Artykuł metodologiczny

Edycja genomu CRISPR-Cas9 w Mesorhizobium ciceri poprzez przerwanie genu nodC w badaniach nad symbiozą ciecierzycy

0 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71513

⸱

25 września 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Root Nodule Symbiosis Laboratory, National Institute of Plant Genome Research, 2Microbial Engineering Laboratory, International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje CRISPR-Cas9-pośrednią dysrupcję locus nodC u Mesorhizobium ciceri z wykorzystaniem naprawy kierowanej homologią oraz przesiewu opartego na GFP w celu generowania mutantów z defektem symbiozy do badań genomiki funkcjonalnej rizobiów związanych z ciecierzycą.

Streszczenie

Mesorhizobium ciceri, azot wiążący symbiont ciecierzycy (Cicer arietinum), pozostaje pod względem genetycznym trudny do manipulacji przy użyciu konwencjonalnych metod rekombinacji homologicznej, które są pracochłonne i często pozostawiają niepożądane markery selekcyjne. W niniejszym protokole opisujemy usprawnioną strategię edycji genomu z wykorzystaniem systemu białka Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) o szerokim zakresie gospodarzy, dostosowanego do M. ciceri. Wykazujemy skuteczność tej metody poprzez celowanie w gen nodC, który koduje N-acetyloglukozaminylotransferazę niezbędną do syntezy szkieletu chitynowego w czynnikach Nod – głównych cząsteczkach sygnałowych zaangażowanych w symbiotyczną komunikację molekularną. Protokół ten szczegółowo opisuje systematyczne projektowanie pojedynczych RNA przewodnich (sgRNA) oraz konstrukcję matrycy do naprawy kierowanej homologią (HDR). Matryca HDR została zaprojektowana w celu umożliwienia specyficznej integracji reportera białka fluorescencyjnego GFP (green fluorescent protein) flankującego miejsce cięcia nodC. Po wprowadzeniu konstrukcji Cas9/sgRNA/HDR poprzez kojenie biparentalne, potencjalne mutanty zidentyfikowano za pomocą przesiewowej metody opartej na fluorescencji. Skuteczne przerwanie loci nodC o długości 1,3 kb w obrębie kasety nodulacyjnej (nod) sprawdzono początkowo poprzez wizualizację ekspresji GFP w koloniach mutantów z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej. Przerwanie to zostało następnie potwierdzone za pomocą trawienia restrykcyjnego, amplifikacji zintegrowanej kasety z DNA genomowego oraz sekwencjonowania metodą Sangera. Ekspresję GFP ilościowo określono dodatkowo za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR). Aby zweryfikować funkcjonalny wpływ mutacji, przeprowadzono testy infekcji ciecierzycy, które wykazały upośledzoną nodulację w roślinach inokulowanych szczepem ΔnodC M. ciceri w porównaniu ze szczepem typu dzikiego. Ogólnie rzecz biorąc, niniejszy protokół zapewnia wydajne i powtarzalne ramy dla precyzyjnego wyłączania genów oraz badań genomiki funkcjonalnej u Mesorhizobium.

Wprowadzenie

System nukleazy Cas9 (białko 9 związane z CRISPR – Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), pierwotnie zidentyfikowany jako adaptacyjny mechanizm odpornościowy u prokariotów, został przystosowany do roli skutecznego i niezawodnego narzędzia do edycji genomu1,2. System ten wykorzystuje syntetyczne przewodniące RNA (sgRNA) do identyfikacji docelowych sekwencji DNA poprzez parowanie zasad Watsona-Cricka. sgRNA składa się z 20 nukleotydów komplementarnych do regionu genomowego sąsiadującego z sekwencją PAM (protospacer adjacent motif) NGG. Cas9 generuje pęknięcie dwuniciowe (DSB) w określonym miejscu wewnątrz sekwencji docelowej, zazwyczaj 3 pary zasad (bp) powyżej miejsca PAM1. Powstałe DSB mogą być naprawiane albo poprzez niehomologiczne łączenie końców, albo poprzez naprawę kierowaną homologią (HDR) z wykorzystaniem matrycy donorowej3,4. Strategia ta jest szeroko stosowana w podejściach do zaburzania genów, knock-in oraz knock-out w bakteriach5,6,7,8. Głównym celem niniejszego protokołu jest opracowanie wydajnej metody edycji genomu dla Mesorhizobium ciceri z wykorzystaniem systemu CRISPR-Cas9 o szerokim zakresie gospodarzy.

M. ciceri jest gramujemna bakterią glebową, która pełni funkcję niezbędnego azotowo wiążącego endosymbionta ciecierzycy (Cicer arietinum)9. Jeden ze szczepów, M. ciceri CC1192, wykazuje wysoką wydajność nodulacji, a jego genom został zsekwencjonowany10. Pomimo znaczenia rolniczego, manipulacje genetyczne gatunków Mesorhizobium pozostają ograniczone. Systemy oparte na CRISPR zostały wcześniej zaimplementowane u innych ryzobiów, w tym interferencja CRISPR (CRISPRi) u Rhizobium etli11, edycja genomu u Sinorhizobium meliloti12 oraz edycja zasad u S. meliloti13. Jednakże nie zgłoszono jeszcze istnienia solidnej platformy edycji genomu dla M. ciceri. Tradycyjne podejścia opierają się na rekombinacji homologicznej zapośredniczonej przez plazmidy samobójcze, co jest pracochłonne, wymaga wielu rund selekcji i często pozostawia markery oporności na antybiotyki w postaci blizn genomicznych14.

Aby rozwiązać te ograniczenia, system wektorów pCasPP, opracowany pierwotnie dla Paenibacillus polymyxa, został dostosowany do zastosowania w M. ciceri15. Konstrukcja pCasPP wykorzystuje białko Cas9 z Streptococcus pyogenes o optymalizacji kodonów dla aktynomycetów o wysokiej zawartości GC i zawiera kasetę lacZ do selekcji niebiesko-białej klonowania sgRNA pod konstytutywnym promotorem gapdh8. W celu wprowadzenia wektora edytującego przeprowadzono kojenie biparentalne między szczepem donora Escherichia coli a szczepem biorcy Mesorhizobium16. Aby zwiększyć wydajność selekcji, w szablon donora HDR włączono wariant zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) bjGFP, pierwotnie zoptymalizowany kodonowo dla Bradyrhizobium diazoefficiens16. Tę strategię selekcji opartą na fluorescencji zastosowano w celu ukierunkowania na niezbędny locus nodC, który jest wymagany na wczesnych etapach sygnalizacji symbiotycznej między bakterią a ciecierzycą17,18.

Niniejszy protokół stanowi precyzyjną i wydajną alternatywę dla metod losowej mutagenezy chemicznej lub ultrafioletowej (UV). W eksperymentach walidacyjnych ponad 80% odzyskanych kolonii wykazywało fluorescencję GFP, a reprezentatywne edytowane kolonie zostały dodatkowo potwierdzone za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz sekwencjonowania metodą Sangera. Otrzymane mutanty ΔnodC M. ciceri stanowią użyteczny zasób do badania sygnalizacji symbiotycznej oraz interakcji gospodarz-mikrob. W ogólnym ujęciu ramy te oferują społeczności badawczej zajmującej się ryzobiami wydajne i skalowalne podejście do badań nad genomiką funkcjonalną w obrębie rodzaju Mesorhizobium.

Protokół

Wszystkie protokoły eksperymentalne obejmujące wzrost roślin, inokulację mikrobiologiczną oraz postępowanie z bakteriami modyfikowanymi genetycznie były prowadzone zgodnie z wytycznymi i regulacjami instytucjonalnymi. Uprawa roślin oraz inokulacje bakteryjne odbywały się w kontrolowanych warunkach komory wzrostowej. Szczep M. ciceri wykorzystany w niniejszym badaniu jest klasyfikowany jako mikroorganizm 1. poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-1). Ponieważ wszystkie eksperymenty przeprowadzono w zamkniętych warunkach laboratoryjnych bez uwalniania do środowiska, formalna zgoda instytucjonalna ds. bezpieczeństwa biologicznego nie była wymagana zgodnie z polityką bezpieczeństwa biologicznego danej instytucji. Wszystkie odpady biologiczne powstałe podczas badania zostały poddane autoklawowaniu przed utylizacją.

1. Przygotowanie kompetentnych komórek

Chemicznie kompetentne komórki E. coli DH5α oraz E. coli S17-1λpir przygotowano i zweryfikowano zgodnie z procedurą opisaną w Pliku uzupełniającym 1.

