Artykuł badawczy

Zależne od czasu pogorszenie ruchliwości plemników i integralności DNA podczas przedłużonej ekspozycji na spermę

DOI:

10.3791/71515

⸱

7 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University Hospitals Fertility Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fragmentacja DNA spermy wzrosła, a ruchliwość znacząco spadła po przedłużonym narażeniu na spermę po ejakulacji. W 14 normalnych próbkach fragmentacja DNA wzrosła odpowiednio o 5,5%, 11,5% i 16,1% po 1 h, 2 h i 4 h, podczas gdy ruchliwość spadła. Te ustalenia wspierają minimalizowanie opóźnień w poza-lokalnym pobieraniem i przetwarzaniem spermy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiadomo, że fragmentacja DNA plemnika jest szkodliwa dla jakości plemników, co może negatywnie wpłynąć na cykle wspomaganej reprodukcji (ART). Badanie fragmentacji DNA plemników (SDF) w płynie nasiennym w czasie może dać wgląd w wpływ długotrwałego narażenia nasienia na integralność DNA plemników. W niniejszym wstępnym badaniu przeprowadzono test SDF w różnych punktach czasowych, aby symulować warunki zbierania nasienia w miejscu innym niż laboratorium za pomocą testu dyfuzji chromatyny plemników na 14 normalnych próbkach nasienia. Analiza statystyczna procentowej fragmentacji DNA w trakcie trwania testu wykazała, że przedłużone stagnowanie płynu nasiennego od wytrysku do analizy nasienia znacząco zwiększało fragmentację DNA. Średnia ruchliwość plemników była znacząco obniżona o 7,4% po 1 h, o 14,5% po 2 h i o 18,7% po 4 h, a średnia SDF znacząco wzrosła o 5,5% po 1 h, o 11,5% po 2 h i o 16,1% po 4 h po pobraniu nasienia. Ten spadek jakości plemników w czasie może wpłynąć na protokoły klinik zajmujących się płodnością podczas rozważania przygotowania plemników do cykli ART, szczególnie gdy pobór nasienia odbywa się w miejscu innym niż laboratorium andrologiczne. Laboratoria mogą rozważyć ustalenie akceptowalnego limitu czasowego dla otrzymywania nasienia od poboru w miejscu innym niż laboratorium.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) określa, że jedna na sześć osób lub 17,5% populacji świata doświadcza niepłodności w pewnym momencie swojego życia1. Około 20% przypadków niepłodności ma wyłączną diagnozę niepłodności z przyczyn męskich, z dodatkowymi 30–40% przypadków, w których niepłodność z przyczyn męskich jest diagnozą wtórna2. Nawet u zdrowych mężczyzn parametry nasienia mogą znacznie różnić się od osoby do osoby, w tym wahania koncentracji, ruchliwości, morfologii i żywotności3. Dlatego ważne jest zrozumienie konkretnych czynników, które osłabiają płodność męską, aby zapewnić odpowiednie leczenie w środowisku klinicznym.

Rozwijanym obszarem badań jest wpływ integralności DNA plemników na cykle asystowanej reprodukcji (ART)4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Podręcznik laboratoryjny WHO do badania i przetwarzania ludzkiego nasienia, wydanie 5, stwierdza, że fragmentacja DNA plemników (SDF) (przez pojedyncze lub podwójne rozerwania nici) może wpływać na rozwój zarodków, implantację i wyniki ciąży14. Muriel i in. przeprowadzili analizę SDF i stwierdzili, że zwiększona SDF prowadzi do zaburzeń wskaźników zapłodnienia, jakości zarodków i wskaźników implantacji w cyklach ART10. Jednakże potrzebne jest lepsze zrozumienie, co powoduje fragmentację DNA.

