Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Szybka detekcja w miejscu opieki (point-of-care) patogenów wywołujących zakażenia dolnych dróg oddechowych u pacjentów na oddziałach intensywnej terapii

649 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71534

⸱

19 września 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Infrastructures for Translational Medicine, State Key Laboratory of Complex, Severe, and Rare Diseases, Institute of Clinical Medicine, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd, 3Department of Critical Care Medicine, State Key Laboratory of Complex, Severe, and Rare Diseases, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, 4Department of Medicine, Cape Cod Hospital, 5Harvard T.H. Chan School of Public Health, 6Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Center for Inflammation Research, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje w pełni zintegrowaną metodę LAMP opartą na chipie mikroprzepływowym, umożliwiającą w ciągu jednej godziny wykrycie w punkcie opieki (point-of-care) 15 patogenów wywołujących infekcje dolnych dróg oddechowych u pacjentów na oddziałach intensywnej terapii.

Streszczenie

Infekcje dolnych dróg oddechowych (LRTIs) należą do głównych przyczyn pogorszenia stanu klinicznego i zgonów u pacjentów w stanie krytycznym. Na oddziałach intensywnej terapii (OIT) szybka identyfikacja patogenu sprawczego jest niezbędna do wdrożenia odpowiedniej terapii przeciwdrobnoustrojowej; jednak konwencjonalne metody hodowlane trwają od 3 do 5 dni i charakteryzują się niską czułością, szczególnie w przypadku grzybów. Metody molekularne, takie jak PCR, skracają czas oczekiwania na wynik, lecz wciąż opierają się na ręcznej ekstrakcji kwasów nukleinowych i termocyklowaniu, co ogranicza ich przydatność w diagnostyce przyłóżkowej. Niniejszy protokół opisuje procedurę point-of-care opartą na w pełni zintegrowanym, dyskowym chipie mikrofluidycznym (chip CD), który łączy oczyszczanie kwasów nukleinowych za pomocą kulek magnetycznych z izotermiczną amplifikacją zapętloną (LAMP). Po uproszczonym etapie ręcznego upłynniania i lizy, przetworzona próbka jest ładowana na chip wraz z dwiema gotowymi fiolkami z odczynnikami. Następnie urządzenie autonomicznie wykonuje ekstrakcję, amplifikację w temperaturze 65 °C oraz odczyt fluorescencji w czasie rzeczywistym, dostarczając wyników jakościowych dla 15 celów (w tym 11 bakterii, 3 grzybów i 1 patogenu atypowego) w ciągu 45 min czasu pracy urządzenia (około 1 h dla pełnego procesu od próbki do wyniku, wliczając ręczny etap wstępnego przetwarzania). Przedstawiamy dane detekcyjne z 10 próbek pobranych na OIT, w tym plwociny, aspiraty oskrzelowe oraz płyn z rozdzielczego płukania pęcherzyków płucnych, obejmujące zarówno monoinfekcje, jak i koinfekcje polimikrobiologiczne z udziałem do 7 organizmów na jednym chipie. Zamknięta konstrukcja kartridża minimalizuje ryzyko kontaminacji aerozolowej, a pojedynczy krok ładowania nie wymaga specjalistycznego przeszkolenia, co czyni ten system praktycznym narzędziem diagnostyki przyłóżkowej dla zespołów OIT.

