Specnuezhenide łagodzi nefropatię cukrzycową u myszy db/db, co wiąże się z poprawą czynności nerek, integralności bariery jelitowej oraz zmniejszonym stanem zapalnym i stresem oksydacyjnym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
Specnuezhenide łagodzi nefropatię cukrzycową u myszy db/db, co wiąże się z poprawą czynności nerek, integralności bariery jelitowej oraz zmniejszonym stanem zapalnym i stresem oksydacyjnym.
Patogeneza nefropatii cukrzycowej (DN) jest wieloczynnikowa, obejmująca stan zapalny, stres oksydacyjny i oś jelitowo-nerkową. Specnuezhenide jest głównym aktywnym składnikiem Ligustri Lucidi Fructus i wykazuje działanie przeciwnowotworowe, przeciwutleniające i przeciwzapalne. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw jego wpływu na DN wymagają dalszych badań. Niniejsze badanie ma zatem na celu zbadanie mechanizmów molekularnych działania Specnuezhenide na DN. Model myszy z DN został ustanowiony u myszy db/db, którym podawano Specnuezhenide przez 8 tygodni. Wpływ Specnuezhenide na te myszy został oceniony poprzez ewaluację poziomu glukozy w surowicy i oceny czynności nerek. Zmiany histopatologiczne oceniono za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną. Do ilościowego wyznaczania poziomów cytokin zapalnych zastosowano enzymatyczne testy immunopochłanianiowe. Ścieżki Nrf2 oraz A20/NF-κB analizowano za pomocą Western blotting (WB), podczas gdy ekspresję białek złączy ciasnych jelit oceniono za pomocą WB i immunofluorescencji. Zmiany w mikrobiocie jelitowej zbadano poprzez sekwencjonowanie 16S rRNA o wysokiej wydajności. W porównaniu z kontrolą modelu, Specnuezhenide poprawiło funkcję nerek u myszy db/db, obniżając poziom glukozy we krwi (z 37,13 mmol/L do 28,96 mmol/L), azotu mocznika (z 18,27 mmol/L do 15,15 mmol/L) i białka w moczu (z 28,5 mg do 20,41 mg) w grupie wysokiej dawki. Tymczasem analiza mikrobioty jelitowej wykazała wzrost obfitości mikroorganizmów i spadek poziomów lipopolisacharydów po podaniu Specnuezhenide. Tymczasem Specnuezhenide może zwiększyć ekspresję białek złączy ciasnych jelit, poprawiając w ten sposób integralność bariery jelitowej. Specnuezhenide może zwiększyć ekspresję Nrf2 i A20 oraz zmniejszyć ekspresję NF-κB. Ponadto Specnuezhenide może poprawić uszkodzenie funkcji nerek, regulując jednocześnie ścieżki Nrf2 i A20/NF-κB.
Cukrzyca jest główną przyczyną chorób nerek, a wzrost liczby pacjentów z cukrzycą powoduje wzrost jej częstości występowania1. Udowodniono, że tradycyjne leczenie nefropatii cukrzycowej (DN) opóźnia postęp przewlekłej choroby nerek2. Jednakże, nadal istnieje potrzeba zidentyfikowania leków o większej skuteczności w zapobieganiu i leczeniu DN. Patogeneza DN jest wielowarstwowa i obejmuje stan zapalny, stres oksydacyjny oraz oś jelito-nerkową1. Dzięki swojemu wielocelemu podejściu, Tradycyjna Medycyna Chińska (TCM) wykazała niezwykłą skuteczność w leczeniu przewlekłych chorób metabolicznych. Ponadto, rosnące badania nad TCM w zapobieganiu i leczeniu DN wykazały obiecujące wyniki3.
Cukrzyca jest złożonym zaburzeniem metabolicznym, a jelita odgrywają centralną rolę w jego patofizjologii poprzez interakcje z narządami metabolicznymi4. Współpraca między gospodarzem a mikroflorą jelitową jest kluczowa dla utrzymania homeostazy gospodarza. Zakłócenie zdrowia struktury mikroflory jelitowej może powodować toksyny, które uszkadzają nerki2, podczas gdy upośledzona klirencja nerkowa może zmieniać metabolizm i skład mikroorganizmów5,6. Bariera jelitowa funkcjonuje zarówno jako chemiczna, jak i fizyczna obrona i jest utrzymywana przez szczelne połączenia nabłonka i warstwę śluzu składającą się z mukoinów5. Dowody sugerują korelację między DN a upośledzoną funkcją bariery jelitowej7, co umożliwia przemieszczanie toksyn i produktów ubocznych bakterii, takich jak lipopolisacharyd (LPS), do krwioobiegu8,9. Translokacja LPS przez upośledzoną barierę może wywołać dysregulację odpowiedzi immunologicznych adaptacyjnych i wrodzonych oraz stymulować produkcję cytokin prozapalnych7,10, co ostatecznie prowadzi do przewlekłego stanu zapalnego charakterystycznego dla DN11,12.