Poprzednie badania donoszą, że stres oksydacyjny może prowadzić do zmniejszenia ruchliwości plemników, upośledzonej produkcji enzymatycznej i funkcji oraz, co najważniejsze, uszkodzenia DNA8. Takie uszkodzenie DNA może obejmować, ale nie ogranicza się do, delecji genów, błędów translacji i SDF. Obecnie testy SDF są używane do oceny integralności DNA plemników. Chociaż badania korelują krioprezerwację, obróbkę mediów i stres oksydacyjny ze SDF, niewiele wiadomo o SDF w okresie od ejakulacji do analizy4,5. Jest to krytyczny czas w życiu plemnika, biorąc pod uwagę zwiększoną częstość domowych pobierań nasienia do przygotowania plemników w cyklach ART15. Zbiórki domowe stały się coraz bardziej popularne podczas pandemii COVID-19, ponieważ ograniczają bezpośredni kontakt z pacjentem i zwiększają komfort i wygodę. Jednakże nie ma specyficznych wytycznych, które sugerują optymalny czas od ejakulacji do analizy dla domowych zbiorów. Dlatego głównym celem naszego badania było zrozumienie, czy SDF zmienia się w czasie w stagnującej cieczy nasiennej i czy takie zmiany mogą być istotne dla obsługi próbek ART.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Helsińską i zostało zatwierdzone przez Komitet Etyczny Uniwersyteckich Szpitali (STUDY20201371). Poinformowana zgoda została uzyskana od wszystkich osób zaangażowanych w badanie. Czternaście próbek nasienia wybrano od pacjentów w jednym akademickim centrum zajmującym się płodnością w północno-wschodnim Ohio. Wszystkie próbki analizowane w tym eksperymencie zostały pobrane na miejscu w naszym obiekcie. Testowanie dyfuzji chromatyny plemnika przeprowadzano na próbkach nasienia przez w pełni wyszkolonego androloga, zgodnie z instrukcjami producenta, aby zminimalizować różnice między osobami. Z wykorzystaniem tego zestawu, całe, niezabezpieczone, świeże plemniki były zanurzane w obojętnym mikrożelu agarozy na wstępnie przygotowanym szkiełku, a następnie chłodzone w temperaturze 4 °C przez 5 min, aby zestalić mikrożel. Początkowe leczenie kwasem zostało wykorzystane do denaturacji DNA w komórkach plemników z fragmentowanym DNA, a bufor lizycyjny został zastosowany do usunięcia białek jądrowych. Po przepłukaniu wodą destylowaną, szkiełka zostały odwodnione w stopniach stężenia etanolu i osuszone na powietrzu. Po zobrazowaniu pod mikroskopem świetlnym po zabarwieniu za pomocą dostarczonych w zestawie roztworów barwników, plemniki bez fragmentacji wykazywały nukleoidy z dużym halo dyfuzji (większym niż 1/3 średnicy rdzenia), podczas gdy plemniki z fragmentacją wykazywały małe halo (mniej niż 1/3 średnicy rdzenia) lub brak halo. Procent plemników z fragmentacją DNA był obliczany jako liczba fragmentowanych i zdegradowanych plemników i wyrażany jako procent. Łącznie na szkiełku zliczano 300 plemników, które były klasyfikowane jako posiadające duże lub średnie halo dyfuzji lub jako brak halo dyfuzji. To zliczenie powtarzano dwa razy, aby ocenić zmienność techniczną, a dwa zliczenia średniowano. Czułość diagnostyczna i swoistość zestawu wynoszą 93%, a zarówno kontrole dodatnie, jak i ujemne były zawarte w każdym eksperymencie. Próbki nasienia były oceniane w 0, 1, 2 i 4 godziny (0 godzin zostało zdefiniowane jako 15 minut po okresie likwidacji w temperaturze 37 °C) i były utrzymywane w temperaturze pokojowej (22–25 °C).