Wprowadzenie

Wśród pacjentów w stanie krytycznym na oddziałach intensywnej terapii (OIT), infekcje dolnych dróg oddechowych, z zapaleniami płuc związanymi z wentylacją mechaniczną (VAP) na czele, pozostają stałym czynnikiem zwiększającym chorobowość, wydłużającym czas wentylacji mechanicznej i prowadzącym do nadmiarowej śmiertelności1,2. Obraz mikrobiologiczny infekcji dolnych dróg oddechowych (LRTI) nabytych na OIT różni się znacząco od obrazu chorób pozyszpitalnych. Przeważają wielolekooporne bakterie Gram-ujemne (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii), często występujące w konstelacjach polimikrobowych, co utrudnia stosowanie schematów empirycznych3,4. Grzyby oportunistyczne wprowadzają dodatkowy poziom złożoności. Inwazyjna aspergiloza płucna, niegdyś uważana za cechę głębokiej immunosupresji, jest obecnie rozpoznawana z coraz większą częstotliwością u pacjentów na OIT bez neutropenii, przede wszystkim po ciężkim przebiegu grypy oraz COVID-195. Istniejące algorytmy diagnostyczne aspergilozy łączą mało wydajne posiewy z testami na antygen galaktoMannanu (GM), jednak test GM jest ograniczony dobrze udokumentowanymi oknami diagnostycznymi oraz zmienną czułością u gospodarzy bez neutropenii6. Każda godzina opóźnienia w rozpoczęciu odpowiedniej terapii przeciwdrobnoustrojowej w sepsie wiąże się z mierzalnym wzrostem śmiertelności7. Biorąc to pod uwagę, szybkość i złożoność infekcji na OIT wymagają narzędzi diagnostycznych, które będą odpowiadać pilności klinicznej.

Standardowe posiewy mikrobiologiczne, choć niezbędne do badania wrażliwości, są zasadniczo ograniczone pod względem czasu: czas oczekiwania na wynik wynosi od 3 do 5 dni, pomijane są organizmy wymagające, a odsetek dodatnich wyników w posiewach grzybów pozostaje niski8. Metagenomiczne sekwencjonowanie nowej generacji (mNGS) stanowi obiektywną alternatywę, jednak jego wdrożenie kliniczne jest ograniczane przez koszty, czas przetwarzania wynoszący od 24 do 48 godzin, zależność od rurociągów bioinformatycznych oraz ograniczoną możliwość zastosowania w punkcie opieki nad pacjentem (point-of-care)9. Panele oparte na metodzie PCR skróciły ten przedział czasowy, ale wciąż wymagają wieloetapowej ekstrakcji kwasów nukleinowych, aparatury do cyklicznej zmiany temperatury oraz, w przypadku formatów konwencjonalnych, elektroforezy po amplifikacji10. Żadna z tych platform nie spełnia w pełni zbieżnych wymagań oddziałów intensywnej terapii: czasu analizy poniżej jednej godziny, minimalnego nakładu pracy manualnej, multipleksowego wykrywania patogenów, w tym grzybów, oraz prostoty operacyjnej wystarczającej dla personelu pozalaboratoryjnego.

Izotermiczna amplifikacja wspomagana pętlą (LAMP) rozwiązuje kilka z tych ograniczeń. Metoda ta, po raz pierwszy opisana przez Notomi i współpracowników, amplifikuje docelowe DNA w stałej temperaturze 65 °C przy użyciu zestawu od czterech do sześciu starterów rozpoznających sześć odrębnych regionów, przy udziale polimerazy o aktywności wypierającej nić11. Reakcja generuje charakterystyczne struktury amplikonów w formie pętli z łodygą oraz struktur przypominających kalafior, które są wykrywalne za pomocą fluorescencji w czasie rzeczywistym, co pozwala na uzyskanie krzywych w kształcie litery S w ciągu kilku minut od przekroczenia progu detekcji. Czułość przy niskich stężeniach matrycy jest wysoka, a zastosowanie wielu starterów zapewnia selektywność ograniczającą liczbę wyników fałszywie dodatnich12,13. W połączeniu z platformami mikroprzepływowymi metoda LAMP może być przeprowadzana równolegle dla wielu celów z jednej próbki14. Wcześniejsze prace wykazały, że systemy chipowe LAMP wykrywają patogeny układu oddechowego w czasie poniżej trzech godzin15. Kluczowym ograniczeniem tych systemów jest jednak zależność od oddzielnej, ręcznej ekstrakcji DNA, co wydłuża czas analizy, zwiększa złożoność operacyjną oraz ryzyko kontaminacji.

