Artykuł metodologiczny

Metoda cięcia wewnątrzkomorowego do kwantyfikacji w czasie rzeczywistym lotnych związków uwalnianych podczas ranienia liści oraz wymiany gazowej

31 wyświetleń

⸱

11 września 2026

 ,  ,  , 
1Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, 2Estonian Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół przedstawia zestandaryzowane podejście do nacinania wewnątrz komory w celu określenia momentu rozpoczęcia, czasu wystąpienia szczytu oraz kinetyki emisji lotnych związków indukowanych zranieniem, wraz z jednoczesnymi pomiarami wymiany gazowej.

Streszczenie

Lotne związki organiczne (VOCs) uwalniane przez liście roślin odgrywają kluczową rolę w sygnalizacji stresu, oddziaływaniach roślina–atmosfera oraz w obronie roślin. Wśród nich lotne związki organiczne indukowane uszkodzeniami (wVOCs) są emitowane w ciągu kilku sekund od wystąpienia uszkodzeń mechanicznych, żerowania roślinożerców lub zaburzeń środowiskowych. Dynamika ich emisji silnie zależy od czasu, nasilenia i metody uszkodzenia tkanki. Niemniej jednak, dokładna kwantyfikacja pozostaje wyzwaniem ze względu na artefakty mechaniczne, zmienne warunki ekspozycji oraz opóźnienia między uszkodzeniem a pomiarem. Niniejsze badanie przedstawia zestandaryzowany protokół wycinania liści wewnątrz komory do monitorowania w czasie rzeczywistym wVOCs oraz wymiany gazowej. Nożyk chirurgiczny został zintegrowany z przenośną komorą wymiany gazowej, aby umożliwić czyste i kontrolowane cięcia w zamkniętej komorze w stabilnych warunkach oświetlenia, wilgotności, CO2 i temperatury. Spektrometr mas czasu przelotu z reakcją przeniesienia protonu (PTR-TOF-MS) stale mierzył emisje lotnych związków na wylocie z komory, minimalizując opóźnienia i zniekształcenia sygnału. Układ ten pozwala na określenie momentu rozpoczęcia emisji, czasu wystąpienia szczytu, maksymalnej szybkości wzrostu oraz całkowitej ilości uwalnianych związków z wysoką rozdzielczością czasową. Zastosowanie tej metody do Quercus rubra, Acer platanoides oraz Gossypium hirsutum wykazało zdolność do rozróżnienia odmiennych wzorców emisji indukowanej uszkodzeniami u różnych typów liści. Poprzez wyeliminowanie opóźnień związanych z konwencjonalnym próbkowaniem, metoda ta pozwala na odtworzenie pełnej trajektorii kinetycznej emisji indukowanych uszkodzeniami i przełamuje główne ograniczenia poprzednich podejść. Stanowi ona solidną podstawę do badania szybkich odpowiedzi stresowych w fizjologii roślin, biochemii ekologicznej i oddziaływaniach roślina–atmosfera.

Wprowadzenie

Rośliny reagują na uszkodzenia poprzez uwalnianie szybkiego sygnału chemicznego, jednak precyzyjne uchwycenie tego sygnału pozostaje wyzwaniem technicznym. W ciągu kilku sekund po żerowaniu roślinożerców, uszkodzeniach przez wiatr lub zakłóceniach mechanicznych, rośliny uwalniają przejściowy wyrzut lotnych związków organicznych (VOCs), które aktywują wewnętrzne mechanizmy obronne i przygotowują sąsiednie rośliny do reakcji1,2,3,4. Te indukowane uszkodzeniami lotne związki organiczne (wVOCs) obejmują lotne związki zielonych liści (GLVs), metanol, krótkołańcuchowe alkohole i aldehydy, terpenoidy oraz pochodne oksylipin. Powstają one albo w wyniku syntezy de novo w komórkach mezofila, albo w wyniku przerwania struktur magazynujących, takich jak kanały żywiczne i trichomy. Jako bezpośrednie sygnały stresowe, wVOCs koordynują obronę fizjologiczną, pośredniczą w komunikacji między roślinami oraz oddziałują na chemię atmosfery1,5,6,7.

Ponieważ naturalna herbiworia łączy uszkodzenia mechaniczne z elicytorami ślinowymi i mikrobiologicznymi, w badaniach eksperymentalnych stosuje się symulowane ranienie, aby wyizolować odpowiedzi wyłącznie na uraz fizyczny8. Jednakże przejściowy charakter wVOC sprawia, że ich wychwycenie jest z natury trudne. Konwencjonalne metody, takie jak statyczne pobieranie próbek z przestrzeni nad próbką w połączeniu z chromatografią gazową sprzężoną z spektrometrią mas (GC-MS), często pomijają początkowy wyrzut emisji i zniekształcają jej profil kinetyczny9,10. Opóźnienia w osiągnięciu równowagi, podwyższone temperatury inkubacji oraz wydłużone linie pobierania próbek zwiększają czas przebywania i zniekształcają rejestrowany sygnał, szczególnie w przypadku związków reaktywnych, takich jak seskwiterpeny9,1,12. Wspólnie artefakty te zmniejszają amplitudę sygnału i zacierają dynamikę czasową emisji lotnych związków indukowanych ranieniem, co utrudnia interpretację reakcji roślin na stres.

W wielu badaniach pomiar jest przerywany w celu zranienia liści poza komorą. Przerwa ta destabilizuje przepływ gazów, zmienia czas powstania rany i zmniejsza kontrolę nad precyzją nacięcia13,14,15. W rezultacie pierwsze minuty po uszkodzeniu są często tracone lub zniekształcone13, czyli dokładnie wtedy, gdy szybkość emisji osiąga szczyt i pojawiają się charakterystyczne wzorce kinetyczne3,6,16,17. W niektórych podejściach wycinanie liści przeniesiono do wnętrza komór o dużej objętości, wykorzystując ostrza teflonowe lub wycinaki mechaniczne12,18,19. Jednakże takie układy często prowadziły do niestabilności uszczelnienia, niespójnej długości cięć i nierównych nacięć z powodu przesuwania się przecinaka lub różnic w twardości liści. Duża objętość komory dodatkowo opóźniała wymianę powietrza i poszerzała sygnał lotnych związków16. Wspólnie te ograniczenia eksperymentalne uniemożliwiają dokładną charakterystykę dynamiki czasowej emisji indukowanych zranieniem w stabilnych warunkach fizjologicznych.

Aby pokonać te trudności, niniejsze badanie przedstawia protokół ranienia wewnątrzkomorowego w czasie rzeczywistym, który integruje przecinak klasy chirurgicznej z systemem wymiany gazowej sprzężonym ze spektrometrią mas czasu przelotu z reakcją transferu protonu (PTR-TOF-MS). Protokół ten umożliwia jednoczesne ranienie liścia i detekcję substancji lotnych w kontrolowanych warunkach środowiskowych, przy jednoczesnym pomiarze strumieni substancji lotnych i wymiany gazowej z wysoką rozdzielczością czasową. Dzięki przeprowadzaniu wycinania liścia wewnątrz komory pomiarowej, protokół minimalizuje opóźnienia w pobieraniu próbek związane z konwencjonalnymi metodami, zachowuje dynamikę czasową szybko emitowanych lotnych związków indukowanych ranieniem oraz ilustruje zestandaryzowaną procedurę cięcia liści o różnych właściwościach mechanicznych. Taka rozdzielczość czasowa umożliwia bezpośrednią charakterystykę początku, czasu wystąpienia szczytu oraz specyficznej dla gatunku kinetyki emisji lotnych związków indukowanych ranieniem.