Ligustri Lucidi Fructus jest klinicznie stosowany w leczeniu nefropatii cukrzycowej (DN)13, a Specnuezhenide jest identyfikowane jako kluczowy aktywny składnik14. Specnuezhenide, unikalny sekoiridoid glikozyd15, wykazuje właściwości przeciwzapalne, przeciwutleniające i immunomodulujące16,17,18,19. Mysz db/db jest dobrze ugruntowanym spontanicznym modelem typu 2 DN, który odbija kluczowe cechy ludzkiej DN, w tym trwałą hiperglikemię, albuminurię i rozszerzenie struktury kłębuszkowej20. Poprzednie badania wskazały, że Specnuezhenide wywiera działanie renoprotekcyjne u szczurów z DN21; jednak mechanizmy molekularne pozostają w dużej mierze niezbadane. Warto zauważyć, że Specnuezhenide ma niską biodostępność doustną (około 1,93%)22, co sprawia, że trudno jest wyjaśnić jego działanie farmakologiczne jedynie poprzez bezpośrednią absorpcję. Nowe dowody sugerują, że Specnuezhenide może być szybko metabolizowany przez mikroflorę jelitową, a jego działanie farmakologiczne może być pośredniczone przez zależne od mikroflory jelitowej ścieżki19. Na podstawie tych rozważań postawiono hipotezę, że Specnuezhenide łagodzi DN poprzez modulacje mikroflory jelitowej i powiązanych z nią ścieżek stanu zapalnego i stresu oksydacyjnego. Aby przetestować tę hipotezę, oceniliśmy działanie dawki Specnuezhenide u myszy db/db, wybierając dawki na podstawie wstępnych eksperymentów i wcześniejszych badań farmakologicznych.
Dlatego niniejsze badanie miało na celu ocenić potencjalny wpływ i mechanizm działania Specnuezhenide w kontekście DN, ze szczególnym uwzględnieniem jego zdolności do łagodzenia stanu zapalnego nerek i stresu oksydacyjnego poprzez oś jelito-nerkową. Badanie to przyczynia się do wyjaśnienia mechanizmów, za pomocą których Specnuezhenide przyczynia się do zapobiegania i leczenia DN.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Komitet Etyczny Uniwersytetu Medycyny Tradycyjnej Chińskiej w Shanxi zatwierdził to badanie (2022DW167). Stosowany sprzęt i odczynniki są wymienione w Tabeli Materiałów.
Eksperymenty na zwierzętach
Samce myszy db/db, w wieku 8–9 tygodni, uzyskano ze źródła komercyjnego. Myszy były przechowywane w pomieszczeniu dla zwierząt o poziomie SPF w Centrum Zarządzania Eksperymentalnego na Uniwersytecie Medycyny Tradycyjnej Chińskiej w Shanxi i utrzymywane w stabilnej wilgotności 55% ± 5% i komfortowym środowisku 25 °C ± 1 °C z 12/12-godzinnym cyklem światło/ciemność oraz ad libitum dostępem do pokarmu i wody. Przed eksperymentem wszystkie myszy były przyzwyczajone przez 7 dni. Humanitarne punkty końcowe: Myszy wykazujące >20% utratę masy ciała, stan umierania lub niemożność dotarcia do pokarmu/wody były humanitarnie uśmiercane przed zaplanowanym punktem końcowym. Uśmiercanie: Wszystkie myszy były uśmiercane poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodowego, po którym następowało wyciągnięcie szyi, zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez instytucję.
