Zoptymalizowany protokół odwrotnej transfekcji w celu dostarczenia mRNA telomerazy do wczesno-senescencyjnych fibroblastów ludzkich

Sukanta Jash; John Sedivy

doi:10.3791/71538

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowany protokół odwrotnej transfekcji w celu dostarczenia mRNA telomerazy do wczesno-senescencyjnych fibroblastów ludzkich

126 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71538

⸱

18 sierpnia 2026

Sukanta Jash^*¹ , John Sedivy^*¹

¹Center on the Biology of Aging, and Department of Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Brown University

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy artykuł przedstawia zoptymalizowany protokół transfekcji odwrotnej w celu wydajnego dostarczenia mRNA ludzkiej odwrotnej transkryptazy telomerazy (hTERT mRNA) z modyfikowanymi nukleozydami do starzejących się ludzkich fibroblastów. Wstępne pokrycie powierzchni hodowlanych kompleksami hTERT mRNA-lipid zwiększa pobór, umożliwiając aktywację telomerazy, wydłużenie telomerów i częściowe odmłodzenie. Hodowle ostatecznie ponownie wchodzą w stan starzenia lub kryzysu bez uniezależnienia się od sygnałów proliferacyjnych (immortalizacji).

Streszczenie

Starzenie się komórek wiąże się z głębokimi zmianami w fizjologii komórkowej, w tym ze zmniejszoną płynnością błon, zaburzeniami transportu endosomalnego, obniżoną zdolnością endocytarną oraz zwiększoną aktywnością zewnątrzkomórkowej RNazy, co w połączeniu utrudnia efektywne dostarczanie mRNA. Bariery te ograniczały zastosowanie metod opartych na RNA w komórkach starzejących się, szczególnie w przypadku dostarczania dużych transkryptów terapeutycznych. Niniejszy protokół opisuje zoptymalizowaną metodę odwrotnej transfekcji w celu wydajnego wprowadzania zmodyfikowanego mRNA (mRNA) do starzejących się ludzkich fibroblastów. Choć jako transkrypt modelowy wykorzystano mRNA ludzkiej odwrotnej transkryptazy telomerazy (hTERT), opisany schemat postępowania ma szerokie zastosowanie w przypadku innych mRNA. W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod transfekcji, w których kompleksy RNA-lipid dodaje się do pożywki po przytwierdzeniu komórek, odwrotna transfekcja polega na naniesieniu kompleksów na powierzchnię hodowlaną przed wysianiem komórek, co umożliwia bezpośrednią interakcję między przytwierdzającymi się komórkami a kompleksami transfekcyjnymi. Aby zmaksymalizować wydajność transfekcji, protokół obejmuje zastosowanie mRNA z modyfikacjami nukleozydowymi zawierającymi pseudourydynę i 5-metylocytydynę, wydłużone ogony poli(A), zoptymalizowany czas tworzenia kompleksów, inhibicję RNazy, przejściowe podniesienie pH endosomów za pomocą chlorochiny, zwiększoną gęstość wysiewu komórek oraz wydłużone okresy inkubacji. Stosując to podejście, osiągnięto wydajność transfekcji na poziomie około 50%–80% w starzejących się fibroblastach po dostarczeniu transkryptu mRNA hTERT o długości 5 kb. Szczyt aktywności telomerazy odnotowano 24–48 h po transfekcji. Pojedynczy cykl transfekcji spowodował mierzalne wydłużenie telomerów, natomiast trzy sekwencyjne transfekcje doprowadziły do znacznego, lecz ograniczonego wydłużenia telomerów. Częściowe odwrócenie fenotypów związanych ze starzeniem było zauważalne w ciągu 72–96 h, w tym zmniejszona aktywność β-galaktozydazy związanej ze starzeniem, obniżona ekspresja p16 i p21, przywrócenie morfologii komórek oraz wydłużenie czasu życia replikacyjnego. Dostarczone mRNA hTERT uległo degradacji w ciągu 72–96 h, a nie zaobserwowano unieśmiertelnienia. Niniejszy protokół stanowi praktyczne podejście do przejściowego dostarczania mRNA do komórek starzejących się i może być dostosowany do szerokiej gamy typów komórek i gatunków.

Wprowadzenie

Metoda transfekcji odwrotnej stanowi kluczową adaptację metodologiczną dla komórek starzejących się, która pozwala pokonać fundamentalne bariery, jakie komórki te stawiają standardowym metodom transfekcji. W przeciwieństwie do transfekcji bezpośredniej, w której komórki są najpierw wysiewane i poddawane adhezji przed dodaniem kompleksów transfekcyjnych, transfekcja odwrotna polega na dodaniu komórek w zawiesinie bezpośrednio na uprzednio sformowane kompleksy mRNA hTERT-lipidy. Technika ta drastycznie zwiększa wydajność transfekcji w komórkach starzejących się poprzez maksymalizację ekspozycji na kompleksy transfekcyjne podczas krytycznej fazy przywierania, kiedy przebudowa błony jest najintensywniejsza.