2. Projektowanie gRNA

  1. Projektowanie gRNA
    1. Otwórz platformę Benchling (https://benchling.com/). Zaloguj się na istniejące konto Benchling lub utwórz nowe konto.
    2. Utwórz nowy projekt i otwórz narzędzie CRISPR Guide Design Tool.
    3. Prześlij lub wklej pełną sekwencję docelowego DNA do projektowania gRNA. Wybierz opcję projektowania „Single Guide” i ustaw długość przewodnika na 20 bp.
    4. Wybierz referencyjny genom z dostępnych opcji. W przypadku projektowania gRNA celującego w M. ciceri wybierz Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110 jako genom referencyjny. Użyj sekwencji NGG jako motywu PAM (protospacer adjacent motif) wymaganego do aktywności Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9).
    5. Użyj algorytmu Hsu i wsp.19 do obliczenia przewidywanej częstotliwości cięć poza celem (off-target). Utrzymaj wartość progową ≥50, aby zminimalizować niespecyficzne cięcia w obrębie referencyjnego genomu.
    6. Użyj algorytmu Doench-Root20 do obliczenia przewidywanych wyników wydajności cięcia w miejscu docelowym (on-target). Ustaw próg wyboru celu na poziomie ≥60, aby zidentyfikować przewodniki o korzystnej przewidywanej wydajności cięcia przez Cas9 w locus docelowym.
    7. Kliknij „Finish”, aby wygenerować listę kandydackich gRNA.
  2. Wybór gRNA
    1. Otwórz panel wyników dla gRNA.
    2. Nadaj priorytet kandydackim sgRNA, które według przewidywań spowodują pęknięcie obu nici DNA w odległości do 100 bp od startowego kodonu translacyjnego (ATG), co zwiększa prawdopodobieństwo powstania niefunkcjonalnego białka.
    3. Oceń wyniki off-target i on-target. Wybierz wyższy wynik off-target zamiast nieco wyższego wyniku on-target, aby zmniejszyć ryzyko niezamierzonych cięć poza celem.
    4. Wybierz jeden lub dwa kandydackie pojedyncze gRNA (sgRNA), które spełniają wszystkie kryteria wyboru.
  3. Przygotowanie oligonukleotydów gRNA
    1. Wygeneruj sekwencję odwrotną komplementarną dla wybranego gRNA.
    2. Dodaj sekwencję 5′-ACGC do końca 5′ gRNA oraz sekwencję 5′-AAAC do końca 5′ nici odwrotnie komplementarnej.
    3. Zamów oba oligonukleotydy z fosforylacją na końcu 5′ i oczyszczaniem metodą PAGE przy skali syntezy 25 nmol.
  4. Hybrydyzacja oligonukleotydów gRNA
    1. Przygotuj bufor HEPES 30 mM, rozpuszczając 7,15 g wolnego kwasu HEPES w około 800 mL wody destylowanej. Dostosuj pH do 7,8 za pomocą wodorotlenku sodu i doprowadź końcową objętość do 1 L.
    2. Resuspenduj każdy fosforylowany oligonukleotyd w wodzie beznukleazowej do końcowego stężenia 100 µM. Połącz 5 µL każdego oligonukleotydu z 90 µL buforu HEPES 30 mM w sterylnej probówce do mikrowirówki.
    3. Krótko wymieszaj na wirówce typu vortex i odwiruj, aby zebrać ciecz. Przeprowadź hybrydyzację oligonukleotydów w termocyklerze, inkubując w 95°C przez 5 min, a następnie chłodząc do 4°C z szybkością 0,1°C/s.
    4. Rozcieńcz zhybrydyzowane oligonukleotydy 10-krotnie za pomocą wody beznukleazowej.
  5. Montaż gRNA w wektorze pCasPP
    1. Pozyskaj wektor pCasPP opisany wcześniej przez Rüteringa i wsp.15.
    2. Sekwencja plazmidu została dostarczona przez Jochena Schmida, a konstrukt użyty w tej badaniu pozyskano od dr. Syeda Shams Yazdaniego (ICGEB).  
    3. Przygotuj reakcję Golden Gate zawierającą 100 ng wektora pCasPP, 0,3 µL zhybrydyzowanego oligonukleotydu (insertu), 2 µL 10× buforu ligazy T4 DNA, 1 µL ligazy T4 DNA, 1 µL enzymu restrykcyjnego BbsI oraz wodę beznukleazową do końcowej objętości 20 µL.
    4. Przygotuj reakcję kontrolną negatywną, zastępując insert wodą beznukleazową.
    5. Delikatnie wymieszaj reakcje i krótko odwiruj.
  6. Warunki cykli montażu Golden Gate
    1. Włóż probówki z reakcją do termocyklera. Przeprowadź dziewięć cykli składających się z 37°C przez 10 min, a następnie 16°C przez 10 min.
    2. Inkubuj reakcje w 50°C przez 5 min, a następnie w 65°C przez 20 min. Przechowuj reakcje w 4°C do momentu użycia.
  7. Transformacja reakcji montażowych
    1. Rozmroź 50 µL kompetentnych komórek Escherichia coli DH5α na lodzie przez 10–15 min.
    2. Dodaj 3 µL każdej reakcji montażu Golden Gate do kompetentnych komórek. Równolegle przeprowadź reakcję kontrolną negatywną. Inkubuj mieszaniny na lodzie przez 30 min.
    3. Przeprowadź szok termiczny komórek w 42°C przez 45 s i natychmiast przenieś probówki na lód na 2 min. Dodaj 950 µL pożywki Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC).
    4. Przygotuj pożywkę SOC zawierającą 0,5% ekstraktu drożdżowego, 2% tryptonu, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄ oraz 20 mM glukozy. Sterylizuj pożywkę przez filtr 0,4 µm w warunkach aseptycznych.
    5. Inkubuj hodowle w 37°C przy 180 rpm przez 1 h.
  8. Wybór pozytywnych transformantów
    1. Przygotuj płytki z agarem LB uzupełnione o 50 µg/mL neomycyny, 0,2 mM izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) oraz 32 mg/L 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopiranozydu (X-gal). Wysiej 100 µL hodowli regeneracyjnej na płytki selekcyjne. Inkubuj płytki w 37°C przez 12–16 h.
    2. Wybierz białe kolonie i odrzuć kolonie niebieskie. Sprawdź, czy na płytce kontrolnej negatywnej znajduje się mniej niż pięć kolonii.
  9. Przesiewanie i namnażanie pozytywnych klonów
    1. Przenieś od trzech do czterech niezależnych białych kolonii na świeże selekcyjne płytki z agarem LB.
    2. Inkubuj płytki w 37°C przez 12–16 h. Zaszczep poszczególne kolonie do 10 mL pożywki LB uzupełnionej o 50 µg/mL neomycyny.
    3. Przetwarzaj każdy konstrukt gRNA niezależnie w dalszym toku prac.
  10. Walidacja konstruktów pCasPP-gRNA
    1. Zebierz hodowle bakteryjne poprzez wirowanie. Izoluj DNA plazmidowe za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidów na kolumnach krzemionkowych.
    2. Traw izolowane DNA plazmidowe enzymami XbaI i EcoRI w odpowiednim buforze reakcyjnym przez 1 h w 37°C.
    3. Rozdziel produkty trawienia na 1% żelu agarozowym przygotowanym w 1× buforze Tris-acetate-EDTA (TAE) zawierającym bromek etydyny w końcowym stężeniu 0,5 µg/mL.
    4. Prowadź elektroforezę przy 90–110 V, aż front barwnika przejdzie przez około 70–80% długości żelu. Wizualizuj fragmenty DNA za pomocą transiluminatora UV.
    5. Potwierdź pozytywne klony poprzez wykrycie fragmentu o długości 1 280 bp i zidentyfikuj kontrole z pustym wektorem poprzez wykrycie fragmentu o długości 1 630 bp. Pusty wektor pCasPP ma około 9 663 bp i zawiera gen lacZ; wstawienie 24 bp oligonukleotydu gRNA usuwa fragment lacZ, tworząc mniejszy konstrukt pCasPP zawierający gRNA. Miejsca restrykcyjne XbaI i EcoRI flankujące region lacZ są używane do diagnostycznego potwierdzenia klonowania gRNA.
  11. Przygotowanie banków w glicerolu
    1. Hoduj potwierdzony pozytywny klon w selektywnej pożywce LB.
    2. Przygotuj bank w glicerolu, mieszając 700 µL hodowli w fazie logarytmicznej z 300 µL sterylnego 50% glicerolu. Przenieś mieszaninę do sterylnych probówek kriogenicznych. Przechowuj banki w glicerolu w temperaturze −80°C.
      UWAGA: Unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. Przygotuj wiele alikwotów, aby zachować stabilność plazmidu i żywotność bakterii. Zakończona reakcja montażu Golden Gate może być przechowywana w 4°C przez noc lub w −20°C przez 1–2 tygodnie przed transformacją.

