Niniejszy protokół opisuje w pełni zintegrowaną metodę LAMP opartą na chipie mikroprzepływowym, umożliwiającą w ciągu jednej godziny wykrycie w punkcie opieki (point-of-care) 15 patogenów wywołujących infekcje dolnych dróg oddechowych u pacjentów na oddziałach intensywnej terapii.
Artykuł metodologiczny
Szybka detekcja w miejscu opieki (point-of-care) patogenów wywołujących zakażenia dolnych dróg oddechowych u pacjentów na oddziałach intensywnej terapii
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Infekcje dolnych dróg oddechowych (LRTIs) należą do głównych przyczyn pogorszenia stanu klinicznego i zgonów u pacjentów w stanie krytycznym. Na oddziałach intensywnej terapii (OIT) szybka identyfikacja patogenu sprawczego jest niezbędna do wdrożenia odpowiedniej terapii przeciwdrobnoustrojowej; jednak konwencjonalne metody hodowlane trwają od 3 do 5 dni i charakteryzują się niską czułością, szczególnie w przypadku grzybów. Metody molekularne, takie jak PCR, skracają czas oczekiwania na wynik, lecz wciąż opierają się na ręcznej ekstrakcji kwasów nukleinowych i termocyklowaniu, co ogranicza ich przydatność w diagnostyce przyłóżkowej. Niniejszy protokół opisuje procedurę point-of-care opartą na w pełni zintegrowanym, dyskowym chipie mikrofluidycznym (chip CD), który łączy oczyszczanie kwasów nukleinowych za pomocą kulek magnetycznych z izotermiczną amplifikacją zapętloną (LAMP). Po uproszczonym etapie ręcznego upłynniania i lizy, przetworzona próbka jest ładowana na chip wraz z dwiema gotowymi fiolkami z odczynnikami. Następnie urządzenie autonomicznie wykonuje ekstrakcję, amplifikację w temperaturze 65 °C oraz odczyt fluorescencji w czasie rzeczywistym, dostarczając wyników jakościowych dla 15 celów (w tym 11 bakterii, 3 grzybów i 1 patogenu atypowego) w ciągu 45 min czasu pracy urządzenia (około 1 h dla pełnego procesu od próbki do wyniku, wliczając ręczny etap wstępnego przetwarzania). Przedstawiamy dane detekcyjne z 10 próbek pobranych na OIT, w tym plwociny, aspiraty oskrzelowe oraz płyn z rozdzielczego płukania pęcherzyków płucnych, obejmujące zarówno monoinfekcje, jak i koinfekcje polimikrobiologiczne z udziałem do 7 organizmów na jednym chipie. Zamknięta konstrukcja kartridża minimalizuje ryzyko kontaminacji aerozolowej, a pojedynczy krok ładowania nie wymaga specjalistycznego przeszkolenia, co czyni ten system praktycznym narzędziem diagnostyki przyłóżkowej dla zespołów OIT.
Wprowadzenie
Wśród pacjentów w stanie krytycznym na oddziałach intensywnej terapii (OIT), infekcje dolnych dróg oddechowych, z zapaleniami płuc związanymi z wentylacją mechaniczną (VAP) na czele, pozostają stałym czynnikiem zwiększającym chorobowość, wydłużającym czas wentylacji mechanicznej i prowadzącym do nadmiarowej śmiertelności1,2. Obraz mikrobiologiczny infekcji dolnych dróg oddechowych (LRTI) nabytych na OIT różni się znacząco od obrazu chorób pozyszpitalnych. Przeważają wielolekooporne bakterie Gram-ujemne (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii), często występujące w konstelacjach polimikrobowych, co utrudnia stosowanie schematów empirycznych3,4. Grzyby oportunistyczne wprowadzają dodatkowy poziom złożoności. Inwazyjna aspergiloza płucna, niegdyś uważana za cechę głębokiej immunosupresji, jest obecnie rozpoznawana z coraz większą częstotliwością u pacjentów na OIT bez neutropenii, przede wszystkim po ciężkim przebiegu grypy oraz COVID-195. Istniejące algorytmy diagnostyczne aspergilozy łączą mało wydajne posiewy z testami na antygen galaktoMannanu (GM), jednak test GM jest ograniczony dobrze udokumentowanymi oknami diagnostycznymi oraz zmienną czułością u gospodarzy bez neutropenii6. Każda godzina opóźnienia w rozpoczęciu odpowiedniej terapii przeciwdrobnoustrojowej w sepsie wiąże się z mierzalnym wzrostem śmiertelności7. Biorąc to pod uwagę, szybkość i złożoność infekcji na OIT wymagają narzędzi diagnostycznych, które będą odpowiadać pilności klinicznej.
Standardowe posiewy mikrobiologiczne, choć niezbędne do badania wrażliwości, są zasadniczo ograniczone pod względem czasu: czas oczekiwania na wynik wynosi od 3 do 5 dni, pomijane są organizmy wymagające, a odsetek dodatnich wyników w posiewach grzybów pozostaje niski8. Metagenomiczne sekwencjonowanie nowej generacji (mNGS) stanowi obiektywną alternatywę, jednak jego wdrożenie kliniczne jest ograniczane przez koszty, czas przetwarzania wynoszący od 24 do 48 godzin, zależność od rurociągów bioinformatycznych oraz ograniczoną możliwość zastosowania w punkcie opieki nad pacjentem (point-of-care)9. Panele oparte na metodzie PCR skróciły ten przedział czasowy, ale wciąż wymagają wieloetapowej ekstrakcji kwasów nukleinowych, aparatury do cyklicznej zmiany temperatury oraz, w przypadku formatów konwencjonalnych, elektroforezy po amplifikacji10. Żadna z tych platform nie spełnia w pełni zbieżnych wymagań oddziałów intensywnej terapii: czasu analizy poniżej jednej godziny, minimalnego nakładu pracy manualnej, multipleksowego wykrywania patogenów, w tym grzybów, oraz prostoty operacyjnej wystarczającej dla personelu pozalaboratoryjnego.
Izotermiczna amplifikacja wspomagana pętlą (LAMP) rozwiązuje kilka z tych ograniczeń. Metoda ta, po raz pierwszy opisana przez Notomi i współpracowników, amplifikuje docelowe DNA w stałej temperaturze 65 °C przy użyciu zestawu od czterech do sześciu starterów rozpoznających sześć odrębnych regionów, przy udziale polimerazy o aktywności wypierającej nić11. Reakcja generuje charakterystyczne struktury amplikonów w formie pętli z łodygą oraz struktur przypominających kalafior, które są wykrywalne za pomocą fluorescencji w czasie rzeczywistym, co pozwala na uzyskanie krzywych w kształcie litery S w ciągu kilku minut od przekroczenia progu detekcji. Czułość przy niskich stężeniach matrycy jest wysoka, a zastosowanie wielu starterów zapewnia selektywność ograniczającą liczbę wyników fałszywie dodatnich12,13. W połączeniu z platformami mikroprzepływowymi metoda LAMP może być przeprowadzana równolegle dla wielu celów z jednej próbki14. Wcześniejsze prace wykazały, że systemy chipowe LAMP wykrywają patogeny układu oddechowego w czasie poniżej trzech godzin15. Kluczowym ograniczeniem tych systemów jest jednak zależność od oddzielnej, ręcznej ekstrakcji DNA, co wydłuża czas analizy, zwiększa złożoność operacyjną oraz ryzyko kontaminacji.