Protokół oceniono z wykorzystaniem trzech gatunków o kontrastujących cechach anatomicznych i fizjologicznych (Quercus rubra, Acer platanoides oraz Gossypium hirsutum), aby wykazać jego przydatność dla różnych typów liści. Zastosowanie identycznych warunków pomiarowych dla wszystkich gatunków dowodzi, że protokół pozwala na rozróżnienie dynamiki VOC indukowanych przez zranienie w szerokim zakresie wzorców emisji, przy jednoczesnym zminimalizowaniu zmienności eksperymentalnej. Podejście to znajduje szerokie zastosowanie w badaniach wymagających pomiarów VOC indukowanych przez zranienie z wysoką rozdzielczością czasową w kontrolowanych warunkach środowiskowych. Wspólnie cechy te zapewniają zestandaryzowane ramy do badania szybkich reakcji roślin na stres i ułatwiają stosowanie protokołu w różnych gatunkach i systemach eksperymentalnych.

Protokół

Wszystkie rośliny były hodowane w warunkach kontrolowanego środowiska w komorach wzrostowych. Odczynniki i sprzęt wykorzystane w badaniu wymieniono w Tabeli materiałów.

1. Konstrukcja i instalacja przecinaka do liści wewnątrz komory

  1. Wykonaj obrotową wycinarkę do liści, dostosowaną do wymiarów wewnętrznych (4 cm × 2 cm) standardowej głowicy pomiarowej.
  2. Przymocuj żyletkę do pręta ze stali nierdzewnej (średnica 1 mm), używając lutu srebrowego w celu zapewnienia stabilności mechanicznej.
    OSTROŻNIE: Żyletki są niezwykle ostre. Podczas pracy należy używać rękawic odpornych na przecięcia. Po użyciu żyletki należy zutylizować zgodnie z instytucjonalnymi procedurami bezpieczeństwa w laboratorium dotyczącymi ostrych przedmiotów. Lutowanie srebrowe należy przeprowadzać pod odpowiednią wentylacją i w okularach ochronnych.
  3. Wsuń pręt utrzymujący ostrze do igły strzykawki ze stali nierdzewnej (średnica zewnętrzna 1,6 mm), aby umożliwić swobodną rotację osiową.
  4. Uszczelnij oba końce igły za pomocą stopera z politetrafluoroetylenu (PTFE) o niskiej emisji, aby utrzymać szczelność powietrzną przy jednoczesnym zachowaniu możliwości obrotu.
  5. Zamontuj pokrętło ręczne na proksymalnym końcu pręta, aby umożliwić kontrolowany obrót wewnętrznej wycinarki.
  6. Przymocuj dwa elastyczne wsporniki wykonane z blachy mosiężnej sprężynowej (grubość 0,2 mm) do zewnętrznej powierzchni igły, aby przymocować wycinarkę do dolnej części komory.
  7. Wykonaj trójkątne nacięcie w uszczelce dolnej komory, aby umożliwić wprowadzenie ostrza bez kontaktu z powierzchnią liścia.
  8. Uszczelnij miejsce wprowadzenia za pomocą niskoemisyjnej masy uszczelniającej, aby zapobiec wyciekowi gazu.
    UWAGA: Przed kontynuacją sprawdź, czy montaż wycinarki nie naruszył szczelności komory. Potwierdź, że komora zamyka się całkowicie, termopara pozostaje w kontakcie z powierzchnią liścia, a system wymiany gazów wskazuje stabilny przepływ powietrza bez oznak nieszczelności. Kontynuuj pracę dopiero po potwierdzeniu stabilnych warunków w komorze. Dobierz długość ostrza tak, aby uzyskać nacięcie o długości około 10 mm. Zintegrowany mechanizm tnący oraz jego położenie w komorze liściowej przedstawiono na Rysunku 1B.

Układ pobierania próbek do chromatografii gazowej sprzężonej z spektrometrią mas (GC-MS) do analizy chemicznej; port PTR-TOF-MS.
Rysunek 1Zmodyfikowany system wymiany gazowej zintegrowanym przecinaczem liści wewnątrz komory oraz liniami do pobierania próbek substancji lotnych.  (A) Przegląd zmodyfikowanego układu wymiany gazowej, przedstawiający port pobierania próbek PTR-TOF-MS oraz linię pobierania próbek GC-MS umieszczoną w pobliżu wylotu komory w celu zbierania substancji lotnych. (B) Zbliżenie otwartej komory przedstawiające zintegrowany mechanizm cięcia oraz obszar, w którym liść jest umieszczony podczas ranienia. Nożyk jest hermetycznie wbudowany w komorę, co umożliwia ranienie liścia bez otwierania obudowy podczas pomiaru. Taka konfiguracja pozwala na monitorowanie w czasie rzeczywistym emisji substancji lotnych oraz wymiany gazowej w kontrolowanych warunkach środowiskowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.

2. Konfiguracja ścieżek pobierania próbek lotnych

  1. Zainstaluj teflonowy trójnik (średnica wewnętrzna 1/16″ lub 1/8″) przy wylocie komory (Rycina 1A), aby zminimalizować długość rurki między komorą a analizatorem substancji lotnych.
  2. Podłącz wylot do systemu zbierania LZO za pomocą obojętnych rurek (np. FEP lub PTFE; średnica wewnętrzna 1,6 mm). Zainstaluj trójnik bezpośrednio przy wylocie komory, aby rurka między komorą a analizatorem substancji lotnych była tak krótka, jak to tylko możliwe, co zminimalizuje objętość wewnętrzną, czas przebywania oraz straty wynikające z adsorpcji.
  3. Utrzymuj przepływ powietrza w komorze na poziomie 750 µmol s-1.
    UWAGA: Krótkie rurki obojętne ograniczają adsorpcję i czas przebywania związków reaktywnych.

3. Przygotowanie materiału roślinnego

  1. Uprawiać Quercus rubra, Acer platanoides oraz Gossypium hirsutum w komorze z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi w temperaturze 25 °C w dzień / 20 °C w nocy, przy wilgotności względnej 60%, natężeniu światła 100 µmol m-2 s-1 oraz fotoperiodzie 16 h/ 8 h przez okres 4 miesięcy.
  2. Utrzymywać rośliny w atmosferycznym stężeniu CO2 (~430 ppm) przez cały czas trwania eksperymentu.
  3. Podlewać wszystkie rośliny co dwa dni, aż gleba osiągnie pojemność polową.
  4. Do eksperymentów wybrać w pełni rozwinięte, niesenescencyjne liście o porównywalnym stadium rozwojowym.

