Platforma hybrydowa oparta na kulturze komórkowej 3D przeznaczona do optycznego obrazowywania z wykorzystaniem gąbek z jedwabiu fibrynowego

Podsumowanie

Artykuł opisuje prostą, dostępną i powtarzalną metodologię produkcji podpór z jedwabiu oraz hodowli komórek raka piersi 4T1-iRFP720 w warunkach kontrolowanym przepływem, aby wspierać dynamiczną hodowlę. Wzrost i migracja komórek zostały oceniane jako dowód koncepcji przy użyciu instrumentu do obrazowania optycznego in vivo jako głównego nieinwazyjnego odczytu.

Streszczenie

Prezentujemy innowacyjną hybrydową platformę bioanalityczną zaprojektowaną do oceny przedklinicznej cech komórkowych. System łączy trójwymiarową (3D) kulturę komórek wyhodowanych na sztucznej macierzy pozakomórkowej z konfiguracją tablicową inspirowaną chromatografią. Gąbki, wykonane z białka strukturalnego jedwabiu fibroiny, służą zarówno jako biomimetyczna macierz pozakomórkowa, jak i jako faza stacjonarna. Gąbki z fibroiny jedwabiu zostały wyprodukowane wewnątrz zakładu za pomocą wieloetapowego procesu, który obejmował usunięcie białek serycyny z surowych włókien jedwabiu, następnie rozpuszczenie i dializę w celu oczyszczenia roztworu fibroiny, rozpuszczenie w organicznym rozpuszczalniku i następnie odlewanie na bazie soli, aby wytworzyć gąbki na bazie jedwabiu o kontrolowanej porowatości/rozmiarach porów 500–800 µm. Genetycznie zmodyfikowane linie komórek raka piersi 4T1-iRFP720 i 4T1-wt (niefluorescencyjna kontrola) były hodowane w obrębie szkieletów jedwabiu przy użyciu ciągłego przepływu medium poprzez pompę, a ich wzrost komórkowy i cechy były analizowane nieinwazyjnie za pomocą technik obrazowania optycznego (instrument do obrazowania optycznego in vivo). Łącząc kluczowe zalety systemów chromatograficznych (automatyzacja, powtarzalność) z biologicznym znaczeniem zaawansowanych 3D kultur komórkowych, platforma umożliwia in vitro modelowanie architektury i morfologii podobnej do tkanki oraz ułatwia monitorowanie dynamicznego zachowania komórek. Równolegle zastosowanie technologii obrazowania medycznego umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym i przedłużone monitorowanie migracji i wzrostu komórek, między innymi. Takie podejście oferuje znaczny potencjał do badania zachowań komórkowych w skali makroskopowej w systemie przepływu laminarnego. Poprawiając fizjologiczne znaczenie modeli in vitro, ta metoda może pomóc w przerzuceniu przepaści translacyjnej na badania in vivo i jest zgodna z ramami zmniejszania, zastępowania, doskonalenia (3R) dla eksperymentów na zwierzętach.

Wprowadzenie

W tkankach żywych migracja komórek i ich wzrost zachodzą w trójwymiarowym, heterogenicznym środowisku pozakomórkowym (ECM), kierowane przez sygnały biofizyczne i biochemiczne, takie jak przepływ płynu międzykomórkowego i interakcje między komórkami. Czynniki te regulują polaryzację komórek, mechanotransdukcję i skoordynowany ruch, co leży u podstaw kluczowych procesów biologicznych, w tym naprawy tkanek i inwazji nowotworowej^1,2,3,4.

Mimo ich znaczenia, większość in vitro testów migracji, takich jak scratch i Transwell, ocenia ruch pojedynczych komórek na płaskich, statycznych podłożach. Chociaż są one proste i opłacalne, te 2D podejścia słabo odwzorowują strukturalne i dynamiczne cechy środowiska in vivo^5,6. Ta ograniczona możliwość staje się szczególnie istotna w kontekście przerzutów nowotworowych, gdzie komórki nowotworowe migrują kolektywnie przez mechanicznie i chemicznie zróżnicowane matryce tkankowe^3,7,8. Chociaż testy scratch 2D nadal są popularne, ponieważ są łatwe do wykonania, nie odzwierciedlają one złożoności ECM ani efektów przepływu płynów⁶. Podejścia oparte na Transwellu dostarczają ilościowych wyników, ale tylko w stałych punktach końcowych, uniemożliwiając ciągłą obserwację migracji^6,9.