Opisany tutaj system eliminuje wspomniane wąskie gardło. Oparty na jednorazowym, dyskowym chipie mikrofluidycznym (o średnicy 86 mm), integruje on ładowanie próbki, oczyszczanie kwasów nukleinowych z wykorzystaniem kulek magnetycznych oraz 16-pleksową amplifikację LAMP w jednej szczelnej kasecie (Rycina 1). Operator wykonuje jedynie krótki, ręczny etap upłynniania i lizy przy użyciu specjalnie zaprojektowanej probówki procesowej, a następnie ładuje lizat oraz dwie fiolki z odczynnikami na chip (Rycina 2). Od tego momentu instrument autonomicznie przeprowadza ekstrakcję, amplifikację izotermiczną w temperaturze 65 °C oraz detekcję fluorescencji, dostarczając jakościowych wyników dla 15 klinicznie istotnych celów: 11 bakterii, 3 grzybów (Aspergillus spp., Candida albicans, Pneumocystis jirovecii) oraz 1 atypowego patogenu (Mycoplasma pneumoniae) w ciągu 45 min. Gen z rodziny neuroblastoma breakpoint family (NBPF), stosowany jako kontrola wewnętrzna, potwierdza odpowiedniość materiału oraz integralność reakcji w każdym badaniu. Niniejszy protokół zawiera instrukcje krok po kroku dla pełnego procesu roboczego – od pobrania próbki z oddziału intensywnej terapii (OIT), przez wstępne przetwarzanie, ładowanie chipa i zautomatyzowaną detekcję, aż po interpretację wyników – i jest przeznaczony zarówno dla personelu laboratoriów klinicznych, jak i zespołów przy łóżku pacjenta na OIT.
Protokół
Wszystkie próbki zostały pobrane zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komisję Rewizyjną ds. Etyki Szpitala Peking Union Medical College przy Chińskiej Akademii Nauk Medycznych (numer zatwierdzenia I-24PJ1778). Przed pobraniem materiału od każdego uczestnika lub jego prawnie upoważnionego przedstawiciela uzyskano pisemną zgodę. Panel patogenów docelowych oraz przypisania do studzienek reakcyjnych przedstawiono w Tabeli 1, natomiast materiały eksploatacyjne użyte podczas wstępnego przetwarzania próbek wymieniono w Tabeli 2.
1. Pobieranie próbek klinicznych z dolnych dróg oddechowych na oddziale intensywnej terapii
- Pobieranie plwociny
- Trzykrotnie przepłukać jamę ustną czystą wodą lub sterylną solą fizjologiczną, aby usunąć resztki pokarmowe i komensalną florę jamy ustnej.
- Polecić pacjentowi wykonanie dwóch do trzech głębokich wdechów, a następnie silne odkrztuszenie plwociny z dolnych dróg oddechowych bezpośrednio do sterylnego pojemnika na próbkę.
UWAGA: Właściwa próbka powinna składać się z materiału lepkiego, ropnego lub z pasmami krwi pochodzącego z obszaru poniżej tchawicy; czysta ślina lub wydzielina spływająca po tylnej ścianie gardła są niewystarczające i mogą upośledzić późniejszą detekcję.
- Pobieranie aspiratu oskrzelowego (BAS)
- W przypadku pacjentów nieintubowanych wprowadzić sterylny cewnik ssący (cewnik 10–12 Fr, z ciśnieniem ssania ustawionym na −0.0267 MPa, co odpowiada −200 mmHg) drogą nosową lub jamą ustną na głębokość około 30 cm.
- Zastosować ssanie, obracając cewnik, a następnie powoli go wycofać. Zebrane wydzieliny aspiracyjne przelać do sterylnej pułapki na próbki.
UWAGA: Jeśli wydzieliny są skąpe, przed ssaniem wprowadzić przez cewnik około 5 mL sterylnej soli fizjologicznej. - W przypadku pacjentów wentylowanych mechanicznie dobrać cewnik ssący odpowiednio do rozmiaru rurki endotrachealnej: użyć cewnika 10 Fr dla rurki 7.0–7.5 mm oraz cewnika 12 Fr dla rurki 8.0 mm.
- Przed ssaniem przeprowadzić preoksygenację pacjenta 100% tlenem przez 30–60 s. Odłączyć obwód respiratora i wprowadzić wybrany cewnik przez sztuczną drogę oddechową aż do napotkania oporu.
- Zastosować podciśnienie −0.0267 MPa (odpowiednik −200 mmHg), ograniczając każde przejście cewnika, a tym samym czas odłączenia od respiratora, do maksymalnie 15 s, aby zminimalizować derekrutację i hipoksemię, a po ssaniu ponownie podać pacjentowi 100% tlenu przez 30–60 s.
- Wprowadzić 1–2 mL sterylnej soli fizjologicznej przez cewnik i odczekać 3 s.
- Zastosować ssanie i wycofać cewnik. Zebrane wydzieliny aspiracyjne przelać do sterylnej pułapki na próbki. Natychmiast po pobraniu próbki ponownie podłączyć obwód respiratora.
UWAGA: Przez cały czas niezbędne jest ścisłe przestrzeganie zasad aseptyki, aby uniknąć zakażenia próbki patogenami szpitalnymi.
- Pobieranie płynu z płukania pęcherzykowo-oskrzelowego (BALF)
- Zidentyfikować docelowy segment na obrazie klatki piersiowej. Przesunąć bronchoskop i umieścić go w odpowiednim oskrzelu segmentowym lub podsegmentowym.
- Szybko wprowadzać sterylna sól fizjologiczną w porcjach 20–50 mL, powtórzyć czynność 3–5 razy (łącznie 60–120 mL). Po każdej porcji zastosować delikatne ssanie, a następnie zebrać odzyskany płyn do sterylnego, szczelnego pojemnika.
OSTROŻNIE: Podczas BAL u pacjentów na OIT obowiązkowe jest ciągłe monitorowanie hemodynamiczne i wentylacyjne. W przypadku osób wentylowanych mechanicznie dostosować ustawienia respiratora w razie potrzeby.
UWAGA: Typowy odzysk stanowi 40–60% wprowadzonej objętości. Słaby powrót płynu może wymagać ponownego ustawienia końcówki bronchoskopu.
2. Upłynnianie i liza patogenów
- Za pomocą jednorazowej pipety nr 2 pobierz próbkę do zaznaczonej linii (około 1 mL) i przenieś ją do probówki do upłynniania. Wielokrotnie ściskaj gruszkę pipety, aby przenieść cały materiał lepki, a następnie zakręć probówkę.
UWAGA: W przypadku BALF lub wodnistego plwocin pobierz dwie objętości pipety, aby zapewnić wystarczającą ilość patogenów. - Energicznie wstrząśnij probówką do upłynniania ręcznie przez 1 min. Obejrzyj próbkę wizualnie i kontynuuj wstrząsanie, aż do momentu, gdy nie będą widoczne grudki śluzu, a próbka będzie swobodnie przepływać przez jednorazową pipetę nr 1 bez oporu (jednorodna, wodnista konsystencja). Wstrząsaj przez co najmniej 1 min, wydłużając ten czas w razie potrzeby dla próbek o wysokiej lepkości, aż do spełnienia tych kryteriów.