4. Eksperymenty z ranieniem liści i pobieraniem LZO

  1. Zamknij liść i ustaw warunki środowiskowe
    1. Umieść w pełni rozwinięty przyczepiony liść w kuwecie wyposażonej w wewnętrzny przecinacz.
    2. Ustaw temperaturę bloku na 25 °C, względną wilgotność powietrza do 60%, natężenie światła aktynicznego do 1000 µmol m-2 s-1 (90% czerwony, 10% niebieski) oraz przepływ powietrza do 750 µmol s-1.
    3. Pozostawić liść do aklimatyzacji w wybranych warunkach środowiskowych do momentu uzyskania wartości stanu ustalonego dla netto CO2 poziomy asymilacji, przewodności szparkowej oraz bazowe sygnały LZO zostają osiągnięte, zazwyczaj w ciągu 20–30 min po zamknięciu liścia.
  2. Przeprowadzenie monitorowania wymiany gazowej, fluorescencji i LZO
    1. Rozpocznij jednoczesne pomiary wymiany gazowej i LZO z rozdzielczością 1 Hz.
    2. Po zakończeniu pomiarów wymiany gazowej należy zapisać wydajność fluorescencji w stanie stacjonarnym (Fs) a następnie zastosować impuls nasycający (8000 µmol m-2 s-1, 0,6 s) poprzez fluorymetr komorowy (305-FL) do wyznaczania maksymalnej wydajności fluorescencji (Fm(′) w liściach zaadaptowanych do światła.
    3. Wyłącz światło aktyniczne i poddaj liść adaptacji do ciemności przez 20 min.
    4. Zarejestruj ciemne oddychanie liścia.
    5. Zmierz początkową fluorescencję (F₀) przy użyciu słabego modulowanego światła pomiarowego (0.03 µmol m-2 s-1), a następnie impuls nasycający w celu uzyskania maksymalnej fluorescencji w liściach zaadaptowanych do ciemności (Fm).
    6. Ponownie włącz światło aktyniczne.
    7. Kontynuuj pomiary LZO oraz wymiany gazowej w tych samych warunkach środowiskowych, aż do momentu stabilizacji wartości bazowych sprzed zranienia.
      UWAGA: Przed zadaniem zranienia należy potwierdzić, że wybrane warunki środowiskowe pozostają stabilne, a netto asymilacja CO₂, transpiracja oraz sygnały bazowe LZO osiągnęły wartości stanu ustalonego. Należy kontynuować procedurę dopiero po utrzymaniu tych warunków przy wybranych ustawieniach pomiarowych.
  3. Ranienie liści i pobieranie LZO
    1. Wprowadź pierwszy wkład na LZO do linii wylotowej i podłącz go do przenośnej pompy do poboru próbek powietrza o stałym przepływie. Przepuść powietrze z komory przez wkład ze stałą prędkością przepływu 20 mL min⁻¹.-1Należy użyć wielowarstwowego adsorbera ze stali nierdzewnej (długość 10,5 cm, średnica wewnętrzna 3 mm) odpowiedniego do wychwytywania związków lotnych C3–C17, wypełnionego materiałami: Carbotrap C 20/40 mesh (0,2 g), Carbopack B 40/60 mesh (0,1 g) oraz Carbotrap X 20/40 mesh (0,1 g), rozmieszczonymi w kierunku pobierania próbki od najsłabszej do najsilniejszej zdolności adsorpcyjnej.
      UWAGA: Przed pobraniem próbki należy przygotować wkłady, przepuszczając przez nie hel o wysokiej czystości z przepływem 20 mL min-1-1 przez 3 h w temperaturze 250 °CPróbkowanie na wkładach umożliwia późniejszą analizę GC-MS w trybie offline w celu identyfikacji związków, gdy wymagają tego cele eksperymentalne. Choć pobieranie próbek na wkłady stanowi część opisanego tutaj schematu postępowania, reprezentatywne wyniki przedstawione w niniejszym badaniu pochodzą z ciągłych pomiarów PTR-TOF-MS. Dobór adsorbentu należy dopasować do zakresu lotności i polarności docelowych LZO, a także do warunków próbkowania.
    2. Zbierać LZO przed zranieniem przez 15 min przy przepływie 200 ml/min-1.
    3. Wymień wkład i zbieraj LZO przez 2 min.
    4. Obrócić wewnętrzny nożyk 360° aby wyciąć liść bez otwierania komory i przywrócić ostrze do pozycji początkowej.
      UWAGA: Należy umieścić liść w komorze w taki sposób, aby nacięcie zostało wykonane w zamkniętej części blaszki liściowej, przy jednoczesnym zachowaniu pełnej szczelności komory. Jeśli pozwalają na to rozmiar i morfologia liścia, należy unikać przecinania żyłki głównej oraz dbać o jak najdokładniejszą powtarzalność miejsca nacięcia we wszystkich próbkach. Ponieważ uszkodzenie głównych żyłek może znacząco zwiększyć emisję lotnych związków indukowanych zranieniem, spójne rozmieszczenie ran poprawia odtwarzalność eksperymentu.5.
      UWAGA: Przed rozpoczęciem cięcia należy upewnić się, że komora jest całkowicie szczelna.
    5. Kontynuuj pobieranie LZO przy użyciu tego samego wkładu przez 13 min.
    6. Włóż trzeci wkład i zbieraj LZO przez 15 min.
    7. Uruchomić spektrometr PTR-TOF-MS w trybie ciągłym przez cały czas trwania pomiarów w celu detekcji w czasie rzeczywistym.
      UWAGA: Przed i po każdym pomiarze rośliny należy pobrać próbkę tła z pustej komory w tych samych warunkach środowiskowych. Pomiary tła te należy wykorzystać do korekty linii bazowej danych dotyczących emisji LZO podczas analizy danych.

5. Detekcja związków lotnych i obsługa instrumentu

  1. Ustaw temperaturę wlotu i rury dryfu PTR-TOF-MS na 80 °C, przepływ wlotowy na 10 mL min-1, przepływ pary wodnej na 4,0 mL min-1, prąd jonowy na 4,0 mA, ciśnienie w komorze dryfu na 2,1 mbar, stosunek gęstości pola rury dryfu na 15 Td oraz ciśnienie modułu TOF-MS na 1,2 × 10-7 mbar.
  2. Rejestruj sygnały lotnych związków z rozdzielczością czasową 1 Hz i odstępem próbkowania 40 ps.
  3. Przed każdym eksperymentem skalibruj PTR-TOF-MS, używając certyfikowanej mieszaniny gazów wzorcowych zawierającej reprezentatywne LZO z głównych klas lotnych związków roślinnych. Przetwórz dane kalibracyjne i oblicz stężenia LZO za pomocą oprogramowania PTR-MS Viewer zgodnie z opisanymi procedurami13,16.