Dodatkowa analiza ruchliwości została przeprowadzona na każdej próbce w 0, 1, 2 i 4 godziny. Ocena ruchliwości została przeprowadzona przez doświadczonego androloga za pomocą protokołu liczenia przy użyciu jednorazowej komory liczącej. Trzysta ruchliwych plemników było liczonych na siatce, a liczenie było powtarzane dwa razy. Średnie stężenie ruchliwych plemników było obliczane na podstawie dwóch powtórzonych zliczeń.

Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą wielokrotnie powtarzanej analizy wariancji porównującej każdą grupę czasową. Kiedy wykryto istotny efekt ogólny, do porównań parami post hoc zastosowano test różnic uczciwie istotnych (HSD) Tukeya. Wartość p < 0,05 była uważana za istotną statystycznie. Szczegółowe informacje na temat materiałów są podsumowane w Tabeli Materiałów.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ocenić wpływ przedłużonej ekspozycji nasienia na ruchliwość plemników i fragmentację DNA, przeanalizowano łącznie 14 próbek od pacjentów z normozoospermią w czterech punktach czasowych od momentu pobrania. Próbki poddane analizie uznano za „normalne” pod względem parametrów analizy nasienia zgodnie z 5th edycją wytycznych WHO14. Wszystkie próbki zostały pobrane na miejscu w naszym Centrum Płodności, aby zoptymalizować dokładność parametrów analizy w każdym punkcie czasowym. Średni wiek pacjentów wynosił 35,4 lata (24–45 lat). Wstępne wyniki parametrów nasienia w grupie wykazały średnią objętość nasienia wynoszącą 3,7 mL, średnie stężenie 42,2 milion/mL, średnią ruchliwość 46,9%, średnią morfologię prawidłową na poziomie 4% oraz negatywny wynik testu jakościowego na obecność białych krwinek dla wszystkich próbek (Table 1).

Obserwowano stopniowy spadek ruchliwości plemników w czasie. W porównaniu z wartością początkową (0 h), średnia ruchliwość plemników spadła o 7,4% (zakres 3–16%) po 1 h, o 14,5% (zakres 4–31%) po 2 h oraz o 18,7% (zakres 8–37%) po 4 h. Ruchliwość plemników spadała progresywnie w czasie, z 58,6% w punkcie wyjścia do 42,5% po 4 h ekspozycji (Rycina 1). Ogólnie rzecz biorąc, spadek ruchliwości w poszczególnych punktach czasowych był statystycznie istotny (p = 0,0001585). Jednocześnie SDF znacząco wzrastało wraz z przedłużeniem czasu inkubacji w osoczu nasiennym. Średnia wartość SDF wzrosła z 15,6% w punkcie wyjścia do 21,1% po 1 h, 27,1% po 2 h oraz 31,7% po 4 h. W stosunku do wartości początkowej, SDF wzrosło o 5,5 punktu procentowego (zakres 4–8 punktów procentowych) po 1 h, o 11,5 punktu procentowego (zakres 8–16 punktów procentowych) po 2 h oraz o 16,1 punktu procentowego (zakres 13–22 punktów procentowych) po 4 h. Statystycznie istotne wzrosty SDF stwierdzono we wszystkich kolejnych punktach czasowych w porównaniu z wartością początkową, w tym po 1 h (p = 0,021129), 2 h (p < 0,00001) i 4 h (p = 0,000018) (Tabela 2).

DOSTĘPNOŚĆ DANYCH
Dane dotyczące motylności i SDF na poziomie pacjenta, wykorzystane w analizie, znajdują się w Tabeli uzupełniającej S1.

figure-results-1
Rysunek 1. Zmiana ruchliwości plemników w czasie po ejakulacji. Ruchliwość plemników oceniano w punkcie wyjściowym oraz po 1 h, 2 h i 4 h ekspozycji nasienia. Ruchliwość spadała stopniowo wraz ze wzrostem czasu ekspozycji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

ParametrŚredniaOdchylenie standardowe
Wiek pacjenta35,4 (zakres: 24–45 lat)6.22
Objętość nasienia3,7 ml2.18
Stężenie42,2 mln/ml33.45
Ruchliwość46.9%18.77
LeukocytyNegatywne (wszystkie)—
Morfologia4.0%0.77

Tabela 1: Baseline semen characteristics of the study samples. Parametry nasienia zapisano po upłynnieniu i przed zależną od czasu oceną fragmentacji DNA oraz ruchliwości plemników.