- Otwórz zakrętkę uszczelniającą probówki do lizy.
- Pobierz około 0,5 mL zhomogenizowanej próbki za pomocą jednorazowej pipety nr 1 i przenieś próbkę do probówki do lizy.
- Zamknij zakrętkę uszczelniającą i upewnij się, że nakrętka końcówki jest mocno dokręcona.
- Umieść probówkę do lizy w urządzeniu do wstępnego przetwarzania próbek (urządzenie SP), naciskając w dół, aż zostanie stabilnie osadzona. Naciśnij Start.
- Poczekaj, aż urządzenie SP zakończy automatyczny cykl upłynniania i lizy (parametry w Tabeli 3) trwający około 15 min.
UWAGA: Nie otwieraj ani nie wyjmuj probówki podczas przetwarzania.
3. Załadunek chipa i detekcja zautomatyzowana
- Ładowanie odczynników i próbki
- Wyjąć chip CD z przechowywania w 4 °C i wyrównać jego temperaturę do temperatury pokojowej (około 25 °C) przez 10 min.
UWAGA: Fiolki z odczynnikami O i B oraz wstępnie przetworzony lizat są wykorzystywane w temperaturze pokojowej; amplifikacja LAMP na chipie jest przeprowadzana w 65 °C (patrz krok 3.2.3 i Tabela 3). - Otworzyć foliową torebkę i położyć chip na płaskiej powierzchni.
- Obrócić nakrętkę przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby otworzyć chip.
- Strząsnąć fiolkę O, aby zebrać ciecz na dnie naczynia.
- Zdjąć nakrętkę z fiolki O, włożyć dyszę do portu O i dozować całą zawartość do portu.
- Wyrzucić fiolkę O. Powtórzyć procedurę, używając fiolki B i portu B.
- Wyjąć probówkę z przetworzonym lizatem z urządzenia SP i zdjąć zatyczkę z końcówki.
- dopasować końcówkę probówki do portu S i dozować całą objętość lizatu do chipu.
- Wyrzucić zużytą probówkę do lizy.
- Obrócić nakrętkę chipu zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż dwa słyszalne kliknięcia potwierdzą całkowite uszczelnienie.
UWAGA: Niepełne napełnienie któregokolwiek z portów może spowodować awarię poszczególnych kanałów. Przed uszczelnieniem należy potwierdzić całkowite dozowanie. Aby uniknąć niepełnego uszczelnienia i ryzyka kontaminacji, nie należy nosić rękawiczek z PE podczas zakręcania nakrętki; zaleca się zamiast nich rękawiczki lateksowe lub nitrylowe.
- Wyjąć chip CD z przechowywania w 4 °C i wyrównać jego temperaturę do temperatury pokojowej (około 25 °C) przez 10 min.
- Obsługa urządzenia
- Włączyć zautomatyzowany analizator kwasów nukleinowych. Dotknąć opcji Detect, zeskanować kod kreskowy na foliowej torebce chipu, a następnie wprowadzić dane demograficzne pacjenta i ID próbki.
- Zamontować chip na wrzecionie obrotowym i docisnąć, aż kliknięcie potwierdzi zablokowanie.
- Dotknąć opcji Start. Urządzenie autonomicznie wykonuje odśrodkową dystrybucję odczynników, ekstrakcję za pomocą kulek magnetycznych, amplifikację LAMP w 65 °C oraz akwizycję fluorescencji. Czas przebiegu wynosi około 45 min (ładowanie odczynników/próbki oraz schemat pracy urządzenia przedstawiono na Rysunek 3).
UWAGA: Nie otwierać pokrywy podczas pracy urządzenia.
- Interpretacja wyników
- Oprogramowanie identyfikuje punkt przegięcia każdej S-kształtnej krzywej amplifikacji za pomocą analizy maksimum drugiej pochodnej i raportuje odpowiadającą jej wartość TP (czas do uzyskania dodatniego wyniku).
- Porównać każdą wartość TP z odpowiednim progiem wymienionym w Tabeli 4. Kanały z wartościami TP równymi lub niższymi od progu zaklasyfikować jako dodatnie, a kanały z wartościami TP powyżej progu jako ujemne.
- Zweryfikować, czy kanał kontroli wewnętrznej (dołek 16) wykazuje S-kształtną krzywą amplifikacji z wartością TP poniżej 12 min.
- Odrzucić wynik przebiegu, jeśli kontrola wewnętrzna nie zadziałała. Powtórzyć badanie, używając nowego chipu, lub ponownie pobrać materiał.
Wyniki
Po zakończeniu poprawnego przebiegu instrument wyświetlił ślady fluorescencji w czasie rzeczywistym dla wszystkich 16 kanałów. Kanały dodatnie wykazały oczekiwaną S-kształtną kinetykę amplifikacji z automatycznie naniesionymi wartościami TP, podczas gdy kanały ujemne pozostały na poziomie linii bazowej. Kanał IC (dołek 16) generował krzywą S-kształtną z TP < 12 min we wszystkich poprawnych przebiegach.
W ramach pilotażowej demonstracji koncepcji protokołu wybrano 10 reprezentatywnych próbek, aby zilustrować zakres scenariuszy klinicznych spotykanych w praktyce OIT, w tym 6 aspiratów z oskrzeli (BAS), 2 próbki płynu z płukania pęcherzykowo-oskrzela (BALF) oraz 2 próbki głębokiej plwociny (Spt). Próbki te zostały celowo dobrane tak, aby obejmowały przypadki monomikrobowe i złożone polymikrobowe, a nie w celu oszacowania rozpowszechnienia patogenów; 8 z 10 próbek było polymikrobowych (od 2 do 7 celów w każdej), a 2 były monomikrobowe. Pełne dane TP przedstawiono w Tabeli 5, a reprezentatywne krzywe amplifikacji pokazano na Rysunku 4.
Na jednym z krańców spektrum złożoności próbka S1 (BAS) wygenerowała pojedynczy sygnał dodatni dla Aspergillus spp. (TP = 8 min), podczas gdy wszystkie kanały bakteryjne pozostały ujemne. Wzorzec ten był zgodny z izolowaną inwazyjną aspergilozą – diagnozą, której konwencjonalne posiewy często nie są w stanie szybko wykryć. Próbka S10 (Spt) w podobny sposób dała pojedynczy wynik dodatni dla Streptococcus pneumoniae (TP = 5,5 min). Wyniki te wykazały zdolność testu do identyfikacji infekcji monomikrobowych na tle 15 celów patogennych.
W pozostałych próbkach zaobserwowano infekcje polimikrobiologiczne, co jest zgodne z epidemiologią infekcji dróg oddechowych u pacjentów na oddziałach intensywnej terapii. Próbki S2–S5 zawierały każda Aspergillus spp. wraz z jednym lub więcej patogenów bakteryjnych, a w dwóch próbkach stwierdzono obecność Candida albicans. Najbardziej złożona próbka, S5 (BALF), wygenerowała siedem jednoczesnych sygnałów dodatnich, w tym dla Aspergillus spp., Burkholderia cepacia, Corynebacterium striatum, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus oraz Stenotrophomonas maltophilia. Wyniki te zademonstrowały zdolność do detekcji multipleksowej 16-dołkowego chipu mikroprzepływowego w warunkach testów klinicznych.