Opisany tutaj system eliminuje wspomniane wąskie gardło. Oparty na jednorazowym, dyskowym chipie mikrofluidycznym (o średnicy 86 mm), integruje on ładowanie próbki, oczyszczanie kwasów nukleinowych z wykorzystaniem kulek magnetycznych oraz 16-pleksową amplifikację LAMP w jednej szczelnej kasecie (Rycina 1). Operator wykonuje jedynie krótki, ręczny etap upłynniania i lizy przy użyciu specjalnie zaprojektowanej probówki procesowej, a następnie ładuje lizat oraz dwie fiolki z odczynnikami na chip (Rycina 2). Od tego momentu instrument autonomicznie przeprowadza ekstrakcję, amplifikację izotermiczną w temperaturze 65 °C oraz detekcję fluorescencji, dostarczając jakościowych wyników dla 15 klinicznie istotnych celów: 11 bakterii, 3 grzybów (Aspergillus spp., Candida albicans, Pneumocystis jirovecii) oraz 1 atypowego patogenu (Mycoplasma pneumoniae) w ciągu 45 min. Gen z rodziny neuroblastoma breakpoint family (NBPF), stosowany jako kontrola wewnętrzna, potwierdza odpowiedniość materiału oraz integralność reakcji w każdym badaniu. Niniejszy protokół zawiera instrukcje krok po kroku dla pełnego procesu roboczego – od pobrania próbki z oddziału intensywnej terapii (OIT), przez wstępne przetwarzanie, ładowanie chipa i zautomatyzowaną detekcję, aż po interpretację wyników – i jest przeznaczony zarówno dla personelu laboratoriów klinicznych, jak i zespołów przy łóżku pacjenta na OIT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie próbki zostały pobrane zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komisję Rewizyjną ds. Etyki Szpitala Peking Union Medical College przy Chińskiej Akademii Nauk Medycznych (numer zatwierdzenia I-24PJ1778). Przed pobraniem materiału od każdego uczestnika lub jego prawnie upoważnionego przedstawiciela uzyskano pisemną zgodę. Panel patogenów docelowych oraz przypisania do studzienek reakcyjnych przedstawiono w Tabeli 1, natomiast materiały eksploatacyjne użyte podczas wstępnego przetwarzania próbek wymieniono w Tabeli 2.

