Aby zamodelować, jak sygnały zapalne wpływają na neurorozwój u organizmów genetycznie podatnych, przedstawiamy protokół mikroiniekcji IL-6 do przewodu Cuviera (żyła główna kardynałowa) larw rybki zebra, umożliwiając kontrolowane wywołanie stanu zapalnego i ocenę jego wpływu na rozwój w kontekście zespołu stwardnienia guzowatego (TSC).
Artykuł metodologiczny
Mikrowstrzyknięcie Interleukiny-6 do krwioobiegu larw ryb cebra TSC w celu badania zachowań przypominających zaburzenia neuropsychiatryczne
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pacjenci z zespołem stwardnienia guzowatego (mutacje TSC1/TSC2) wykazują różnorodne objawy zaburzeń ze spektrum autyzmu (ASD), a aktywacja odpornościowa matki znana jest z podwyższania ryzyka ASD. Interleukina-6 (IL-6) jest cytokiną pleiotropową o dobrze ustalonych rolach w regulacji odporności, zapaleniu i procesach neurozapalnych. Jest wytwarzana przez wiele rodzajów komórek odpornościowych w odpowiedzi na infekcję lub uszkodzenie tkanek i zwykle charakteryzuje się jako czynnik prozapalny. Warto zauważyć, że IL-6 może przenikać przez barierę kręgowo-mózgową i jest związana z neurozapaleniem oraz stanami neuropsychiatrycznymi związanymi z zapaleniem, w tym zaburzeniami ze spektrum autyzmu (ASD) i upośledzeniem umysłowym (ID). W tym miejscu opisujemy protokół indukcji układowego sygnałowania zapalnego u rybki labiryntowej poprzez dostarczenie IL-6 do krwioobiegu poprzez wstrzyknięcie do przewodu Cuviera. Podejście to umożliwia kontrolowane i powtarzalne reakcje zapalne w celu badania zmian napędzanych zapaleniem we wczesnym rozwoju. Protokół szczegółowo opisuje istotne kroki przygotowania IL-6, mikroiniekcji i dalszych zastosowań eksperymentalnych w modelach rybki labiryntowej chorób i neurozapaleni, w tym badań zaprojektowanych w celu zbadania interakcji gen-środowisko. Umożliwiając kontrolowane wywoływanie układowego sygnałowania zapalnego, podejście to zapewnia wszechstronną platformę do badania, w jaki sposób skłonność genetyczna i ekspozycje zapalne krzyżują się, aby kształtować wyniki rozwojowe.
Wprowadzenie
Zrozumienie, jak sygnały zapalne kształtują wczesny rozwój neuronowy, jest niezbędne do analizy mechanizmów leżących u podstaw zaburzeń rozwoju neuronowego, szczególnie w kontekście genetycznie podatnych. Głównym celem tego protokołu jest zapewnienie precyzyjnego, powtarzalnego podejścia do indukowania układowego sygnałowania zapalnego u larw ryby zwanej "danio pręgowany" poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie mikroiniekcyjne interleukiny-6 (IL-6) do przewodu Cuviera (wspólnej żyły głównej).
Zespół stwardnienia guzowatego (TSC) jest przykładem interakcji gen-środowisko. TSC jest rzadkim genetycznym zaburzeniem spowodowanym mutacjami w TSC1 lub TSC2, które kodują odpowiednio hamartinę i tuberynę, białka, które tworzą kompleks, który normalnie hamuje sygnałowanie mTORC1. Utrata tej inhibicji prowadzi do nadmiernej aktywacji szlaku mTORC1, co powoduje nieprawidłowy wzrost komórek i szerokie spektrum objawów klinicznych, w tym zaburzenie spektrum autyzmu (ASD)1,2. Szacuje się, że ASD dotyka około 1,5% osób, a średnia wieku diagnozy wynosi około 3 lat w krajach rozwiniętych3. ASD charakteryzuje się powtarzającymi zachowaniami, upośledzonymi interakcjami społecznymi i obniżoną elastycznością poznawczą4, a pacjenci często przedstawiają dodatkowe wyzwania neurobehawioralne, takie jak lęk, depresja lub upośledzenie umysłowe3. Warto zauważyć, że 40-60% osób z TSC wykazuje cechy związane z ASD2, jednak nasilenie objawów jest bardzo zróżnicowane – nawet wśród pacjentów z podobnymi mutacjami – co sugeruje, że czynniki środowiskowe modulują ryzyko wynikające z genów.
