Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
Fragmentacja DNA spermy wzrosła, a ruchliwość znacząco spadła po przedłużonym narażeniu na spermę po ejakulacji. W 14 normalnych próbkach fragmentacja DNA wzrosła odpowiednio o 5,5%, 11,5% i 16,1% po 1 h, 2 h i 4 h, podczas gdy ruchliwość spadła. Te ustalenia wspierają minimalizowanie opóźnień w poza-lokalnym pobieraniem i przetwarzaniem spermy.
Wiadomo, że fragmentacja DNA plemnika jest szkodliwa dla jakości plemników, co może negatywnie wpłynąć na cykle wspomaganej reprodukcji (ART). Badanie fragmentacji DNA plemników (SDF) w płynie nasiennym w czasie może dać wgląd w wpływ długotrwałego narażenia nasienia na integralność DNA plemników. W niniejszym wstępnym badaniu przeprowadzono test SDF w różnych punktach czasowych, aby symulować warunki zbierania nasienia w miejscu innym niż laboratorium za pomocą testu dyfuzji chromatyny plemników na 14 normalnych próbkach nasienia. Analiza statystyczna procentowej fragmentacji DNA w trakcie trwania testu wykazała, że przedłużone stagnowanie płynu nasiennego od wytrysku do analizy nasienia znacząco zwiększało fragmentację DNA. Średnia ruchliwość plemników była znacząco obniżona o 7,4% po 1 h, o 14,5% po 2 h i o 18,7% po 4 h, a średnia SDF znacząco wzrosła o 5,5% po 1 h, o 11,5% po 2 h i o 16,1% po 4 h po pobraniu nasienia. Ten spadek jakości plemników w czasie może wpłynąć na protokoły klinik zajmujących się płodnością podczas rozważania przygotowania plemników do cykli ART, szczególnie gdy pobór nasienia odbywa się w miejscu innym niż laboratorium andrologiczne. Laboratoria mogą rozważyć ustalenie akceptowalnego limitu czasowego dla otrzymywania nasienia od poboru w miejscu innym niż laboratorium.
Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) określa, że jedna na sześć osób lub 17,5% populacji świata doświadcza niepłodności w pewnym momencie swojego życia1. Około 20% przypadków niepłodności ma wyłączną diagnozę niepłodności z przyczyn męskich, z dodatkowymi 30–40% przypadków, w których niepłodność z przyczyn męskich jest diagnozą wtórna2. Nawet u zdrowych mężczyzn parametry nasienia mogą znacznie różnić się od osoby do osoby, w tym wahania koncentracji, ruchliwości, morfologii i żywotności3. Dlatego ważne jest zrozumienie konkretnych czynników, które osłabiają płodność męską, aby zapewnić odpowiednie leczenie w środowisku klinicznym.
Rozwijanym obszarem badań jest wpływ integralności DNA plemników na cykle asystowanej reprodukcji (ART)4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Podręcznik laboratoryjny WHO do badania i przetwarzania ludzkiego nasienia, wydanie 5, stwierdza, że fragmentacja DNA plemników (SDF) (przez pojedyncze lub podwójne rozerwania nici) może wpływać na rozwój zarodków, implantację i wyniki ciąży14. Muriel i in. przeprowadzili analizę SDF i stwierdzili, że zwiększona SDF prowadzi do zaburzeń wskaźników zapłodnienia, jakości zarodków i wskaźników implantacji w cyklach ART10. Jednakże potrzebne jest lepsze zrozumienie, co powoduje fragmentację DNA.
Poprzednie badania donoszą, że stres oksydacyjny może prowadzić do zmniejszenia ruchliwości plemników, upośledzonej produkcji enzymatycznej i funkcji oraz, co najważniejsze, uszkodzenia DNA8. Takie uszkodzenie DNA może obejmować, ale nie ogranicza się do, delecji genów, błędów translacji i SDF. Obecnie testy SDF są używane do oceny integralności DNA plemników. Chociaż badania korelują krioprezerwację, obróbkę mediów i stres oksydacyjny ze SDF, niewiele wiadomo o SDF w okresie od ejakulacji do analizy4,5. Jest to krytyczny czas w życiu plemnika, biorąc pod uwagę zwiększoną częstość domowych pobierań nasienia do przygotowania plemników w cyklach ART15. Zbiórki domowe stały się coraz bardziej popularne podczas pandemii COVID-19, ponieważ ograniczają bezpośredni kontakt z pacjentem i zwiększają komfort i wygodę. Jednakże nie ma specyficznych wytycznych, które sugerują optymalny czas od ejakulacji do analizy dla domowych zbiorów. Dlatego głównym celem naszego badania było zrozumienie, czy SDF zmienia się w czasie w stagnującej cieczy nasiennej i czy takie zmiany mogą być istotne dla obsługi próbek ART.