1. Pobieranie próbek klinicznych z dolnych dróg oddechowych na oddziale intensywnej terapii

  1. Pobieranie plwociny
    1. Trzykrotnie przepłukać jamę ustną czystą wodą lub sterylną solą fizjologiczną, aby usunąć resztki pokarmowe i komensalną florę jamy ustnej.
    2. Polecić pacjentowi wykonanie dwóch do trzech głębokich wdechów, a następnie silne odkrztuszenie plwociny z dolnych dróg oddechowych bezpośrednio do sterylnego pojemnika na próbkę.
      UWAGA: Właściwa próbka powinna składać się z materiału lepkiego, ropnego lub z pasmami krwi pochodzącego z obszaru poniżej tchawicy; czysta ślina lub wydzielina spływająca po tylnej ścianie gardła są niewystarczające i mogą upośledzić późniejszą detekcję.
  2. Pobieranie aspiratu oskrzelowego (BAS)
    1. W przypadku pacjentów nieintubowanych wprowadzić sterylny cewnik ssący (cewnik 10–12 Fr, z ciśnieniem ssania ustawionym na −0.0267 MPa, co odpowiada −200 mmHg) drogą nosową lub jamą ustną na głębokość około 30 cm.
    2. Zastosować ssanie, obracając cewnik, a następnie powoli go wycofać. Zebrane wydzieliny aspiracyjne przelać do sterylnej pułapki na próbki.
      UWAGA: Jeśli wydzieliny są skąpe, przed ssaniem wprowadzić przez cewnik około 5 mL sterylnej soli fizjologicznej.
    3. W przypadku pacjentów wentylowanych mechanicznie dobrać cewnik ssący odpowiednio do rozmiaru rurki endotrachealnej: użyć cewnika 10 Fr dla rurki 7.0–7.5 mm oraz cewnika 12 Fr dla rurki 8.0 mm.
    4. Przed ssaniem przeprowadzić preoksygenację pacjenta 100% tlenem przez 30–60 s. Odłączyć obwód respiratora i wprowadzić wybrany cewnik przez sztuczną drogę oddechową aż do napotkania oporu.
    5. Zastosować podciśnienie −0.0267 MPa (odpowiednik −200 mmHg), ograniczając każde przejście cewnika, a tym samym czas odłączenia od respiratora, do maksymalnie 15 s, aby zminimalizować derekrutację i hipoksemię, a po ssaniu ponownie podać pacjentowi 100% tlenu przez 30–60 s.
    6. Wprowadzić 1–2 mL sterylnej soli fizjologicznej przez cewnik i odczekać 3 s.
    7. Zastosować ssanie i wycofać cewnik. Zebrane wydzieliny aspiracyjne przelać do sterylnej pułapki na próbki. Natychmiast po pobraniu próbki ponownie podłączyć obwód respiratora.
      UWAGA: Przez cały czas niezbędne jest ścisłe przestrzeganie zasad aseptyki, aby uniknąć zakażenia próbki patogenami szpitalnymi.
  3. Pobieranie płynu z płukania pęcherzykowo-oskrzelowego (BALF)
    1. Zidentyfikować docelowy segment na obrazie klatki piersiowej. Przesunąć bronchoskop i umieścić go w odpowiednim oskrzelu segmentowym lub podsegmentowym.
    2. Szybko wprowadzać sterylna sól fizjologiczną w porcjach 20–50 mL, powtórzyć czynność 3–5 razy (łącznie 60–120 mL). Po każdej porcji zastosować delikatne ssanie, a następnie zebrać odzyskany płyn do sterylnego, szczelnego pojemnika.
      OSTROŻNIE: Podczas BAL u pacjentów na OIT obowiązkowe jest ciągłe monitorowanie hemodynamiczne i wentylacyjne. W przypadku osób wentylowanych mechanicznie dostosować ustawienia respiratora w razie potrzeby.
      UWAGA: Typowy odzysk stanowi 40–60% wprowadzonej objętości. Słaby powrót płynu może wymagać ponownego ustawienia końcówki bronchoskopu.

2. Upłynnianie i liza patogenów

  1. Za pomocą jednorazowej pipety nr 2 pobierz próbkę do zaznaczonej linii (około 1 mL) i przenieś ją do probówki do upłynniania. Wielokrotnie ściskaj gruszkę pipety, aby przenieść cały materiał lepki, a następnie zakręć probówkę.
    UWAGA: W przypadku BALF lub wodnistego plwocin pobierz dwie objętości pipety, aby zapewnić wystarczającą ilość patogenów.
  2. Energicznie wstrząśnij probówką do upłynniania ręcznie przez 1 min. Obejrzyj próbkę wizualnie i kontynuuj wstrząsanie, aż do momentu, gdy nie będą widoczne grudki śluzu, a próbka będzie swobodnie przepływać przez jednorazową pipetę nr 1 bez oporu (jednorodna, wodnista konsystencja). Wstrząsaj przez co najmniej 1 min, wydłużając ten czas w razie potrzeby dla próbek o wysokiej lepkości, aż do spełnienia tych kryteriów.
  3. Otwórz zakrętkę uszczelniającą probówki do lizy.
  4. Pobierz około 0,5 mL zhomogenizowanej próbki za pomocą jednorazowej pipety nr 1 i przenieś próbkę do probówki do lizy.
  5. Zamknij zakrętkę uszczelniającą i upewnij się, że nakrętka końcówki jest mocno dokręcona.
  6. Umieść probówkę do lizy w urządzeniu do wstępnego przetwarzania próbek (urządzenie SP), naciskając w dół, aż zostanie stabilnie osadzona. Naciśnij Start.
  7. Poczekaj, aż urządzenie SP zakończy automatyczny cykl upłynniania i lizy (parametry w Tabeli 3) trwający około 15 min.
    UWAGA: Nie otwieraj ani nie wyjmuj probówki podczas przetwarzania.