6. Analiza próbek z wkładów metodą offline GC-MS

UWAGA: Poniższa procedura opisuje analizę offline próbek z kartridży pobranych podczas powyższego procesu. Analiza GC-MS zapewnia uzupełniającą identyfikację związków, podczas gdy reprezentatywne wyniki przedstawione w niniejszym badaniu opierają się na ciągłych pomiarach PTR-TOF-MS.

  1. Przeprowadzić desorpcję termiczną z wkładów przy użyciu zautomatyzowanej jednostki desorpcji termicznej sprzężonej z systemem GC-MS, zgodnie z procedurą opisaną przez Kännaste i wsp.20.
  2. Zidentyfikować związki poprzez porównanie z autentycznymi standardami oraz biblioteką widm masowych NIST. Wykonać detekcję spektrometryczną z wykorzystaniem jonizacji uderzeniem elektronów (70 eV) i potwierdzić tożsamość związków poprzez dopasowanie zarówno czasów retencji, jak i widm masowych do autentycznych standardów, jeżeli są one dostępne.
    UWAGA: Pobieranie próbek do wkładów odbywa się zgodnie z zmodyfikowanym protokołem Kännaste i wsp.20 w celu wychwytywania substancji lotnych C3–C17.

7. Analiza danych

  1. Przed analizą odjąć tło z pustej komory od wszystkich śladów emisji. Linię bazową przed zranieniem dla każdej monitorowanej masy zdefiniować jako średni sygnał w stałym odstępie czasu bezpośrednio przed cięciem.
  2. Czas cięcia przyjąć jako wspólny punkt odniesienia dla wszystkich monitorowanych mas. Początek emisji określić jako pierwszy wykrywalny wzrost sygnału LZO skorygowanego o linię bazową po przecięciu liścia.
    UWAGA: Początek emisji zdefiniowano jako pierwszy następujący po sobie wzrost powyżej linii bazowej przed zranieniem, który trwał w fazie wzrostowej wyrzutu emisji, co pozwoliło wykluczyć odosobnione fluktuacje przypisywane szumowi instrumentalnemu.
  3. Czas do osiągnięcia szczytu obliczyć jako odstęp między czasem cięcia a maksymalnym sygnałem emisji. Maksymalne nachylenie wyrzutu emisji obliczyć z pierwszej pochodnej sygnału skorygowanego o linię bazową, stosując średnią z nachyleń przednich i tylnych między sąsiednimi punktami danych13. Amplitudę szczytu zdefiniować jako maksymalną obserwowaną wartość emisji podczas wyrzutu.

Wyniki

Aby ocenić, czy pozycja pobierania substancji lotnych wpływa na detekcję sygnału, porównaliśmy dwie konfiguracje, wykorzystując kontrolowane wstrzyknięcia gazu do komory liściowej. W jednej konfiguracji substancje lotne były pobierane bezpośrednio z wylotu zmodyfikowanej komory wymiany gazowej (Rycina 1). W drugiej natomiast powietrze przechodziło przez przewody analizatora wymiany gazowej przed dotarciem do detektora. Jednoczesne rejestrowanie obu sygnałów umożliwiło bezpośrednie porównanie ich dynamiki czasowej.

Wstrzyknięcie czystych związków lotnych wywołało szybkie odpowiedzi detektora z wyraźnymi pikami emisji (Rycina 2). Podczas pobierania próbek bezpośrednio z wylotu komory sygnały rosły natychmiast po wstrzyknięciu, osiągały ostre maksima, a następnie szybko zanikały. W przypadku pobierania próbek za rurką analizatora te same związki wywołały opóźnione i stłumione odpowiedzi.

W przypadku izoprenu (m/z 69) opóźnienie czasowe między pozycjami poboru próbek było minimalne, a wartości szczytów pozostały podobne (Rysunek 2A). Dla Z-3-heksen-1-olu (m/z 83) przejście przez rurkę spowodowało zmniejszenie wysokości szczytu i poszerzenie krzywej zaniku w porównaniu z bezpośrednim poborem próbek (Rysunek 2B). Efekt ten był najsilniejszy w przypadku α-pinenu (m/z 137), gdzie przejście przez rurkę znacznie osłabiło szczyt w porównaniu z sygnałem zmierzonym bezpośrednio na wylocie z komory (Rysunek 2C).

Krzywe odpowiedzi spektrometrii masowej; m/z 69, 83, 137; wtrysk gazu; odpowiedź detektora w funkcji czasu.
Rysunek 2Efekt wpływu pozycji próbkowania na odpowiedź czasową detekcji substancji lotnych. Odpowiedzi na wtrysk czystego (A) izoprenu (m/z 69), (B) Z-3-heksen-1-olu, wykrywanego głównie jako jon fragmentacyjny m/z 83, oraz (C) α-pinenu (m/z 137) zarejestrowano w dwóch pozycjach poboru próbek. Linie ciągłe reprezentują pobór próbek bezpośrednio za wylotem z komory, natomiast linie przerywane reprezentują standardową pozycję poboru próbek przed analizatorami CO₂/H₂O, po przejściu przez przewody układu wymiany gazowej. Strzałki wskazują wtrysk gazu. Odpowiedzi znormalizowano do maksymalnego sygnału wykrytego przez PTR-QMS podczas poboru próbek obok komory. W celu wizualizacji różnic w kształcie odpowiedzi, przebiegi czasowe dla standardowego poboru próbek przesunięto o 0,9 s względem poboru bezpośredniego. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Rasulov et al..16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Odcięcie liścia wywołało szybką emisję lotnych związków organicznych specyficznych dla poszczególnych substancji u wszystkich gatunków (Quercus rubra, Acer platanoides oraz Gossypium hirsutum), a system wykrył te emisje w ciągu kilku sekund. Ponieważ układ wewnątrzkomorowy bezpośrednio określił zarówno moment rozpoczęcia emisji, jak i czas jej szczytu, umożliwiło to ilościowe określenie kinetyki poszczególnych związków bez przerywania pomiaru.

U wszystkich gatunków dominujący sygnał PTR-TOF-MS indukowany zranieniem wykryto przy m/z 9, wstępnie przypisując go do związków typu heksenalu pochodnych LOX na podstawie wcześniejszych badań PTR-TOF-MS (Rysunek 3, Rysunek 4 oraz  Rysunek 5). Emisje szczytowe w trzech gatunkach mieściły się w zakresie 24–300 nmol m-2 s-1, co ilustruje zdolność protokołu do rozdzielania dynamiki LZO indukowanych zranieniem w szerokim zakresie natężeń emisji (Rysunek 3, Rysunek 4 oraz Rysunek 5). We wszystkich przypadkach m/z 9 wzrastało w ciągu kilku sekund po przecięciu, osiągało szczyt w ciągu ~39–57 s i wykazywało najgwałtowniejszy wzrost spośród monitorowanych mas (Tabela 1), co identyfikuje je jako dominujący ostry komponent wyrzutu wywołanego zranieniem.

Masa 69 pozostała na pomijalnym poziomie przed cięciem w przypadku A. platanoides (Rycina 4B) i G. hirsutum (Rycina 5B) i wzrosła jedynie nieznacznie po zranieniu. W przeciwieństwie do nich, Q. rubra wykazywała znaczną emisję bazową przed cięciem, po której nastąpił niewielki, przejściowy wzrost i późniejsza stabilizacja, co jest zgodne z konstytutywnym uwalnianiem izoprenu nałożonym na odpowiedź na zranienie (Rycina 3B).