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Badanie przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Helsińską i zostało zatwierdzone przez Komitet Etyczny Uniwersyteckich Szpitali (STUDY20201371). Poinformowana zgoda została uzyskana od wszystkich osób zaangażowanych w badanie. Czternaście próbek nasienia wybrano od pacjentów w jednym akademickim centrum zajmującym się płodnością w północno-wschodnim Ohio. Wszystkie próbki analizowane w tym eksperymencie zostały pobrane na miejscu w naszym obiekcie. Testowanie dyfuzji chromatyny plemnika przeprowadzano na próbkach nasienia przez w pełni wyszkolonego androloga, zgodnie z instrukcjami producenta, aby zminimalizować różnice między osobami. Z wykorzystaniem tego zestawu, całe, niezabezpieczone, świeże plemniki były zanurzane w obojętnym mikrożelu agarozy na wstępnie przygotowanym szkiełku, a następnie chłodzone w temperaturze 4 °C przez 5 min, aby zestalić mikrożel. Początkowe leczenie kwasem zostało wykorzystane do denaturacji DNA w komórkach plemników z fragmentowanym DNA, a bufor lizycyjny został zastosowany do usunięcia białek jądrowych. Po przepłukaniu wodą destylowaną, szkiełka zostały odwodnione w stopniach stężenia etanolu i osuszone na powietrzu. Po zobrazowaniu pod mikroskopem świetlnym po zabarwieniu za pomocą dostarczonych w zestawie roztworów barwników, plemniki bez fragmentacji wykazywały nukleoidy z dużym halo dyfuzji (większym niż 1/3 średnicy rdzenia), podczas gdy plemniki z fragmentacją wykazywały małe halo (mniej niż 1/3 średnicy rdzenia) lub brak halo. Procent plemników z fragmentacją DNA był obliczany jako liczba fragmentowanych i zdegradowanych plemników i wyrażany jako procent. Łącznie na szkiełku zliczano 300 plemników, które były klasyfikowane jako posiadające duże lub średnie halo dyfuzji lub jako brak halo dyfuzji. To zliczenie powtarzano dwa razy, aby ocenić zmienność techniczną, a dwa zliczenia średniowano. Czułość diagnostyczna i swoistość zestawu wynoszą 93%, a zarówno kontrole dodatnie, jak i ujemne były zawarte w każdym eksperymencie. Próbki nasienia były oceniane w 0, 1, 2 i 4 godziny (0 godzin zostało zdefiniowane jako 15 minut po okresie likwidacji w temperaturze 37 °C) i były utrzymywane w temperaturze pokojowej (22–25 °C).
Dodatkowa analiza ruchliwości została przeprowadzona na każdej próbce w 0, 1, 2 i 4 godziny. Ocena ruchliwości została przeprowadzona przez doświadczonego androloga za pomocą protokołu liczenia przy użyciu jednorazowej komory liczącej. Trzysta ruchliwych plemników było liczonych na siatce, a liczenie było powtarzane dwa razy. Średnie stężenie ruchliwych plemników było obliczane na podstawie dwóch powtórzonych zliczeń.
Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą wielokrotnie powtarzanej analizy wariancji porównującej każdą grupę czasową. Kiedy wykryto istotny efekt ogólny, do porównań parami post hoc zastosowano test różnic uczciwie istotnych (HSD) Tukeya. Wartość p < 0,05 była uważana za istotną statystycznie. Szczegółowe informacje na temat materiałów są podsumowane w Tabeli Materiałów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Aby ocenić wpływ przedłużonego czasu ekspozycji nasienia na ruchliwość plemników i fragmentację DNA, przeanalizowano łącznie 14 próbek od pacjentów z normozoospermią w czterech punktach czasowych od momentu pobrania. Próbki poddane analizie uznano za „normalne” pod względem parametrów analizy nasienia zgodnie z 5th edycją wytycznych WHO14. Wszystkie próbki pobrano na miejscu w naszym Centrum Płodności, aby zoptymalizować dokładność parametrów analizy w każdym punkcie czasowym. Średni wi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W próbkach uwzględnionych w tym eksperymencie, SDF wzrastało wraz z czasem, podczas gdy ruchliwość spadała w tym samym okresie. Sugeruje to, że integralność DNA plemników może się zmniejszać, gdy płyn nasienny pozostaje w stanie spoczynku przez dłuższy czas między ejakulacją a analizą lub przetworzeniem. Przedłużanie czasu, w którym próbki pozostawały w stanie spoczynku przed analizą, mogło zwiększyć narażenie na warunki związane ze stresem oksydacyjnym. Jak wcześniej omówiono, stres oksydacyjny może być szkodliwy dla ja...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zadeklarowania.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ANOVA Calculator | Statistics Kingdom | Statystyczna analiza https://www.statskingdom.com/pl/anova_manova.html | |
| Halosperm G2 | Halotech | HT-HSG2 | In vitro zestaw do pomiaru fragmentacji DNA plemników https://halotechdna.com/pl/producto/halosperm-g2/ |
| Microcell | Vitrolife | 15423 | Miernik do analizy nasienia jednorazowego https://www.vitrolife.com/products/sperm-processing/microcell--accessories/ |
| Quality Control for WBC/pH Test Strips | Medical Electronic Systems | A-CA-01752-00 | Pozytywne i negatywne kontrole dla testów QwikCheck WBC https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/qwikcheck-wbc-ph-test-strips-quality-control/ |
| QwikCheck WBC/pH Test Reagent Strips | Medical Electronic Systems | 0700 | Oznaczanie leukocytów (WBC) w spermie https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/ |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.