3. Załadunek chipa i detekcja zautomatyzowana

  1. Ładowanie odczynników i próbki
    1. Wyjąć chip CD z przechowywania w 4 °C i wyrównać jego temperaturę do temperatury pokojowej (około 25 °C) przez 10 min.
      ​UWAGA: Fiolki z odczynnikami O i B oraz wstępnie przetworzony lizat są wykorzystywane w temperaturze pokojowej; amplifikacja LAMP na chipie jest przeprowadzana w 65 °C (patrz krok 3.2.3 i Tabela 3).
    2. Otworzyć foliową torebkę i położyć chip na płaskiej powierzchni.
    3. Obrócić nakrętkę przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby otworzyć chip.
    4. Strząsnąć fiolkę O, aby zebrać ciecz na dnie naczynia.
    5. Zdjąć nakrętkę z fiolki O, włożyć dyszę do portu O i dozować całą zawartość do portu.
    6. Wyrzucić fiolkę O. Powtórzyć procedurę, używając fiolki B i portu B.
    7. Wyjąć probówkę z przetworzonym lizatem z urządzenia SP i zdjąć zatyczkę z końcówki.
    8. dopasować końcówkę probówki do portu S i dozować całą objętość lizatu do chipu.
    9. Wyrzucić zużytą probówkę do lizy.
    10. Obrócić nakrętkę chipu zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż dwa słyszalne kliknięcia potwierdzą całkowite uszczelnienie.
      UWAGA: Niepełne napełnienie któregokolwiek z portów może spowodować awarię poszczególnych kanałów. Przed uszczelnieniem należy potwierdzić całkowite dozowanie. Aby uniknąć niepełnego uszczelnienia i ryzyka kontaminacji, nie należy nosić rękawiczek z PE podczas zakręcania nakrętki; zaleca się zamiast nich rękawiczki lateksowe lub nitrylowe.
  2. Obsługa urządzenia
    1. Włączyć zautomatyzowany analizator kwasów nukleinowych. Dotknąć opcji Detect, zeskanować kod kreskowy na foliowej torebce chipu, a następnie wprowadzić dane demograficzne pacjenta i ID próbki.
    2. Zamontować chip na wrzecionie obrotowym i docisnąć, aż kliknięcie potwierdzi zablokowanie.
    3. Dotknąć opcji Start. Urządzenie autonomicznie wykonuje odśrodkową dystrybucję odczynników, ekstrakcję za pomocą kulek magnetycznych, amplifikację LAMP w 65 °C oraz akwizycję fluorescencji. Czas przebiegu wynosi około 45 min (ładowanie odczynników/próbki oraz schemat pracy urządzenia przedstawiono na Rysunek 3).
      UWAGA: Nie otwierać pokrywy podczas pracy urządzenia.
  3. Interpretacja wyników
    1. Oprogramowanie identyfikuje punkt przegięcia każdej S-kształtnej krzywej amplifikacji za pomocą analizy maksimum drugiej pochodnej i raportuje odpowiadającą jej wartość TP (czas do uzyskania dodatniego wyniku).
    2. Porównać każdą wartość TP z odpowiednim progiem wymienionym w Tabeli 4. Kanały z wartościami TP równymi lub niższymi od progu zaklasyfikować jako dodatnie, a kanały z wartościami TP powyżej progu jako ujemne.
    3. Zweryfikować, czy kanał kontroli wewnętrznej (dołek 16) wykazuje S-kształtną krzywą amplifikacji z wartością TP poniżej 12 min.
    4. Odrzucić wynik przebiegu, jeśli kontrola wewnętrzna nie zadziałała. Powtórzyć badanie, używając nowego chipu, lub ponownie pobrać materiał.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po zakończeniu poprawnego przebiegu instrument wyświetlił ślady fluorescencji w czasie rzeczywistym dla wszystkich 16 kanałów. Kanały dodatnie wykazały oczekiwaną S-kształtną kinetykę amplifikacji z automatycznie naniesionymi wartościami TP, podczas gdy kanały ujemne pozostały na poziomie linii bazowej. Kanał IC (dołek 16) generował krzywą S-kształtną z TP < 12 min we wszystkich poprawnych przebiegach.