Próbki S6–S9, w których stwierdzono koinfekcje bakteryjne bez udziału grzybów, wykazały wykrywalność od dwóch patogenów (S6: B. cepacia i E. coli) do czterech patogenów (S8: Acinetobacter baumannii, B. cepacia, Klebsiella pneumoniae oraz S. maltophilia). We wszystkich 10 próbkach wartości TP dla kanałów dodatnich mieściły się w zakresie 3,5–9 min, a wszystkie kanały kontroli wewnętrznej spełniły zdefiniowane kryterium ważności TP < 12 min.
W przypadku tego zestawu pilotażowego wyniki z chipa porównano z dwiema metodami referencyjnymi, przeprowadzonymi równolegle na tych samych 10 próbkach: ukierunkowanym metagenomicznym sekwencjonowaniem następnej generacji (tNGS) oraz konwencjonalną hodowlą plwociny. Zgodność dla poszczególnych celów w 15 kanałach patogenów podsumowano w Tabeli 6. W odniesieniu do tNGS, test wykazał 100% procentową zgodność pozytywną (PPA) oraz 100% procentową zgodność negatywną (NPA) dla wszystkich celów w tych próbkach. W odniesieniu do hodowli plwociny, PPA wynosiła 100% dla każdego celu dodatniego w hodowli, natomiast NPA wahała się od 44,4% do 100%; niższe wartości NPA odzwierciedlały cele wykryte przez chip (oraz przez tNGS), ale nieodzyskane w hodowli, co jest zgodne z wyższą czułością analityczną amplifikacji kwasów nukleinowych w porównaniu z hodowlą, a nie z fałszywą pozytywnością. Biorąc pod uwagę małą, celowo dobraną próbę, wartości te są opisowymi szacunkami zgodności dla kohorty pilotażowej i nie mają na celu służyć jako formalne miary dokładności diagnostycznej. Ponieważ tNGS jest również metodą opartą na kwasach nukleinowych, zgodność z tNGS potwierdza zgodność na poziomie kwasów nukleinowych, a nie ustala stanu klinicznego każdego organizmu; żadna z tych metod samodzielnie nie odróżnia prawdziwej infekcji od kolonizacji.
Rysunek 1: Architektura chipa mikrofluidycznego oraz powiązane materiały eksploatacyjne. (A) Przegląd dyskowego chipa o średnicy 86 mm, przedstawiający trzy koncentryczne strefy: obszar ładowania, pośredni obszar oczyszczania za pomocą kulek magnetycznych oraz zewnętrzny obszar amplifikacji i detekcji. (B) Zewnętrzny pierścień amplifikacji zawierający 16 studzienek reakcyjnych (oznaczono pozycje 1, 4, 8, 12 i 16). (C) Elementy probówki do lizy (nasadka końcówki, zakrętka uszczelniająca i korpus probówki). (D) Fiolki z odczynnikami w pojedynczych dawkach „O” i „B”. (E) Obszar ładowania przedstawiający studzienkę na próbkę „S” oraz studzienki na odczynniki „O” i „B”. Skróty: O = odczynnik O; B = odczynnik B; S = próbka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Zestaw do wstępnego przetwarzania i schemat przygotowania próbki. (A) Próbkę przenosi się do probówki do upłynniania i homogenizuje poprzez ręczne wstrząsanie. (B>) Zhomogenizowaną próbkę przenosi się z probówki do upłynniania do probówki do lizy. (C) Probówkę do lizy umieszcza się w urządzeniu do wstępnego przetwarzania próbek (SP) w celu przeprowadzenia automatycznego cyklu upłynniania i lizy. (D) Zużywalne materiały do wstępnego przetwarzania: jednorazowe pipety nr 1 i nr 2 (czerwone strzałki wskazują oznaczenia poziomu załadunku próbki), probówka do lizy oraz probówka do upłynniania. Skrót: SP = Sample preprocessing (wstępne przetwarzanie próbek). Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rysunek 3: Schemat ładowania chipu i zautomatyzowanego procesu detekcji. (A) Fiolka z odczynnikiem O, fiolka z odczynnikiem B oraz przetworzona próbka są umieszczane w odpowiednich portach chipu (O, B i S). (B) Chip zostaje złożony i zapieczętowany. (C) Chip jest montowany w automatycznym analizatorze kwasów nukleinowych, a następnie skanowany jest kod kreskowy. (D) Analiza jest uruchamiana za pomocą ekranu dotykowego, po czym automatycznie przebiegają etapy ekstrakcji kwasów nukleinowych, amplifikacji i detekcji fluorescencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Reprezentatywne krzywe amplifikacji uzyskane z 10 próbek z dolnych dróg oddechowych pobranych od pacjentów z OIOM. Każdy panel przedstawia pojedynczą próbkę (S1–S10). Krzywe amplifikacji w kształcie litery S wskazują na obecność docelowych sekwencji z naniesionymi wartościami TP, natomiast płaskie linie wskazują na wyniki negatywne. Próbka S1 zawierała wyłącznie Aspergillus spp.; próbki S2–S5 zawierały Aspergillus spp. wraz z patogenami bakteryjnymi i/lub Candida albicans; próbki S6–S9 zawierały polimikrobowe zakażenia bakteryjne; a próbka S10 zawierała wyłącznie Streptococcus pneumoniae. Odpowiadające im wartości TP znajdują się w Tabeli 5. Skróty: Aba = Acinetobacter baumannii; Asp = Aspergillus spp.; Bcc = Burkholderia cepacia; Cal = Candida albicans; Cst = Corynebacterium striatum; Eco = Escherichia coli; Hin = Haemophilus influenzae; IC = kontrola wewnętrzna; Kpn = Klebsiella pneumoniae; Lpn = Legionella pneumophila; Mpn = Mycoplasma pneumoniae; Pae = Pseudomonas aeruginosa; Pji = Pneumocystis jirovecii; Sau = Staphylococcus aureus; Sma = Stenotrophomonas maltophilia; Spn = Streptococcus pneumoniae. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| Studnia | Cel | Skrót | Kategoria | Typ |
| 1 | Acinetobacter baumannii | Aba | Bakterie | Bakteria |
| 2 | Aspergillus spp. | Asp | Grzyby | Grzyb |
| 3 | Burkholderia cepacia | Bcc | Bakterie | Bakteria |
| 4 | Candida albicans | Kalibracja | Grzyby | Grzyb |
| 5 | Corynebacterium striatum | Cst | Bakterie | Bakteria |
| 6 | *Escherichia coli* | Ekologiczny | Bakterie | Bakteria |
| 7 | *Haemophilus influenzae* | HNT | Bakterie | Bakteria |
| 8 | *Klebsiella pneumoniae* | Kpn | Bakterie | Bakteria |
| 9 | Legionella pneumophila | Lpn | Bakterie | Bakteria |
| 10 | Mycoplasma pneumoniae | Mpn | Atopowy | Bakteria atypowa |
| 11 | Pseudomonas aeruginosa | Pae | Bakterie | Bakteria |
| 12 | Pneumocystis jirovecii | Pji | Grzyby | Grzyb |
| 13 | Staphylococcus aureus | Sau | Bakterie | Bakteria |
| 14 | Stenotrophomonas maltophilia | Sma | Bakterie | Bakteria |
| 15 | Streptococcus pneumoniae | Spn | Bakterie | Bakteria |
| 16 | NBPF (kontrola wewnętrzna) | IC | kontrola wewnętrzna | Kontrola wewnętrzna |
Tabela 1: Panel patogenów docelowych i przypisanie studzienek reakcyjnych.