3. Przygotowanie matrycy do naprawy sterowanej homologią

  1. Przygotowanie wstawki zielonego białka fluorescencyjnego (GFP)
    1. Pozyskać plazmid pRJPaph-bjGFP zawierający kasetę reporterową fluorescencyjną16 (Tabela 1)10,15,16,21,22,23. Plazmid został udostępniony przez prof. Hans-Martina Fischera (ETH Zurich, Szwajcaria) i jest dostępny poprzez Addgene (Plazmid #67032).
    2. Wyciąć kasetę gfp z pRJPaph-bjGFP za pomocą trawienia restrykcyjnego enzymami SacI i KpnI, zgodnie z opisem w Pliku uzupełniającym 2 (Krok 3.1). Sekwencja gfp w pRJPaph-bjGFP jest syntetycznym genem bjGFP zoptymalizowanym kodonowo dla Bradyrhizobium diazoefficiens.
    3. Oczyścić oczekiwany fragment gfp o długości 1081 bp.
  2. Konstrukcja pUC18-gfp
    1. Pozyskać szkielet pUC18 (plazmid Addgene #50004)21.
    2. Zlinearyzować pUC18 przy użyciu SacI i KpnI, zgodnie z opisem w Pliku uzupełniającym 2 (Krok 3.2).
    3. Ligować oczyszczony fragment gfp do zlinearyzowanego wektora pUC18, zgodnie z opisem w Pliku uzupełniającym 2 (Krok 3.2).
    4. Transformować kompetentne komórki E. coli DH5α, stosując procedurę transformacji opisaną w Kroku 2.7, zastępując mieszaninę reakcji Golden Gate assembly mieszaniną ligacji otrzymaną w Kroku 3.2.3.
    5. Wyselekcjonować pozytywne transformanty i zweryfikować wstawienie gfp za pomocą kolonialnej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), zgodnie z opisem w Pliku uzupełniającym 2 (Krok 3.2).
  3. Amplifikacja ramion homologii
    1. Zaprojektować startery do amplifikacji ramienia homologii upstream (UHA) i downstream (DHA) o długości około 400–500 bp z DNA genomowego M. ciceri (Tabela 2).
    2. Wprowadzić miejsca restrykcyjne SacI/EcoRI do starterów UHA oraz miejsca restrykcyjne XbaI/KpnI do starterów DHA. Do amplifikacji UHA użyć starterów F_nodC_Up_EcoRI i R_nodC_Up_SacI, a do amplifikacji DHA starterów F_nodCdown_KpnI i R_nodCdown_XbaI (Tabela 2).
    3. Wyizolować DNA genomowe M. ciceri zgodnie z metodą Weerakkody i wsp.25.
    4. Amplifikować i oczyścić fragmenty UHA i DHA zgodnie z opisem w Pliku uzupełniającym 2 (Krok 3.3).
  4. Konstrukcja pUC18-UHA-gfp
    1. Klonować fragment UHA do pUC18-gfp przy użyciu EcoRI i SacI, zgodnie z opisem w Pliku uzupełniającym 2 (Krok 3.4).
    2. Potwierdzić poprawność konstrukcji plazmidu za pomocą trawienia restrykcyjnego enzymami XbaI i KpnI. Prawidłowa konstrukcja powinna przynieść fragmenty o długości około 500 i 3725 bp.
    3. Kontynuować pracę z jednym zweryfikowanym klonem.
  5. Konstrukcja pUC18-UHA-gfp-DHA
    1. Klonować fragment DHA do pUC18-UHA-gfp przy użyciu KpnI i XbaI, zgodnie z opisem w Pliku uzupełniającym 2 (Krok 3.5).
    2. Potwierdzić poprawność konstrukcji za pomocą trawienia restrykcyjnego enzymami SacI i EcoRI. Prawidłowa konstrukcja powinna przynieść fragmenty o długości około 400 i 4271 bp.
    3. Zweryfikować 5–6 klonów kandydackich poprzez sekwencjonowanie metodą Sangera przy użyciu starterów F_nodC_Up_EcoRI, BjGFP_BP_F1 oraz R_nodCdown_XbaI (Tabela 2), które łącznie pokrywają większość sekwencji kasety do naprawy sterowanej homologią (HDR).
  6. Amplifikacja i oczyszczanie końcowej matrycy HDR
    1. Amplifikować pełną kasetę HDR przy użyciu starterów F_FL_nodCgfp_XbaI i R_nodCdown_XbaI (Tabela 2).
    2. Oczyścić oczekiwany fragment HDR o długości 2012 bp i poddać oczyszczony produkt PCR trawieniu enzymem XbaI, zgodnie z opisem w Pliku uzupełniającym 2 (Krok 3.6).
  7. Przygotowanie wektorów pCasPP-gRNA
    1. Pobrać plazmidy pCasPP-gRNA1 i pCasPP-gRNA2 wytworzone w Kroku 2.
    2. Zlinearyzować plazmidy enzymem XbaI i defosforylować szkielet wektora zgodnie z opisem w Pliku uzupełniającym 2 (Krok 3.7).
  8. Klonowanie matrycy HDR do wektorów pCasPP-gRNA
    1. Ligować kasetę HDR do zlinearyzowanych enzymem XbaI wektorów pCasPP-gRNA1 lub pCasPP-gRNA2 zgodnie z opisem w Pliku uzupełniającym 2 (Krok 3.8).
    2. Transformować kompetentne komórki E. coli DH5α i wyselekcjonować transformanty na agarze LB zawierającym 50 µg/mL neomycyny.
  9. Przesiewanie klonów zawierających HDR
    1. Przesiewać transformanty pod kątem fluorescencji GFP za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w standardowy zestaw filtrów GFP (pobudzenie 470–488 nm; emisja 507–510 nm).
    2. Klasyfikować kolonie jako GFP-dodatnie na podstawie obecności wyraźnej, jednolitej zielonej fluorescencji, która wyraźnie przewyższa słabą autofluorescencję obserwowaną w nieedytowanych koloniach kontrolnych ujemnych.
    3. Namnożyć klony GFP-dodatnie i wyizolować DNA plazmidowe.
  10. Walidacja konstrukcji wektora HDR
    1. Potwierdzić wstawienie HDR za pomocą trawienia restrykcyjnego enzymem XbaI.
    2. Zweryfikować poprawność konstrukcji poprzez uwolnienie oczekiwanego fragmentu HDR o długości 2012 bp wraz z szkieletem wektora pCasPP-gRNA o długości około 9,300 bp.
      UWAGA: Po inaktywacji termicznej enzymów restrykcyjnych i fosfatazy, mieszaniny reakcyjne można przechowywać w temperaturze 4°C przez noc lub w −20°C do 1 miesiąca. Potwierdzone konstrukty plazmidowe przechowywać w −20°C w celu długoterminowej konserwacji.
Szczep lub plazmidOpisBibliografia
Mesorhizobium ciceri CC1192Szczep biorcy wykorzystywany do edycji genomu metodą CRISPR-Cas9 i testów nodulacji ciecierzycyHaskett i wsp.10
pCasPPWektor do edycji genomu CRISPR-Cas9 stosowany do klonowania gRNA i dostarczania matrycy HDRRütering i wsp.15
pRJPaph-bjGFPPlazmid reporterowy GFP wykorzystany jako źródło kasety GFP
(plazmid Addgene nr 67032)		Ledermann i wsp.16
pUC18Uniwersalny wektor klonujący stosowany do składania matrycy HDR
(plazmid Addgene nr 50004)		Norrander i wsp.21
Escherichia coli S17-1λpirSzczep donora wykorzystany do koniugacji biparentalnejSimon i wsp.22
Escherichia coli DH5αGospodarz klonujący używany do propagacji plazmidówHanahan i wsp.23

Tabela 1: Szczepy bakteryjne i plazmidy użyte w niniejszym badaniu. Tabela ta wymienia szczepy bakteryjne i plazmidy wykorzystane do propagacji plazmidów, edycji genomu za pomocą systemu CRISPR-Cas9, składania matryc do naprawy ukierunkowanej homologią (HDR), kojarzenia biparentalnego oraz znakowania fluorescencyjnego Mesorhizobium ciceri CC1192.

KategoriaNazwaSekwencja (5′ figure-protocol-1 3′) lub opis
Szczep bakteryjnyEscherichia coli DH5αSzczep gospodarza do klonowania
Szczep bakteryjnyEscherichia coli S17-1λpirSzczep donora do kojenia biparentalnego
Wektor klonującypUC18Wektor szkieletowy do klonowania
Wektor CRISPRpCasPPWektor CRISPR-Cas9 o szerokim zakresie gospodarzy
Plazmid reporterowypRJPaph-bjGFPPlazmid reporterowy GFP
StarterF_guide1_BbsIpACGCTGTTTACAGAGGCATGCAAG
StarterR_guide1_BbsIpAAACCTTGCATGCCTCTGTAAACA
StarterF_guide2_BbsIpACGCGCTTGTTCGGATCCGACCGT
StarterR_guide2_BbsIpAAACACGGTCGGATCCGAACAAGC
StarterF_nodC_Up_EcoRIAAAGAATTCCTCATTGCAAGCCAGCAGT
StarterR_nodC_Up_SacIAAAGAGCTCCGGAAAGCTTGTTTCGGATCC
StarterF_nodCdown_KpnIAAAGGTACCTCGAGAGCACCGCATAAGAC
StarterR_nodCdown_XbaIAATTCTAGATGGTTCGGTACTTTCGTGCA
StarterF_FL_nodCgfp_XbaIAAATTCTAGACTCATTGCAAGCCAGCCAGT
StarterBjGFP_BP_F1GAAGTTCATCTGCACCACCG
StarterBjGFP_BP_R1GTCCTTGAACGAGATGGTGC
StarterBjGFP_BP_F2CCAACTTCAAGATCCGCCAC
StarterGFP_RCCAACTTCAAGATCCGCCAC
StarterBjGFP_BP_R2CTTGTACAGCTCGTCCATGC
Starter16S_F1ATCCTGGCTCAGAACGAACG
Starter16S_R1ATTCCCACGCGTTACTCACC
Starter16S_F2AGTCCGAGAGGGTGAGTGG
Starter16S_R2GTCAGTACCGAGCCAGTGAG
StarterF1_nodCCGATTTCCAGAACCGTCGTC
StarternodC_RCGATTTCCAGAACCGTCGTC
StarterR1_nodCTCCCCTGCTACAATGAGGAC
StarterF2_nodCAGTGACTCCGCAATTCCAGA
StarterR2_nodCTGTCGGTAAAAGTGTTTCCC
StarterF1_nodBTGGTTCGGTACTTTCGTGCA
StarterR1_nodBAGTCGCGTGGATCAATGGAC
StarterF1_nodATGATCGTCGCTGAATTGGGC
StarterR1_nodACAACTGATGGAGCACTGGGT
StarterF1_nodDTGGCCTTAAGAGACGTGTCG
StarterR1_nodDAAATGCCTGACCAGCCGTAA

Tabela 2: Szczepy bakteryjne, plazmidy i startery oligonukleotydowe użyte w niniejszym badaniu.W tabeli wymieniono szczepy bakteryjne, plazmidy i startery oligonukleotydowe wykorzystane do konstrukcji pojedynczego przewodniego RNA (sgRNA), składania matrycy do naprawy kierowanej homologią (HDR), diagnostycznej reakcji polimerazy łańcuchowej (PCR), sekwencjonowania metodą Sangera oraz ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR). Sekwencje starterów przedstawiono w orientacji 5′ figure-protocol-2 3′. Uwaga: BjGFP_BP_F2 i GFP_R odnoszą się do tej samej sekwencji oligonukleotydowej, ale są wymienione pod różnymi nazwami starterów, ponieważ zostały użyte w różnych analizach eksperymentalnych.