Czas0 h1 h2 h4 h
Średnia redukcja ruchliwości plemników od 0 h*—-7.4%-14.5%-18.7%
Średnie SDF15.6%21.1%27.1%31.7%
Odchylenie standardowe5.28%5.27%5.31%4.80%
Wartość p w stosunku do 0 h—p = 0,021129p < 0.00001p = 0,000018
ANOVA z powtarzanymi pomiarami z porównaniami post hoc testem Tukey HSD.

Tabela 2: Zmiany fragmentacji DNA oraz ruchliwości plemników w zależności od czasu. Fragmentację DNA oraz ruchliwość plemników oceniano w punkcie wyjścia oraz po 1 h, 2 h i 4 h ekspozycji nasienia. Wartości przedstawiono zgodnie z raportem autorów, a porównania statystyczne wykonano względem punktu wyjścia.

Tabela uzupełniająca S1. Wartości różnicy w ruchliwości plemników i indeksu fragmentacji DNA plemników na poziomie pacjenta. Wartości wyrażone są jako ułamki; należy pomnożyć je przez 100, aby przeliczyć na wartości procentowe. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W próbkach uwzględnionych w tym eksperymencie, SDF wzrastało wraz z czasem, podczas gdy ruchliwość spadała w tym samym okresie. Sugeruje to, że integralność DNA plemników może się zmniejszać, gdy płyn nasienny pozostaje w stanie spoczynku przez dłuższy czas między ejakulacją a analizą lub przetworzeniem. Przedłużanie czasu, w którym próbki pozostawały w stanie spoczynku przed analizą, mogło zwiększyć narażenie na warunki związane ze stresem oksydacyjnym. Jak wcześniej omówiono, stres oksydacyjny może być szkodliwy dla jakości DNA plemników, prowadząc do wysokiego poziomu fragmentacji DNA6,8,13. Wyniki tego badania mogą wpłynąć na postępowanie z nasieniem w cyklach OAT.

Po pierwsze, warto byłoby, aby kliniki dodały to badanie do tradycyjnych parametrów analizy nasienia, aby zapewnić jakość DNA plemników przed wykorzystaniem ich w cyklach OAT. Optymalizacja jakości plemników może być związana z lepszymi wynikami, takimi jak większa liczba zamrożonych zarodków, wzrost wskaźników euploidii i wyższe wskaźniki pozytywnych ciąż i żywych urodzeń, jak wskazano w poprzednich badaniach16.

Po drugie, te wyniki dostarczają wglądu w wpływ domowego pobierania nasienia na wyniki OAT. Podczas pandemii COVID-19 wiele klinik zaczęło korzystać z domowego pobierania nasienia jako bezpieczniejszej opcji dla pacjentów15,17. Gdy praktyki zaczęły się zmieniać, pacjenci mogli zmniejszyć ekspozycję na COVID, a także wykonać pobieranie w prywatności własnego domu. Jednak nasze ustalenia sugerują, że te zmiany praktyki mogą wiązać się z kompromisami związanymi z jakością plemników i potencjalnie wynikami OAT.

Poprzednie badania nad zestawami do pobierania nasienia w domu wykazały duże wahania wyników analizy nasienia u mężczyzn z różnymi diagnozami dotyczącymi męskich czynników oraz u mężczyzn, którzy zwykle wytwarzają "normalne" próbki nasienia18. Ta fluktuacja może wynikać z stagnacji plemników podczas transportu z domu do kliniki, szczególnie w przypadku wysyłki próbek nasienia przez noc w niektórych przypadkach. Inne badania potwierdzają nasze wyniki, że SDF szybko wzrasta w ciągu pierwszych 3-4 h inkubacji w 5% CO2 w 37 °C po przygotowaniu plemników, zarówno w przypadku mrożonych/rozmrożonych plemników19, jak i świeżych plemników20, co sugeruje, że plemniki powinny być używane tak szybko, jak to możliwe po przygotowaniu plemników do OAT.