Analiza innych monitorowanych mas ujawniła wyraźną sekwencję czasową po przecięciu. We wszystkich gatunkach m/z 43, 57, 69 i 9 definiowały wczesną fazę wyrzutu, podczas gdy m/z 45 i 83 osiągały szczyt później (Rysunek 3, Rysunek 4 i Rysunek 5; Tabela 1). Wzorzec ten był najbardziej wyraźny u A. platanoides, gdzie m/z 45 zaczynało rosnąć natychmiast po przecięciu, lecz szczyt osiągnęło dopiero po ~15 s, co wskazuje na wolniejszą i bardziej przedłużoną odpowiedź niż w przypadku wczesnych fragmentów związanych z LOX (Rysunek 4A; Tabela 1). Podobnie m/z 83 osiągało szczyt później niż wczesne fragmenty we wszystkich gatunkach i było szczególnie opóźnione u G. hirsutum, osiągając maksimum dopiero po ~23 s (Rysunek 5A; Tabela 1).

Wykres spektroskopii absorpcji przejściowej; kinetyka M43+, M45+, M83+; czas vs. stężenie.
Rysunek 3Rozdzielczość czasowa emisji lotnych substancji indukowanych zranieniem w reprezentatywnym liściu Quercus rubra. (A) m/z 43, 45 i 83. (B) m/z 57, 69 i 9. W czasie t = 0 liść został odcięty za pomocą przecinaka do liści umieszczonego wewnątrz komory, przedstawionego w Rycina 1wykonując nacięcie o długości 10 mm. Emisje lotne były monitorowane w sposób ciągły przy użyciu spektrometru mas czasu przelotu z reakcją przeniesienia protonu (PTR-TOF-MS), a szybkość wymiany gazowej mierzono za pomocą systemu Walz GFS-30. Sygnały przedstawiono jako reprezentatywne profile emisji z korekcją linii bazowej, ilustrujące rozdzielczość czasową osiągalną przy zastosowaniu tego protokołu. Patrz Tabela 1 dla reprezentatywnych deskryptorów kinetycznych wyodrębnionych z tych profilów emisji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Pomimo tych wspólnych cech, reprezentatywne pomiary ilustrują, że trajektorie emisji mogą różnić się w zależności od gatunku. U Q. rubra sygnały m/z 43 i 57 rosły gwałtownie, lecz rozeszły się w fazie zaniku, przy czym m/z 57 spadał wolniej niż m/z 43 (Rycina 3A,B). U A. platanoides wzorzec ten uległ odwróceniu, a m/z 43 wykazywał wolniejszy spadek w późnej fazie (Rycina 4A). U G. hirsutum wszystkie sygnały miały niższą amplitudę, a profile emisji łączyły gwałtowne początkowe piki z bardziej stopniowym zanikiem. Co istotne, m/z 45 wykazywał niewielki wtórny wzrost podczas fazy zaniku (Rycina 5A).

Wykres wyników chromatografii przedstawiający piki M43, M45, M83 oraz zmiany dynamiczne M57, M69, M9.
Rysunek 4: Rozdzielczość czasowa emisji lotnych związków indukowanych zranieniem w reprezentatywnym liściu Acer platanoides. (A) m/z 43, 45 i 83. (B) m/z 57, 69 i 9. Liść odcięto w czasie t = 0 za pomocą przecinaka wbudowanego w komorę (Rycina 1; nacięcie 10 mm). Emisje lotne pomiarzono w sposób ciągły za pomocą spektrometru mas czasu przelotu z reakcją przeniesienia protonu (PTR-TOF-MS), a wymianę gazową za pomocą systemu Walz GFS-30. Sygnały przedstawiono jako reprezentatywne profile emisji z korekcją linii bazowej, ilustrujące rozdzielczość czasową osiągalną przy zastosowaniu tego protokołu. Patrz Tabela 1 dla reprezentatywnych deskryptorów kinetycznych wyodrębnionych z tych profili emisji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wspólnie wzorce te wskazują, że emisje indukowane zranieniem przebiegają zgodnie ze swoistą dla każdego związku kaskadą, a nie w formie pojedynczego, synchronicznego wyrzutu, z wyraźnymi wczesnymi komponentami, po których następują szersze, opóźnione odpowiedzi.

Dwa wykresy kinetyczne jonów serii M (M_43, M_45, M_83; M_57, M_69, M_9) w funkcji czasu.
Rycina 5Rozdzielczość czasowa emisji lotnych związków indukowanych zranieniem w reprezentatywnym liściu Gossypium hirsutum. (A) m/z 43, 45 i 83. (B) m/z 57, 69 i 9. Liść został odcięty w czasie t = 0 za pomocą przecinaka wewnątrzkomorowego (Rysunek 1; nacięcie o długości 10 mm). Emisje lotne były mierzone w sposób ciągły za pomocą spektrometru mas czasu przelotu z reakcją przeniesienia protonu (PTR-TOF-MS), a wymiana gazowa była mierzona za pomocą systemu Walz GFS-30. Sygnały przedstawiono jako reprezentatywne profile emisji z korekcją linii bazowej, ilustrujące rozdzielczość czasową możliwą do uzyskania przy zastosowaniu tego protokołu. Patrz Tabela 1 dla reprezentatywnych deskryptorów kinetycznych wyekstrahowanych z tych profilów emisji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia analizę emisji substancji lotnych indukowanych zranieniem z wysoką rozdzielczością czasową w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych. Dzięki zintegrowaniu procesu nacinania bezpośrednio w komorze liściowej i ciągłemu monitorowaniu sygnałów lotnych (Rycina 1), system rejestruje odpowiedź emisyjną bez zniekształceń wprowadzanych przez opóźnione próbkowanie, otwieranie komory lub manipulację liściem poza układem pomiarowym. Zakłócenia te mogą zmieniać zarówno pozorne ramy czasowe, jak i wielkość szczytów emisji w pomiarach opartych na zamkniętych komorach3,6,13,17. Poprzez przeprowadzenie procesu zranienia i pomiaru w tej samej komorze, protokół zachowuje linię czasu emisji i umożliwia wiarygodną, rozdzielczą w czasie kwantyfikację odpowiedzi lotnych indukowanych stresem.