Kluczowa zmiana koncepcyjna w niniejszym protokole polega na potraktowaniu komórek senescencyjnych jako odrębnego problemu w kontekście dostarczania substancji, a nie jedynie jako trudniej transfekowalnych wersji komórek młodych. W procesie senescencji globalne zmiany w składzie lipidów błonowych, obejmujące fosfolipidy, sfingolipidy i cholesterol, zmieniają płynność błony, jej krzywiznę oraz oddziaływania białko-lipid, przyczyniając się jednocześnie do powstania fenotypu wydzielniczego związanego z senescencją¹^,²^,³. Komórki senescencyjne wykazują również zmniejszoną endocytozę receptorową zależną od klatryny i kaweol oraz zmieniony szlak endocytyczny, co jest częściowo spowodowane obniżeniem poziomu amfifizyny-1 i kompensacyjnymi zmianami w ekspresji kaweolin, które osłabiają pobieranie zapośredniczone przez receptory i sygnalizację⁴^,⁵^,⁶. Równocześnie dochodzi do dysregulacji osi późny endosom-lizosom regulowanej przez Rab7 oraz szerszej sieci endosomalno-autofagiczno-lizosomalnej (EAL), przy czym Rab7 pełni rolę głównego regulatora dojrzewania endolizosomów i fuzji autofagosomów z lizosomami, które ulegają zaburzeniom w procesach starzenia i neurodegeneracji⁷.

Komórki senescentne powszechnie zwiększają ekspresję wielu komponentów systemu przetwarzania i adaptacji lizosomalnej (LYPAS), w tym napędzaną przez TFEB/TFE3 biogenezę lizosomów oraz autofagię pośredniczoną przez białka opiekuńcze, co prowadzi do zwiększenia masy lizosomalnej. Jednakże pojedyncze lizosomy często wykazują podwyższone pH wewnątrzświetlne, uszkodzenia błon oraz zmienną zdolność proteolityczną, co przyczynia się do dysfunkcji lizosomów pomimo ich zwiększonej liczebności⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹. Wspólnie zmiany te mogą bardziej efektywnie kierować zinternalizowany materiał do degradacyjnych przedziałów endolizosomalnych, zwiększając prawdopodobieństwo, że dostarczone RNA lub białko zostanie zdegradowane przed produktywnym uwolnieniem do cytozolu⁹^,¹⁰^,¹¹. Transfekcja odwrotna bezpośrednio celuje w najwcześniejszy etap przebudowy błon podczas adhezji, wymuszając trwały, wysokowartościowy kontakt między komórkami a kompleksami mRNA-lipid i przynajmniej częściowo omijając upośledzoną endocytozę w stanie stacjonarnym w w pełni adherentnych komórkach senescentnych⁴^,⁵^,⁶^,¹².

W kwestii projektowania RNA protokół zakłada, że w kontekście starzenia się organizmu prosta baza składająca się z czapeczki i ogona jest niewystarczająca: pełna modyfikacja nukleozydowa (na przykład pseudourydyna lub N1‑metylopseudourydyna oraz 5‑metylocytydyna) jest traktowana jako niezbędna, aby oddzielić translację od wykrywania przez endosomalne receptory Toll-podobne i indukcji interferonu typu I. Prace fundamentalne wykazały, że włączenie zmodyfikowanych nukleozydów do RNA hamuje aktywację TLR3, TLR7 oraz TLR8 i znacząco redukuje produkcję cytokin przez komórki dendrytyczne, co stanowi podstawę mechanistyczną dla obniżonej wrodzonej immunogenności obecnych platform mRNA z modyfikowanymi nukleozydami¹³. Nowsze przeglądy dotyczące szczepionek mRNA–LNP oraz leków opartych na mRNA podkreślają skoordynowaną inżynierię czapeczki 5′, regionów UTR, sekwencji kodującej i ogona poly(A) w celu zwiększenia stabilności i translacji in vivo przy jednoczesnym minimalizowaniu aktywacji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej¹⁴. W szczególności długość i architektura ogona poly(A) okazały się kluczowymi czynnikami determinującymi stabilność mRNA transkrybowanego in vitro oraz wydajność translacji, co skłania do stosowania wydłużonych lub zmodyfikowanych konstrukcji poly(A) w terapeutycznym mRNA¹⁵.

Dodatkowo protokół ten w sposób jawny zapewnia ochronę przed zewnątrzkomórkowymi i endosomalnymi RNazami podczas tworzenia kompleksów i ich pobierania, wraz z określonym oknem ucieczki endosomalnej przy użyciu przejściowego czynnika lysosomotropowego, takiego jak chlorochina¹⁶^,¹⁷. Chlorochina od dawna jest stosowana jako funkcjonalna sonda barier endosomalnych i może znacząco zwiększyć stopień oddziaływania z celem oraz wyciszanie przez siRNA lub oligonukleotydy antysensowne poprzez promowanie rozpadu błony endosomalnej i ucieczki kwasów nukleinowych do cytozolu¹⁸. Jednocześnie obrazowanie żywych komórek oraz obrazowanie superrozdzielcze mRNA dostarczanego przez LNP wykazały, że efektywne dostarczenie jest silnie ograniczone przez rzadkie zdarzenia ucieczki z endosomów wczesnych/recyklingujących, a nie przez samo początkowe pobieranie, co podkreśla znaczenie celowego zaprojektowania etapu ucieczki endosomalnej w terapiach opartych na mRNA¹⁹.