Kerdtawee i in. przeprowadzili metaanalizę wpływu miejsca pobierania plemników na parametry nasienia i wyniki płodności. Chociaż nie wykazali żadnych istotnych różnic między próbkami pobieranymi w domu a pobieranymi w klinice, zwrócili uwagę na istotną heterogeniczność wśród analizowanych badań, z których większość była badaniami obserwacyjnymi16. Co ważne, te badania nie miały również kontrolowanego harmonogramu, kiedy próbki zebrane w domu powinny być zwrócone do klinik i analizowane. Dane analizowane w tym badaniu umożliwiły jednak kontrolowane analizy fragmentacji DNA w kilku punktach czasowych, co zapewniło większą precyzję i spójność wyników eksperymentalnych.

Chociaż pobieranie nasienia w domu może być opcją dla niektórych pacjentów, zrozumienie wskaźnika SDF może pomóc w opracowaniu wytycznych dotyczących pacjentów, dla których pobieranie nasienia w domu może być szkodliwe dla wyników OAT. Systematyczne przeglądy i metaanalizy przeprowadzone przez Christoforaki i in. wykazały, że potencjał redukcji oksydacyjnej w płynie nasiennym niekorzystnie wpływa na bezpłodność mężczyzn21. Analizowano parametry takie jak stężenie plemników, ich liczba, ruchliwość i morfologię, które wszystkie były niekorzystnie wpłynięte przez wyższy potencjał redukcji oksydacyjnej, co pokazuje, że jakość plemników może być wpłynięta przez stres oksydacyjny.

Zaletami tego badania są jego nowość, ponieważ niewiele badań oceniło zmiany SDF zależne od czasu podczas długotrwałego narażenia na płyn nasienny. To badanie zostało również przeprowadzone w kontrolowanym środowisku z stosunkowo jednorodną grupą mężczyzn bez podstawowej patologii nasienia. Jednak badanie to było ograniczone do niewielkiej liczby 14 pacjentów. Należy przeprowadzić dalsze eksperymenty, aby maksymalizować pewność co do zebranych danych i uzyskać ostateczne wnioski.

Dalsze badania powinny również zbadać zmienne, które mogą wpływać na wskaźnik SDF, w szczególności aby lepiej zrozumieć czynniki, które przyczyniają się do utrzymania jakości plemników. Niektóre czynniki do rozważenia obejmują, ale nie ograniczają się do, mediów obsługujących stosowanych podczas przygotowywania plemników, temperatury warunków transportu z domu do kliniki, metod kri

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zadeklarowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ANOVA CalculatorStatistics KingdomStatystyczna analiza
https://www.statskingdom.com/pl/anova_manova.html
Halosperm G2HalotechHT-HSG2In vitro zestaw do pomiaru fragmentacji DNA plemników
https://halotechdna.com/pl/producto/halosperm-g2/
MicrocellVitrolife15423Miernik do analizy nasienia jednorazowego
https://www.vitrolife.com/products/sperm-processing/microcell--accessories/
Quality Control for WBC/pH Test StripsMedical Electronic SystemsA-CA-01752-00Pozytywne i negatywne kontrole dla testów QwikCheck WBC
https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/qwikcheck-wbc-ph-test-strips-quality-control/
QwikCheck WBC/pH Test Reagent StripsMedical Electronic Systems0700Oznaczanie leukocytów (WBC) w spermie
https://mes-global.com/products/semen-analysis-validation-kits/qwikcheck-test-kits/