| Materiały zużywalne | Specyfikacja / objętość | Funkcja |
| Probówka do upłynniania | 2 ml/probówka | Odbiór próbki; homogenizacja ręczna |
| Probówka do lizy | 0,5 ml/probówkę | Ściśliwalny korpus silikonowy z 200 µm membrana filtracyjna; gotowe odczynniki lizujące |
| #1 pipeta jednorazowa | 0,5 ml | Przenosi zhomogenizowany preparat do probówki do lizy |
| #2 jednorazowa pipeta | 2 ml | Aspiracja próbki do zaznaczonej linii w probówce do upłynniania |
Tabela 2: Specyfikacje materiałów eksploatacyjnych użytych podczas wstępnego przetwarzania próbek.
| Krok | Temperatura | Czas trwania |
| Upłynnianie | 50 °C | 10 min |
| Lizaza patogenów | 95 °C | 5 min |
| Całkowity cykl | — | ~15 min |
Tabela 3: Parametry operacyjne cyklu urządzenia do wstępnego przetwarzania próbek (SP).
| Cel | Próg TP (min) | Reguła klasyfikacji |
| Acinetobacter baumannii | 13 | TP ≤ próg = wynik dodatni |
| Aspergillus spp. | 15.5 | TP ≤ próg = wynik dodatni |
| Burkholderia cepacia | 12.5 | TP ≤ próg = wynik dodatni |
| Candida albicans | 13.5 | TP ≤ próg = wynik dodatni |
| Corynebacterium striatum | 13 | TP ≤ próg = wynik dodatni |
| Escherichia coli | 12 | TP ≤ próg = wynik dodatni |
| Haemophilus influenzae | 13.5 | TP ≤ próg = wynik dodatni |
| Klebsiella pneumoniae | 15.5 | TP ≤ próg = wynik dodatni |
| Legionella pneumophila | 14.5 | TP ≤ próg = wynik dodatni |
| Mycoplasma pneumoniae | 14 | TP ≤ próg = wynik dodatni |
| Pseudomonas aeruginosa | 12 | TP ≤ próg = wynik dodatni |
| Pneumocystis jirovecii | 14.5 | TP ≤ próg = wynik dodatni |
| Staphylococcus aureus | 15.5 | TP ≤ próg = wynik dodatni |
| Stenotrophomonas maltophilia | 12 | TP ≤ próg = wynik dodatni |
| Streptococcus pneumoniae | 14.5 | TP ≤ próg = wynik dodatni |
| NBPF (kontrola wewnętrzna) | 12 | Analiza prawidłowa, jeśli TP < 12 min |
Tabela 4: Wartości progowe TP użyte do klasyfikacji celu.
| Próbka | Typ | Wykryty cel | TP (min) | Hodowla / tNGS (odczyty) |
| S1 | BAS | Aspergillus spp. | 8 | + / 1,253 |
| S2 | BAS | Aspergillus spp. | 7.5 | – / 3,877 |
| Pseudomonas aeruginosa | 4 | + / 55,039 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 6.5 | – / 3,087 | ||
| S3 | BAS | Aspergillus spp. | 5.5 | + / 6,145 |
| Burkholderia cepacia | 6 | – / 3,221 | ||
| Candida albicans | 7.5 | – / 3,280 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 6 | + / 13,189 | ||
| S4 | BALF | Acinetobacter baumannii | 6.5 | + / 10,485 |
| Aspergillus spp. | 7.5 | – / 4,432 | ||
| Burkholderia cepacia | 5.5 | – / 1,676 | ||
| Candida albicans | 8.5 | – / 576 | ||
| S5 | BALF | Aspergillus spp. | 7.5 | + / 2,869 |
| Burkholderia cepacia | 4 | – / 6,532 | ||
| Corynebacterium striatum | 5.5 | – / 71,839 | ||
| Escherichia coli | 7 | – / 1,891 | ||
| Pseudomonas aeruginosa | 4 | + / 31,386 | ||
| Staphylococcus aureus | 6.5 | – / 26,683 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 4 | + / 21,467 | ||
| S6 | BAS | Burkholderia cepacia | 5.5 | – / 1,984 |
| Escherichia coli | 5.5 | + / 8,005 | ||
| S7 | BAS | Acinetobacter baumannii | 5.5 | + / 28,007 |
| Burkholderia cepacia | 4 | + / 3,585 | ||
| Haemophilus influenzae | 6.5 | – / 8,912 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 6 | – / 8,865 | ||
| S8 | BAS | Acinetobacter baumannii | 5.5 | – / 43,721 |
| Burkholderia cepacia | 4 | – / 53,796 | ||
| Klebsiella pneumoniae | 3.5 | + / 23,757 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 4 | – / 26,898 | ||
| S9 | Spt | Haemophilus influenzae | 9 | – / 3,636 |
| Staphylococcus aureus | 8.5 | + / 1,918 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 8.5 | – / 872 | ||
| S10 | Spt | Streptococcus pneumoniae | 5.5 | – / 29,893 |
Tabela 5: Wyniki detekcji oraz wartości TP dla 10 reprezentatywnych próbek z dolnych dróg oddechowych pobranych od pacjentów na OIT.
| Cel | tNGS + | POCT + | tNGS − | POCT − | PPA | NPA | (SC) PPA/NPA |
| Acinetobacter baumannii | 3 | 3 | 7 | 7 | 100% | 100% | 100% / 87.5% |
| Aspergillus spp. | 5 | 5 | 5 | 5 | 100% | 100% | 100% / 71.4% |
| Burkholderia cepacia | 6 | 6 | 4 | 4 | 100% | 100% | 100% / 44.4% |
| Candida albicans | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | – / 80.0% |
| Corynebacterium striatum | 1 | 1 | 9 | 9 | 100% | 100% | 100% / 100% |
| Escherichia coli | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | 100% / 88.9% |
| Haemophilus influenzae | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | – / 80.0% |
| Klebsiella pneumoniae | 1 | 1 | 9 | 9 | 100% | 100% | 100% / 100% |
| Legionella pneumophila | 0 | 0 | 10 | 10 | – | 100% | – / 100% |
| Mycoplasma pneumoniae | 0 | 0 | 10 | 10 | – | 100% | – / 100% |
| Pseudomonas aeruginosa | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | 100% / 100% |
| Pneumocystis jirovecii | 0 | 0 | 10 | 10 | – | 100% | – / 100% |
| Staphylococcus aureus | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | 100% / 88.9% |
| Stenotrophomonas maltophilia | 6 | 6 | 4 | 4 | 100% | 100% | 100% / 50.0% |
| Streptococcus pneumoniae | 1 | 1 | 9 | 9 | 100% | 100% | – / 90.0% |
Tabela 6: Zgodność testu z celowanym metagenomicznym sekwencjonowaniem nowej generacji (tNGS) i konwencjonalną hodowlą plwociny dla poszczególnych celów w 10 reprezentatywnych próbkach.Dla każdego z 15 celów patogennych przedstawiono liczbę wyników dodatnich i ujemnych dla każdej metody oraz wynikającą z nich procentową zgodność dodatnią (PPA) i procentową zgodność ujemną (NPA). Skróty: PPA = procentowa zgodność dodatnia; NPA = procentowa zgodność ujemna; tNGS = celowane metagenomiczne sekwencjonowanie nowej generacji; PPA/NPA przedstawione jako „/” w przypadku braku dostępnych referencyjnych wyników dodatnich (lub ujemnych).