Wspólnie te związane ze starzeniem się zmiany w dynamice błon, transporcie endocytycznym, przetwarzaniu lizosomalnym oraz aktywacji odporności wrodzonej tworzą znaczne bariery dla efektywnego dostarczania mRNA. Opisana tutaj strategia transfekcji odwróconej została opracowana w celu przezwyciężenia tych ograniczeń poprzez połączenie zoptymalizowanej inżynierii mRNA, ochrony przed RNazami, zwiększonego ucieczki z endosomów oraz bezpośredniej ekspozycji przywierających komórek na preformowane kompleksy mRNA-lipid. Chociaż jako modelowy ładunek wykorzystano mRNA hTERT, opisany schemat postępowania ma szerokie zastosowanie w dostarczaniu innych dużych terapeutycznych transkryptów mRNA do starzejących się i trudnych do transfekcji populacji komórek²⁰^,²¹^,²².

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Transkrypcja in vitro mRNA hTERT

In vitro transkrypcja (IVT) z użyciem ARCA i ΨUTP
1. Przygotować 20 µL reakcji IVT zgodnie z Tabelą 1. W przypadku potrzeby uzyskania większej wydajności należy skalować reakcję liniowo.
2. Połączyć wszystkie składniki reakcji, z wyjątkiem polimerazy RNA T7, w probówce wolnej od RNaz. Na końcu dodać polimerazę RNA T7, delikatnie wymieszać i krótko odwirować probówkę.
3. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 0,5–4 h.
  UWAGA: Czas inkubacji należy dostosować do długości matrycy. Reakcje zawierające krótsze matryce (około 500 bp) inkubować przez około 30 min, a reakcje zawierające dłuższe matryce (około 4 kb) przez 3–4 h.
Obróbka DNazą
1. Dodać 1 µL wolnej od RNaz DNazy I bezpośrednio do mieszaniny reakcyjnej IVT.
2. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 15 min.
  UWAGA: Obróbkę DNazą należy przeprowadzić bezpośrednio w mieszaninie reakcyjnej IVT, bez uprzedniego oczyszczania syntetyzowanego mRNA.
Oczyszczanie mRNA
1. Dodać 115 µL wolnej od nukleaz H₂O w celu rozcieńczenia mieszaniny reakcyjnej.
2. Oczyścić mRNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Eluować oczyszczone mRNA w 20–30 µL wolnej od nukleaz H₂O.
4. Zmierzyć czystość mRNA za pomocą spektrofotometrii i zweryfikować integralność RNA poprzez elektroforezę na 1,0–1,5% denaturującym żelu agarozowym lub niskoprocentowym żelu poliakryloamidowym.
Dodawanie ogona poli(A)
1. Przygotować 50 µL reakcji dodawania ogona poli(A) zgodnie z Tabelą 2. Delikatnie wymieszać składniki reakcji i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30–60 min.
  UWAGA: Czas inkubacji należy dostosować do ilości wprowadzonego RNA.
2. Zatrzymać reakcję poprzez dodanie 2 µL 0,5 M EDTA (pH 8,0).
Ostateczne oczyszczanie i kontrola jakości
1. Oczyścić mRNA z ogonem poli(A) za pomocą zestawu do oczyszczania RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Eluować oczyszczone mRNA w 20–30 µL wolnej od nukleaz H₂O.
3. Ocenić jakość mRNA przed przystąpieniem do transfekcji
  1. Zmierzyć stężenie mRNA przy 260 nm i określić czystość za pomocą stosunków A260/A280 oraz A260/A230. Należy używać preparatów mRNA o wartościach A260/A280 około 2,0 i wartościach A260/A230 większych niż 2,0.
  2. Ocenić integralność mRNA za pomocą elektroforezy żelowej lub systemu analizy RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Potwierdzić długość ogona poli(A) za pomocą RT-PCR lub analizy Bioanalyzer. Zweryfikować, czy długość ogona poli(A) mieści się w przedziale od 120 do 200 nukleotydów.
  4. Rozdzielić oczyszczone mRNA na alikwoty i przechowywać je w temperaturze −80 °C, aby zminimalizować liczbę cykli zamrażania i rozmrażania.