4. Krzyżowanie biparentalne w celu transferu plazmidu do M. ciceri CC1192

  1. Transformacja komórek dawcy E. coli
    1. Przeprowadzić transformację komórek E. coli S17-1λpir konstruktami pCasPP-gRNA1-HDR lub pCasPP-gRNA2-HDR zgodnie z procedurą opisaną w Supplementary File 3 (Krok 4.1).
    2. Wyselekcjonować transformanty na agarze LB zawierającym 50 µg/mL neomycyny.
    3. Przeprowadzić przesiew transformantów pod kątem fluorescencji GFP, stosując wzbudzenie przy około 488 nm i detekcję emisji przy około 510–520 nm.
    4. Zakwalifikować kolonie jako GFP-dodatnie, jeśli wykazują jednolitą, wyraźną zieloną fluorescencję, która nie występuje w koloniach kontrolnych nietransformowanych E. coli S17-1λpir przy identycznych ustawieniach mikroskopu.
    5. Przygotować zapasy glicerolowe z potwierdzonych GFP-dodatnich klonów dawcy.
  2. Przygotowanie kultur nasiennych i starterowych
    1. Przygotować kultury starterowe dawcy E. coli S17-1λpir oraz biorcy M. ciceri zgodnie z Supplementary File 3 (Krok 4.2).
    2. Hodować kultury starterowe do uzyskania OD₆₀₀ na poziomie 0,3–0,4, co odpowiada szacowanej gęstości komórek wynoszącej około 1 × 108 CFU/mL.
  3. Przygotowanie subkultur do kojenia biparentalnego
    1. Przygotować subkultury dawcy i biorcy i hodować je do wymaganej fazy wzrostu wykładniczego zgodnie z Supplementary File 3 (Krok 4.3).
    2. Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) za pomocą spektrofotometru UV–vis zgodnie z procedurą pomiaru gęstości optycznej opisaną w Supplementary File 1 (Krok 1.2.3).
  4. Procedura kojenia biparentalnego
    1. Przeprowadzić kojenie biparentalne na filtrze membranowym zgodnie z Supplementary File 3 (Krok 4.4).
    2. Nanieść cztery alikwoty zawiesiny kojonej na sterylną membranę filtracyjną z polifluorku winylidenu (PVDF) o rozmiarze porów 0,22 µm (średnica 47 mm), zachowując odpowiednie odstępy między plamkami, aby zapobiec ich mieszaniu.
  5. Odzyskiwanie i selekcja transkonjugantów
    1. Odzyskać transkonjuganty i przeprowadzić selekcję podwójnym antybiotykiem zgodnie z Supplementary File 3 (Krok 4.5).
    2. Wielokrotnie pasażować transkonjuganty na podłożu zawierającym wyłącznie karbenycylinę w celu wyeliminowania resztkowych plazmidów.
    3. Potwierdzić usunięcie plazmidów brakiem wzrostu kolonii na podłożu z neomycyną oraz za pomocą diagnostycznej PCR wykazującej brak szkieletu pCasPP przy zachowaniu zintegrowanej z chromosomem kasety HDR.
      UWAGA: Wymagane jest wielokrotne pasażowanie w celu weryfikacji stabilności zintegrowanej modyfikacji i wyeliminowania pozostałych plazmidów episomalnych.
  6. Przesiew kolonii GFP-dodatnich
    1. Przesiać oczyszczone transkonjuganty pod kątem fluorescencji GFP i porównać je z kontrolami dzikiego typu M. ciceri zgodnie z Supplementary File 3 (Krok 4.6).
    2. Wyselekcjonować kolonie fluorescencyjne jako domniemane szczepy HDR-dodatnie.
    3. Zakwalifikować kolonie jako GFP-dodatnie, jeśli wykazują jednolitą, wyraźną zieloną fluorescencję, która nie występuje w koloniach M. ciceri typu dzikiego przy identycznych ustawieniach mikroskopu i warunkach ekspozycji.
    4. Potwierdzić kolonie GFP-dodatnie za pomocą diagnostycznej PCR przed przejściem do dalszej walidacji.
    5. Przechowywać potwierdzone kolonie na agarze z manitolem drożdżowym (YM) w temperaturze 4°C do krótkotrwałego utrzymania lub jako zapasy glicerolowe zawierające 20%–25% glicerolu w −80°C do długotrwałego przechowywania.

5. Walidacja mutantów nodC

  1. Walidacja integracji GFP w locus nodC
    1. Zaszczep pojedynczą kolonię wykazującą ekspresję GFP *M. ciceri* kolonię do 10 ml pożywki mannitolowej dla drożdży (YMB) uzupełnionej o 100 µg/mL karbenycylina24Inkubować kulturę w temperaturze 28°C z wytrząsaniem przy 180 obr./min przez 20–24 h.
    2. Odwirować komórki bakteryjne przez wirowanie przy 8 000 rpm × g przez 10 min przy 25°CZebrać osad komórkowy i wyizolować DNA genomiczne zgodnie z metodą Weerakkody i wsp.25.
    3. Przeprowadź diagnostyczną reakcję PCR, wykorzystując genomowe DNA jako matrycę (Tabela 2). Przygotuj 10 µL mieszanina reakcyjna PCR zawierająca 5 µL 2× mieszanina PCR Master Mix, 0.2 µM startery F1_nodB i nodC_R lub startery F1_nodB i gfp_R oraz 50 ng DNA genomicznego.
    4. Zaprogramuj termocykler na wstępną denaturację w temperaturze 95°C przez 5 min, a następnie 35 cykli 95°C przez 1 min, 62°C przez 30 s, a następnie 72°C przez 45 s, z końcową elongacją w 72°C przez 5 min.
    5. Produkty PCR należy rozdzielić w 1% (w/v) żelu agarozowym zgodnie z wcześniejszym opisem. Integrację GFP potwierdza się poprzez wykrycie produktu o wielkości około 430 bp u szczepu dzikiego (WT) oraz produktu o wielkości około 1500 bp u mutanta z przerwaniem przy użyciu pary starterów F1_nodB/nodC_R, a także produktu o wielkości około 1000 bp u mutanta (brak produktu u WT) przy użyciu pary starterów F1_nodB/gfp_R.
    6. Podczas walidacji PCR należy zastosować odpowiednie kontrole. Jako kontrolę pozytywną należy wykorzystać plazmidowe DNA zawierające sekwencję docelową, a jako kontrolę negatywną kontrolę bez matrycy (NTC) zawierającą wodę wolną od nukleaz.
  2. Ilościowe oznaczenie ekspresji GFP metodą ilościowej polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR)
    1. Izolacja całkowitego RNA z typu dzikiego (WT) i mutantów M. ciceri kultury z użyciem odczynnika TRIzol zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Potraktuj RNA nukleazą DNaza I zgodnie z instrukcją producenta, aby usunąć zanieczyszczające DNA genomiczne. Zweryfikuj całkowite usunięcie DNA, stosując kontrolę bez odwrotnej transkrypcji (−RT) podczas qPCR.
    3. Syntetyzuj pierwszą nić cDNA z 1 µg całkowite RNA przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu do syntezy pierwszej nici cDNA zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotować 20 µL mieszanina reakcyjna zawierająca RNA, startery oligo(dT), dNTP, bufor do reakcji, inhibitor RNazy oraz odwrotną transkryptazę.
    4. Inkubować reakcję syntezy cDNA w temperaturze 42°C przez 60 min, a następnie inaktywację termiczną w temperaturze 70°C przez 5 min. Przechowywać cDNA w temperaturze −20°C do momentu użycia.
    5. Przygotować reakcje RT-qPCR w trzech powtórzeniach technicznych. Złożyć 10 µL reakcje zawierające 5 µL 2× SYBR Green Master Mix, 0.2 µM startery BjGFP_BP_F1 i BjGFP_BP_R1 do amplifikacji GFP lub startery 16S_F1 i 16S_R1 do amplifikacji genu referencyjnego (Tabela 2), 2 µL matryca cDNA (około 20 ng) oraz woda wolna od nukleaz.
    6. Przeprowadź reakcję RT-qPCR, stosując następujące warunki cykli: wstępna denaturacja w 95°C przez 2 min, a następnie 40 cykli 95°C przez 15 s i 58°C przez 45 s, a następnie analizę krzywej topnienia od 65°C Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. 95°C.
    7. Przeprowadź qRT-PCR przy użyciu systemu detekcji Real-Time PCR Bio-Rad CFX96. Przeanalizuj wykresy amplifikacji, Ct wartości oraz krzywe topnienia przy użyciu oprogramowania Bio-Rad CFX Manager.
    8. Obliczanie względnej ekspresji genów z wykorzystaniem metody 2^-ΔΔCt−ΔΔCt metoda. Należy znormalizować poziom ekspresji do genu referencyjnego 16S rRNA i wykorzystać grupę WT M. ciceri szczep jako próbkę kalibracyjną. Przeanalizowano trzy powtórzenia biologiczne, z których każde zmierzono w trzech powtórzeniach technicznych.
  3. Ocena potencjału brodawkowania
    1. Przygotowanie inokulum bakteryjnego
      1. Zaszczepić pojedyncze kolonie szczepów WT i mutantów do selektywnego pożywki YMB zawierającej 100 µg/mL karbenicylina. Inkubować hodowle w 28°C z wytrząsaniem przy 180 obr./min przez 30–36 h.
      2. Rozcieńczyć kultury w stosunku 1:100 w świeżej selektywnej pożywce YMB i monitorować wzrost poprzez pomiar OD600 przy użyciu spektrofotometru UV–Vis. Wyzeruj instrument przy użyciu niezaszczepionej pożywki YMB i kontynuuj inkubację, aż hodowle osiągną wartość OD600 wynoszącą 0,3–0,4, co odpowiada około 1 × 108 CFU/ml
      3. Do inokulacji każdej rośliny należy użyć 3 ml zestandaryzowanej zawiesiny bakteryjnej.
    2. Test infekcji rośliny ciecierzycy
      1. Pozyskać nasiona C. arietinum odmiana BDG25618,24 z ICAR–Indian Agricultural Research Institute (IARI) w New Delhi w Indiach.
      2. Dokładnie opłucz nasiona pod bieżącą wodą z kranu, a następnie wodą oczyszczoną w systemie Milli-Q. Przeprowadź sterylizację powierzchniową nasion w 1% podchlorynie sodu przez 5 min przy ciągłym mieszaniu i pięciokrotnie opłucz sterylną wodą oczyszczoną.
      3. Nasiona należy poddać działaniu 0,1% fungicydu Bavistin (50% WP karbendazymu) przez 2–3 h w temperaturze pokojowej. Potraktowane nasiona należy dwukrotnie wypłukać w sterylnej wodzie oczyszczonej.
      4. Umieść nasiona na wilgotnym, sterylnym papierze filtracyjnym w sterylnych płytkach Petriego (110 mm) × 40 mm), szczelnie zamknąć Parafilmem i inkubować w ciemności w temperaturze 28°C ± 2°C przez 3 dni.
      5. Przenieś wykiełkowane siewki pojedynczo do sterylnego piasku. Sterylizuj piasek w temperaturze 121°C oraz pod ciśnieniem 15 psi przez 20 min przed użyciem.
      6. Przygotować bezazotową pożywkę McKnighta, rozpuszczając 6,0 g CaSO₄, 1,0 g MgSO4₄·7H₂O, 1,0 g KH₂PO₄, 1,5 g KCl, 14,3 mg H₃BO₃, 0,4 mg CuSO₄₄·5H₂O, 0,08 mg MnSO4₄·4H₂O, 0,45 mg H₂MoO₄, oraz 1,1 mg ZnSO₄₄·7H₂dopełnić sterylną wodą destylowaną do końcowej objętości 5 L.
      7. Wsadź siewki do doniczek o średnicy 10 cm zawierających sterylny piasek, zachowując cztery rośliny w każdej doniczce. Podlewaj każdą doniczkę dwa razy w tygodniu 20 ml bezazotowego roztworu McKnighta.
      8. Utrzymywać rośliny w kontrolowanych warunkach 22°C ± 2°C (dzień), 18°C ± 2°C (noc), 55%–60% wilgotności względnej, fotoperiod 16 h światła/8 h ciemności oraz natężenie światła wynoszące 200 µmol fotony m⁻2 s⁻1Hodować siewki przez 6–7 dni przed inokulacją.
      9. Nanieś 3 ml zawiesiny bakteryjnej bezpośrednio na każdą siewkę. Kontrolę (próbę pozorowaną) prowadź poprzez naniesienie 3 ml sterylnego pożywki YMB. W każdej grupie eksperymentalnej wykorzystaj 16 roślin jako powtórzenia biologiczne.
      10. Zbierz korzenie i pędy 20 dni po inokulacji. Policz grudki ręcznie i zmierz masę świeżą bezpośrednio po zbiorze.
      11. Osuszyć tkanki w 65°C do uzyskania stałej masy. Przyjmuje się, że stała masa została osiągnięta, gdy dwa kolejne pomiary wykonane w odstępach 24-godzinnego suszenia różnią się o <0,01 g, a następnie odnotować masę suchej biomasy.
      12. Wyniki należy przedstawić jako średnią ± błąd standardowy (SE). Przeprowadzić jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie test wielokrotnych porównań Tukeya przy użyciu programu GraphPad Prism w wersji 10.0, przyjmując P < 0,05 istotność statystyczna.
        UWAGA: Przez cały czas trwania procesu sterylizacji nasion, kiełkowania, inokulacji oraz wzrostu roślin należy zachować warunki sterylności.
        OSTROŻNIE: Roztwory podchlorynu sodu oraz fungicydu należy przygotowywać i stosować przy użyciu odpowiednich środków ochrony indywidualnej, w tym rękawic i okularów ochronnych.