Ostatnie badania wykazały, że przepływ międzykomórkowy zwiększa potencjał przerzutowy, podczas gdy sztywność i skład ECM sprzyja przejściu nabłonkowo-mezenchymalnemu i kolektywnej migracji^4,10. Bardziej zaawansowane systemy 3D, takie jak sferoidy i organoidalne struktury, lepiej naśladują rodzime środowiska ECM; jednak ich użycie jest często ograniczone przez zmienność, ograniczony dostęp do eksperymentów i trudności w standaryzowanej analizie^11,12. Platformy mikrofluidyczne oferują lepszą kontrolę nad warunkami mechanicznymi i płynnymi, ale ich zależność od wyspecjalizowanych metod produkcji i sprzętu ogranicza ich szerokie zastosowanie¹³. Stąd odtworzenie tych zintegrowanych wskazówek in vitro w kontrolowany, dostępny, nieinwazyjny i opłacalny sposób pozostaje głównym wyzwaniem^5,14.

Aby sprostać tym wyzwaniom i przerzucić most między konwencjonalnymi testami 2D a złożonymi modelami in vivo, opracowałeśmy prostą platformę komórkową 3D z możliwością przepływu opartą na szkielecie z gąbki z jedwabiu fibryny. System zastosował gąbkę jedwabną o regulacyjnych właściwościach mechanicznych jako podobne do ECM wsparcie. Jedwab został wybrany ze względu na jego porowatą strukturę, która pozwala na delikatną perfuzję i wspiera fizjologicznie istotny przepływ międzykomórkowy¹⁵. Jego biokompatybilność i ugruntowane zastosowanie w biomedycynie i inżynierii tkankowej sprawiają, że jest to odpowiedni materiał do tej aplikacji. Niedawna publikacja dalsze wykazała zrównoważoność środowiskową i potencjał recyklingu szkieletu¹⁶. W innym badaniu dodatkowo wykazaliśmy ich przystosowawczość do różnych trybów obrazowania, takich jak tomografia emisyjna pozytonów¹⁷. Ta poprzednia praca posłużyła jako fundament dla bieżącego opisu metodologii, w którym opieramy się na tym samym koncepcie platformy w uproszczonej konfiguracji opartej na optycznym obrazowaniu in vivo. Razem te badania demonstrują potencjał systemu dla multimodalnej oceny opartej na obrazowaniu konstrukcji tkankowych i wspierają jego zastosowanie jako wszechstronnej platformy eksperymentalnej do integracji in vitro kultury i in vivo odpowiedzi odpowiednich dla różnych modeli komórek nowotworowych.

Jako dowód koncepcji, hodowaliśmy komórki raka piersi potrójnie ujemne 4T1 z oznaczeniem iRFP720 wewnątrz szkieletu w warunkach dwóch niskich stresów przepływu przez pięć dni. Nieinwazyjne monitorowanie optycznego obrazu in vivo ujawniło odrębne wzorce wzrostu skierowane przez przepływ i znaczące zmiany w dynamice populacji komórek w porównaniu ze statycznymi kontrolami. Podkreślając prostotę inżynieryjną i powtarzalność, ten model zapewnia praktyczny most między testami 2D a badaniami in vivo, umożliwiając badaczom badanie, w skali makroskopowej i nieinwazyjnie, cech komórkowych pośredniczyć przez przepływ w fizjologicznie istotnym, ale dostępnym formacie. W przeciwieństwie do poprzednich metodologii, które często opierają się na destrukcyjnych analizach końcowych lub braku standaryzowanych kryteriów siewu, ten protokół wprowadza systematyczną ramę dla optymalizacji produkcji szkieletu i, w następstwie, siewu komórek i obrazu. To podejście zwiększa odporność eksperymentalną i zapewnia bardziej