2. Transfekcja odwrócona

Dzień −1: Przygotowanie przed transfekcją
1. Weryfikacja fenotypu starzenia
  1. Wykonanie barwienia na β-galaktozydazę związaną ze starzeniem (SA-β-gal) na reprezentatywnej próbce komórek. Należy zweryfikować, czy ponad 70% komórek jest pozytywnych.
  2. Potwierdzenie ekspresji markerów starzenia (p16 i p21) za pomocą qRT-PCR lub immunofluorescencji.
  3. Określenie żywotności komórek i weryfikacja, czy żywotność przekracza 90%.
2. Przygotowanie odczynników
  1. Podgrzanie pełnej pożywki hodowlanej do 37 °C.
  2. Podgrzanie soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) do 37 °C.
  3. Przygotowanie świeżej pożywki Opti-MEM I.
    UWAGA: Przed użyciem nie dodawać inhibitora RNazy do Opti-MEM I.
Dzień 0: Dzień transfekcji
UWAGA: Należy zachować odstęp około 3 h od przygotowania odczynników do inkubacji transfekowanych komórek.
1. Przygotowanie mRNA hTERT
  1. Rozmrożenie mRNA hTERT na lodzie. Pomiar stężenia mRNA i użycie preparatów o stężeniu od 0,5 do 1,0 µg/µL.
  2. Rozcieńczenie odpowiedniej ilości mRNA hTERT w Opti-MEM I zgodnie z zastosowanym formatem hodowli (Tabela 3). Dodanie inhibitora RNazy do stężenia końcowego 0,5–1,0 U/µL i delikatne wymieszanie.
  3. Przechowywanie rozcieńczonego mRNA na lodzie do czasu tworzenia kompleksów.
    UWAGA: Inhibitor RNazy należy dodać bezpośrednio przed użyciem. Nie przechowywać mRNA z inhibitorem RNazy, ponieważ jego aktywność spada po zamrożeniu.
2. Przygotowanie odczynnika do transfekcji
  1. Połączenie 6,0 µL odczynnika do transfekcji z 100 µL Opti-MEM I w sterylnej probówce wolnej od RNaz. Delikatne wymieszanie poprzez pipetowanie.
  2. Inkubacja mieszaniny w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    UWAGA: W przypadku dużych konstruktów mRNA hTERT (~5 kb) należy zoptymalizować stosunek odczynnika do mRNA w zakresie od 0,4 do 0,6 µL odczynnika na 100 ng mRNA.
3. Tworzenie kompleksów mRNA-lipid
  1. Dodanie rozcieńczonego roztworu mRNA hTERT (100 µL) do rozcieńczonego roztworu odczynnika do transfekcji (106 µL). Delikatne wymieszanie poprzez 5–6 krotne pipetowanie.
  2. Inkubacja mieszaniny w temperaturze pokojowej przez 15–20 min.
  3. Czas tworzenia kompleksów nie może przekroczyć 30 min.
  4. Weryfikacja pomyślnego utworzenia kompleksów poprzez pojawienie się lekko mętnego roztworu.
    UWAGA: Przygotowanie komórek należy przeprowadzić w czasie tworzenia kompleksów.
4. Przygotowanie komórek do transfekcji odwróconej
  1. Odsanie pożywki hodowlanej z kultur komórek starzejących się.
  2. Jednorazowe przemycie komórek podgrzanym PBS (2 mL na studzienkę płytki 6-dołkowej).
  3. Dodanie 500 µL 0,05% trypsyny-EDTA na studzienkę.
  4. Inkubacja komórek w temperaturze 37 °C przez 3–5 min.
  5. Neutralizacja trypsyny za pomocą 3 mL pełnej pożywki zawierającej surowicę.
  6. Delikatna tryturacja komórek w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.
  7. Określenie liczby komórek przy użyciu hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
  8. Przygotowanie zawiesiny zawierającej 2,0–2,5 × 10⁵ komórek na studzienkę w pełnej pożywce.
    UWAGA: Należy unikać przedłużonej trypsynizacji, ponieważ komórki starzejące się są bardzo podatne na stres mechaniczny. Komórki należy utrzymać w zawiesinie; nie wysiewać ich przed transfekcją odwróconą.
5. Transfekcja odwrócona
  1. Przygotowanie płytki hodowlanej
    1. Dodanie 500 µL 0,01% poli-L-lizyny do każdej studzienki płytki 6-dołkowej i inkubacja przez 30 min w temperaturze pokojowej.
    2. Odsanie roztworu powlekającego bezpośrednio przed użyciem.
    3. Dodanie 200 µL kompleksu mRNA hTERT-lipid do środka każdej studzienki.
    4. Inkubacja płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 30 min.
      UWAGA: Powlekanie płytki należy przeprowadzić równolegle z tworzeniem kompleksów i przygotowaniem komórek.
  2. Przygotowanie zawiesiny komórek
    1. Zawieszenie 2,0–2,5 × 10⁵ komórek w 1800 µL pełnej pożywki bez antybiotyków.
    2. Delikatne resuspensowanie komórek w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny pojedynczych komórek.
      UWAGA: Podczas transfekcji należy stosować pożywkę bez antybiotyków.
  3. Wysiew komórek na kompleksy
    1. Dodanie 1800 µL zawiesiny komórek bezpośrednio na wcześniej utworzone kompleksy mRNA hTERT-lipid.
    2. Delikatne przechylenie płytki 2–3 razy w każdym kierunku, aby równomiernie rozłożyć komórki.
      UWAGA: Po dodaniu komórek nie należy pipetować zawiesiny, ponieważ może to zniszczyć kompleksy mRNA-lipid.
  4. Inkubacja komórek
    1. Inkubacja komórek w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO₂ przez 6–8 h.
    2. Monitorowanie przylegania komórek za pomocą mikroskopii świetlnej 2–3 h po transfekcji.
    3. Weryfikacja, czy komórki są równomiernie rozłożone i zaczynają przylegać do powierzchni hodowlanej.
      UWAGA: Nadmierna liczba pływających komórek lub resztek komórkowych może wskazywać na cytotoksyczność związaną z transfekcją.