Jednym z takich czynników jest stan zapalny. Chociaż etiologia ASD pozostaje w dużej mierze nieznana, zapalenie układu nerwowego w wielu regionach mózgu od dawna jest wiązane z tym stanem5. Rosnące dowody przedkliniczne i kliniczne wskazują, że zapalenie układu nerwowego płodu wywołane przez aktywację odpornościową matki (MIA) i wynikające z tego podwyższenie sygnalizacji cytokin mogą znacząco przyczyniać się do patogenezy ASD6. Dlatego modelowanie ekspozycji na cytokiny zapalne w genetycznie podatnych systemach, takich jak TSC, zapewnia potężną ramę do badania, jak sygnały odpornościowe krzyżują się z zakłóconymi regulacjami mTORC1, aby wpływać na wczesny rozwój mózgu.
Racjonalność opracowania tego protokołu wynika z rosnącego uznania, że stany zapalne wywołane przez cytokiny, w tym sygnalizacja IL-6, mogą współdziałać z podatnością genetyczną, aby wpływać na drogi rozwoju neuronowego. Cytokiny to niskocząsteczkowe glikoproteiny, które koordynują komunikację w układzie odpornościowym. W ASD wiele badań konsekwentnie donosi o podwyższonym poziomie prozapalnych cytokin, w tym IL-6 we krwi obwodowej7,8,9,10, co wspiera hipotezę, że dysregulacja sygnalizacji IL-6 może przyczyniać się do cech neurorozwojowych i behawioralnych charakterystycznych dla tego zaburzenia. IL-6 jest kluczowym mediatorem aktywacji odpornościowej wytwarzanym przez różne typy komórek odpornościowych w odpowiedzi na infekcję lub uszkodzenie tkanki. Ponieważ IL-6 może przenikać przez barierę krew-mózg i bezpośrednio wpływać na neurony, astrocyty i mikrogleję, utrzymane podwyższenie tego cytokiny zostało powiązane ze zmianami w szlakach neurorozwojowych, plastyczności synaptycznej i homeostazy neuroimmunologicznej – mechanizmach coraz częściej eksplorowanych w patofizjologii ASD11,12. Te powiązania są dodatkowo wzmacniane przez badania MIA, w których podwyższony poziom IL-6 u matek w czasie ciąży odbija się na rozwoju mózgu płodu i zwiększa ryzyko związane z ASD13. Jednak istniejące modele kręgowców często polegają na ogólnoustrojowym stymulowaniu odporności poprzez cząsteczki związane z patogenem lub paradygmaty ekspozycji matczynej, co może wprowadzać różnorodność, aktywować jednocześnie wiele ścieżek odpornościowych i ograniczać zdolność do izolowania konkretnego wkładu IL-6. Bezpośrednie wstrzyknięcie mikroiniekcyjne IL-6 u danio pręgowanego pozwala na przezwyciężenie tych ograniczeń poprzez umożliwienie ukierunkowanego manipulowania pojedynczym cytokiną w przezroczystym, genetycznie uchwytnym organizmie.
Danio pręgowane oferują kilka zalet w badaniach nad efektami rozwojowymi wywoływanymi przez cytokiny. Ich optyczna przezroczystość umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym odpowiedzi immunologicznych i neuronowych; ich szybki rozwój umożliwia eksperymenty o dużej wydajności; a zachowane szlaki sygnalizacyjne cytokin sprawiają, że są one potężnym modelem kręgowców do analizy mechanizmów zapalnych14,15,
Protokół
W ramach opisanej tu procedury, zastosowano linię rybek zwanych tsc2vu242/+22,23. Wszystkie przeprowadzone eksperymenty były zgodne z obowiązującymi przepisami prawa, a dodatkowa aprobata komitetu etycznego nie była wymagana, ponieważ stosowany etap rozwojowy (<5 dpf) nie podlega obowiązkowej ocenie etycznej. Rysunek 1 przedstawia schemat protokołu.
1. Wyciąganie mikropipet
- Przygotuj igły do mikroiniekcji z kapilar borokrzemianowych za pomocą wyciągarki do mikropipet, zgodnie z ustalonymi procedurami24.
- Użyj 10 cm długich kapilar borokrzemianowych (1,0 mm średnicy zewnętrznej, ścianki cienkie) i załaduj je do wyciągarki do mikropipet.
- Umieść kapilarę w wyciągarce, upewniając się o precyzyjnym wycentrowaniu w wyznaczonym rowku i zabezpiecz ją mocno za pomocą zacisków instrumentu, aby zapobiec przemieszczaniu się podczas wyciągania.