Protokół

Pierwsza sekcja opisuje przygotowanie szkieletów z fibroiny jedwabnej na podstawie wcześniej opublikowanych prac¹⁶. Kolejne sekcje opisują optymalizację gęstości siewu komórek, integrację przepływu i obrazowania optycznego do monitorowania ruchu i wzrostu komórek. W niniejszym badaniu wykorzystano wyłącznie ustanowione linie komórek raka piersi myszy (4T1-wt i 4T1-iRFP720) i nie obejmowało ludzkich uczestników, próbek pacjentów, tkanek pierwotnych ani żywych zwierząt. Zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i krajowymi, zatwierdzenie etyczne nie było wymagane. Schematyczny przegląd przepływu pracy przedstawiono na Rysunku 1.

1. Przygotowanie gąbki z fibroiny jedwabnej

1. Czyszczenie i usuwanie jedwabiu z kokonów.
   1. Wytnij kokony jedwabników Bombyx mori L. za pomocą bezpiecznego skalpela.
   2. Usuń larwy i wydobyj najbardziej wewnętrzną warstwę kokonu (warstwa kompaktowa bezpośrednio otaczająca jamę larw) za pomocą standardowej igły do sekcjonowania.
   3. Napchnij kolbę 1,6 L podwójnie destylowaną wodą (ddH₂O).
   4. Dodaj kulkę mieszającą i zagotuj wodę pod mieszaniem; przykryj kolbę folią aluminiową, aby przyspieszyć nagrzewanie i zmniejszyć utratę wody.
   5. Kiedy temperatura wody osiągnie około 70 °C, dodaj 3,4 g Na₂CO₃.
   6. Kiedy mieszanina zacznie się gotować, włóż 4 g przygotowanego kokonu do roztworu i mieszaj za pomocą szkła.
   7. Gotuj kokony przez 30 min, mieszając za pomocą szkła co 10 min, aby zapewnić odpowiednie naświetlenie.
   8. Wydobądź jedwab z roztworu i wielokrotnie przepłucz go wodą kranowaną, aby usunąć pozostałą sericeinę.
   9. Wyciśnij nadmiar wody i rozłóż włókna jedwabiu na przygotowanej folii aluminiowej.
   10. Wysusz włókna jedwabiu w nagrzanym do 50 °C piekarniku do całkowitego wyschnięcia (około 18 h).
2. Rozpuszczanie i dializa
   1. Do kolejnych kroków użyj absolutnego alkoholu etylowego i bezwodnego CaCl₂. Macierz rozpuszczania składa się z 1 części CaCl₂, 2 części etanolu i 8 części ddH₂O. Stosunek suchego zdegumowanego jedwabiu do macierzy rozpuszczania wynosi 1:10 [w/w].
   2. Waż suchy jedwab i odpowiednio oblicz odpowiednie ilości składników dla macierzy rozpuszczania.
   3. Włóż odpowiednią ilość CaCl₂ do kolby szyjkowej wyposażonej w kulkę mieszającą.
   4. Zmierzyj potrzebną ilość etanolu i ddH₂O i połącz je.
   5. Dodaj mieszaninę etanolu-ddH₂O do CaCl₂ podczas mieszania.
   6. Ustaw urządzenie do destylacji zwrotnej i podgrzej mieszaninę do 100 °C w kąpieli olejowej, pozwalając CaCl₂ na rozpuszczenie i doprowadzając mieszaninę do wrzenia.
   7. Kiedy mieszanina zacznie się gotować, dodaj suszony jedwab i podgrzewa pod destylacja zwrotną przez 45 min.
   8. Przygotuj 15 cm długie rury dializujące o przenikalności 3,5 kDa, przepłukując je wielokrotnie wodą, aby je zrehydratować, a następnie zabezpiecz jednym końcem zawiniętym wokół szkła za pomocą klipsu uszczelniającego.
   9. Po zagotowaniu przenieś gorący roztwór jedwabiu do rurki i zamknij przeciwległy koniec klipsem, pozostawiając 2–3 cm przestrzeni między płynem a klipsem uszczelniającym, bez żadnych wtrąt powietrza.
   10. Umieść napełnioną rurkę dializującą w 2 L kolbie wypełnionej ddH₂O i wykonaj dializę w temperaturze pokojowej przez 72 h, zmieniając wodę dwa razy dziennie, aby zapewnić skuteczne oczyszczenie.
   11. Centrifuguj roztwór z 4500 × g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
   12. Delikatnie wlej surnatę do tub do wirowania bez zaburzania osiadłu i przechowuj tuby w temperaturze -20 °C.
       UWAGA: Należy wypełniać tuby do wirowania do połowy ich pojemności i zamrażać je w pozycji poziomej.
3. Liofilizacja
   1. Podgrzej pompę próżniową przez 20 min i uruchom liofilizator zgodnie z instrukcjami producenta.
   2. Umieść zamrożone tuby do wirowania, bezpośrednio z zamrażarki, w kolbie szyjkowej.
   3. Podłącz kolbę do liofilizatora i liofilizuj przez 24 h.
   4. Do dalszego użytku przechowuj