W ramach pilotażowej demonstracji koncepcji protokołu wybrano 10 reprezentatywnych próbek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Szybka identyfikacja patogenów jest kluczowa w zarządzaniu infekcjami na oddziałach intensywnej terapii (OIT). System opisany w niniejszym opracowaniu skraca czas identyfikacji patogenów z 3–5 dni zazwyczaj wymaganych przy hodowli do mniej niż 1 godziny, co jest przedziałem czasowym, w którym często podejmuje się decyzje dotyczące stosowania leków przeciwdrobnoustrojowych pierwszego rzutu7. Dzięki zintegrowaniu ekstrakcji kwasów nukleinowych, oczyszczania oraz amplifikacji 16-plex LAMP w obrębie j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy declare brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Niezakaźne Choroby Przewlekłe – Narodowy Główny Projekt Naukowo-Technologiczny (No. 2023ZD0516500), Narodowe Finansowanie Badań Klinicznych w Szpitalach Wysokiego Poziomu (2026-PUMCH-A-103), Program Otwartych Konkurencji CMB (24-561) oraz Program Kształcenia Talentów Szpitala Peking Union Medical College (No.UGG11571).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zautomatyzowany analizator kwasów nukleinowychBeijing Taihao Biotechnology Co., LtdTHE-T80-01TurboFlow T; wykonuje odśrodkową dystrybucję odczynników, ekstrakcję za pomocą kulek magnetycznych oraz LAMP w 65 °Coraz detekcja fluorescencji w czasie rzeczywistym (czas przebiegu ~45 min)
#1 jednorazowa pipeta PasteuraZhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen)Wykonany na zamówienieJednorazowy materiał eksploatacyjny; 0,5 ml; służy do przenoszenia zhomogenizowanego preparasu do probówki lizującej
#2 Jednorazowa pipeta PasteuraZhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen)Wykonany na zamówienieProdukt jednorazowy; 2 ml; służy do pobierania próbki do zaznaczonej linii w probówce do upłynniania
chip CDBeijing Hongyang Chensheng Technology Co., LtdWykonany na zamówienieJednorazowy materiał eksploatacyjny; dysk o średnicy 86 mm z centralną strefą załadunku (porty O, B, S), strefą oczyszczania za pomocą kulek magnetycznych oraz zewnętrznym pierścieniem z 16 studniami reakcyjnymi (15 celów patogennych + wewnętrzna kontrola NBPF)
Odczynniki do reakcji LAMPYeasen Biotechnology (Shanghai) Co., LtdW celu optymalizacji procesu ekstrakcji DNA z próbek tkanek roślinnych, należy zastosować ulepszoną metodę opartą na zastosowaniu buforów ekstrakcyjnych z dodatkiem czynników redukujących polisacharydy i polifenole. Po pierwsze, tkankę roślinną należy zamrozić w ciekłym azocie i starannie sproszkować w kriomłynce, aby uzyskać jednorodny pył. Następnie do homogenizatu dodaje się bufor lizujący zawierający SDS oraz PVP (poliwiniłopirolydon), który zapobiega tworzeniu kompleksów DNA z polifenolami. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze 65°C przez 30 minut, co pozwala na efektywną lize komórek i denaturację białek. Kolejnym krokiem jest oddzielenie frakcji wodnej od osadu poprzez wirowanie przy wysokiej prędkości. Wyizolowane DNA oczyszcza się za pomocą precypitacji izopropanolem, a następnie przemywa 70% etanolem, aby usunąć pozostałości soli i zanieczyszczeń. Ostatnim etapem jest rozpuszczenie oczyszczonego DNA w buforze TE lub wodzie o niskiej zawartości nukleaz. Jakość i ilość uzyskanego materiału genetycznego należy ocenić za pomocą spektrofotometrii UV-VIS oraz elektroforezy żelowej.Odczynniki do reakcji LAMP zmagazynowane w chipie CD w postaci liofilizowanych kulek
Probówka do upłynnianiaBeijing Taihao Biotechnology Co., LtdWykonany na zamówienieProdukt jednorazowy; 2 ml/probówka; przeznaczony do homogenizacji ręcznej próbki
Probówka do lizyBeijing Taihao Biotechnology Co., LtdWykonany na zamówienieJednorazowy materiał eksploatacyjny; 0,5 ml/probówka; ściskany korpus silikonowy z 200 µm membrana filtrująca; gotowe odczynniki lizujące
StarterySangon Biotech (Shanghai) Co., LtdWykonany na zamówienieMieszanina starterów osadzona w komorze reakcyjnej chipa CD
Urządzenie do wstępnego przetwarzania próbekBeijing Taihao Biotechnology Co., LtdTHE-R10-02TS-2000; automatyczna upłynniajka–cykl lizy (~15 min)
Fiolka jednorazowa “B”Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., LtdWykonany na zamówienieWymienne materiały eksploatacyjne; gotowy odczynnik na chipie; jeden na test; przechowywać w temperaturze 4 °C i doprowadzone do temperatury pokojowej (~25 °C) przed załadowaniem
Fiolka jednodawkowa “O”Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., LtdWykonany na zamówienieJednorazowy materiał eksploatacyjny; gotowy odczynnik na chipie; jeden na test; przechowywać w 4 °C i doprowadzono do stanu równowagi w temperaturze pokojowej (~25 °C) przed załadowaniem