- Wyreguluj kapilarę tak, aby była centralnie umiejscowiona względem żarnika, zapewniając jednolite nagrzewanie wzdłuż regionu, który ma być wyciągnięty, aby uzyskać jednolite formowanie igły.
- Uruchom program wyciągania przy użyciu zoptymalizowanych parametrów (np. w przypadku instrumentu Sutter: temperatura: 533, wyciąganie: 50, prędkość: 60, opóźnienie: 90 i ciśnienie: 200) w celu wygenerowania mikroiniekcyjnych igieł o ostrym końcu.
OSTRZEŻENIE: Igły mikro przeciągnięte z kapilar są kruche i mogą łatwo pękać, zatkać się lub tworzyć nieregularne kształty końcówek, które zmieniają objętość wstrzykiwania. Przed użyciem sprawdź każdą igłę pod stereomikroskopem, unikaj dotykania końcówki twardymi powierzchniami i natychmiast wymień igły, jeśli zauważysz opór, wyciek lub niekonsekwentną wielkość kropli.
UWAGA: Po procesie wyciągania, na obu końcach kapilary tworzą się stożkowate końcówki igieł. Przed użyciem ostrość końcówki powinna zostać ostrożnie otwarta przez delikatne złamanie za pomocą drobnych kleszczyków pod stereomikroskopem, aby uzyskać pożądaną wielkość otworu na mikroiniekcję.
2. Przygotowanie buforów i roztworu bazowego
- Przygotuj 60x roztwór bazowy środowiska embrionalnego E3 (patrz Tabela 1). Wysterylizuj roztwór przez autoklawację i przechowuj w temperaturze 4 °C. Do użytku roztwór bazowy należy rozcieńczyć wodą ultraczystą, aby uzyskać 1x roztwór roboczy E3.
UWAGA: 60x roztwór bazowy środowiska embrionalnego E3 można przechowywać w temperaturze 4 °C w celu długotrwałego przechowywania. - Przygotuj 20x roztwór bazowy trikainy (MS-222) zgodnie z opisem w Tabeli 1. Przechowuj roztwór w temperaturze 4 °C w ciemności, aby zapobiec degradacji. Przed użyciem rozcieńcz do stężenia roboczego 1x w środowisku E3.
UWAGA: PH roztworu bazowego trikainy należy ustawić na 7,5 za pomocą 1 M Tris pH 9,0. Roztwór można podzielić na porcje i przechowywać w -20 °C (zamrożony) w celu długotrwałego przechowywania lub przechowywać w temperaturze 4 °C. Trikaina ulega degradacji w RT i w świetle, tworząc toksyczne związki.
OSTRZEŻENIE: Należy zachować szczególną ostrożność podczas stosowania trikainy (MS-222) do znieczulenia, ponieważ zarówno niedostateczne, jak i nadmiernie długie narażenie może niekorzystnie wpływać na fizjologię i zachowanie larw. Nadmierne narażenie może obniżyć czynność serca i zmienić zachowanie później, podczas gdy niewystarczające znieczulenie zwiększa ryzyko urazów podczas montażu. Używaj tylko minimalnej efektywnej stężenia i czasu trwania oraz pozwól na pełne wyzdrowienie w świeżym środowisku embrionalnym przed badaniem zachowań. - Przygotuj 1% (w/v) roztwór agarozy w środowisku E3 poprzez podgrzanie do pełnego rozpuszczenia.
UWAGA: Jeśli przygotowano wcześniej, roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C i podgrzać ponownie przed użyciem. W dniu eksperymentu należy utrzymywać agaroz w stanie ciekłym w temperaturze 55–60 °C, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu. - Przygotuj 0,9% (w/v) roztwór NaCl i przechowuj w temperaturze pokojowej przez maksymalnie 1 tydzień lub w temperaturze 4 °C w celu długotrwałego przechowywania. Przed użyciem wyrównaj roztwór do temperatury pokojowej lub inkubauj w 28,5 °C, aby dopasować warunki fizjologiczne zarodków.
- Przygotuj 2 pg/nL roztwór IL-6 w 0,9% NaCl. Podziel roztwór na porcje, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, i przechowuj w -20 °C. Przed użyciem roztwór należy rozmrozić i doprowadzić do temperatury pokojowej.