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje przyjazny dla użytkownika, nisko kosztujący system do makroskopowej obserwacji wzrostu i ruchu komórek w fizjologicznie odpowiednim środowisku 3D. Metoda wykorzystuje gąbki z jedwabiu jako naśladownictwo ECM i uwzględnia kontrolowany przepływ międzymiąższowy, aby modelować dynamiczne warunki tkankowe. Schematyczne przedstawienie krok po kroku od produkcji gąbki jedwabnej i wytwarzania podłoża do wysiewu komórek i montażu platformy eksperymentalnej przedstawiono na Rysunku 1...

Dyskusja

Opisany w tym protokole proces produkcji gąbki jedwabnej jest znormalizowany, zapewniając powtarzalne wytwarzanie szkieletów, jak opisano we wcześniejszym badaniu¹⁶. Produkcja gąbek w pełni znormalizowanych warunkach, takich jak wysokość/ilość łóżka solnego, objętość roztworu jedwabiu i inkubacja w metanol, jest kluczowa dla uzyskania jednorodnych, porównywalnych gąbek. Wyprodukowane gąbki muszą spełniać kryteria protokołu kontroli jakości opublikowane wcześniej¹⁶. W skróci...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,1,1,3,3,3-Hexafluoroizopropanol (HFIP)	Sigma-Aldrich	8.04515	Ostrożnie: Niebezpieczne. Używane do rozpuszczania liofilizowanego jedwabiu
24-well plate	Cellstar, Greiner Bio-One	662102	Przechowywanie podsiewianych scaffoldów podczas inkubacji
4T1-iRFP720 murine triple-negative breast cancer cells	Macromolecular Cancer Therapeutics Laboratory (MMCT), University of Vienna	N/A	Eksperymenty z hodowlą komórek; 4T1-iRFP720 zostało wyprowadzone w domu z rodziców 4T1 (ATCC: CRL-2539)
4T1-wt murine triple-negative breast cancer cells	Macromolecular Cancer Therapeutics Laboratory (MMCT), University of Vienna	ATCC: CRL-2539	Eksperymenty z hodowlą komórek
Bruker Alpha Compact FTIR with Platinum-ATR Sampling Module	Bruker	A220/D-01	Analiza FT-IR
Calcium chloride, anhydrous, ≥93% reagent grade	Sigma-Aldrich	902179	Do przygotowania macierzy rozpuszczalnej
Cell culture flask, T25	Cellstar, Greiner Bio-One	690175	Materiały eksploatacyjne; do hodowli komórek
Cell culture flask, T75	Cellstar, Greiner Bio-One	658175	Materiały eksploatacyjne; do hodowli komórek
Centrifuge 5804 R	Eppendorf	5805000010	Używane do separacji próbek przez wirowanie
Combi-stopper (female Luer-lock connector)	Braun Melsungen AG	4495101	Używane do montażu platformy
Cucurbitacin E	Sigma-Aldrich	SML0577	Inhibitor migracji komórek
Dermal biopsy puncher, ø 6 mm	Dahlhausen	1190001006	Używane do uzyskania cylindrycznych scaffoldów gąbczastych
Dialysis tubes (3.5 kDa, cellulose)	Spectra/Por by Spectrum Labs	SPEC132724	Do dializy roztworu jedwabiu
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537	Do utrzymania komórek
Ethanol, absolute	Merck	1.07017	Do przygotowania macierzy rozpuszczalnej