Wyniki

W niniejszym protokole edycja genomu za pomocą CRISPR-Cas9 została zaadaptowana dla M. ciceri CC1192 poprzez celowanie w locus nodC. Aby doprowadzić do utraty funkcji, zaprojektowano sgRNA celujące w region proksymalny 5′ sekwencji kodującej nodC, wprowadzając tym samym pęknięcie dwuniciowe (DSB) w początkowym regionie kodującym, aby zakłócić translację kodowanego białka (Rycyna 1A).

figure-results-1
Rycina 1. Projekt pojedynczych przewodnich RNA (sgRNA) celujących w locus nodC u Mesorhizobium ciceri. (A) Schematyczny obraz locus M. ciceri nodC pokazujący pozycje dwóch 20-bp sgRNA zaprojektowanych dla celowania za pomocą systemu CRISPR-Cas9. Miejsca docelowe sgRNA zaznaczono na niebiesko. (B) Sekwencje nukleotydowe sgRNA1 i sgRNA2 celujące w locus nodC. Motyw PAM (protospacer adjacent motif; 5′-NGG-3′) zaznaczono na czerwono, a kodon start translacji nodC (ATG) wyróżniono na żółto. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dwie 20-bp sekwencje docelowe zidentyfikowano bezpośrednio powyżej sekwencji PAM 5′-NGG-3′ (Rysunek 1B). Analiza in silico tych kandydatów na sgRNA z wykorzystaniem algorytmu opracowanego przez Hsu i wsp.19 dała wyniki specyficzności równe 100, co wskazuje na wysoką przewidywaną specyficzność celowania przy braku znaczącej komplementarności poza celami w genomie M. ciceri. Zaobserwowano niewielkie różnice w przewidywanych wynikach wydajności celowania wybranych sgRNA (Tabela 3), co posłużyło do wyboru przewodników do dalszej oceny eksperymentalnej.

Pozycja docelowa
(p.z.)		Nićsekwencja sgRNA (5'′ figure-results-2 3′)PAMWynik swoistościWskaźnik wydajności
77+TGTTTACAGAGGCATGCAAGCGG10043.58
139+GCTTGTTCGGATCCGACCGTTGG99.747.63

Tabela 3: Kandydackie pojedyncze przewodnie RNA (sgRNA) zaprojektowane do edycji genu nodC w Mesorhizobium ciceri za pomocą systemu CRISPR-Cas9.Kandydackie sgRNA zostały zaprojektowane przy użyciu narzędzia Benchling CRISPR Guide Design Tool z wykorzystaniem genomu Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110 jako genomu referencyjnego. Przewodniki uszeregowano według przewidywanej specyficzności oraz wyników wydajności on-target; wybrano te, które celują w sekwencje sąsiadujące z kodonem start translacji nodC i zawierają wymagany motyw PAM (protospacer adjacent motif) NGG dla białka Cas9 z Streptococcus pyogenes (SpCas9).

Aby ułatwić HDR oraz screening oparty na fluorescencji w celu identyfikacji domniemanych mutantów, zmontowano kasetę HDR z wykorzystaniem wektora klonującego pUC18 (Rycina 2). Kaseta reporterowa gfp została wycięta z pRJPaph-bjGFP poprzez trawienie restrykcyjne enzymami SacI i KpnI, a następnie ligowana do zlinearyzowanego szkieletu pUC18 (Rycina 2A). Po transformacji do E. coli potencjalne klony pozytywne zidentyfikowano za pomocą screeningu niebiesko-białego. Integrację insertu gfp ze szkieletem pUC18 potwierdzono dodatkowo za pomocą amplifikacji PCR z użyciem starterów specyficznych dla genu, co w klonach pozytywnych pozwoliło uzyskać oczekiwany amplikon o długości 500 bp (Rycina 2A).

figure-results-3
Rysunek 2. Konstrukcja systemu CRISPR-Cas9 do naprawy sterowanej homologią (HDR) w celu przerwania genu nodC. (A) Konstrukcja i walidacja pośredniego plazmidu pUC18-gfp. Górny panel przedstawia mapę plazmidu pUC18-gfp powstałego poprzez wstawienie kasety zielonego białka fluorescencyjnego (gfp) do szkieletu pUC18. Środkowy panel przedstawia reprezentatywne kolonie po selekcji niebiesko-białej. Dolny panel przedstawia walidację metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z kolonii przy użyciu pary starterów BjGFP_BP_F1 i BjGFP_BP_R2. (B) Sekwencyjna budowa matrycy HDR w szkieletie pUC18. Mapy plazmidów i analizy trawienia restrykcyjnego potwierdzają wstawienie ramienia homologii powyżej (UHA), ramienia homologii poniżej (DHA) oraz kompletnej kasety HDR UHA-gfp-DHA. (C) Klonowanie i walidacja kasety HDR UHA-gfp-DHA w wektorze CRISPR-Cas9 pCasPP. Górny panel przedstawia końcową mapę plazmidu pCasPP-HDR, a dolny panel pokazuje trawienie restrykcyjne potwierdzające wstawienie kasety HDR. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Konstrukt HDR został następnie złożony poprzez wprowadzenie ramion homologii nodC flankujących kasetę gfp. UHA o długości 500 bp oraz DHA o długości 400 bp, zlokalizowane w sąsiedztwie przewidywanego miejsca cięcia Cas9, zostały sekwencyjnie sklonowane do konstruktu pUC18-gfp poprzez trawienie restrykcyjne i ligację (Rycina 2B). Złożenie kasety UHA-gfp-DHA potwierdzono analizą trawienia restrykcyjnego, w wyniku której uzyskano oczekiwany fragment o długości 2012 bp (Rycina 2B). Kompletna kaseta HDR została następnie podklonowana do wektora CRISPR pCasPP o szerokim zakresie gospodarzy (Rycina 2C). Analiza trawienia restrykcyjnego potwierdziła integralność końcowego konstruktu oraz pomyślne złożenie wektora dostarczającego system edycji genomu dla M. ciceri (Rycina 2C).