- Przygotuj
Wyniki
Aby ocenić wpływ mikroiniekcji IL‑6 na fizjologię i zachowanie larw, porównano larwy po iniekcji IL‑6 z grupą kontrolną po iniekcji NaCl pod kątem przeżywalności oraz dwóch parametrów behawioralnych powszechnie stosowanych do oceny zachowań lękowych i powtarzalnych u rybek zebrafish. Mikroiniekcja IL‑6 nie wpłynęła na żywotność larw w porównaniu z iniekcjami NaCl (Rysunek 4A). Wskaźniki przeżywalności w 5. dniu po zapłodnieniu (dpf) były nieodróżnialne między grupą po iniekcji IL‑6 a grupą po iniekcji NaCl, co wskazuje, że zastosowany schemat dawkowania jest dobrze tolerowany i nie wywołuje niespecyficznej toksyczności. Same mikroiniekcje nieznacznie obniżyły żywotność w porównaniu z nieiniekcyjnym rodzeństwem, co wskazuje na niewielki wpływ związany z manipulacją, niezależny od ekspozycji na IL‑6. Potwierdza to, że protokół jest odpowiedni do dalszych analiz behawioralnych.
Aby potwierdzić, że paradygmat mikroiniekcji IL‑6 wywołuje mierzalną odpowiedź zapalną w 5. dniu po zapłodnieniu (dpf), oznaczono ilość prostaglandyny E2 (PGE2), będącej mediatorą w dół strumienia sygnałowego stanu zapalnego indukowanego przez cytokiny25. Mutanty homozygotyczne tsc2-/- wykazywały podwyższone bazowe poziomy PGE2 nawet bez iniekcji IL‑6, znacznie wyższe niż u ich rodzeństwa typu dzikiego (WT) tsc2+/+ (Rycina 4B). Mutanty heterozygotyczne tsc2+/- wykazały niewielki, nieistotny statystycznie wzrost bazowego poziomu PGE2 w porównaniu z larwami WT, jednak istotne jest to, że ich poziomy PGE2 gwałtownie wzrosły po mikroiniekcji IL‑6. Wzorzec ten jest zgodny z naszym celem modelowania interakcji gen × środowisko: larwy WT pozostają w dużej mierze niewrażliwe na łagodną, przejściową ekspozycję na IL‑6, podczas gdy genetycznie podatne mutanty tsc2+/- wykazują wyraźną odpowiedź zapalną.
W związku z tymi zależnymi od genotypu różnicami w tonie zapalnym, w następnej kolejności zbadaliśmy, czy sygnalizacja indukowana przez IL‑6 przekłada się na mierzalne zmiany behawioralne w teście otwartego pola. Test otwartego pola w 5. dniu po zapłodnieniu (dpf) (opisany wcześniej22) wykazał, że larwy mutantów tsc2 przejawiały zwiększone zachowania lękowe w porównaniu z rodzeństwem WT (Ryc. 4C); jednak mikroiniekcje IL6 nie wpłynęły na to zachowanie. Konkretnie, larwy tsc2+/- oraz tsc2-/- spędzały znacznie więcej czasu w strefie zewnętrznej areny i wykazywały ograniczoną eksplorację centrum w porównaniu do tsc2+/+, co jest zgodne z ustalonymi fenotypami związanymi z lękiem u larw zebrafish.
Iniekcje IL‑6 zwiększyły częstotliwość powtarzalnych, stereotypowych wzorców pływania, szczególnie u larw mutantów tsc2+/- (Rysunek 4D–E), co jest cechą behawioralną powszechnie stosowaną jako odczyt istotny dla ASD w modelach rybek zebrafish26. Szczegółowa kwantyfikacja powtarzalnego pływania po okręgu, zdefiniowanego jako trzy lub więcej kolejnych okrążeń, wykazała istotny wzrost proporcji mutantów tsc2+/- po iniekcji IL‑6 wykazujących to zachowanie w porównaniu z kontrolami po iniekcji NaCl. Ta selektywna intensyfikacja powtarzalnego pływania u larw podatnych genetycznie dodatkowo potwierdza interakcję gen × środowisko, w której łagodna stymulacja zapalna odsłania lub potęguje tendencje behawioralne przypominające ASD specyficznie w tle mutacyjnym tsc2+/-.