Mysz db/db jest genetycznie spontanicznym modelem cukrzycy (nie jest to model indukowany). Sukces modelu został potwierdzony w wieku 9 tygodni poprzez pomiar poziomu glukozy na czczo (≥16 mmol/L) i mikroalbuminy w moczu (dodatni). Wszystkie myszy db/db spełniły kryteria, a żadne zwierzęta nie zostało wykluczone. Po pomyślnym ustanowieniu modelu DN u myszy db/db, myszy zostały losowo przydzielone do grup za pomocą sekwencji losowej wygenerowanej komputerowo. Badacz wykonujący eksperymenty był nieswobodny dotyczącą przydziału grup. Każdy klatka mieściła tylko jedną grupę leczoną, aby uniknąć krzyżowania się. Myszy zostały losowo podzielone na cztery grupy (n = 10 na grupę): grupę kontrolną modelu (MC), grupę irbezartanu (Irb), grupę niskiej dawki Specnuezhenide (Spe-L) i grupę wysokiej dawki Specnuezhenide (Spe-H), z myszami db/m (n = 10) używanymi jako normalna grupa kontrolna (NC). Grupy NC i MC były karmione wodą destylowaną. Natomiast grupy Irb, Spe-L i Spe-H otrzymywały codzienne doustne wlewy 43,75 mg/kg Irbesartanu, 57 mg/kg Specnuezhenide i 114 mg/kg Specnuezhenide odpowiednio przez 8 tygodni. Dawka wlewowa była zwiększana proporcjonalnie do wzrostu masy ciała. Po 8 tygodniach podawania wszystkie myszy były głodzone przez noc (12 h) z wolnym dostępem do wody przed uśmierceniem, a surowica (odwirowania przy ~1500 x g przez 15 min i zebranie nadstanu), mocz (pobrany mocz 24-godzinny w klatce metabolicznej), kał oraz tkanki jelitowe i nerkowe zostały zebrane natychmiast po uśmierceniu, zamrożone w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C aż do analizy. Po zebraniu danych zniesiono oślepianie, aby wykonać analizę statystyczną.
Wskaźniki krwi i moczu
Poziom LPS, SCr i BUN w surowicy został zmierzony zgodnie z instrukcjami producenta. Stężenie albuminy w 24-godzinnym moczu zostało wykryte zgodnie z instrukcjami zestawu. Poziom glukozy w surowicy został zmierzony za pomocą automatycznego analizatora biochemicznego.
Wykrywanie ELISA
Stężenia TNF-α, IL-6 i IL-1β w surowicy myszy zostały zmierzone za pomocą czytnika mikroplatek modelu 352 zgodnie z instrukcjami producenta.
Patologiczna obserwacja tkanek nerkowych myszy
Tkanki jelitowe i nerkowe zostały fiksowane w 4% roztworze paraformaldehydu przez 48 h przed płukaniem, odwodnieniem i osadzanie w parafinie. Sekcje (4 μm grubości) zostały uzyskane za pomocą mikrotomu parafinowego. Po deparafinizacji sekcje zostały wybarwione hematoksyliną i eozyną (HE) i zeskanowanej za pomocą skanera slajdów patologicznych cyfrowych.
Sekwencjonowanie 16S rRNA
Bakteryalne DNA genomowe zostało wyekstrahowane z zawartości ślepego jelita za pomocą zestawu ekstrakcji DNA z gleby opartego na magnesowych kulkach zgodnie z protokołem producenta. Stężenie DNA zostało zmierzone za pomocą fluorometru.
Region hiperzmienności V3–V4 genu 16S rRNA został wzmocniony za pomocą sekwencji starterów 338F (5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’) i 806R (5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’). Amplifikacja została przeprowadzona za pomocą zestawu PCR Master Mix w następujących warunkach cyklu: początkowa denaturacji w 95 °C przez 3 min; 5 cykli 95 °C przez 30 s, 45 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s; następnie 20 cykli 95 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s; i ostateczne przedłużenie w 72 °C przez 5 min. Amplifikowane produkty PCR zostały następnie oczyszczone za pomocą magnetycznych kulek do czyszczenia DNA i wyboru wielkości.
Biblioteki zostały
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podanie Specnuezhenide obniżyło poziom glukozy we krwi, poprawiło funkcję nerek i złagodziło uszkodzenie nerek u myszy z DN
Myszy z modelem DN otrzymywały Specnuezhenide przez 8 tygodni po pomyślnym wytworzeniu modelu. U myszy z grupy MC odnotowano wyraźny wzrost poziomu glukozy w surowicy, podczas gdy w grupie Specnuezhenide poziomy te były znacząco obniżone (Rysunek 1B). Grupa MC wykazała znacznie podwyższone poziomy albuminy w moczu, SCr oraz B...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
DN, uporczywa mikronaczyniowa powikłanie cukrzycy, charakteryzuje się podwyższonym wydalaniem albuminy w moczu i upośledzoną czynnością nerek24. Albuminuria jest często stosowanym wczesnym klinicznym wskaźnikiem progresji DN25. Pacjenci z DN mogą wykazywać nieprawidłową czynność nerek, co potwierdzają znacznie podwyższone poziomy SCr i BUN26. W niniejszym badaniu grupa Specnuezhenide wykazała wyraźnie obniżone poziomy albuminy w moczu oraz znacząco z...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy deklarują, że nie mają znanych konkurencyjnych interesów finansowych ani osobistych relacji, które mogłyby mieć wpływ na pracę przedstawioną w tym artykule.