Przeprowadzono kojarzenie biparentalne między szczepem donora E. coli S17-1λpir a szczepem biorcy M. ciceri w celu dostarczenia konstruktu pCasPP-gRNA-HDR do M. ciceri (Rycina 3A). Rycina 3B ilustruje organizację operonu nod oraz przewidywane zastąpienie locus nodC kasetą gfp poprzez rekombinację homologiczną z wykorzystaniem matrycy HDR. Kolonie transkonjugantów zidentyfikowano początkowo poprzez screening fluorescencji GFP po kojarzeniu biparentalnym (Rycina 3B i 3C). Ponad 80% odzyskanych kolonii wykazało fluorescencję GFP przy zastosowaniu gRNA2, a ponad 65% kolonii wykazało fluorescencję po wprowadzeniu gRNA1 (Rycina 3C). Ponieważ sam screening fluorescencyjny nie pozwala odróżnić ekspresji GFP z plazmidu od skutecznej integracji genomowej, przeprowadzono dalszą walidację molekularną w celu potwierdzenia specyficznej dla locus insercji kasety reporterowej.

figure-results-4
Rysunek 3. CRISPR-Cas9-pośrednia dysrupcja locus nodC w Mesorhizobium ciceri. (A) Schematyczna ilustracja kojenia biparentalnego wykorzystanego do transferu konstruktu pCasPP-gRNA-HDR z komórek donorowych Escherichia coli S17-1λpir do komórek biorcy M. ciceri. (B) Schemat ilustrujący zastąpienie locus nodC kasetą gfp za pomocą naprawy kierowanej homologią (HDR) po cięciu CRISPR-Cas9. Matryca HDR zawiera ramiona homologii o długości około 500 bp powyżej oraz 400 bp poniżej kasety gfp. (C) Przesiew fluorescencyjny kolonii transkonjugantów M. ciceri. Przedstawiono reprezentatywne obrazy z mikroskopii stereoskopowej w świetle przechodzącym i fluorescencyjnej dla kolonii GFP-dodatnich, wraz z procentem odzyskanych fluorescencyjnych transkonjugantów po kojeniu biparentalnym z użyciem konstruktów zawierających sgRNA1 lub sgRNA2. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Aby potwierdzić integrację kasety gfp w locus nodC, wybrane kolonie GFP-dodatnie poddano analizie PCR. Amplifikacja regionu genomowego obejmującego nodB i nodC pozwoliła na otrzymanie fragmentu o długości 1511 bp w klonach zmodyfikowanych, co jest zgodne z integracją kasety reporterowej, podczas gdy szczep dziki (WT) dał amplikon o długości 430 bp (Rysunek 4A). Amplifikacja PCR z użyciem starterów specyficznych dla gfp oraz flankujących nodC spowodowała powstanie wyraźnego fragmentu o długości 997 bp w klonach zmodyfikowanych, podczas gdy w kontroli WT nie stwierdzono amplifikacji, co potwierdza wstawienie w konkretnym locus. Orientacja kasety reporterowej została potwierdzona za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera. Dodatkowo ekspresję GFP w zmodyfikowanych szczepach oceniono za pomocą RT-qPCR, co wykazało zwiększoną akumulację transkryptów GFP w stosunku do szczepu WT (Rysunek 4B). Wartości ekspresji obliczono metodą 2−ΔΔCt i znormalizowano do referencyjnego genu 16s, przyjmując szczep WT jako kontrolę. Dane reprezentują średnią ± SD z trzech powtórzeń biologicznych (n = 3). Istotność statystyczną określono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu Dunnetta względem kontroli WT.

Obecnym ograniczeniem badania jest brak wektora kontrolnego, takiego jak pusty pCasPP-HDR-gRNA, w celu ustalenia podstawowego współczynnika rekombinacji. Przyszłe badania powinny uwzględniać taką kontrolę.

figure-results-5
Rycina 4Walidacja molekularna ΔnodC Mesorhizobium ciceri mutanty. (A) Potwierdzenie metodą PCR nodC przerwanie. Lewy panel przedstawia amplifikację z użyciem pary starterów F1_nodB i nodC_R. Ścieżka M, drabinka DNA; ścieżki 1–4, ΔnodC M. ciceri mutanty; ścieżka WT, typ dziki M. ciceriPanel prawy przedstawia amplifikację z użyciem pary starterów F1_nodB i gfp_R. Ścieżka M, drabinka DNA; ścieżki 1–4, ΔnodC M. ciceri mutanty; ścieżka WT, typ dziki M. ciceriWskazano oczekiwane rozmiary amplikonów. (B) Względnia ekspresja zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) w ΔnodC M. ciceri mutanty określone za pomocą ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR). Ekspresję genów znormalizowano względem M. ciceri gen referencyjny 16S rybosomalnego RNA (16S rRNA) i wyrażony w stosunku do kontroli typu dzikiego (WT) przy użyciu metody 2^−ΔΔMetoda Ct. Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe. Istotność statystyczną określono w stosunku do kontroli WT. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wpływ biologiczny przerwania genu nodC oceniono za pomocą testów infekcji ciecierzycy. Rośliny inokulowane szczepem WT M. ciceri wytworzyły widoczne brodawki korzeniowe, podczas gdy rośliny inokulowane szczepem ΔnodC M. ciceri wykazały znaczne zmniejszenie lub brak nodulacji (Rysunek 5A). Nieinokulowane rośliny kontrolne pozostały pozbawione brodawek, co potwierdza utrzymanie sterylnych warunków eksperymentalnych (Rysunek 5A). Analiza ilościowa parametrów wzrostu roślin dodatkowo wykazała różnice między roślinami inokulowanymi WT a ΔnodC M. ciceri, w tym w odniesieniu do długości korzenia, świeżej masy korzenia, suchej masy korzenia, długości pędu, świeżej masy pędu, suchej masy pędu oraz liczby brodawek (Rysunek 5B). Rośliny inokulowane WT wykazały większą liczbę brodawek i lepsze parametry związane ze wzrostem w porównaniu z roślinami inokulowanymi ΔnodC M. ciceri oraz nieinokulowanymi roślinami kontrolnymi. Wyniki te są zgodne z zaburzeniem funkcji nodulacji związanej z nodC i potwierdzają przydatność tego schematu opartego na CRISPR-Cas9 do badań genomiki funkcjonalnej u M. ciceri. Ilościowe dane fenotypowe roślin zostały poddane ocenie w celu porównania różnic między grupami traktowanymi. W analizie uwzględniono łącznie 90 powtórzeń biologicznych (n = 30 roślin na grupę traktowaną). Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Istotność statystyczną oceniono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnych porównań post hoc Tukeya. Różnice uznano za statystycznie istotne przy P < 0.05.

figure-results-6
Rycina 5. Walidacja funkcjonalna mutantów ΔnodC Mesorhizobium ciceri przy użyciu testu infekcji ciecierzycy. (A) Reprezentatywne rośliny ciecierzycy (Cicer arietinum) 20 dni po inokulacji szczepem dzikim M. ciceri, mutantem ΔnodC M. ciceri lub kontrolami nieinokulowanymi. (B) Analiza ilościowa parametrów wzrostu roślin i nodulacji, w tym długości korzeni, świeżej masy korzeni, suchej masy korzeni, długości pędów, świeżej masy pędów, suchej masy pędów oraz liczby brodawek. Dane przedstawiono dla roślin inokulowanych szczepem dzikim M. ciceri, mutantem ΔnodC M. ciceri lub kontroli nieinokulowanej. Słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe. Istotność statystyczną określono za pomocą jednostronnej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Plik uzupełniający 1. Szczegółowy protokół przygotowania i walidacji chemicznie kompetentnych komórek Escherichia coli.Ten plik uzupełniający zawiera pełną procedurę przygotowania i walidacji chemicznie kompetentnych komórek Escherichia coli DH5α oraz E. coli S17-1λpir, obejmującą przygotowanie kultur bakteryjnych, indukcję kompetencji, zbieranie komórek, przemywanie buforem CaCl₂–glicerolowym, rozdzielanie na alikwoty, kriokonserwację oraz walidację poprzez testowanie wydajności transformacji. Uwzględniono również krytyczne środki kontroli jakości, zalecenia dotyczące przechowywania oraz kryteria akceptacji kompetencji. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2. Szczegółowy protokół konstrukcji matryc do naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR) oraz składania wektorów do edycji genomu CRISPR-Cas9.Ten plik uzupełniający zawiera szczegółowe procedury wycinania kasety białka fluorescencyjnego zielonego (GFP), konstrukcji plazmidu pośredniego pUC18-gfp, amplifikacji i klonowania ramion homologii powyżej i poniżej miejsca insercji, składania kompletnej matrycy do naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR), przygotowania wektorów pCasPP-guide RNA (gRNA), insercji matryc HDR do plazmidów CRISPR-Cas9, przesiewania klonów w oparciu o fluorescencję oraz walidacji plazmidów rekombinowanych za pomocą analizy restrykcyjnej i sekwencjonowania metodą Sangera. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3. Szczegółowy protokół zapłodnienia biparentalnego i generowania transkonjugantów Mesorhizobium ciceri z tagiem GFP.Plik uzupełniający ten opisuje przygotowanie szczepów dawcy i biorcy, zapłodnienie biparentalne na filtrze membranowym, regenerację i selekcję antybiotykową transkonjugantów, procedury usuwania plazmidów, przesiew fluorescencyjny kolonii rekombinowanych, molekularne potwierdzenie szczepów z edytowanym genomem oraz krótkoterminowe i długoterminowe przechowywanie potwierdzonych transkonjugantów M. ciceri wykazujących fluorescencję GFP. Podano szczegółowe warunki hodowli, parametry zapłodnienia oraz procedury selekcji. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Ustanowienie systemu edycji genomu CRISPR-Cas9 w M. ciceri rozwiązuje istotne ograniczenie techniczne w manipulacjach genetycznych tego ważnego rolniczo, wiążącego azot symbionta. Poprzez przerwanie locus nodC z wykorzystaniem reportera gfp oraz HDR, niniejszy schemat pracy zapewnia ramowy system wspomagany fluorescencją do celowanej modyfikacji genomowej w M. ciceri.

