis. 6th ed. Harlow, England: Prentice Hall; 2000.
  35. Kučera J, Štefánik, M. & Veselka, P. Fluorine determination in biological and environmental samples with INAA using fast neutrons from a p(19 MeV)+Be neutron generator. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 2019;322:7.
  36. Okamoto M, Yamashita S, Memida T, Mendonca M, Brueckner S, Nakamura S, et al. Microhardness Measurements on Tooth and Alveolar Bone in Rodent Oral Disease Models. J Vis Exp. 2024(206). doi:10.3791/66583
  37. Okamoto M, Yamashita S, Mendonca M, Brueckner S, Achong-Bowe R, Thompson J, et al. Ultrastructural evaluation of adverse effects on dentine formation from systemic fluoride application in an experimental mouse model. Int Endod J. 2025;58(1):128-40.
  38. Frant MS, Ross JW, Jr. Electrode for sensing fluoride ion activity in solution. Science. 1966;154(3756):1553-5.
  39. Umezawa Y, Umezawa, K and Sato, H. Selectivity coefficients for ion-selective electrodes: recommended methods for reporting KRB values, 1995.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oznaczanie ilości fluorkówdyfuzja HMDSfluorki w surowicyfluorki w kościachfluorki w zębachpróbki biologicznekrzywa wzorcowadepozycja w tkankach

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.