To badania zostały sfinansowane przez Narodowe Fundusze Naukowe Chin (nr 81973486 i 82173974), projekty badawcze Administracji Tradycyjnej Medycyny Chińskiej Prowincji Shanxi (nr 2024ZYYA021) oraz Dyscyplinarny Projekt Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Shanxi (nr 2026XK24).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Albustix | Guangzhou Huadu Gaoerbo Biotechnology Co., Ltd. | 20211203 | |
| Analytical balance | Beijing Sartorius Instrument System Co., Ltd. | CPA | |
| antibodie A20 | Cell Signalling Technology | 5630s | (1:1000) |
| antibodie Bax | Cell Signalling Technology | 2772s | (1:1000) |
| antibodie Bcl-2 | Cell Signalling Technology | 3498s | (1:1000) |
| antibodie claudin 1 | Abcam | EPR25359-48 | (1:1000) |
| antibodie COX2 | Proteintech Group | 12375-1-AP | (1:2000) |
| antibodie GAPDH | Abcam | EPR16891 | (1:10000) |
| antibodie GCLC | Proteintech Group | 12601-1-AP | (1:10000) |
| antibodie HO-1 | Proteintech Group | 10701-1-AP | (1:10000) |
| antibodie IκBα | Cell Signalling Technology | 4812s | (1:1000) |
| antibodie Myd88 | Abcam | EPR21824 | (1:1000) |
| antibodie NF-κB p65 | Cell Signalling Technology | 8242s | (1:1000) |
| antibodie NLRP3 | Proteintech Group | 68102-1-Ig | (1:5000) |
| antibodie NQO1 | Proteintech Group | 11451-1-AP | (1:5000) |
| antibodie Nrf2 | Proteintech Group | 16396-1-AP | (1:5000) |
| antibodie occludin | Cell Signalling Technology | 91131S | (1:1000) |
| antibodie p-IκBα | Cell Signalling Technology | 2859s | (1:1000) |
| antibodie p-NF-κB p65 | Cell Signalling Technology | 3033s | (1:1000) |
| antibodie TAX1BP1 | Proteintech Group | 14424-1-AP | (1:2000) |
| antibodie TLR4 | GeneTex | GTX75742 | (1:1000) |
| antibodie TRAF6 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8409 | (1:1000) |
| antibodie ZO-1 | Proteintech Group | 21773-1-AP | (1:10000) |
| Automatic biochemical analyzer for blood glucose measurement | Biobase Biodusty (Shandong) Co., Ltd. | BK-280 | |
| blood urea nitrogen | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C03-2-1 | |
| Centrifugal machine | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd | HI650 | |
| db/db mice (8-9 week-old male) | Changzhou Kavens Laboratory Animal Co., Ltd. | SCXK (Su) 2021-0013 | |
| IL-1β ELISA Kit | Wuhan Fine Biotech Co., Ltd. | EM0109 | |
| IL-6 ELISA Kit | Wuhan Fine Biotech Co., Ltd. | EM1158 | |
| Irbesartan | Zhejiang Huahai Pharmaceutical Co., Ltd. | 0000019353 | |
| LPS | Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. | MM-0634M1 | |
| microscope | Olympus Corporation | BX53 | |
| microtome | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM 2016 | |
| Organized pizza slicing machine | Wuhan Junjie Electronic Co., Ltd | JK-6 | |
| Paraffin slicing machine | RWD Life Science Co., Ltd. | S710 | |
| Pathological slide scanner | Ningbo Konfoong Bioinformation Tech Co., Ltd. | KFBIO PRO-005 | |
| serum creatinine | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C011-2-1 | |
| Specnuezhenide | National Institutes for Food and Drug Control | 39011-92-2 | purity >98% |
| SPSS statistics 26.0 | |||
| Tissue Embedding Center | Wuhan Junjie Electronic Co., Ltd | JB-P5 | |
| Tissue Processor | Wuhan Junjie Electronic Co., Ltd | JT-12J | |
| TNF-α ELISA Kit | Wuhan Fine Biotech Co., Ltd. | ER1393 | |
| urinary protein | Wuhan Fine Biotech Co., Ltd. | EM0632 |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.