GatunkiProtonowana masa cząsteczkowaAmplituda piku (nmol m-2 s-1)Czas rozpoczęcia po przecięciu (s)Czas szczytu (s)Maksymalne nachylenie (nmol m-2 s-2)
Quercus rubra4321.91~0.055.61.49
4510.527111.40.29
5721.272055.61.37 
69145.625611.44
8324.132171.81.39
99243.162157.418.17
Acer platanoides4320.265.4541.59
4518.061.8154.80.55
5718.6510.841.41.55
6915.1510.841.41.13
838.787.257.60.76
99292.8610.843.223.62
Gossypium hirsutum433.55.448.60.19
454.98995.40.29
572.4810.8360.18
692.4212.637.80.17
834.8314.4223.20.3
9923.4712.639.61.95

Tabela 1: Reprezentatywne wartości wielkości piku, początku emisji, czasu do osiągnięcia piku oraz maksymalnego nachylenia wyodrębnione z ciągłych pomiarów PTR-TOF-MS po uszkodzeniu liści.Wartości obejmują wielkość piku, początek emisji, czas do osiągnięcia piku oraz maksymalne nachylenie. Wartości te ilustrują rodzaj deskryptorów kinetycznych generowanych przez protokół i są przedstawione jako przykłady dowodu koncepcji, a nie jako porównania statystyczne między gatunkami. Początek emisji zdefiniowano jako pierwszy wykrywalny wzrost powyżej linii bazowej sprzed uszkodzenia po przecięciu, czas do osiągnięcia piku jako odstęp między przecięciem a maksymalnym sygnałem, a maksymalne nachylenie jako maksymalną pierwszą pochodną sygnału skorygowanego o linię bazową.

Porównanie pozycji poboru próbek wykazało, że konfiguracja poboru próbek znacząco wpływała na rejestrowany sygnał (Rysunek 2). Bezpośredni pobór próbek przy wylocie z komory pozwolił na zachowanie szybkiego formowania się piku, podczas gdy pobór próbek za przewodami analizatora opóźnił formowanie piku i osłabił intensywność sygnału. Efekt ten był pomijalny dla izoprenu (m/z 69), umiarkowany dla m/z 83 i najsilniejszy dla α-pinenu (m/z 137), co jest zgodne ze wzrostem zniekształceń związanych z transportem w przypadku związków cięższych lub bardziej reaktywnych10,21. Adsorpcja na powierzchniach rurek, opóźniony transport przez linię poboru próbek oraz oddziaływania chemiczne podczas transportu mogą poszerzać lub tłumić piki emisji, zmieniając tym samym interpretację kinetyki lotnych związków9,12,21.

Główną zaletą niniejszego protokołu jest zdolność do rozdzielenia najwcześniejszej fazy emisji substancji lotnych indukowanych przez zranienie. U wszystkich gatunków faza ta pojawiała się w ciągu kilku sekund po przecięciu i była zdominowana przez gwałtowny wzrost przy m/z 9, który wykazywał zarówno najwyższą amplitudę piku, jak i najstrmsze nachylenie maksymalne (Rycina 3, Rycina 4 oraz Rycina 5; Tabela 1). Maxima pików wystąpiły w czasie ~40–57 s po przecięciu, czyli znacznie wcześniej niż 10–280 s typowo raportowane w poprzednich badaniach13,19,2. Przesunięcie to prawdopodobnie odzwierciedla synchronizację zranienia i detekcji wewnątrz komory, co minimalizuje opóźnienia spowodowane manipulacją liśćmi i transportem w linii próbkowania.

Dzięki synchronizacji procesu zranienia i detekcji w tej samej komorze, protokół pozwolił również na rozstrzygnięcie kaskady na poziomie fragmentów, w której sygnały m/z 43 i 57 wzrosły natychmiast po przecięciu, podczas gdy sygnał m/z 45 osiągnął szczyt później i wykazał szerszą dynamikę zaniku (Rysunek 3, Rysunek 4 oraz Rysunek 5; Tabela 1). Kolejność ta pozostaje spójna z poprzednimi badaniami opartymi na technice PTR, mimo braku rozdzielczości na poziomie związków w porównaniu z GC-MS, w której wczesne emisje są zdominowane przez aldehydy C6 pochodne lipoksygenazy, a następnie przez alkohole i produkty pokrewne powstające w dalszych etapach szlaku19,2. Zgodnie z poprzednimi badaniami PTR-TOF-MS, dominujący sygnał m/z 9 odpowiada związkom typu heksenalu, których fragment dehydratacyjny przy m/z 81 został zidentyfikowany jako główny wczesny sygnał, podczas gdy m/z 83 odzwierciedla wkład heksenoli i heksanalu2. Sekwencja ta dodatkowo potwierdza hierarchię zależną od wielkości i szlaku metabolicznego, w której mniejsze, szybko tworzące się związki utlenione są uwalniane wcześniej niż cząsteczki większe lub bardziej złożone13,23.

Poza fragmentami pochodzącymi z lipooksygenazy, sygnał przy m/z 69, wstępnie przypisany izoprenowi, wykazywał wyraźne trajektorie emisji w reprezentatywnych przykładach (Rycina 3, Rysunek 4i Rysunek 5). Q. rubra wykazały znaczną emisję bazową, podczas gdy A. platanoides i G. hirsutum wyprodukowano jedynie w ilościach śladowych, co jest zgodne z ich znaną charakterystyką emisyjną24,25W różnych gatunkach emisja izoprenu reagowała słabo na uszkodzenia mechaniczne, co jest zgodne z jego de novo synteza poprzez szlak MEP, który zależy od metabolizmu fotosyntetycznego, a zatem jest jedynie pośrednio wpływany przez uszkodzenia mechaniczne15.

Te szybka dynamika odzwierciedla dobrze udokumentowane odpowiedzi biochemiczne liści na uszkodzenia mechaniczne. Uszkodzenie mechaniczne szybko aktywuje szlak lipooksygenazy, który generuje przejściowe impulsy lotnych związków C6 oraz powiązanych utlenionych związków pochodzących z utleniania lipidów błonowych5,7,17,2,23. Emisje te wykazują silnie asymetryczną dynamikę, z gwałtownym wzrostem po uszkodzeniu tkanki, po którym następuje wolniejsza faza zaniku16. Ten asymetryczny wzorzec w obecnym układzie rozwija się w skali od sekund do minut, co ilustrują reprezentatywne deskryptory kinetyczne podsumowane w Tabeli 1, podczas gdy badania, w których liście były raniwane poza komorą, raportują opóźnione piki13. Tak wcześniejsza rozdzielczość pozwala uchwycić sygnał od momentu jego powstania, redukuje rozmycie czasowe i umożliwia bezpośrednią kwantyfikację zarówno fazy wzrostu, jak i fazy zaniku. Te cechy kinetyczne wspólnie definiują pełną trajektorię emisji, która w podejściach opartych na dyskretnym lub opóźnionym próbkowaniu jest często niedoszacowana5,15.

Standaryzacja procesu cięcia wewnątrz komory dodatkowo poprawia powtarzalność eksperymentalną, zapewniając spójną geometrię i stopień dotkliwości rany, z których oba parametry są determinowane przez długość nacięcia i bezpośrednio wpływają na wielkość emisji LZO5,18,2. Niemniej jednak, ponieważ ostrze tnące zajmuje stałą pozycję wewnątrz komory, umiejscowienie nacięcia zależy od rozmiaru i morfologii liścia oraz od konieczności zachowania szczelności systemu. Jeśli to możliwe, nacięcie powinno zostać wykonane w obrębie blaszki międzyżyłkowej, z pominięciem żyłki środkowej oraz innych głównych żyłek. Jednakże całkowite uniknięcie głównych żyłek nie zawsze jest możliwe, szczególnie w przypadku liści wąskich lub małych. Ponieważ uszkodzenie głównych żyłek może znacząco zmienić indukowaną raną emisję LZO5, miejsce nacięcia powinno być jak najspójniejsze pomiędzy próbkami w obrębie tego samego eksperymentu.

Utrzymanie stabilnych warunków środowiskowych jest równie istotne dla uzyskania powtarzalnych pomiarów LZO indukowanych przez zranienie. Ponieważ produkcja, uwalnianie i transport LZO zależą od warunków środowiskowych, temperaturę w komorze, wilgotność, natężenie promieniowania, stężenie CO2 oraz przepływ powietrza utrzymywano na stałym poziomie podczas wszystkich pomiarów. Standaryzacja tych zmiennych dodatkowo minimalizuje zmienność eksperymentalną i poprawia powtarzalność kinetyki LZO indukowanych przez zranienie. Ponadto, ponieważ protokół jest w pełni kompatybilny z jednoczesnymi pomiarami wymiany gazowej, przyszłe zastosowania mogą bezpośrednio wiązać dynamikę emisji LZO ze zmianami w fotosyntezie i transpiracji w identycznych warunkach eksperymentalnych26. Takie pomiary mogą pomóc w odróżnieniu biochemicznej regulacji produkcji LZO od procesów fizycznych wpływających na uwalnianie substancji lotnych, w tym zwiększonego parowania rozpuszczalnych w wodzie związków utlenionych z uszkodzonej tkanki16. W związku z tym różnice między wariantami lub gatunkami należy interpretować tylko wtedy, gdy warunki środowiskowe, geometria rany i materiał roślinny, w tym stadium rozwoju liścia, są ustandaryzowane w trakcie całego eksperymentu12.

Chociaż poprzednie podejścia z wykorzystaniem pomiarów wewnątrzkomorowych wykazały możliwość pomiaru LZO indukowanych przez rany w czasie rzeczywistym, ujawniły one również istotne ograniczenia techniczne. Nieregularne nacięcia, niespójna wielkość ran oraz zaburzenia uszczelnienia komory wprowadzały zmienność pomiędzy pomiarami18,19. Ponadto podejścia te często opierały się na stosunkowo dużych objętościach komór, co spowalniało wymianę powietrza, opóźniało tworzenie się piku i poszerzało profile sygnałów związków lotnych2,27. Efekty te stają się bardziej wyraźne w przypadku związków o mniejszej lotności i mogą różnić się w zależności od temperatury21. W przeciwieństwie do tego, mniejsza komora zastosowana w niniejszym protokole (objętość wewnętrzna ~8 mL) skraca czas przebywania powietrza, co przyczynia się do ostrzejszego początku obserwowanego w naszych pomiarach (Rycina 1).

Protokół został opracowany z myślą o kontrolowanych eksperymentach fizjologicznych, a nie o bezpośrednim monitorowaniu ekosystemów leśnych in situ. Pomiary są wykonywane na przymocowanych liściach w ściśle określonych warunkach środowiskowych, co minimalizuje zmienność eksperymentalną i umożliwia precyzyjną charakterystykę kinetyki LZO indukowanej zranieniem. Zastosowania terenowe będą zależeć od dostępności przenośnych systemów wymiany gazowej i detekcji LZO. Niemniej jednak, ponieważ zintegrowany mechanizm cięcia może zostać dostosowany do różnych konfiguracji komór przy niewielkich modyfikacjach, podejście to powinno być łatwo przenoszalne na przenośne platformy wymiany gazowej oraz inne platformy eksperymentalne w miarę pojawiania się tych technologii. Elastyczność ta poszerza możliwości badania szybkich reakcji roślin na stres przy zachowaniu rozdzielczości czasowej wymaganej do dokładnej charakterystyki dynamiki emisji LZO, co ułatwia badania mechanistyczne najwcześniejszych odpowiedzi fizjologicznych i biochemicznych na uszkodzenia liści.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktów interesów.

Podziękowania

Potwierdzamy otrzymanie finansowania z Estońskiej Rady Badawczej (PRG2207) oraz Ministerstwa Edukacji i Badań Estonii (Centrum Doskonałości Agro-CropFuture, „Agroekologia i nowe uprawy w przyszłym klimacie”, TK20U1).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System GC-MS z desorberem termicznym TD-20ShimadzuGCMS-QP2010 Plus; TD-20System GC-MS z desorberem termicznym TD-20. www.shimadzu.com
System wymiany gazowej GFS-300Walz GmbHGFS-30Pomiary wymiany gazowej liści. www.walz.com
Hel wysokiej czystości (9.9%)Lokalny dostawcaN/AUżywany do kondycjonowania wkładów adsorbentów i desorpcji termicznej w GC-MS. www.airliquide.com (lub równoważny dostawca).
Wzorzec kalibracyjny izoprenuSigma-Aldrich Chemie GmbHCustomWzorzec kalibracyjny izoprenu przygotowany na zamówienie (3.43 ppm). www.sigmaaldrich.com
Szpachla uszczelniająca o niskiej emisjiLokalny dostawcaN/ASłuży do uszczelnienia punktu wprowadzenia wycinaka do komory.
Wielowarstwowy wkład adsorbentny ze stali nierdzewnejSupelcoCustomDługość 10.5 cm × 3 mm i.d.; wypełniony materiałami Carbotrap C (0.2 g, 20–40 mesh), Carbopack B (0.1 g, 40–60 mesh) oraz Carbotrap X (0.1 g, 20–40 mesh). Stosowany do opcjonalnej offline'owej identyfikacji LZO metodą GC-MS. www.sigmaaldrich.com
Przenośna pompa do pobierania próbek powietrza o stałym przepływieSKC Inc.210-103MTXPrzenośna pompa do pobierania próbek powietrza o stałym przepływie.
Spektrometr mas PTR-TOF 80Ionicon Analytik GmbHPTR-TOF 80Detekcja LZO. www.ionicon.com
Srebrny drut lutowniczyLokalny dostawcaN/AUżywany do przymocowania żyletki do pręta ze stali nierdzewnej.
Sprężysta blacha mosiężna (grubość 0.2 mm)Lokalny dostawcaN/AElastyczne podpory służące do mocowania wycinaka.
Pręt ze stali nierdzewnej (średnica 1 mm)Lokalny dostawcaN/APręt wsporczy wycinaka.
Igła strzykawki ze stali nierdzewnej (średnica zewnętrzna 1.6 mm)Lokalny dostawcaN/AObudowa dla obrotowego ostrza wycinaka.
Zatworki teflonoweLokalny dostawcaN/ASłużą do uszczelnienia obudowy wycinaka przy jednoczesnym umożliwieniu obrotu.
Złącze teflonowe w kształcie litery TLokalny dostawcaN/AZainstalowane w pobliżu wylotu komory w celu skrócenia długości przewodów.
Przewody teflonowe (FEP lub PTFE)Lokalny dostawcaN/ALinia poboru próbek LZO pomiędzy komorą a detektorami.
Mieszanina gazów kalibracyjnych LZOIonimed GmbHCustom1 ppm każdego związku w N2; stosowana do kalibracji PTR-TOF-MS. www.ionimed.com