3. Łagodzenie cytotoksyczności

Skrócić czas ekspozycji na transfekcję do 48 h, jeśli ubytek komórek przekracza 20%.
Uzupełnić hodowle o 10 µM inhibitora ROCK Y-27632 podczas okresu transfekcji, aby poprawić przeżywalność komórek.
Po 6–8 h od transfekcji ostrożnie odessać medium do transfekcji, minimalizując zaburzenia częściowo przytwierdzonych komórek. Pozostawić około 100 µL resztkowego medium w każdej studni.
Do każdej studni dodać 1 mL świeżego, uprzednio ogrzanego pełnego medium wzrostowego uzupełnionego o 15% FBS.
Bezpośrednio po wymianie medium dodać chlorochinę do stężenia końcowego 10–20 µM.
Inkubować hodowle przez dodatkowe 2 h w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z zawartością 5% CO₂.
Wymienić medium zawierające chlorochinę na świeże pełne medium wzrostowe.
Przenieść hodowle z powrotem do inkubatora w celu dalszego wzrostu.
UWAGA: Monitorować morfologię i żywotność komórek przez cały okres rekonwalescencji. Nadmierne odrywanie się komórek lub obecność debris mogą wskazywać na cytotoksyczność związaną z transfekcją.

4. Analiza po transfekcji

Oceń ekspresję białka TERT 24–48 h po transfekcji.
Zmierz poziom białka TERT metodą western blotting lub barwienia immunofluorescencyjnego zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi.
Zmierz aktywność telomerazy w tym samym przedziale czasowym, stosując odpowiedni test aktywności telomerazy.
UWAGA: Aktywność telomerazy zazwyczaj spada po 48 h z powodu degradacji przejściowo dostarczonego mRNA hTERT.
Oceń długość telomerów 48–72 h po transfekcji, stosując monochromatyczną multipleksową ilościową PCR (MMqPCR) lub równoważną metodę analizy długości telomerów.
UWAGA: Po pomyślnym dostarczeniu mRNA hTERT można zaobserwować wykrywalne wydłużenie telomerów.
Oceń fenotypy związane ze starzeniem oraz odmłodzeniem 7 dni po transfekcji
1. Zmierz aktywność β-galaktozydazy związanej ze starzeniem (SA-β-gal).
2. Zmierz poziomy ekspresji p16 i p21.
3. Oceń ekspresję Ki67.
4. Zbadaj morfologię komórkową za pomocą mikroskopii świetlnej.
  UWAGA: Porównaj hodowle traktowane z nieleczonymi lub mock-transfekowanymi kontrolami starzejącymi się, aby ocenić zmiany w fenotypach związanych ze starzeniem oraz w charakterystyce proliferacyjnej.

5. Protokół wielokrotnego dawkowania (opcjonalnie)

Przeprowadź wstępną transfekcję zgodnie z opisem w sekcjach 2–4.
Powtórz transfekcje według następującego harmonogramu: dzień 0: pierwsza transfekcja; dzień 5: druga transfekcja; dzień 10–12: trzecia transfekcja.
Hoduj komórki jako kultury adherentne i nie stosuj trypsynizacji przed kolejnymi transfekcjami.
Przygotuj świeże kompleksy hTERT mRNA–lipid zgodnie z opisem w sekcjach 2.2.1–2.2.3.
Odsiąknij pożywkę hodowlaną z każdego dołka.
Dodaj 200 µL kompleksów hTERT mRNA–lipid bezpośrednio do każdego dołka.
Bezpośrednio po dodaniu kompleksów dodaj 800 µL świeżej pełnej pożywki F-10.
Inkubuj komórki przez 4–6 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem i zawartością 5% CO₂.
Zastąp pożywkę do transfekcji świeżą pełną pożywką.
UWAGA: Ogranicz proces do maksymalnie trzech cykli transfekcji, aby zminimalizować skumulowaną cytotoksyczność związaną z transfekcją.

6. Protokół transfekcji bezpośredniej (2 µg/mL, format 6-dołkowy)

Dzień −1: Wysiew komórek
1. Odczepić fibroblasty senescencyjne lub we wczesnej fazie senescencji, używając 0,05% trypsyny-EDTA.
2. Zneutralizować trypsynę za pomocą pełnej pożywki hodowlanej.
3. Określić liczbę i żywotność komórek.
4. Wysiać komórki do płytek 6-dołkowych z gęstością 2,0–2,5 × 10⁵ komórek na dołek.
5. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z zawartością 5% CO₂ do momentu osiągnięcia konfluencji na poziomie około 60–80%.
Dzień 0: Przygotowanie kompleksów mRNA hTERT–odczynnik
1. Rozmrozić alikwot zmodyfikowanego nukleozydowo mRNA hTERT na lodzie.
2. Rozcieńczyć mRNA hTERT w Opti-MEM do stężenia końcowego 2 µg/mL w sterylnej probówce wolnej od RNaz (Probówka A).
3. Dodać inhibitor RNazy do Probówki A do stężenia końcowego 0,5–1,0 U/µL i delikatnie wymieszać.
4. Rozcieńczyć odczynnik do transfekcji w Opti-MEM w drugiej probówce wolnej od RNaz (Probówka B), używając 0,4–0,6 µL odczynnika na 100 ng mRNA.
5. Dodać zawartość Probówki B kroplami do Probówki A, delikatnie mieszając.
6. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15–20 min.
Dzień 0: Transfekcja w przód (Forward transfection)
1. Potwierdzić, że komórki osiągnęły 60–80% konfluencji i wykazują prawidłową morfologię.
2. Odssać pożywkę hodowlaną.
3. Przemyć komórki raz 1–2 mL uprzednio ogrzanego PBS.
4. Dodać 0,5 mL uprzednio ogrzanej pełnej pożywki lub pożywki o zredukowanej zawartości surowicy do każdego dołka.
5. Opcjonalnie dodać chlorochinę do stężenia końcowego 10–20 µM.
6. Dodać 0,5 mL kompleksów mRNA hTERT–odczynnik przygotowanych w kroku 6.2.6 do każdego dołka.
7. Delikatnie kołysać płytką, aby równomiernie rozprowadzić kompleksy.
8. Inkubować komórki przez 4–6 h w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z zawartością 5% CO₂.
  UWAGA: W razie potrzeby wydłużyć czas inkubacji do 6–8 h dla komórek senescencyjnych.
9. Odssać pożywkę do transfekcji.
10. Dodać 2,0 mL świeżej pełnej pożywki do każdego dołka.
11. Przeprowadzić analizy potretransfekcyjne zgodnie z opisem w sekcji 4.
  UWAGA: Podczas porównywania warunków transfekcji w przód i w tył należy używać tej samej partii mRNA hTERT, tego samego odczynnika do transfekcji oraz tej samej dawki nominalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