| Nr | Patogen | LoD (kopii/mL) |
| 1 | Acinetobacter baumannii | 1,000 |
| 2 | Aspergillus spp. | 2,000 |
| 3 | Burkholderia cepacia | 2,000 |
| 4 | Candida albicans | 1,000 |
| 5 | Corynebacterium striatum | 1,000 |
| 6 | Escherichia coli | 4,000 |
| 7 | Haemophilus influenzae | 2,000 |
| 8 | Klebsiella pneumoniae | 4,000 |
| 9 | Legionella pneumophila | 2,000 |
| 10 | Mycoplasma pneumoniae | 1,000 |
| 11 | Pseudomonas aeruginosa | 2,000 |
| 12 | Pneumocystis jirovecii | 1,000 |
| 13 | Staphylococcus aureus | 2,000 |
| 14 | Stenotrophomonas maltophilia | 2,000 |
| 15 | Streptococcus pneumoniae | 4,000 |
| 16 | Kontrola wewnętrzna (NBPF) | Nie dotyczy (kontrola wewnętrzna) |
Tabela 7: Analityczna granica wykrywalności (LoD) dla każdego celu panelu. LoD określono przy użyciu genomowego kwasu nukleinowego zmierzonego metodą digital-PCR, dodanego do negatywnej macierzy płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, rozcieńczonego seryjnie i przetestowanego w trzech powtórzeniach; zdefiniowano ją jako najniższe stężenie wykryte w co najmniej 95% powtórzeń. Wartości podano w copies/mL. Skrót: LoD = granica wykrywalności.
| Kryterium | POCT (niniejszy test) | Posiew plwociny | Konwencjonalny PCR | mNGS |
| Czas oczekiwania na wynik | ~1 h | 2–5 dni | 4–8 h | > 24 h |
| Wymagane umiejętności operatora | Niskie | Wysokie | Wysokie | Wysokie |
| Wymagania laboratoryjne | Niskie; przy łóżku pacjenta | Wysokie; laboratorium bakteriologiczne | Wysokie; laboratorium PCR | Wysokie; specjalistyczna placówka |
| Nakłady na sprzęt | Niskie–umiarkowane | Niskie | Umiarkowane | Wysokie |
| Koszt pojedynczego testu | Umiarkowany | Niski | Umiarkowany | Wysoki |
| Czułość analityczna | Wysoka | Niska | Wysoka | Wysoka |
| Główna zaleta | Pełna integracja, system sample-in/result-out, brak konieczności specjalistycznej obsługi | Standard referencyjny; określa wrażliwość na antybiotyki | Wysoka czułość; metoda ilościowa | Obiektywność; wykrywanie rzadkich/nieoczekiwanych patogenów; rozstrzyganie trudnych przypadków |
Tabela 8: Porównanie jakościowe obecnego testu w punkcie opieki (point-of-care) z hodowlą plwociny, konwencjonalnym PCR oraz sekwencjonowaniem metagenomicznym.Metody porównano pod kątem czasu uzyskania wyniku, wymaganych umiejętności operatora, wymagań dotyczących infrastruktury laboratoryjnej, inwestycji w sprzęt, kosztu pojedynczego testu, czułości analitycznej oraz głównych zalet. Skróty: POCT = testy w punkcie opieki; PCR = reakcja łańcuchowa polimerazy; mNGS = metagenomiczne sekwencjonowanie następnej generacji.
Dyskusja
Szybka identyfikacja patogenów jest kluczowa w zarządzaniu infekcjami na oddziałach intensywnej terapii (OIT). System opisany w niniejszym opracowaniu skraca czas identyfikacji patogenów z 3–5 dni zazwyczaj wymaganych przy hodowli do mniej niż 1 godziny, co jest przedziałem czasowym, w którym często podejmuje się decyzje dotyczące stosowania leków przeciwdrobnoustrojowych pierwszego rzutu7. Dzięki zintegrowaniu ekstrakcji kwasów nukleinowych, oczyszczania oraz amplifikacji 16-plex LAMP w obrębie jednego szczelnego chipa, ten schemat postępowania eliminuje etap ręcznej ekstrakcji DNA, który stanowił główną wąską gardło operacyjne wcześniejszych platform chipów LAMP15. W efekcie uzyskano pojedynczą procedurę załadunku, którą może przeprowadzić personel bez specjalistycznego szkolenia z zakresu biologii molekularnej.
Kilka aspektów proceduralnych wymaga szczególnej uwagi. Jakość próbki jest kluczowa. Próbki z głębokich dróg oddechowych, takie jak aspirat oskrzelowy lub płyn z laważu pęcherzykowo-oskrzelowego, są preferowane nad odpluwaną plwociną u pacjentów wentylowanych, u których zanieczyszczenie orofaringealne może zamaskować sygnał rzeczywistego patogenu. Niepełne upłynnienie jest najczęstszą przyczyną suboptimalnej lizy, dlatego ręczne wstrząsanie powinno być kontynuowane do momentu, aż próbka wyraźnie osiągnie wodnistą konsystencję. Podczas ładowania chipa niepełne opróżnienie fiolki z odczynnikiem lub probówki do lizy może pozbawić dalszych studzienek wymaganego materiału wejściowego, co prowadzi do awarii specyficznych dla kanału, które mogą zostać błędnie zinterpretowane jako wyniki negatywne. Ponadto dwukrotne kliknięcie przy zamykaniu zakrętki chipa nie jest jedynie cechą mechaniczną; jest ono niezbędne do utrzymania szczelnej przestrzeni nad próbką wymaganej dla amplifikacji izotermicznej oraz do zapobiegania stratom wskutek odparowania.
Rozwiązywanie problemów jest stosunkowo proste. Bardzo lepka plwocina z oddziału intensywnej terapii może wymagać ręcznego wstrząsania przez czas dłuższy niż zalecana 1 min. Rozcieńczone próbki, w szczególności płyn z płukania Dealerów pęcherzyków płucnych (BAL), mogą wymagać naniesienia w podwójnej standardowej objętości pipetowania, aby zrekompensować niższą gęstość patogenów. Niepowodzenie kontroli wewnętrznej, definiowane jako brak krzywej amplifikacji w kształcie litery S lub wartość TP przekraczająca 12 min, wskazuje albo na niewystarczającą komórkowość próbki, albo na awarię przepływu wewnątrz chipa. W takich przypadkach odpowiednim działaniem jest pobranie nowej próbki lub powtórzenie badania przy użyciu nowego chipa, zamiast reinterpretacji poszczególnych kanałów.