Bibliografia

  1. Bergman ME, Huang XQ, Baudino S, Caissard JC, Dudareva N. Plant volatile organic compounds: emission and perception in a changing world. Curr Opin Plant Biol. 2025;85:102706.
  2. Luo R, Lun X, Gao R, Wang L, Yang Y, Su X, et al. A review of biogenic volatile organic compounds from plants: research progress and future prospects. Toxics. 2025;13(5):1-35.
  3. Molleman F, Mandal M, Sokół-Łętowska A, Walczak U, Volf M, Mallick S, et al. Simulated herbivory affects the volatile emissions of oak saplings, while neighbourhood affects flavan-3-ols content of their leaves. J Chem Ecol. 2024;50(5-6):250-261.
  4. Huang PC, Berg-Falloure KM, Gao X, Meeley R, Kolomiets MV. Pentyl leaf volatiles promote insect and pathogen resistance via enhancing ketol-mediated defense responses. Plant Physiol. 2025;197(2):1-18.
  5. Portillo-Estrada M, Niinemets Ü. Massive release of volatile organic compounds due to leaf midrib wounding in Populus tremula. Plant Ecol. 2018;219(9):1021-1028.
  6. Engelberth M, Engelberth J. Leaf developmental stages strongly modulate indole emissions in response to simulated insect herbivory. Plants (Basel). 2025;14:3761.
  7. Matsui K. How and why plants came to smell green: the origins, biosynthesis, and roles of green leaf volatiles. J Exp Bot. 2025;76:1-14.
  8. Waterman JM, Cazzonelli CI, Hartley SE, Johnson SN. Simulated herbivory: the key to disentangling plant defence responses. Trends Ecol Evol. 2019;34(5):447-458.
  9. Tholl D, Boland W, Hansel A, Loreto F, Röse USR, Schnitzler JP. Practical approaches to plant volatile analysis. Plant J. 2006;45(4):540-560.
  10. Ormeño E, Goldstein A, Niinemets Ü. Extracting and trapping biogenic volatile organic compounds stored in plant species. TrAC Trends Anal Chem. 2011;30(7):978-989.
  11. Chang YY, Huang YM, Chang HT. Using headspace gas chromatography-mass spectrometry to investigate the volatile terpenoids released from the Liquidambar formosana leaf and its essential oil. Forests. 2024;15(9):1-12.
  12. Niinemets Ü, Kuhn U, Harley PC, Staudt M, Arneth A, Cescatti A, et al. Estimations of isoprenoid emission capacity from enclosure studies: measurements, data processing, quality and standardized measurement protocols. Biogeosciences. 2011;8(8):2209-2246.
  13. Portillo-Estrada M, Kazantsev T, Talts E, Tosens T, Niinemets Ü. Emission timetable and quantitative patterns of wound-induced volatiles across different leaf damage treatments in aspen (Populus tremula). J Chem Ecol. 2015;41(12):1105-1117.
  14. Waterman JM, Cofer TM, Von Laue OM, Mateo P, Wang L, Erb M. Leaf size determines damage- and herbivore-induced volatile emissions in maize. Plant Cell Environ. 2025;48(5):3766-3777.
  15. Yuan Y, Mao Y, Yuan H, Guo M, Zhou G, Niinemets Ü, et al. Impacts of mechanical injury on volatile emission rate and composition in 45 subtropical woody broad-leaved storage and non-storage emitters. Plants (Basel). 2025;14(5):1-40.
  16. Rasulov B, Talts E, Niinemets Ü. A novel approach for real-time monitoring of leaf wounding responses demonstrates unprecedentedly fast and high emissions of volatiles from cut leaves. Plant Sci. 2019;283:256-265.
  17. Portillo-Estrada M, Okereke CN, Jiang Y, Talts E, Kaurilind E, Niinemets Ü. Wounding-induced VOC emissions in five tropical agricultural species. Molecules. 2021;26(9):1-20.
  18. Mithöfer A, Wanner G, Boland W. Effects of feeding Spodoptera littoralis on lima bean leaves. II. Continuous mechanical wounding resembling insect feeding is sufficient to elicit herbivory-related volatile emission. Plant Physiol. 2005;137(3):1160-1168.
  19. Brilli F, Ruuskanen TM, Schnitzhofer R, Müller M, Breitenlechner M, Bittner V, et al. Detection of plant volatiles after leaf wounding and darkening by proton transfer reaction time-of-flight mass spectrometry (PTR-TOF). PLoS One. 2011;6(5):e20419.
  20. Kännaste A, Copolovici L, Niinemets Ü. Gas chromatography-mass spectrometry method for determination of biogenic volatile organic compounds emitted by plants. In: Rodríguez-Concepción M, editor. Plant Isoprenoids Methods and Protocols. New York (NY): Humana Press; 2014. p. 161-169.
  21. Schaub A, Blande JD, Graus M, Oksanen E, Holopainen JK. Real-time monitoring of herbivore-induced volatile emissions in the field. Physiol Plant. 2010;138(2):123-133.
  22. Fall R, Karl T, Hansel A, Jordan A, Lindinger W. Volatile organic compounds emitted after leaf wounding: on-line analysis by proton-transfer-reaction mass spectrometry. J Geophys Res Atmos. 1999;104(D13):15963-15974.
  23. Kaur D, Schedl A, Lafleur C, Martinez Henao J, van Dam NM, Rivoal J, et al. Arabidopsis transcriptomics reveals the role of Lipoxygenase2 (AtLOX2) in wound-induced responses. Int J Mol Sci. 2024;25(11):5898.
  24. Gentner DR, Ormeño E, Fares S, Ford TB, Weber R, Park JH, et al. Emissions of terpenoids, benzenoids, and other biogenic gas-phase organic compounds from agricultural crops and their potential implications for air quality. Atmos Chem Phys. 2014;14(11):5393-5413.
  25. Harley P, Deem G, Flint S, Caldwell M. Effects of growth under elevated UV-B on photosynthesis and isoprene emission in Quercus gambelii and Mucuna pruriens. Glob Chang Biol. 1996;2(2):149-154.
  26. Lobo-do-Vale R, Schenk HJ, Kübert A, Lintunen A. Gas phase in plants: integrating physiology, ecology and environmental sciences. Tree Physiol. 2026;46(13):1-4.
  27. Niinemets Ü. Whole plant photosynthesis. In: Flexas J, Loreto F, Medrano H, editors. Terrestrial Photosynthesis in a Changing Environment A Molecular Physiological and Ecological Approach. Cambridge: Cambridge University Press; 2012. p. 399-423.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Lotne zwi zki organicznewVOC wywo ane zranieniemmonitorowanie w czasie rzeczywistymsygnalizacja stresu ro linPTR TOF MSobrona ro linoddzia ywania ro lina atmosfera

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.