ModRNA d2EGFP-T2A-hTERT została zaprojektowana jako hybrydowa otwarta ramka odczytu, w której reporter d2EGFP (destabilizowane EGFP) został połączony z ludzkim TERT za pomocą samoprzecinającego się peptydu T2A. Pełne sekwencje nukleotydowe i białkowe wszystkich konstruktów znajdują się w Pliku uzupełniającym 1. Sekwencja kodująca została otoczona syntetycznym 5′ niekodującym regionem (UTR) oraz 3′ UTR ludzkiej β-globiny w celu zwiększenia wydajności translacji i stabilności mRNA (Rys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejsze badanie redefiniuje starzenie się komórek jako odrębny problem dostarczania substancji, a nie jedynie niewielką wariację fizjologii proliferacyjnej, i opracowuje strategię transfekcji mRNA telomerazy dostosowaną do ograniczeń biofizycznych i immunologicznych stanu starzenia. Komórki starzejące się charakteryzują się usztywnionymi, wzbogaconymi w cholesterol błonami oraz zmniejszoną aktywnością endocytarną, co tworzy istotną barierę dla efektywnego dostarczania kwasów nukleinowych. Poprzez zastosowanie podejścia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

J.M.S. jest współzałożycielem oraz przewodniczącym SAB w firmie Transposon Therapeutics.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) P01 AG051449, R01 AG016694 oraz R01 AG078925 przyznane JS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ham's F-10 Nutrient Mix	Thermo Fisher	11550043	Pożywka do hodowli komórkowej.
Analog struktury czapeczki RNA 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G	New England Biolab	S1411L	W przypadku większości cząsteczek RNA struktura czapeczki zwiększa stabilność, zmniejsza podatność na degradację przez egzonukleazy i sprzyja tworzeniu kompleksów inicjacji mRNA.
5-metylocytydyna-5´-trifosforan (5-metylu-CTP)	New England Biolab	N0432S	Modyfikowane NTP są powszechnie stosowane w celu redukcji immunogenności RNA otrzymywanego w drodze transkrypcji in vitro.
Płytka 6-dołkowa	Corning	351146	Do hodowli i traktowania średnich i dużych objętości komórek adherentnych lub w zawiesinie w niezależnych warunkach eksperymentalnych.
Przeciwciało anty-Ki67 (SP6)	abcam	ab16667	Ki67 wykazuje ekspresję głównie w komórkach proliferujących.
Zestaw do badania starzenia komórkowego (barwienie SA-beta-gal)	cellbiolabs	CBA-230	Identyfikacja komórek starzejących się za pomocą testu barwienia SA-β-gal
Probówki DNA LoBind 0,5 ml	Eppendorf	022431005	Do wydajnego odzyskiwania DNA i RNA bez strat
Probówki DNA LoBind 1,5 ml	Eppendorf	22431021	Do wydajnego odzyskiwania DNA i RNA bez strat
DNaza I, wolna od RNaz (1 U/μL)	Thermo Fisher	EN0521	DNaza I, wolna od RNaz, jest endonukleazą trawiącą jednoniciowe i dwuniciowe DNA.
Polimeraza poli(A) z E. coli	New England Biolab	M0276S	W Escherichia coli polimeraza poli(A) I (PAP I) pełni głównie funkcję katalizatora niezależnego od matrycy przyłączania reszt adenozynomonofosforanu (AMP) do końca 3' cząsteczek RNA.
Płodowa surowica bydlęca	Thermo Fisher	A5256701	Suplement do pożywek do hodowli komórkowej
Zestaw HiScribe T7 ARCA mRNA	New England Biolab	E2065S	Zestaw HiScribe T7 ARCA mRNA (z dobudowywaniem ogona) został zaprojektowany do szybkiej produkcji in vitro mRNA z czapeczką ARCA i ogonem poli(A). Czapeczkowane mRNA są syntetyzowane poprzez ko-transkrypcyjną inkorporację analogu czapeczki anty-rewersyjnej (ARCA) przy użyciu polimerazy RNA T7.
Zestaw HiScribe T7 mRNA z odczynnikiem CleanCap AG	New England Biolab	E2080S	Zestawy HiScribe T7 mRNA z odczynnikiem CleanCap AG umożliwiają szybką i usprawnioną produkcję jednego lub wielu transkryptów z typową wydajnością ≥90 μg na reakcję,
Polimeraza DNA LongAmp Hot Start Taq	New England Biolab	M0534S	Polimeraza DNA LongAmp Hot Start Taq oferuje wyjątkową wydajność w przypadku długich amplikonów.
odwrotna transkryptaza M-MuLV	New England Biolab	M0253L	Odwrotna transkryptaza M-MuLV syntetyzuje komplementarną nić DNA inicjując proces od primera, wykorzystując jako matrycę RNA (synteza cDNA) lub jednoniciowe DNA.