Rycina 1: Schemat protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Konfiguracja stanowiska do mikroiniekcji. Schemat stanowiska do mikroiniekcji wykorzystywanego do iniekcji larw zebrafish. (1) szklana mikropipeta zamocowana w uchwycie injektora; (2) pokryta agaroza szalka Petriego z formowanymi wgłębieniami do pozycjonowania larw; (3) olej mineralny do kalibracji; (4) roztwór błękitu trypanu; (5) wyciągane igły szklane; (6) szkiełko kalibracyjne; (7) przedłużone końcówki pipet; (8) pipeta Pasteura; (9) forma silikonowa. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Wtryskiwanie do przewodu Cuviera. (A) Schematyczne przedstawienie miejsca wstrzykiwania do przewodu Cuviera (wspólnej żyły głównej) u larw zebrafish oraz reprezentatywne ścieżki ruchu w otwartej przestrzeni w 5 dpf. (B) Reprezentatywne obrazy grupy kontrolnej (bez wstrzykiwania) oraz po wstrzyknięciu NaCl i IL-6. Pasek skali: 250 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki interakcji gen x środowisko z wykorzystaniem linii mutantów tsc2. (A) Wskaźniki przeżywalności (%) larw tsc2vu242 w przebiegu eksperymentu w grupach kontrolnej (niewstrzykniętej), wstrzykniętej NaCl oraz wstrzykniętej IL-6. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM w 5 dpf (n = 4 niezależne powtórzenia eksperymentalne, każda kombinacja genotyp × traktowanie obejmowała 60–70 ryb). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą ANOVA, a następnie testu post hoc Tukeya dla porównań parowych. Istotne różnice zaobserwowano między grupą kontrolną a grupą wstrzykniętą IL-6 (p = 0.00150) oraz między grupą kontrolną a grupą wstrzykniętą NaCl (p = 0.00243). (B) Wykresy pudełkowe przedstawiające poziomy PGE2 u mutantów tsc2 i ich rodzeństwa, zmierzone w 5 dpf przy użyciu zestawu do testu ELISA zgodnie z protokołem producenta (ANOVA 2-drogowa dla genotypu: F = 7.4503; P = 0.01234). Każda próbka zawiera 20 głów (ogony wykorzystano do genotypowania). Kropki na wykresach pudełkowych reprezentują powtórzenia biologiczne. (C) Wykresy pudełkowe wyników testu otwartego pola dla ryb mutantów tsc2, pokazujące względny czas spędzony przy ściankach dla każdego genotypu po wstrzyknięciach NaCl i IL-6 oraz dla kontroli niewstrzykniętej (ANOVA 2-drogowa dla genotypu: F = 7.021; P = 0.00106). Test otwartego pola przeprowadzono przy użyciu zautomatyzowanej komory analitycznej (Tabela materiałów) zgodnie z wcześniej opisanym protokołem22. (D) Przykładowy rysunek pokazujący losowe zachowanie eksploracyjne po wstrzyknięciu NaCl oraz powtarzalne pływanie po okręgu po wstrzyknięciach IL-6. (E) Wykresy pudełkowe przedstawiające liczbę zwierząt wykazujących normalne zachowanie oraz powtarzalne pływanie po okręgu dla każdego genotypu tsc2 po wstrzyknięciu NaCl lub IL-6 oraz dla kontrolnych ryb niewstrzykniętych (ANOVA 2-drogowa dla genotypu: F = 5.7615; P = 0.005849). Wykorzystano trzy niezależne powtórzenia eksperymentalne, przy czym każda kombinacja genotyp × traktowanie obejmowała 60–70 ryb. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| roztwór stokowy E3 60x | ||
| Odczynnik | Stężenie końcowe | Ilość |
| NaCl | 297 mM | 17,4 g |
| KCl | 10,7 mM | 0,8 g |
| CaCl₂2 | 19,6 mM | 2,18 g |
| MgCl₂26 h2O | 24 mM | 4,89 g |
| Wodór ultra-czysty2O | Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przetłumaczyć na język polski zgodnie z wytycznymi. | dopełnić do 1 l |
| Suma | Ponieważ nie dostarczono żadnego tekstu źródłowego do przetłumaczenia, proszę o przesłanie materiałów, które wymagają tłumaczenia z języka angielskiego na język polski. Jestem gotowy do przygotowania profesjonalnego tłumaczenia naukowego zgodnie z wytycznymi. | 1 L |
| Roztwór zapasu tricainu | ||
| Odczynnik | Stężenie końcowe | Ilość |
| Tricaina | 15,3 mM | 1 g |
| 1 M Tris-HCl pH 9 | 21 mM | 5,25 ml |
| Woda ultrazczysta (H2O)2O | Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. | 244,75 ml |
| Suma | Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski zgodnie z wytycznymi. | 250 ml |
Tabela 1: Skład roztworów E3 i tricainy.