Tradycyjne podejścia do manipulacji genetycznych u ryzobiów opierały się głównie na randomowej mutagenezie opartej na Tn5 lub wymianie allelicznej za pośrednictwem sacB19,26,27. Chociaż podejścia te pozostają wartościowe, są one pracochłonne, często wymagają wielu rund kontrselekcji i mogą pozostawiać w genomie markery oporności na antybiotyki, co komplikuje kolejne etapy edycji. W przeciwieństwie do nich, edycja genomu za pomocą CRISPR-Cas9 oferuje bardziej celowaną i usprawnioną alternatywę dla inżynierii genomowej. W niedawnych badaniach opisano edycję zasad za pośrednictwem CRISPR oraz systemy oparte na Cas12e u S. meliloti w celu zmniejszenia toksyczności związanej z Cas912,13, natomiast u R. etli badano represję transkrypcyjną za pośrednictwem dCas911. Z naszej wiedzy, niniejsze badanie stanowi jedną z pierwszych aplikacji chromosomalnej dysrupcji za pomocą CRISPR-Cas9 u M. ciceri. Protokół obejmuje celowanie sterowane sgRNA, biparentalny transfer plazmidów oraz rekombinację za pośrednictwem HDR w celu edycji specyficznej dla locus. Integracja reporteru gfp w kasecie HDR ułatwia również szybki screening fluorescencyjny potencjalnie zedytowanych kolonii, co redukuje liczbę kolonii wymagających późniejszej walidacji molekularnej.

Kluczowe dla sukcesu wdrożenia tego schematu postępowania były kilka czynników. Wybór sgRNA o wysokiej przewidywanej specyficzności zminimalizował potencjalne efekty off-target w genomie M. ciceri, natomiast zachowanie integralności ramion homologii wsparło wydajność rekombinacji zapśredniczonej przez HDR. Ponadto optymalizacja warunków wzrostu donora i biorcy podczas kojenia biparentalnego poprawiła odzyskiwanie transkonjugantów. Przesiewanie oparte na fluorescencji umożliwiło szybką identyfikację domniemanych mutantów; konieczna była jednak walidacja molekularna z użyciem PCR i sekwencjonowania metodą Sangera, aby potwierdzić specyficzną dla locus integrację kasety reporterowej. W przyszłych badaniach można wykorzystać kontrolny wektor pCasPP-HDR z pustym gRNA w celu ilościowego określenia podstawowego współczynnika rekombinacji.

Poza postępem metodologicznym, platforma ta może wspierać przyszłe badania nad sygnałami symbiotycznymi i genomiką funkcjonalną rizobiów związanych z ciecierzą28. Ciecierza (Cicer arietinum L.) stanowi globalnie ważną roślinę strączkową i jest kluczowym elementem zrównoważonych systemów rolniczych29,30. Szczep ΔnodC M. ciceri wygenerowany w niniejszym badaniu stanowi potencjalnie użyteczne tło genetyczne do badania kompatybilności gospodarz-mikroba oraz szlaków sygnalizacyjnych związanych z nodulacją. Poprzednie badania sugerowały, że sRNA pełnią funkcję efektorów regulacyjnych podczas wczesnej symbiozy w guzkach korzeniowych31. W konsekwencji opisany tutaj szczep ΔnodC M. ciceri, wykazujący deficyt nodulacji, może ułatwić przyszłe badania skoncentrowane na molekularnych mechanizmach leżących u podstaw komunikacji w ryzosferze i symbiozy wiążącej azot.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych lub konfliktów interesów.

Podziękowania

Niniejsza praca jest wspierana przez Departament Biotechnologii (DBT)-MK Bhan Grant HRD-16016/15/2023-AFS-DBT dla dr Nandity Pasari. Praca ta jest również wspierana przez grant podstawowy przyznany dr Senjuti Sinharoy przez Narodowy Instytut Badań nad Genomem Roślin (National Institute of Plant Genome Research) w New Delhi w Indiach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarozaGenetixPG-40005Elektroforeza w żelu
Folia aluminiowaRolia’sGF83048115Ogólne zastosowania laboratoryjne
Agar bakteriologicznyHiMediaGRM026Przygotowanie pożywek
Platforma do projektowania przewodników CRISPR BenchlingBenchlingN/AProjektowanie gRNA
Kwas borowyHiMediaPCT0102Przygotowanie roztworu McKnight’a
Kolba stożkowa z borokrzemianowego szkłaSigmaCLS5100500Przygotowanie kultur
Probówki z borokrzemianowego szkłaSigmaDWK73500-1075Przygotowanie kultur
Chlorek wapnia dwuwodnyHiMediaMB034Przygotowanie komórek kompetentnych
Siarczan wapnia dwuwodnyHiMediaGRM328Przygotowanie roztworu McKnight’a
Karbenycylina disodowaDuchefa BiochemieDUC-C0109.005-18Stosowana w stężeniu 100 µg/mL
Zestaw do syntezy cDNAThermo Fisher ScientificAB1543ASynteza cDNA
Folia spożywczaOA10954049Ogólne zastosowania laboratoryjne
Zestaw do klonowania/ligaza T4 DNAThermo Fisher ScientificK1422Reakcje ligacji
Czerwień KongoHiMedia573-58-0Praca z kulturami drobnoustrojów
Siarczan(II) miedzi pięciowodnyHiMediaPCT0104Przygotowanie roztworu McKnight’a
Probówka do hodowliBorosil9800U08Hodowla pierwotnej kultury bakteryjnej; 15 cm × 2,5 cm
Cyfrowy pH-metrEutech InstrumentsEC PH TUTOR DSRegulacja pH
Fosforan dipotasuHiMediaTC596MPrzygotowanie YMB
Marker wielkości DNA (drabinka)BIO-HELIXDM015-R500Elektroforeza w żelu
Zestaw do usuwania DNazyInvitrogenAM1907Usuwanie DNA z wyizolowanego RNA
Mieszanka dNTPThermo ScientificR0181Amplifikacja PCR
EthanolSigma-Aldrich1.00983.0511Stosowany w stężeniu 75%
Bromek etydynySigma-AldrichE1510Barwienie żeli DNA
Termolabilna fosfataza alkaliczna FastAPThermo Fisher ScientificEF0651Defosforylacja wektora podczas klonowania
Bufor FastDigestThermo Fisher ScientificB64Trawienia restrykcyjne
Chlorek żelaza(III) bezwodnyHiMediaTC583Przygotowanie roztworu McKnight’a
Fluorescencyjny stereomikroskopNikonSMZ25Przesiewanie GFP
Fungicyd, BavistinCrystal Crop ProtectionBavistin Carbendazim 50% WPZalewanie nasion
Zestaw do ekstrakcji z żeluQIAGEN28704Oczyszczanie DNA
GlicerolThermo Fisher ScientificQ24505Komórki kompetentne/zamrażarki glicerolowe
Inkubator do hodowli z wytrząsarką orbitalnąMRCLOM-150Kultura bakteryjna
RękawiczkiKimtech97612Środki ochrony osobistej
HEPESHiMediaMB016Hybrydyzacja oligonukleotydów
IPTGG BiosciencesRC1113DSelekcja niebiesko-biała
Komora z laminarnym przepływem powietrzaBiolinkBL-H1300Praca w warunkach sterylnych
Agar LBHiMediaM1151Szalki z kulturą bakterii
Pożywka LBHiMediaG1245Kultura bakteryjna
Siarczan magnezuHiMediaGRM1281-500GPrzygotowanie YMB
Siarczan magnezu siedmiowodnyHiMediaPCT0008Przygotowanie roztworu McKnight’a
Siarczan(II) manganu czterowodnySigma-AldrichM3634Przygotowanie roztworu McKnight’a
MannitolHiMediaMB198Przygotowanie YMB
Roztwór McKnight’aPrzygotowany w laboratoriumN/ARoztwór odżywczy dla roślin
Kapturki do mikropipet, 0,2–10 µLTarsons521000Obsługa cieczy
Kapturki do mikropipet, 2–200 µLTarsons521010Obsługa cieczy
Kapturki do mikropipet, 200–1000 µLTarsons521020XObsługa cieczy
Probówka do mikrocentryfugi, 0,5 mLTarsons500000Obsługa próbek
Probówka do mikrocentryfugi, 1,5 mLTarsons500010Obsługa próbek
Probówka do mikrocentryfugi, 2,0 mLTarsons500020Obsługa próbek
Kwas molibdenowySigma-Aldrich232084Przygotowanie roztworu McKnight’a
Spektrofotometr NanoDropThermo Fisher Scientific13-400-519Kwantyfikacja DNA/RNA
NeomycynaDuchefa BiochemieM0135Stosowana w stężeniu 50 µg/mL
Woda wolna od nukleazHiMediaML064-100MLZastosowania w biologii molekularnej
Gotowa mieszanina PCR (master mix)Thermo Fisher ScientificK01712× master mix
Stripsy z probówkami PCR, 0,2 mLTarsons610040Przygotowanie PCR
Szalki Petriego, 90 mmPSC2041Szalki z agarem
Pipeta, 0,1–2,5 µLEppendorfN10178MObsługa cieczy
Pipeta, 0,5–10 µLEppendorfH40069LObsługa cieczy
Pipeta, 2–20 µLEppendorfH30046MObsługa cieczy
Pipeta, 10–100 µLEppendorfI00395MObsługa cieczy
Pipeta, 20–200 µLEppendorfM38186MObsługa cieczy
Pipeta, 100–1000 µLEppendorfN20610MObsługa cieczy
Zestaw do ekstrakcji plazmidowego DNAQIAGEN12143Izolacja plazmidów
Chlorek potasuHiMediaTC010Przygotowanie roztworu McKnight’a
Wodorofosforan potasu bezwodnyHiMediaTC011MPrzygotowanie roztworu McKnight’a
Filtr membranowy PVDF, 0,22 µm, 47 mmMilliporeSigmaGVWP04700Krzyżowanie biparentalne
Urządzenie do ilościowej real-time PCRBio-RadCFX96RT-qPCR
Chłodzona wirówka laboratoryjnaEppendorf04-987-373Zbiór komórek
Enzym restrykcyjny, BbsIThermo Fisher ScientificER1011Klonowanie gRNA
Enzym restrykcyjny, EcoRIThermo Fisher ScientificFD0274Klonowanie
Enzym restrykcyjny, KpnIThermo Fisher ScientificFD0524Klonowanie
Enzym restrykcyjny, SacIThermo Fisher ScientificFD1133Klonowanie
Enzym restrykcyjny, XbaIThermo Fisher ScientificFD0684Klonowanie
DNaza wolna od RNazQIAGEN79254Oczyszczanie RNA
PiasekRam SuratSandPodłoże do wzrostu roślin
SekwenatorApplied BiosystemsABI3730xl DNA AnalyzerSekwencjonowanie metodą Sangera
Pożywka SOCPrzygotowana w laboratoriumN/ARegeneracja po transformacji
Chlorek soduHiMediaTC046Przygotowanie pożywek
Wodorotlenek soduHiMediaPCT1325Regulacja pH HEPES
Sterylny skalpelMedicare Surgical16020Wycinanie z żelu/obsługa tkanek
Sterylna strzykawkaHMD Dispovan10ml syringe without needleFiltracja sterylna
Sterylny filtr strzykawkowy, 0,22 µmMerck Millex Durapore12766842Sterylizacja przez filtrację
SYBR Green master mixNew England BiolabsM3003ERT-qPCR
TetracyklinaDuchefa BiochemieT01050Stosowana w stężeniu 5 µg/mL
TermocyklerApplied BiosystemsA24811Amplifikacja PCR
Ręcznik papierowy w rolceRolia’s07AAECR4885K1ZTOgólne zastosowania laboratoryjne
Odczynnik TRIzolInvitrogen15596026Izolacja RNA
Transiluminator UVAnalytik JenaTW-43Wizualizacja żelu
Spektrofotometr UV-VisEppendorfD30Pomiar OD600
Kuwety VisEppendorf30079345Pomiar OD600
Mieszadło VortexNeuationiSWIX-VTMieszanie próbek
X-galG BiosciencesRC1233Selekcja niebiesko-biała
Ekstrakt drożdżowyHiMediaRM668-500GPrzygotowanie pożywek
Siarczan cynku siedmiowodnySigma-AldrichZ0251Przygotowanie roztworu McKnight’a