Zestaw do oczyszczania RNA Monarch Spin (50 μg)	New England Biolab	T2040L	Główną funkcją zestawu Monarch® Spin RNA Cleanup Kit (50 μg) jest oczyszczanie i zagęszczanie do 50 μg wysokiej jakości RNA z reakcji enzymatycznych lub mieszanin ekstrakcyjnych.
Master Mix do składania DNA NEBuilder HiFi	New England Biolab	E2621L	Master Mix do składania DNA NEBuilder HiFi umożliwia bezszwowe składanie wielu fragmentów DNA, niezależnie od ich długości lub kompatybilności końców. Znajduje zastosowanie w biologii syntetycznej, a także w jednokrokowym klonowaniu wielu fragmentów dzięki łatwości użycia, elastyczności i prostej formie master-mixu.
Opti-MEM – pożywka z obniżoną zawartością surowicy	Thermo Fisher	31985070	Służy do maksymalizacji wydajności transfekcji komórek podczas tworzenia kompleksów lipid-ładunek. Stanowi zoptymalizowane, chemicznie zdefiniowane środowisko, które zapewnia wysoką żywotność komórek ssaków, redukując jednocześnie potrzebę standardowej suplementacji surowicą.
PBS, pH 7,4	Thermo Fisher	10010023	Podstawowym zastosowaniem funkcjonalnym soli fosforanowo-buforowanej (PBS) o pH 7,4 jest utrzymanie stabilnego pH i równowagi osmotycznej dla komórek ssaków i cząsteczek biologicznych.
Strypy PCR	Thermo Fisher	AB0776	Podstawowym zastosowaniem funkcjonalnym probówek w formie strypów PCR (zazwyczaj w formacie 8- lub 12-strypowym) jest przechowywanie małych objętości reakcji w cieczy podczas wysokoprzepustowego cyklowania termicznego.
Hydrobromek poli-L-lizyny	Millipore Sigma	P4707-50ML	Podstawowym zastosowaniem funkcjonalnym hydrobromku poli-L-lizyny (PLL) w przywieraniu komórek jest powlekanie ujemnie naładowanych powierzchni stałych (takich jak szkło lub plastik) w celu stworzenia silnie adhezyjnego, dodatnio naładowanego podłoża.
Pseudourydyna-5´-trifosforan (Pseudo-UTP- ΨUTP)	New England Biolab	N0433S	Pseudourydyna-5´-trifosforan (Pseudo-UTP) jest powszechnie stosowany w celu redukcji immunogenności RNA otrzymywanego w drodze transkrypcji in vitro.
Zestaw roztworów rybonukleotydów	New England Biolab	N0450L	Cztery oddzielne roztwory ATP, GTP, CTP i UTP
Inhibitor ROCK Y-27632 (dihydrochlorowodorek)	Stem cell technologies	72302	Y-27632 jest przenikalnym przez błony komórkowe, silnym i selektywnym inhibitorem kinazy białkowej ROCK (Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase). Y-27632 hamuje zarówno ROCK1 (Ki = 220 nM), jak i ROCK2 (Ki = 300 nM), konkurując z ATP o wiązanie w centrum katalitycznym
Woda klasy RT-PCR	Thermo Fisher	AM9935	Podstawowym zastosowaniem funkcjonalnym wody klasy RT-PCR (często oznaczanej jako woda wolna od nukleaz) jest służenie jako ultrazczysty rozpuszczalnik do czułych analiz enzymatycznych, w których jakiekolwiek zanieczyszczenie mogłoby zdegradować próbkę lub zahamować amplifikację.
Inhibitor RNazy SUPERase·In	Thermo Fisher	AM2694	Inhibitor RNazy SUPERase In jest inhibitorem białkowym pochodzenia nie-ludzkiego, który niekowalencyjnie wiąże i hamuje najczęstsze i najbardziej problematyczne RNazy, w tym RNazę A, B, C, 1 oraz T1.
Barwnik do żeli kwasów nukleinowych SYBR Green I	Thermo Fisher	S7563	Podstawowym zastosowaniem funkcjonalnym barwnika do żeli kwasów nukleinowych SYBR™ Green I jest wizualizacja i kwantyfikacja dwuniciowego DNA (dsDNA) w żelach agarozowych lub poliakryloamidowych.
Zestaw do transfekcji TransIT-mRNA	Mirusbio/ Millipore Sigma	MIR 2250	Wysoko wydajny, niskotoksyczny odczynnik do transfekcji dużych cząsteczek RNA
Zestaw do wykrywania telomerazy TRAPeze	Millipore Sigma	S7700	Test TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) to powszechnie stosowana i czuła metoda oparta na PCR, służąca do wykrywania i pomiaru aktywności telomerazy w komórkach ssaków i próbkach tkanek. Obejmuje ona trzy główne etapy: wydłużanie powtórzeń telomerycznych przez telomerazę, amplifikację tych produktów za pomocą PCR oraz późniejszą detekcję.
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa	Thermo Fisher	25300054	Do odrywania adherentnych komórek ssaków od naczyń hodowlanych podczas rutynowego pasażowania (subkultywacji) i zbierania komórek.

Bibliografia

Millner A, Atilla-Gokcumen GE. Lipid players of cellular senescence. Metabolites. 2020;10(9):339.
Hamsanathan S, Gurkar AU. Lipids as regulators of cellular senescence. Front Physiol. 2022;13:796850.
Das UN. Cell membrane theory of senescence and the role of bioactive lipids in aging and aging-associated diseases and their therapeutic implications. Biomolecules. 2021;11(2):241.
Shin EY, Soung NK, Schwartz MA, Kim EG. Altered endocytosis in cellular senescence. Ageing Res Rev. 2021;68:101332.
Park JS, et al. Down-regulation of amphiphysin-1 is responsible for reduced receptor-mediated endocytosis in senescent cells. FASEB J. 2001;15(9):1625-1627.
Park SC. Functional recovery of senescent cells through restoration of receptor-mediated endocytosis. Mech Ageing Dev. 2002;123(8):917-926.
Stroupe C. This is the end: regulation of Rab7 nucleotide binding in endolysosomal trafficking and autophagy. Front Cell Dev Biol. 2018;6:129.
Curnock R, et al. TFEB-dependent lysosome biogenesis is required for senescence. EMBO J. 2023;42(9):e111241.
Guerrero-Navarro L, Jansen-Durr P, Cavinato M. Age-related lysosomal dysfunctions. Cells. 2022;11(12):1977.
Tan JX, Finkel T. Lysosomes in senescence and aging. EMBO Rep. 2023;24(11):e57265.
Rovira M, et al. The lysosomal proteome of senescent cells contributes to the senescence secretome. Aging Cell. 2022;21(10):e13707.
Kilroy G, Burk DH, Floyd ZE. High-efficiency lipid-based siRNA transfection of adipocytes in suspension. PLoS One. 2009;4(9):e6940.
Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175.
Freund I, Eigenbrod T, Helm M, Dalpke AH. RNA modifications modulate activation of innate Toll-like receptors. Genes (Basel). 2019;10(2):92.
Chen H, et al. Branched chemically modified poly(A) tails enhance the translation capacity of mRNA. Nat Biotechnol. 2025;43(2):194-203.
Alshehri A, Grabowska A, Stolnik S. Pathways of cellular internalisation of liposome-delivered siRNA and effects on siRNA engagement with target mRNA and silencing in cancer cells. Sci Rep. 2018;8(1):3748.
Paramasivam P, et al. Endosomal escape of delivered mRNA from endosomal recycling tubules visualized at the nanoscale. J Cell Biol. 2022;221(2):e202110137.
Pandey E, Harris EN. Chloroquine and cytosolic galectins affect endosomal escape of antisense oligonucleotides after Stabilin-mediated endocytosis. Mol Ther Nucleic Acids. 2023;33:430-443.
Bettinger T, et al. Peptide-mediated RNA delivery: a novel approach for enhanced transfection of primary and post-mitotic cells. Nucleic Acids Res. 2001;29(18):3882-3891.
Granados-Riveron JT, Aquino-Jarquin G. Engineering of the current nucleoside-modified mRNA-LNP vaccines against SARS-CoV-2. Biomed Pharmacother. 2021;142:111953.
Hou X, Shi J, Xiao Y. mRNA medicine: recent progresses in chemical modification, design, and engineering. Nano Res. 2024;17(10):9015-9030.
Ramunas J, et al. Transient delivery of modified mRNA encoding TERT rapidly extends telomeres in human cells. FASEB J. 2015;29(5):1930-1939.
Majewska J, Krizhanovsky V. Immune surveillance of senescent cells in aging and disease. Nat Aging. 2025;5(8):1415-1424.
Ajoolabady A, et al. Hallmarks and mechanisms of cellular senescence in aging and disease. Cell Death Discov. 2025;11(1):364.
Lin J, et al. RNA and protein degradation in the aging process. Cell Signal. 2025;136:112166.
Anderson BR, et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Res. 2010;38(17):5884-5892.
Sugawara S, et al. RNaseH2A downregulation drives inflammatory gene expression via genomic DNA fragmentation in senescent and cancer cells. Commun Biol. 2022;5(1):1420.
Chatterjee S, Kon E, Sharma P, Peer D. Endosomal escape: a bottleneck for LNP-mediated therapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(11):e2307800120.
Li YY, Tay FR. The epigenetic rejuvenation promise: partial reprogramming as a therapeutic strategy for aging and disease. Ageing Res Rev. 2026;115:103009.
Zhang W, Qu J, Liu GH, Belmonte JCI. The ageing epigenome and its rejuvenation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21(3):137-150.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

starzejące się fibroblasty mRNA hTERT mRNA z modyfikacją nukleozydową inhibicja RNazy modulacja pH endosomalnego elongacja telomerów limit replikacyjny