Dyskusja
Zgodnie z oczekiwaniami, homozygotyczne mutanty tsc2 wykazywały wysoki poziom początkowy cech podobnych do lęku‑godnych, zgodnie z wcześniej zgłoszonymi fenotypy22,27. Ponieważ te larwy już wykazują poważne nieprawidłowości behawioralne, wstrzyknięcie IL‑6 nie pogorszyło ich fenotypu. W przeciwieństwie do tego, heterozygoty tsc2 wykazywały wyraźne zmiany wywołane przez IL‑6. Ta selektywna wrażliwość podkreśla użyteczność tego protokołu do badania interakcji gen × środowisko, gdzie łagodne, ale długotrwałe sygnały zapalne współdziałają z podstawową podatnością genetyczną, aby kształtować efekty neurobehawioralne.
Ekspozycja na LPS pozostaje najczęściej stosowanym paradygmatem indukującym zapalenie u danionów i niezawodnie wywołuje szeroką, silną odpowiedź immunologiczną charakteryzującą się silnym indukowaniem pro‑zapalnych cytokin, rekrutacją komórek odporności wrodzonej i zależną od dawki śmiertelnością28. Chociaż LPS jest potężne, aktywuje jednocześnie wiele ścieżek receptorów Toll‑podobnych28,29,30, co utrudnia izolację wkładu poszczególnych cytokin w efekty neurorozwojowe. W przeciwieństwie do tego, opisany tu protokół mikroiniekcji IL‑6 zapewnia ukierunkowany i kontrolowany podejście poprzez podniesienie pojedynczej cytokiny znanej jako centralna w aktywacji odporności matczynej. Co ważne, wstrzyknięcia IL‑6 nie zwiększają śmiertelności względem kontroli wstrzykniętych NaCl, umożliwiając badanie fenotypu behawioralnego i molekularnego bez względu na toksyczność. Ponadto, mikroiniekcja IL‑6 powoduje specyficzne sygnały zapalne następcze, jak pokazują podwyższone poziomy PGE2, i wywołuje mierzalne zmiany behawioralne – szczególnie zwiększone pływanie powtarzalne u larw heterozygotycznych tsc2 – gdzie podatność genetyczna współdziała z ekspozycją na cytokiny. Razem, te różnice podkreślają, że podczas gdy model LPS przedstawia globalną aktywację odporności, mikroiniekcja IL‑6 umożliwia precyzyjne rozróżnienie mechanizmów specyficznych dla cytokin, istotnych dla ryzyka neurorozwojowego.
Prezentowane tu wyniki reprezentacyjne ilustrują efekty IL‑6 w tle mutacji tsc2, ale sam protokół jest ogólnie stosowany. Metoda może być łatwo wdrożona u larw dzikiego typu lub innych modeli genetycznych, aby zbadać, jak określone sygnały zapalne współdziałają z różnorodnymi kontekstami genetycznymi podczas wczesnego neurorozwoju. Dla zastosowań poza modelem tsc2, zalecamy empiryczne określenie optymalnej dawki IL‑6, ponieważ wrażliwość na cytokiny i progi zapalne mogą różnić się w zależności od genotypów i celów eksperymentu.
Kluczowym technicznym zagadnieniem w tym protokole jest spójność objętości wstrzyknięcia, ponieważ biologiczne efekty IL‑6 zależą od dokładnego dostarczenia około 1 nL na wstrzyknięcie. Zmienność wielkości kropli często wynika z różnic w średnicy igły lub ciśnieniu wstrzyknięcia. Jeśli krople są zbyt małe, stopniowe zwiększenie ciśnienia lub lekko poszerzenie końcówki igły pod wysokim powiększeniem zazwyczaj przywraca właściwy przepływ. Z kolei krople, które przekraczają zamierzoną objętość, zwykle wskazują, że otwór igły jest zbyt szeroki, w którym to przypadku zmniejszenie ciśnienia lub przygotowanie nowej igły z węższą końcówką jest konieczne. Utrzymanie precyzyjnych objętości wstrzyknięć jest zasadnicze, ponieważ odchylenia mogą zmieniać obciążenie zapalne i kompromitują powtarzalność. Oczasowo użytkownicy mogą napotkać sytuacje, w których żadna substancja nie jest wypychana z igły. Najczęściej jest to spowodowane pęcherzykami powietrza, zanieczyszczeniami lub blokadami na końcówce igły. Inspekcja igły pod stereomikroskopem i sprawdzenie systemu wtryskiwacza pod kątem wycieków lub luźnych połączeń zwykle rozwiązuje problem. Zapewnienie czystej, niezablokowanej końcówki igły jest zasadnicze dla spójnego dostarczenia i zapobiegania nagromadzeniu ciśnienia, które mogłoby uszkodzić larwy.