Excel	Microsoft	v2604	Organizacja danych, podstawowe obliczenia i rysowanie wykresów
Fetal calf serum (FCS) heat inactivated	Biowest	S181H-500	Suplemen do pożywki hodowlanej komórek
Fiji (former ImageJ)	Open soure (https://imagej.net/software/fiji/)	N/A	Przetwarzanie i analiza obrazów
GraphPad Prism	GraphPad Software	v8.2.1	Analiza statystyczna i generowanie wykresów
HPLC pump Hitachi L-7120 LaChrom	Merck	K-5244	Do dynamicznych warunków hodowli w złożonej platformie
IVIS 200 Spectrum CT system	PerkinElmer	128201	System obrazowania optycznego z możliwością CT
IVIS Living Image Software	PerkinElmer	v4.5.2	Oprogramowanie do pozyskiwania, wizualizacji i ilościowej analizy danych obrazowania IVIS
JEOL JSM-6510 Scanning electron microscope	JEOL GmbH	JSM-6510	Zdjęcia SEM
L-glutamine, 200 mM solution, suitable for cell culture (L-Glu)	Sigma-Aldrich	G7513	Suplemen do pożywki hodowlanej komórek
Lyophilizer Alpha 2-4 LD Plus	Martin Christ	101542	Do liofilizy jedwabiu
Male Luer-lock connector	Supelco (Sigma-Aldrich)	57020-U	Adapter do zbiorników próbek
Methanol, ≥99.9 %, HPLC Gradient Grade	Carl Roth	7342.1	Ostrożnie: Toksyczne. Indukcja formowania łańcuchów beta w kompozytach jedwabiu
Optically transparent Solid Phase Extraction (SPE) tubes without frits	Sigma Aldrich	57240-U	Używane do montażu platformy
OPUS Spectroscopy software	Bruker	v7.5	Analiza FT-IR
Orbital and Linear Shaker MI0103002	Four E'S Scientific	MI0103002	Równomierne rozprowadzanie/mieszanie
Parafilm PM996	Sigma-Aldrich	P7793	Do uszczelniania/owijania płytek i pojemników do przechowywania (np. w lodówce)
Penicillin-Streptomycin, liquid, suitable for cell culture (P/S)	Sigma-Aldrich	P0781	Suplemen do pożywki hodowlanej komórek
Petri dish, 9 cm	VWR	391-0598	Do odlewania spongi na bazie soli; do podsiewu na scaffoldach jedwabnych
Polyethylene frits for 1 mL SPE tubes	Supelco (Sigma Aldrich)	57244	Używane do montażu platformy
RPMI-1640 Medium, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	R0883	Uzupełniona pożywka jest używana do równoważenia spongi jedwabnej, utrzymania hodowli komórek i powiązanych eksperymentów
Serological pipette, 10 mL	Sarstedt	86.1254.025	Materiały eksploatacyjne; do utrzymania komórek
Serological pipette, 25 mL	Sarstedt	86.1685.020	Materiały eksploatacyjne; do utrzymania komórek
Serological pipette, 5 mL	Sarstedt	86.1253.025	Materiały eksploatacyjne; do utrzymania komórek
Silk cocoons of Bombyx mori L.	Sericulture and Agriculture Experimental Station, Vratsa, Bulgaria	N/A	Surowiec surowy do produkcji gąbczastych spong jedwabnych
Sodium carbonate, anhydrous, ≥99.5% ACS	VWR	11552.A3	Używane do chemicznego usuwania jedwabiu, czyli usuwania sericin
Sodium chloride, ≥98%, technical	VWR	27