Bibliografia

  1. Doudna JA, Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014;346(6213):1258096.
  2. Jiang W, Bikard D, Cox D, Zhang F, Marraffini LA. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology. 2013;31(3):233-9.
  3. Bertrand C, Thibessard A, Bruand C, Lecointe F, Leblond P. Bacterial NHEJ: a never ending story. Molecular microbiology. 2019;111(5):1139-51.
  4. Loureiro A, da Silva GJ. Crispr-cas: Converting a bacterial defence mechanism into a state-of-the-art genetic manipulation tool. Antibiotics. 2019;8(1):18.
  5. Altenbuchner J. Editing of the Bacillus subtilis genome by the CRISPR-Cas9 system. Applied and environmental microbiology. 2016;82(17):5421-7.
  6. Wang Y, et al. Bacterial genome editing with CRISPR-Cas9: deletion, integration, single nucleotide modification, and desirable “clean” mutant selection in Clostridium beijerinckii as an example. ACS synthetic biology. 2016;5(7):721-32.
  7. Oh J-H, van Pijkeren J-P. CRISPR–Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri. Nucleic acids research. 2014;42(17):e131-e.
  8. Cobb RE, Wang Y, Zhao H. High-efficiency multiplex genome editing of Streptomyces species using an engineered CRISPR/Cas system. ACS synthetic biology. 2015;4(6):723-8.
  9. Wanjofu EI, et al. Nodulation and growth promotion of chickpea by Mesorhizobium isolates from diverse sources. Microorganisms. 2022;10(12):2467.
  10. Haskett T, et al. Complete genome sequence of Mesorhizobium ciceri strain CC1192, an efficient nitrogen-fixing microsymbiont of Cicer arietinum. Genome Announcements. 2016;4(3):10.1128/genomea. 00516-16.
  11. Bellahsen O, Díaz-Méndez R, Romero D. Genomic engineering in Rhizobium etli: implementation and evaluation of systems based on dCas9. Frontiers in Microbiology. 2025;16:1604430.
  12. Liu G, et al. An efficient CRISPR/Cas12e system for genome editing in Sinorhizobium meliloti. ACS Synthetic Biology. 2023;12(3):898-903.
  13. Wang L, Xiao Y, Wei X, Pan J, Duanmu D. Highly efficient CRISPR-mediated base editing in Sinorhizobium meliloti. Frontiers in Microbiology. 2021;12:686008.
  14. Schäfer A, et al. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene. 1994;145(1):69-73.
  15. Rütering M, et al. Tailor-made exopolysaccharides—CRISPR-Cas9 mediated genome editing in Paenibacillus polymyxa. Synthetic Biology. 2017;2(1):ysx007.
  16. Ledermann R, Bartsch I, Remus-Emsermann MN, Vorholt JA, Fischer H-M. Stable fluorescent and enzymatic tagging of Bradyrhizobium diazoefficiens to analyze host-plant infection and colonization. Molecular Plant-Microbe Interactions. 2015;28(9):959-67.
  17. Göttfert M. Regulation and function of rhizobial nodulation genes. FEMS microbiology reviews. 1993;10(1-2):39-63.
  18. Kant C, Pradhan S, Bhatia S. Dissecting the root nodule transcriptome of chickpea (Cicer arietinum L.). PLoS One. 2016;11(6):e0157908.
  19. Hsu PD, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 2013;31(9):827-32.
  20. Doench JG, et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature biotechnology. 2016;34(2):184-91.
  21. Norrander J, Kempe T, Messing J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 1983;26(1):101-6.
  22. Simon R, Priefer U, Pühler A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Bio/technology. 1983;1(9):784-91.
  23. Hanahan D, Jessee J, Bloom FR. [4] Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods in enzymology. 1991;204:63-113.
  24. Alexandre A, et al. Natural populations of chickpea rhizobia evaluated by antibiotic resistance profiles and molecular methods. Microbial Ecology. 2006:128-36.
  25. Weerakkody LR, et al. A rapid, inexpensive and effective method for the efficient isolation of genomic DNA from Gram-negative bacteria. Molecular Genetics and Genomics. 2024;299(1):26.
  26. Selbitschka W, Niemann S, Pühler A. Construction of gene replacement vectors for Gram− bacteria using a genetically modified sacRB gene as a positve selection marker. Applied microbiology and biotechnology. 1993;38(5):615-8.
  27. Yadav A, Singh RP, Singh AL, Singh M. Identification of genes involved in phosphate solubilization and drought stress tolerance in chickpea symbiont Mesorhizobium ciceri Ca181. Archives of microbiology. 2021;203(3):1167-74.
  28. Dicenzo GC, et al. Multidisciplinary approaches for studying rhizobium–legume symbioses. Canadian Journal of Microbiology. 2019;65(1):1-33.
  29. Calia C, et al. A bibliometric analysis of chickpea agronomic practices in the world during 45 years of scientific research. Legume Science. 2024;6(1):e219.
  30. Sandhu J, Tripathi S, Chaturvedi S. Chickpea nutritional status and value chain for sustainable development.  Sustainable food value chain development: Perspectives from developing and emerging economies: Springer; 2023. p. 175-83.
  31. Ren B, Wang X, Duan J, Ma J. Rhizobial tRNA-derived small RNAs are signal molecules regulating plant nodulation. Science. 2019;365(6456):919-22.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Edycja CRISPR-Cas9naprawa kierowana homologiąreporter GFPmikroskopia fluorescencyjnasekwencjonowanie metodą Sangeratest infekcji ciecierzycygenomika funkcjonalna

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.