Innym ważnym czynnikiem jest fizjologiczna tolerancja wstrzykniętej objętości. Larwy ogólnie tolerują ~1 nL dobrze, ale większe objętości mogą zwiększać śmiertelność, szczególnie gdy wielokrotne wstrzyknięcia są wykonywane przez kolejne dni. W eksperymentach wymagających wielokrotnego dawkowania, istotne jest minimalizowanie stresu mechanicznego, zapewnienie wystarczającego czasu na regenerację między wstrzyknięciami i dostosowanie stężenia IL‑6 zamiast objętości, aby osiągnąć pożądaną dawkę. Te zagadnienia pomagają upewnić się, że obserwowane fenotypy odzwierciedlają ekspozycję na cytokiny, a nie uszkodzenie związane z wstrzyknięciem.
Wreszcie, śmiertelność związ
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnięcia.
Podziękowania
Dziękujemy Kevinowi Essowi i Liliannie Solnica-Krezel (Vanderbilt University) za tsc2vu242/+ ryby i IIMCB ZCF za pomoc w dostarczeniu dorosłych ryb. Ta praca została wsparta grantem SONATA BIS nr 2023/50/E/NZ3/00252, grantem dla JZ z Narodowego Centrum Nauki w Polsce.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Borosilicate Glass capillaries (Outer diameter 1.0 mm/ inner diameter 0.75 mm) | Sutter Instrument | BF150-75-10 | |
| CaCl2 (chlorek wapnia) | Chempur | 118748703 | |
| Callibration Slide (1/100 mm) | Bresser | 5916710 | |
| Capillary holder (Grip head set 4 size 0) | Fertilart Sp. z o.o | 5196082001 | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| HCl | Chempur | 115752837 | |
| Human IL6 | Thermo Fischer Scientific | 200-06-20UG | Stężenie stockowe: 10 µg/mL, Stężenie robocze: 2 pg/nL (rozcieńczone w 0,9% NaCl) |
| Injector pump FemtoJet 4i | Eppendorf | E5252000021 | |
| KCl (chlorek potasu) | Chempur | 117397402 | |
| MgCl2·6H2O (chlorek magnezu sześciowodorku) | Chempur | 116120500 | |
| Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Eppendorf | EPE 5242956003 | |
| Microscope Leica M165 FC 1983 magnification | Leica Microsysytems | https://www.leica-microsystems.com/products/ light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m165-fc/ | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| NaCl (chlorek sodu) | Chempur | 117941206 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | P5147-1G | Stężenie stockowe: 20 mg/mL (przygotowane w ultraczystej wodzie), Stężenie robocze: 0,5 mg/mL (rozcieńczone w E3) |
| Tricaine | Sigma-Aldrich/Merck | A-5040 | |
| Tris base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Trypan Blue | Thermo Fischer Scientific | 15250061 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fischer Scientific | 16520050 | |
| ZebraBox extension - Photo Motor Response EZBPMR | Animalab | https://animalab.eu/zebrabox-high-throughput-monitoring-system | |
| Zebrabox | ViewPoint | https://www.viewpoint.fr/product/zebrafish/fish-behavior-monitoring/zebrabox | Automatyczna komora analityczna |
Bibliografia
- Winden, K., et al. Tuberous sclerosis complex. Nat Rev Dis Primers. 12, 11(2026).
- Ramani, R., et al. The clinical interface of tuberous sclerosis complex and autism spectrum disorder: insights and future directions. Neurol Sci. 46 (6), 2571-2580 (2025).
- Lyall, K., et al. The changing epidemiology of autism spectrum disorders. Annu Rev Public Health. 38, 81-102 (2017).
- Nazeer, A., Ghaziuddin, M. Autism spectrum disorders: clinical features and diagnosis. Pediatr Clin North Am. 59, 19-25 (2012).
- Kern, J. K., Geier, D. A., Sykes, L. K., Geier, M. R. Relevance of neuroinflammation and encephalitis in autism. Front Cell Neurosci. 9, 519(2016).
- Careaga, M., Murai, T., Bauman, M. D. Maternal immune activation and autism spectrum disorder: from rodents to nonhuman and human primates. Biol Psychiatry. 81 (5), 391-401 (2017).
- Croonenberghs, J., Bosmans, E., Deboutte, D., Kenis, G., Maes, M. Activation of the inflammatory response system in autism. Neuropsychobiology. 45, 1-6 (2002).
- Girgis, R. R., Kumar, S. S., Brown, A. S. The cytokine model of schizophrenia: emerging therapeutic strategies. Biol Psychiatry. 75 (4), 292-299 (2014).
- Heuer, L. S., et al. An exploratory examination of neonatal cytokines and chemokines as predictors of autism risk: the early markers for autism study. Biol Psychiatry. 86 (4), 255-264 (2019).
- Sasayama, D., et al. Negative correlation between serum cytokine levels and cognitive abilities in children with autism spectrum disorder. J Intell. 5 (2), 19(2017).
- Banks, W. A., Kastin, A. J., Gutierrez, E. G. Penetration of interleukin-6 across the murine blood-brain barrier. Neurosci Lett. 179 (1-2), 53-56 (1994).
- Otkıran, G., Erdoğan, M. A., Uyanıkgil, Y., Erbaş, O. Prenatal interferon-alpha exposure induces autism-like neurobehavioral and neurochemical alterations in male offspring. J Neuroimmune Pharmacol. 21, 4(2026).
- Smith, S. E. P., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. J Neurosci. 27 (40), 10695-10702 (2007).
- Bedell, V. M., Meng, Q. C., Pack, M. A., Eckenhoff, R. G. A vertebrate model to reveal neural substrates underlying the transitions between conscious and unconscious states. Sci Rep. 10, 15789(2020).
- Belo, M. A. A., et al. Zebrafish as a model to study inflammation: a tool for drug discovery. Biomed Pharmacother. 144, 112310(2021).
- Ka, J., Pak, B., Han, O., Lee, S., Jin, S. -W. Comparison of transcriptomic changes between zebrafish and mice upon high fat diet reveals evolutionary convergence in lipid metabolism. Biochem Biophys Res Commun. 530 (4), 638-643 (2020).
- Li, Y., Hu, B. Establishment of multi-site infection model in zebrafish larvae for studying Staphylococcus aureus infectious disease. J Genet Genomics. 39 (9), 521-534 (2012).
- Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Res. 67 (7), 2927-2931 (2007).
- Cao, Z., et al. Carboxyl graphene oxide nanoparticles induce neurodevelopmental defects and locomotor disorders in zebrafish larvae. Chemosphere. 270, 128611(2021).
- Martini, D., Pucci, C., Gabellini, C., Pellegrino, M., Andreazzoli, M. Exposure to the natural alkaloid berberine affects cardiovascular system morphogenesis and functionality during zebrafish development. Sci Rep. 10, 17358(2020).
- Sun, M., et al. Robotic cardinal vein microinjection of zebrafish larvae based on 3D positioning. 2021 IEEE International Conference on Robotics and Automation (ICRA), Xi'an, China, , (2021).
- Kedra, M., et al. TrkB hyperactivity contributes to brain dysconnectivity, epileptogenesis, and anxiety in zebrafish model of tuberous sclerosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2170-2179 (2020).
- Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Dis Model Mech. 4 (2), 255-267 (2011).
- Konadu, B., Cox, C. K., Gibert, Y. Protocol for the microinjection of free fatty acids and triacylglycerol in zebrafish embryos. STAR Protoc. 5 (2), 103086(2024).
- Evans, S. S., Repasky, E. A., Fisher, D. T. Fever and the thermal regulation of immunity: the immune system feels the heat. Nat Rev Immunol. 15 (6), 335-349 (2015).
- Zabegalov, K. N., et al. Abnormal repetitive behaviors in zebrafish and their relevance to human brain disorders. Behav Brain Res. 367, 101-110 (2019).
- Scheldeman, C., et al. mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebrafish: phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108, 225-237 (2017).
- Ilyin, N. P., et al. Effects of intracerebroventricular lipopolysaccharide administration on behavioral, neurochemical, and neurogenomic responses in adult zebrafish. Behav Brain Res. 493, 115676(2025).
- Luo, R., Yao, Y., Chen, Z., Sun, X. An examination of the LPS-TLR4 immune response through the analysis of molecular structures and protein-protein interactions. Cell Commun Signal. 23, 142(2025).
- Grebennikova, D. V., Shandilya, U. K., Karrow, N. A. Beyond TLR4 and its alternative lipopolysaccharide (LPS) sensing pathways in zebrafish. Genes. 16 (9), 1014(2025).
Przedruki i uprawnienia