Bibliografia

  1. GBD 2016 Lower Respiratory Infections Collaborators. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990–2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Infect Dis. 2018;18(11):1191-1210.
  2. Niederman MS, Torres A. Respiratory infections. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220150.
  3. Weiser JN, Ferreira DM, Paton JC. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nat Rev Microbiol. 2018;16(6):355-367.
  4. Reynolds D et al. The threat of multidrug-resistant/extensively drug-resistant gram-negative respiratory infections: another pandemic. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220068.
  5. Schauwvlieghe AFAD et al. Invasive aspergillosis in patients admitted to the intensive care unit with severe influenza: a retrospective cohort study. Lancet Respir Med. 2018;6(10):782-792.
  6. Meersseman W et al. Galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid: a tool for diagnosing aspergillosis in intensive care unit patients. Am J Respir Crit Care Med. 2008;177(1):27-34.
  7. Seymour CW et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. N Engl J Med. 2017;376(23):2235-2244.
  8. Noviello S, Huang DB. The basics and the advancements in diagnosis of bacterial lower respiratory tract infections. Diagnostics (Basel). 2019;9(2):37.
  9. Chiu CY, Miller SA. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 2019;20(6):341-355.
  10. Hanson KE et al. Molecular testing for acute respiratory tract infections: clinical and diagnostic recommendations from the IDSA's diagnostics committee. Clin Infect Dis. 2020;71(10):2744-2751.
  11. Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
  12. Soroka M, Wasowicz B, Rymaszewska A. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): the better sibling of PCR? Cells. 2021;10(8):1931.
  13. Parida M et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 2008;18(6):407-421.
  14. Ou H et al. Rapid detection of multiple pathogens by the combined loop-mediated isothermal amplification technology and microfluidic chip technology. Ann Palliat Med. 2021;10(10):11053-11066.
  15. Lai JX et al. Rapid detection of bacterial pathogens causing lower respiratory tract infections via microfluidic-chip-based loop-mediated isothermal amplification. J Vis Exp. 2024;(205):e66677.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Zakażenia dolnych dróg oddechowychidentyfikacja patogenówchip mikrofluidycznyoczyszczanie kwasów nukleinowychamplifikacja izotermicznaekstrakcja za pomocą kulek magnetycznychdiagnostyka przy łóżku pacjentapatogeny oddechowe
Szybka detekcja w miejscu opieki (point-of-care) patogenów wywołujących zakażenia dolnych dróg oddechowych u pacjentów na oddziałach intensywnej terapii
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.