Metoda ta posiada również istotne ograniczenia. Panel ogranicza się do 15 predefiniowanych celów, a organizmy spoza tej listy, w tym wiele determinantów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, nie mogą zostać wykryte. Każdy zestaw starterów celuje w konserwowany, gatunkowo specyficzny region docelowego organizmu, z wyjątkiem testu na poziomie rodzaju Aspergillus; w związku z tym gatunki lub szczepy niewykazane w panelu nie są wykrywane, a panel nie obejmuje zmienności wewnątrzgatunkowej na poziomie szczepów. Ponieważ każde z 16 dołków zawiera dedykowany liofilizowany zestaw starterów, panel jest modułowy i może zostać przekonfigurowany w przyszłych wersjach w celu dodania kolejnych celów.
Wynik testu ma charakter jakościowy. Choć wartości TP mogą wykazywać pewną zależność od ilości patogenów, nie mogą one zastąpić ilościowych wyników posiewu ani szacunków opartych na PCR pochodzących z wartości progu cyklu. Podobnie jak w przypadku każdego testu amplifikacji kwasów nukleinowych wykonywanego na próbkach z dróg oddechowych, test ten nie pozwala samodzielnie odróżnić kolonizacji od rzeczywistego zakażenia. Interpretacja kliniczna musi zatem integrować wyniki z chipa z markerami stanu zapalnego, takimi jak białko C-reaktywne i prokalcytonina, wynikami obrazowania, biomarkerami grzybiczymi, w tym galaktomananem i (1,3)-β-D-glukanem, oraz ogólnym przebiegiem klinicznym. Ponadto system nie dostarcza danych dotyczących wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe, a w tym celu niezastąpiony pozostaje konwencjonalny posiew.
Wreszcie, wszystkie próbki objęte niniejszym badaniem pobrano z jednego oddziału intensywnej terapii trzeciego stopnia, a częstość występowania patogenów i wzorce koinfekcji mogą różnić się w zależności od placówki i populacji pacjentów. Niniejsza praca powinna zatem być traktowana jako pilotażowa demonstracja koncepcji (proof-of-concept) protokołu na małym, celowo dobranym zestawie reprezentatywnych próbek; nie była ona zaprojektowana w celu oszacowania dokładności diagnostycznej. Czułość i swoistość kliniczna dla poszczególnych celów, a także systematyczna zgodność z konwencjonalną hodowlą i metagenomicznym sekwencjonowaniem następnej generacji (mNGS), zostaną określone w planowanym prospektywnym, wieloośrodkowym badaniu z kolejnym naborem uczestników.
Jako wstępny pomiar wydajności analitycznej, granicę wykrywalności (LoD) dla każdego celu oszacowano przy użyciu kwasów nukleinowych genomowych o ilości określonej metodą digital-PCR, dodanych do negatywnej matrycy płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego. Próbki poddano rozcieńczeniom seryjnym i analizowano w trzech powtórzeniach. LoD zdefiniowano jako najniższe stężenie wykryte w co najmniej 95% powtórzeń. Wynikowe wartości LoD dla całego panelu mieściły się w przedziale od 1 000 do 4 000 copies/mL (Tabela 7). Ponieważ w tym badaniu pilotażowym nie było dostępnej ilościowej analizy każdego organizmu opartej na zliczaniu kolonii, szacunki LoD zostaną doprecyzowane w przyszłych pracach z wykorzystaniem formalnie zliczonych szczepów referencyjnych.
Porównanie z istniejącymi podejściami diagnostycznymi dodatkowo wyjaśnia pozycję tej platformy. Tradycyjne hodowle, choć powolne, pozostają standardem referencyjnym i dostarczają informacji o wrażliwości na leki. Metagenomiczne sekwencjonowanie następnej generacji oferuje znacznie szerszy zakres wykrywanych organizmów, ale wiąże się z istotnie wyższym kosztem, dłuższym czasem oczekiwania na wynik (zazwyczaj 24–48 h) oraz wymaganiami bioinformatycznymi, których wiele oddziałów intensywnej terapii nie jest w stanie zapewnić na miejscu9. Standardowe panele multipleksowej reakcji PCR skracają czas uzyskania wyniku, jednak zazwyczaj nadal wymagają oddzielnej ekstrakcji kwasów nukleinowych i, w zależności od platformy, przetwarzania seryjnego, co może wprowadzić dodatkowe opóźnienia10.
Z perspektywy kosztów, choć formalna analiza efektywności kosztowej wykraczała poza zakres tego badania pilotażowego, platforma ta odnosi się do głównych czynników generujących koszty w rzeczywistych warunkach na OIOM-ie, obejmując zarówno posiewy, jak i konwencjonalne lub multipleksowe PCR (porównanie jakościowe różnych metod przedstawiono w Tabeli 8). Wyniki są dostępne w około 1 h, w porównaniu do 2–5 dni w przypadku posiewu plwociny, 4–8 h dla konwencjonalnego PCR (który zazwyczaj wymaga przetwarzania partiami) oraz >24 h dla sekwencjonowania metagenomicznego. Ponieważ cały proces jest w pełni zintegrowany (od próbki do wyniku), wymagany jest jedynie jeden manualny krok załadunku bez osobnej ekstrakcji kwasów nukleinowych; badanie można wykonać przy łóżku pacjenta bez potrzeby posiadania dedykowanego laboratorium bakteriologicznego lub molekularnego oraz wyspecjalizowanego personelu biologii molekularnej. Ponadto zastosowano zamknięty, jednorazowy wkład, co ogranicza konieczność powtarzania testów z powodu zanieczyszczeń. Koszty sprzętu są również niewielkie, co pozwala uniknąć konieczności zakupu urządzenia do ilościowego PCR w czasie rzeczywistym lub platformy do sekwencjonowania. W przypadku pacjentów w stanie krytycznym na OIOM-ie tak szybki czas uzyskania wyników może skrócić czas trwania niewłaściwej terapii empirycznej i zmniejszyć długość pobytu w szpitalu, co stanowi pośrednią, ale potencjalnie znaczącą korzyść ekonomiczną.
Obecny system zajmuje odrębną niszę zdefiniowaną przez szybki czas uzyskania wyniku, prostotę obsługi oraz bezpieczeństwo biologiczne zapewnione przez zamknięty kartridż, co łącznie umożliwia wdrożenie procedury przy łóżku pacjenta. Włączenie trzech celów grzybiczych jest szczególnie istotną cechą. Wykryto Aspergillus spp. w 5 z 10 próbek (zakres TP: 5,5–8 min). Biorąc pod uwagę znane ograniczenia hodowli oraz ograniczony okno diagnostyczne testów galaktomananowych w kierunku Aspergillus5,6, sygnał molekularny dostępny w ciągu 45 min może pozwolić na wcześniejsze rozważenie celowanej terapii przeciwgrzybiczej, choć wartość kliniczna tego wcześniejszego sygnału będzie musiała zostać ustalona w badaniach prospektywnych.