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Health Organization. Infertility prevalence estimates, 1990-2021. 1st ed. World Health Organization; Geneva; 2023. xiv, 79 p.
  2. Leslie SW, Soon-Sutton TL, Khan MA. Male infertility. In: StatPearls [Internet]. StatPearls Publishing; Treasure Island (FL); 2025 [cited 2025 Feb 7]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK562258/
  3. Alvarez C et al. Biological variation of seminal parameters in healthy subjects. Hum Reprod. 2003;18(10):2082-8.
  4. Schulte RT, Ohl DA, Sigman M, Smith GD. Sperm DNA damage in male infertility: etiologies, assays, and outcomes. J Assist Reprod Genet. 2010;27(1):3-12.
  5. Le MT et al. Does conventional freezing affect sperm DNA fragmentation? Clin Exp Reprod Med. 2019;46(2):67-75.
  6. Zini A, Bielecki R, Phang D, Zenzes MT. Correlations between two markers of sperm DNA integrity, DNA denaturation and DNA fragmentation, in fertile and infertile men. Fertil Steril. 2001;75(4):674-7.
  7. Zini A et al. Potential adverse effect of sperm DNA damage on embryo quality after ICSI. Hum Reprod. 2005;20(12):3476-80.
  8. Aitken RJ, Krausz C. Oxidative stress, DNA damage and the Y chromosome. Reproduction. 2001;122(4):497-506.
  9. Benchaib M et al. Sperm DNA fragmentation decreases the pregnancy rate in an assisted reproductive technique. Hum Reprod. 2003;18(5):1023-8.
  10. Muriel L et al. Value of the sperm deoxyribonucleic acid fragmentation level, as measured by the sperm chromatin dispersion test, in the outcome of in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril. 2006;85(2):371-83.
  11. Tandara M et al. Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF. Andrology. 2014;2(5):678-86.
  12. Agarwal A et al. Clinical utility of sperm DNA fragmentation testing: practice recommendations based on clinical scenarios. Transl Androl Urol. 2016;5(6):935-50.
  13. Panner Selvam MK, Agarwal A. A systematic review on sperm DNA fragmentation in male factor infertility: laboratory assessment. Arab J Urol. 2018;16(1):65-76.
  14. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5th ed. World Health Organization; Geneva; 2010. 271 p.
  15. Sacha CR et al. The effect of semen collection location and time to processing on sperm parameters and early IVF/ICSI outcomes. J Assist Reprod Genet. 2021;38(6):1449-57.
  16. Kerdtawee P, Salang L, Sothornwit J. Effect of semen collection location on semen parameters and fertility outcomes and implications for practice in the COVID-19 era: a systematic review and meta-analysis of randomized and observational studies. Am J Obstet Gynecol. 2023;228(2):150-60.
  17. Stimpfel M, Jancar N, Vrtacnik-Bokal E. Collecting semen samples at home for IVF/ICSI does not negatively affect the outcome of the fresh cycle. Reprod Biomed Online. 2021;42(2):391-9.
  18. Aznavour Y et al. Semen parameter variability among users of at-home sperm testing kits. BMC Urol. 2022;22(1):184.
  19. Gosálvez J et al. Sperm deoxyribonucleic acid fragmentation dynamics in fertile donors. Fertil Steril. 2009;92(1):170-3.
  20. Nabi A, Khalili MA, Halvaei I, Roodbari F. Prolonged incubation of processed human spermatozoa will increase DNA fragmentation. Andrologia. 2014;46(4):374-9.
  21. Christoforaki V et al. The role of seminal oxidation-reduction potential in male infertility: systematic review and meta-analysis. Reprod Biomed Online. 2026;52(2):104858.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

MedycynaWydanie 234Encyklopedia Eksperyment w Techniki BiologiczneWydanie 234Wydanie 234uszkodzenia DNAfragmentacja DNAanaliza nasienia

Powiązane artykuły