Kierunki przyszłych badań są oczywiste. Rozszerzenie panelu o kluczowe determinanty oporności, a w szczególności o geny karbapenemaz i mecA, pomogłoby wypełnić lukę między identyfikacją patogenu a empirycznym doborem środków przeciwdrobnoustrojowych. Ponadto, wraz ze wzrostem zbiorów danych TP, modele uczenia maszynowego trenowane na sparowanych profilach amplifikacji i metadanych klinicznych mogą w przyszłości pomóc w odróżnieniu kolonizacji od rzeczywistej infekcji, choć takie zastosowania będą wymagały starannej walidacji prospektywnej. W szerszym ujęciu, przed uznaniem wydajności diagnostycznej tej platformy za generalizowalną, konieczna będzie ocena wieloośrodkowa przeprowadzona w geograficznie zróżnicowanych populacjach oddziałów intensywnej terapii (ICU).
Oświadczenia
Autorzy declare brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Niezakaźne Choroby Przewlekłe – Narodowy Główny Projekt Naukowo-Technologiczny (No. 2023ZD0516500), Narodowe Finansowanie Badań Klinicznych w Szpitalach Wysokiego Poziomu (2026-PUMCH-A-103), Program Otwartych Konkurencji CMB (24-561) oraz Program Kształcenia Talentów Szpitala Peking Union Medical College (No.UGG11571).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zautomatyzowany analizator kwasów nukleinowych | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-T80-01 | TurboFlow T; wykonuje odśrodkową dystrybucję odczynników, ekstrakcję za pomocą kulek magnetycznych oraz LAMP w 65 °Coraz detekcja fluorescencji w czasie rzeczywistym (czas przebiegu ~45 min) |
| #1 jednorazowa pipeta Pasteura | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Wykonany na zamówienie | Jednorazowy materiał eksploatacyjny; 0,5 ml; służy do przenoszenia zhomogenizowanego preparasu do probówki lizującej |
| #2 Jednorazowa pipeta Pasteura | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Wykonany na zamówienie | Produkt jednorazowy; 2 ml; służy do pobierania próbki do zaznaczonej linii w probówce do upłynniania |
| chip CD | Beijing Hongyang Chensheng Technology Co., Ltd | Wykonany na zamówienie | Jednorazowy materiał eksploatacyjny; dysk o średnicy 86 mm z centralną strefą załadunku (porty O, B, S), strefą oczyszczania za pomocą kulek magnetycznych oraz zewnętrznym pierścieniem z 16 studniami reakcyjnymi (15 celów patogennych + wewnętrzna kontrola NBPF) |
| Odczynniki do reakcji LAMP | Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | W celu optymalizacji procesu ekstrakcji DNA z próbek tkanek roślinnych, należy zastosować ulepszoną metodę opartą na zastosowaniu buforów ekstrakcyjnych z dodatkiem czynników redukujących polisacharydy i polifenole. Po pierwsze, tkankę roślinną należy zamrozić w ciekłym azocie i starannie sproszkować w kriomłynce, aby uzyskać jednorodny pył. Następnie do homogenizatu dodaje się bufor lizujący zawierający SDS oraz PVP (poliwiniłopirolydon), który zapobiega tworzeniu kompleksów DNA z polifenolami. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze 65°C przez 30 minut, co pozwala na efektywną lize komórek i denaturację białek. Kolejnym krokiem jest oddzielenie frakcji wodnej od osadu poprzez wirowanie przy wysokiej prędkości. Wyizolowane DNA oczyszcza się za pomocą precypitacji izopropanolem, a następnie przemywa 70% etanolem, aby usunąć pozostałości soli i zanieczyszczeń. Ostatnim etapem jest rozpuszczenie oczyszczonego DNA w buforze TE lub wodzie o niskiej zawartości nukleaz. Jakość i ilość uzyskanego materiału genetycznego należy ocenić za pomocą spektrofotometrii UV-VIS oraz elektroforezy żelowej. | Odczynniki do reakcji LAMP zmagazynowane w chipie CD w postaci liofilizowanych kulek |
| Probówka do upłynniania | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Wykonany na zamówienie | Produkt jednorazowy; 2 ml/probówka; przeznaczony do homogenizacji ręcznej próbki |
| Probówka do lizy | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Wykonany na zamówienie | Jednorazowy materiał eksploatacyjny; 0,5 ml/probówka; ściskany korpus silikonowy z 200 µm membrana filtrująca; gotowe odczynniki lizujące |
| Startery | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | Wykonany na zamówienie | Mieszanina starterów osadzona w komorze reakcyjnej chipa CD |
| Urządzenie do wstępnego przetwarzania próbek | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-R10-02 | TS-2000; automatyczna upłynniajka–cykl lizy (~15 min) |
| Fiolka jednorazowa “B” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Wykonany na zamówienie | Wymienne materiały eksploatacyjne; gotowy odczynnik na chipie; jeden na test; przechowywać w temperaturze 4 °C i doprowadzone do temperatury pokojowej (~25 °C) przed załadowaniem |
| Fiolka jednodawkowa “O” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Wykonany na zamówienie | Jednorazowy materiał eksploatacyjny; gotowy odczynnik na chipie; jeden na test; przechowywać w 4 °C i doprowadzono do stanu równowagi w temperaturze pokojowej (~25 °C) przed załadowaniem |
Bibliografia
- GBD 2016 Lower Respiratory Infections Collaborators. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990–2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Infect Dis. 2018;18(11):1191-1210.
- Niederman MS, Torres A. Respiratory infections. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220150.
- Weiser JN, Ferreira DM, Paton JC. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nat Rev Microbiol. 2018;16(6):355-367.
- Reynolds D et al. The threat of multidrug-resistant/extensively drug-resistant gram-negative respiratory infections: another pandemic. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220068.
- Schauwvlieghe AFAD et al. Invasive aspergillosis in patients admitted to the intensive care unit with severe influenza: a retrospective cohort study. Lancet Respir Med. 2018;6(10):782-792.
- Meersseman W et al. Galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid: a tool for diagnosing aspergillosis in intensive care unit patients. Am J Respir Crit Care Med. 2008;177(1):27-34.
- Seymour CW et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. N Engl J Med. 2017;376(23):2235-2244.
- Noviello S, Huang DB. The basics and the advancements in diagnosis of bacterial lower respiratory tract infections. Diagnostics (Basel). 2019;9(2):37.
- Chiu CY, Miller SA. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 2019;20(6):341-355.
- Hanson KE et al. Molecular testing for acute respiratory tract infections: clinical and diagnostic recommendations from the IDSA's diagnostics committee. Clin Infect Dis. 2020;71(10):2744-2751.
- Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
- Soroka M, Wasowicz B, Rymaszewska A. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): the better sibling of PCR? Cells. 2021;10(8):1931.
- Parida M et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 2008;18(6):407-421.
- Ou H et al. Rapid detection of multiple pathogens by the combined loop-mediated isothermal amplification technology and microfluidic chip technology. Ann Palliat Med. 2021;10(10):11053-11066.
- Lai JX et al. Rapid detection of bacterial pathogens causing lower respiratory tract infections via microfluidic-chip-based loop-mediated isothermal amplification. J Vis Exp. 2024;(205):e66677.
Przedruki i uprawnienia
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny