Wymuszona nadekspresja miR-486-3p hamuje aktywność związaną z proliferacją, wzrost klonogenny, gojenie ran oraz migrację przez Matrigel w liniach komórkowych gruczolakoraka płuca A549 i H358. Efekty te towarzyszą obniżonej ekspresji WNT5B, DVL1, β-catenin oraz BCL-2, co wskazuje na powiązanie in vitro ze zmianami zależnymi od szlaku Wnt, bez ustanowienia bezpośredniego celowania lub związku przyczynowo-skutkowego w obrębie tego szlaku.
Artykuł badawczy
miR-486-3p hamuje fenotypy złośliwe i wiąże się z obniżoną ekspresją WNT5B, DVL1 oraz β-kateniny w komórkach gruczolakoraka płuca
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Gruczolak płuca (LUAD) jest dominującym podtypem histologicznym niedrobnokomórkowego raka płuca i pozostaje związany ze znaczną zachorowalnością oraz śmiertelnością. Poprzednie badania zidentyfikowały funkcje supresyjne miR-486-3p w LUAD, jednak jego związek ze zmianami ekspresji WNT5B, DVL1 i β-kateniny nie został jasno określony. W niniejszej pracy zbadano wyjściową liczebność miR-486-3p w komórkach LUAD A549 i H358 i porównano ją z liczebnością w komórkach nabłonka oskrzeli Beas-2b utrzymywanych w ich rutynowych warunkach. Stabilne modele z nadekspresją miR-486-3p wygenerowano za pomocą transdukcji lentiwirusowej. Aktywność związaną z wzrostem komórek, wzrost klonogenny, zamykanie rany oraz przenikanie przez membrany powlekane Matrigelem oceniono za pomocą zestawu Cell Counting Kit-8, testu tworzenia kolonii, testu gojenia ran oraz testu Transwell. Ilość białek WNT5B, DVL1, β-kateniny i BCL-2 oceniono metodą Western blotting, a poziomy mRNA WNT5B, DVL1, CTNNB1 i BCL2 dodatkowo zbadano za pomocą RT-qPCR. W zastosowanych warunkach hodowli liczebność miR-486-3p była niższa w komórkach A549 i H358 niż w komórkach Beas-2b, a transdukcja lentiwirusowa doprowadziła do stabilnej nadekspresji w obu liniach komórkowych LUAD. Wymuszona nadekspresja miR-486-3p zredukowała sygnał CCK-8, tworzenie kolonii, zamykanie rany oraz przenikanie przez membrany powlekane Matrigelem, co towarzyszyło obniżonej liczebności białek WNT5B, DVL1, całkowitej β-kateniny i BCL-2. RT-qPCR wykazało ponadto niższą liczebność transkryptów WNT5B, DVL1, CTNNB1 i BCL2 w obu liniach komórkowych LUAD po nadekspresji miR-486-3p. Wyniki te potwierdzają związek in vitro między wymuszoną ekspresją miR-486-3p, osłabieniem kilku parametrów komórek złośliwych a zmienioną ekspresją związaną z szlakiem Wnt; nie ustalają one jednak bezpośredniego wiązania miRNA z celem, aktywności szlaku ani przyczynowego, liniowego mechanizmu sygnalizacyjnego.
Wprowadzenie
Gruczolakorak płuca (LUAD) jest najczęstszym podtypem histologicznym niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) i w znacznym stopniu przyczynia się do zachorowalności oraz śmiertelności z powodu raka płuca na całym świecie1,2,3,4,5. Klasyfikacja molekularna i terapie celowane poprawiły rokowania dla wybranych grup pacjentów, jednak zaawansowany LUAD pozostaje trudny do leczenia i jest biologicznie heterogenny1,2,3,4,5. Zdefiniowanie procesów regulacyjnych przyczyniających się do złośliwego zachowania komórek pozostaje zatem istotne dla opracowania sprawdzalnych hipotez terapeutycznych.
Sygnalizacja Wnt obejmuje gałęzie zależne i niezależne od β-kateniny, które regulują proliferację, przeżywalność, polarność oraz ruchliwość6,7,8,9. WNT5B jest najczęściej kojarzony z sygnalizacją niekanoniczną, choć jego efekty biologiczne różnią się w zależności od receptora i kontekstu komórkowego10,11. DVL1 jest cytoplazmatycznym białkiem transdukcji sygnału współdzielonym przez kilka gałęzi Wnt i zostało powiązane z zachowaniem zależnym od β-kateniny w raku płuca12. W związku z tym jednoczesne zmiany poziomu WNT5B, DVL1 i β-kateniny nie powinny być same w sobie interpretowane jako dowód na istnienie jednej linearnej ścieżki.
MikroRNA (miRNA) to krótkie niekodujące RNA, które regulują ekspresję genów poprzez zależne od sekwencji oddziaływania z transkryptami docelowymi13,14,15. Ponieważ jedna cząsteczka miRNA może wpływać na wiele cząsteczek RNA, zmiana poziomu miRNA może oddziaływać na różnorodne fenotypy związane z nowotworami13,14,15,16,17,18. Kilka rodzajów miRNA powiązano z wzrostem, ruchliwością i sygnalizacją w raku płuca, a interakcje między miRNA a sieciami związanymi z szlakiem Wnt zostały opisane w wielu kontekstach nowotworowych16,17,18,19,20.
Locus MIR486 daje początek dojrzałym niciom miR-486-3p i miR-486-5p. Wykazano, że miR-486-3p posiada aktywność supresorową w raku jamy ustnej i glejakach, podczas gdy w przypadku raka płaskonabłonkowego skóry zgłaszano efekt pronowotworowy21,22,23,24,25. miR-486-3p został wybrany do niniejszego badania zgodnie ze strategią opartą na hipotezie, bazując na jego obniżonej liczebności w publicznych danych dotyczących LUAD, wcześniej zgłaszanej aktywności supresorowej w LUAD oraz przewidywaniach bioinformatycznych wiążących go z kandydowanymi transkryptami związanymi z WNT. Tomioka i wsp. wykazali efekty supresorowe obu nici miR-486 w LUAD i zidentyfikowali GINS4 za pomocą genomowego przesiewu celów26. W związku z tym niniejsze badanie nie pretenduje do bycia pierwszym dowodem na występowanie fenotypu przeciwnowotworowego. Zamiast tego ocenia ono, czy wymuszona ekspresja miR-486-3p wiąże się ze zmianami w liczebności WNT5B, DVL1 i β-catenin oraz z powtarzalnymi zmianami fenotypowymi w dwóch liniach komórkowych LUAD. Analizy te oceniają korelacje i nie ustanawiają bezpośredniego celowania, aktywności szlaku ani liniowego mechanizmu WNT5B/DVL1/β-catenin.
Protokół
Użyte odczynniki i sprzęt wymieniono w Tabeli Materiałów.
Hodowla komórkowa
Wykorzystano linie komórkowe gruczolaka płuca człowieka (LUAD) A549 i H358 oraz unieśmiertelnioną linię komórek nabłonkowych oskrzeli Beas-2b. Linie A549 (KRAS G12S) i H358 (KRAS G12C; niedobór STK11) wybrano jako powszechnie stosowane modele LUAD o odmiennych profilach mutacji KRAS, natomiast linię Beas-2b włączono jako niemaligniczny komparator nabłonkowy oskrzeli. Komórki A549 i H358 hodowano w podłożu RPMI-1640, a komórki Beas-2b w podłożu DMEM; każde z podłoży zawierało 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Komórki hodowano w temperaturze 37 °C w atmosferze uwilgotnionej zawierającej 5% CO₂. Ze względu na to, że linie komórkowe guza i komparatora nabłonkowego utrzymywano w różnych rutynowych podłożach, porównania bazowej ekspresji między różnymi liniami komórkowymi interpretowano z ostrożnością.
Transdukcja lentiwirusowa i selekcja stabilnych linii komórkowych
W stabilnym modelu wzmocnienia funkcji (gain-of-function) zastosowano wektory lentiwirusowe przenoszące prekursor hsa-miR-486-3p (LV-miR-486-3p) lub sekwencję kontrolną typu scrambled (LV-NC). Komórki A549 i H358 wysiano na płytki 6-dołkowe w zagęszczeniu 5 × 104 komórek/dołek i inkubowano przez noc. Następnego dnia komórki poddano transdukcji lentiwirusem przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 10 w obecności 8 µg/mL polybrene. Po 24 h inokulum wirusowe zastąpiono świeżą pożywką kompletną. Przetransdukowane komórki selekcjonowano puromycyną w stężeniu 2 µg/mL przez 7 dni. Po selekcji przeżywającym komórkom pozwolono na regenerację, a następnie namnożono je do kolejnych analiz molekularnych i funkcjonalnych. W badaniu nie zastosowano inhibitora miR-486-3p, ponieważ eksperyment został zaprojektowany specjalnie w celu oceny efektów stabilnej, wymuszonej nadekspresji.
UWAGA: MOI, czas ekspozycji na polybrene oraz warunki selekcji puromycyną muszą być identyczne dla grup LV-NC i LV-miR-486-3p, aby zminimalizować różnice w żywotności komórek wynikające z zastosowanego zabiegu.
RT-qPCR
Przeprowadzono analizę RT-qPCR w celu określenia poziomów ekspresji miR-486-3p oraz potwierdzenia wydajności nadekspresji lentiwirusowej w komórkach A549 i H358. Całkowity RNA wyizolowano przy użyciu odczynnika TRIzol zgodnie z instrukcjami producenta. Stężenie i czystość RNA oceniono spektrofotometrycznie, przyjmując stosunek A260/A280 w zakresie 1,8–2,1 za akceptowalny. Do analizy mRNA 1 µg całkowitego RNA poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA z wykorzystaniem komercyjnego zestawu do syntezy cDNA zgodnie z protokołem producenta. W przypadku analizy microRNA syntezę cDNA przeprowadzono z użyciem specyficznego dla miRNA primera do odwrotnej transkrypcji w formie stem-loop. Ilościowy PCR wykonano w całkowitej objętości reakcji 20 µL zawierającej 10 µL 2× SYBR Green Master Mix, 0,4 µM każdego primera oraz 2 µL matrycy cDNA. Protokół amplifikacji obejmował wstępny etap denaturacji w 95 °C przez 5 min, a następnie 40 cykli denaturacji w 95 °C przez 10 s oraz przyłączania/elongacji w 60 °C przez 30 s. Następnie przeprowadzono analizę krzywej topnienia w celu weryfikacji specyficzności amplifikacji. Małe jądrowe RNA U6 służyło jako kontrola wewnętrzna do ilościowego oznaczenia miRNA, natomiast GAPDH wykorzystano jako gen referencyjny do normalizacji mRNA. Względne poziomy ekspresji wyznaczono metodą 2−ΔΔCq.
Sekwencje primerów miRNA były następujące: primer do odwrotnej transkrypcji typu stem-loop, 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′; primer forward dla miR-486-3p, 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′; uniwersalny primer reverse, 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′; primer forward dla U6, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′ oraz primer reverse dla U6, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. Sekwencje primerów dla WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2 i GAPDH, wraz z długościami amplikonów i wydajnością amplifikacji, przedstawiono w Tabeli 1. Ekspresję mRNA znormalizowano względem GAPDH, natomiast ekspresję miR-486-3p znormalizowano względem U6. Każdy eksperyment obejmował trzy niezależne powtórzenia biologiczne, z trzema powtórzeniami technicznymi na każde powtórzenie biologiczne.
Western blotting
Po zakończeniu 7-dniowej selekcji puromycyną i okresie regeneracji komórki lizeowano w buforze RIPA zawierającym inhibitory proteaz. Stężenia białek określono za pomocą testu białkowego BCA. Równe ilości białka (20 µg na ścieżkę) rozdzielono na 10% żelach SDS-PAGE i przeniesiono na membrany PVDF metodą transferu mokrego przy 300 mA przez 120 min. Membrany blokowano 5% mlekiem odtłuszczonym przygotowanym w buforze Tris-buffered saline zawierającym 0,1% Tween-20 (TBST) przez 1 h w temperaturze pokojowej. Membrany inkubowano przez noc w 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko WNT5B (1:1 000), DVL1 (1:1 000), β-catenin (1:1 000), BCL-2 (0,5 µg/mL) lub β-actin (1:5 000). Producenci i numery katalogowe wszystkich przeciwciał podano w Tabeli Materiałów. Po trzykrotnym 10-minutowym płukaniu w TBST membrany inkubowano przez 1 h w temperaturze pokojowej z koniugowanym z HRP kozim przeciwciałem wtórnym przeciwko króliczemu IgG w rozcieńczeniu 1:5 000. Następnie membrany przemyto trzykrotnie buforem TBST, a prążki białkowe wizualizowano za pomocą substratu chemiluminescencyjnego i obrazowano przy użyciu systemu dokumentacji i obrazowania żeli. Intensywność prążków ilościowo określono programem ImageJ. Ilość każdego białka docelowego znormalizowano względem sygnału odpowiadającej mu β-actin z tej samej próbki biologicznej. Do analizy densytometrycznej wykorzystano wyłącznie ekspozycje w liniowym, nienasyconym zakresie detekcji. Przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty biologiczne.
Test CCK-8 (Cell Counting Kit-8)
Komórki A549 i H358 stabilnie transdukowane LV-NC lub LV-miR-486-3p wysiano na płytki 96-dołkowe w zagęszczeniu 1,5 × 104 komórek/dołek w 100 µL pełnej pożywki. Po przylgnięciu komórek przez noc pożywkę wymieniono, a absorbancję w czasie 0 h zmierzono niezwłocznie po dodaniu odczynnika Cell Counting Kit-8. W godzinach 0 h, 24 h, 48 h, 72 h i 96 h do każdego dołka dodano 10 µL odczynnika i inkubowano przez 1 h w 37 °C przed odczytem absorbancji przy 450 nm. Dla skorygowanej analizy przebiegu czasowego każdą grupę znormalizowano do jej własnej wartości w czasie 0 h przed wykreśleniem wyników. Przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty biologiczne, a wartości z powtórzeń technicznych w obrębie każdego eksperymentu uśredniono przed analizą statystyczną.
Test tworzenia kolonii
Stabilnie wyselekcjonowane komórki A549 i H358 przygotowano w formie zawiesiny pojedynczych komórek o stężeniu 5 × 102 komórek/mL. Do każdej studzienki płytki 6-dołkowej naniesiono jeden mililitr zawiesiny komórkowej, a następnie dodano 3 mL pożywki kompletnej. Komórki hodowano przez 14 dni, wymieniając pożywkę co 5 dni. Kolonie przemyto PBS, utrwalono 4% paraformaldehydem przez 20 min, zbarwiono fioletem krystalicznym przez 20 min, przemyto i wysuszono na powietrzu. W programie ImageJ policzono kolonie zawierające co najmniej 50 komórek. Przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty biologiczne.
UWAGA: Aby zapobiec sztucznemu skupianiu się komórek, wymagane jest przygotowanie jednorodnej zawiesiny pojedynczych komórek oraz minimalne zakłócanie płytki podczas tworzenia kolonii.
Test migracji komórek
Stabilnie transdukowane komórki A549 i H358 wysiano do płytek 6-dołkowych i hodowano do czasu powstania konfluentnej monowarstwy. Za pomocą sterylnej końcówki pipety o pojemności 10 µL wykonano liniowe zadrapanie, usunięto oderwane komórki, a następnie obrazowano te same wyznaczone pola w czasie 0 h, 24 h, 48 h i 72 h. Pole powierzchni rany zmierzono w programie ImageJ, a stopień zamknięcia rany obliczono według wzoru: (pole w 0 h − pole w wskazanym punkcie czasowym) / pole w 0 h × 100%. Przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty biologiczne. Nie stosowano farmakologicznych blokerów proliferacji, w związku z czym wynik testu interpretowano jako pomiar zamknięcia rany, a nie jako odczyt specyficzny dla migracji.
UWAGA: Zadrapania powinny być wykonywane z zachowaniem stałej szerokości i nacisku, a w trakcie całego przebiegu czasowego należy obserwować te same pola.
Test inwazji komórkowej
Testy inwazji Transwell przeprowadzono przy użyciu wkładek z membraną poliwęglanową w płytkach 24-dołkowych o rozmiarze porów 8 µm. Górną powierzchnię każdej wkładki pokryto 100 µL macierzy błony podstawnej Matrigel rozcieńczonej 1:8 w bezsurowiczym medium DMEM do przybliżonego stężenia końcowego białka 1 mg/mL i inkubowano w 37 °C przez 4 h. Komórki A549 i H358 resuspendowano w bezsurowiczym medium RPMI-1640 w zagęszczeniach odpowiednio 8 × 105 komórek/mL i 4 × 105 komórek/mL. Do górnej komory dodano 200 µL alikwotu zawiesiny komórkowej, co odpowiadało 1,6 × 105 komórek A549 lub 8 × 104 komórek H358 na wkładkę. Dolną komorę wypełniono 500 µL medium RPMI-1640 zawierającego 20% płodowej surowicy bydlęcej jako chemoatraktanta. Po inkubacji w 37 °C w nawilżonej atmosferze zawierającej 5% CO₂ przez 48 h, komórki nieinwazyjne pozostałe na górnej powierzchni membrany delikatnie usunięto patyczkiem bawełnianym. Komórki, które przeniknęły przez membranę, utrwalono 4% paraformaldehydem przez 20 min i zabarwiono 0,1% fioletem krystalicznym przez 20 min w temperaturze pokojowej. Dla każdej wkładki wykonano zdjęcia pięciu losowo wybranych pól mikroskopowych, a liczbę inwazyjnych komórek określono za pomocą programu ImageJ. Średnią liczbę komórek z pięciu pól uznano za jedną wartość dla każdej wkładki, a jako jednostkę eksperymentalną traktowano wkładkę, a nie pojedyncze pole mikroskopowe. Wykonano trzy niezależne eksperymenty biologiczne.
UWAGA: Należy ostrożnie i konsekwentnie usuwać komórki, które nie zainwadowały, aby uniknąć uszkodzenia membrany lub odczepienia komórek, które zmigrowały na jej dolną powierzchnię.
Analiza statystyczna
Dane przedstawiono jako średnia ± SD, a n oznacza niezależne eksperymenty biologiczne, chyba że zaznaczono inaczej. Powtórzenia techniczne lub wiele pól mikroskopowych z tej samej jednostki eksperymentalnej uśredniono przed wykonaniem testów wnioskowania. Do porównania trzech linii komórkowych zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie parzyste porównania z poprawką Tukeya. W przypadku przebiegów czasowych testu CCK-8 oraz czasu zamykania rany zastosowano dwuczynnikową analizę wariancji z powtarzanymi pomiarami w celu oceny wpływu traktowania, czasu oraz interakcji traktowanie-czas, a następnie porównania z poprawką Šídáka w poszczególnych punktach czasowych. Porównania dwóch grup analizowano za pomocą dwustronnych nieparzystych testów t Studenta. Analizy statystyczne i wizualizacja danych zostały wykonane przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej i tworzenia wykresów. Dokładne wartości p podano na panelach rycin lub w tabelach danych źródłowych. Istotność statystyczną określono jako p < 0,05; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 oraz ****p < 0,0001.
Wyniki
Analiza TCGA/starBase wykazuje obniżoną zawartość miR-486-3p w LUAD, a TargetScan identyfikuje potencjalne miejsca wiązania
Dane dotyczące ekspresji pochodzące z TCGA, uzyskane za pośrednictwem bazy starBase v3.0, wykazały, że miR-486-3p obfitość była znacznie niższa w 512 próbkach gruczolakowatego raka płuca (LUAD) niż w 20 nieguzowych próbkach płuca (test sum rang Wilcoxona, p = 3.2 × 10⁻5; Rysunek 1). Program TargetScanHuman zidentyfikował słabo konserwowaną potencjalną sekwencję wiązania typu 7mer-m8 dla miR-486-3p w pozycjach 468–474 DVL1 niezakodowany region 3′ (3′ UTR), z wynikiem context++ wynoszącym −0,23 oraz percentylem wyniku context++ na poziomie 80. Słabo zakonserwowaną potencjalną sekwencję wiążącą typu 8mer zidentyfikowano w pozycjach 913–920 WNT5B 3′ UTR, z wynikiem context++ wynoszącym −0,46 i percentylem wyniku context++ równym 97 (Rycina 2). Te przewidziane obliczeniowo miejsca posłużyły do sformułowania hipotezy eksperymentalnej i nie były traktowane jako dowód bezpośredniego wiązania miRNA z celem. Adresy URL źródeł podano w Tabela 2.
Poziom miR-486-3p jest obniżony w liniach komórkowych LUAD i wyraźnie zwiększony po transdukcji lentiwirusem
W ich odpowiednich rutynowych warunkach hodowli, analiza RT-qPCR wykazała, że poziom miR-486-3p był niższy w komórkach A549 i H358 niż w komórkach nabłonka oskrzelowego Beas-2b. Porównania z korektą Tukeya po jednoczynnikowej analizie wariancji wykazały istotne różnice pomiędzy komórkami A549 a Beas-2b (p < 0,01) oraz pomiędzy komórkami H358 a Beas-2b (p < 0,01; Rysunek 3A).
Stabilna transdukcja za pomocą LV-miR-486-3p znacznie zwiększyła poziom miR-486-3p w stosunku do odpowiadających im grup LV-NC. Ekspresja wzrosła około 1470-krotnie w komórkach A549 i 20-krotnie w komórkach H358, przy czym oba porównania osiągnęły istotność statystyczną (p < 0,01; Rysunek 3B,C). Wyniki te potwierdziły pomyślne stworzenie stabilnych modeli komórkowych z nadekspresją miR-486-3p.
Wymuszona ekspresja miR-486-3p wiąże się ze zmniejszoną ekspresją WNT5B, DVL1, β-kateniny i BCL-2
Analiza Western blotting wykazała niższą zawartość białek WNT5B, DVL1, całkowitej β-kateniny oraz BCL-2 w komórkach transdukowanych LV-miR-486-3p w porównaniu z odpowiednimi kontrolami LV-NC (Rysunek 4A–E). W komórkach A549 wymuszona ekspresja miR-486-3p wiązała się ze zmniejszoną zawartością białek β-kateniny (p = 0,02), WNT5B (p = 0,008), DVL1 (p = 0,019) oraz BCL-2 (p = 0,017). Odpowiednie spadki zaobserwowano również w komórkach H358 dla β-kateniny (p = 0,01), WNT5B (p = 0,002), DVL1 (p = 0,003) oraz BCL-2 (p = 0,018).
Następnie przeprowadzono analizę RT-qPCR, aby ustalić, czy zmianom na poziomie białek towarzyszyły zmiany na poziomie transkrypcji (Rycina 4F–I). W komórkach A549 wymuszona ekspresja miR-486-3p zredukowała poziom mRNA CTNNB1 do 0,26-krotności w stosunku do grupy LV-NC (p = 0,004), mRNA WNT5B do 0,180-krotności (p = 0,04), mRNA DVL1 do 0,278-krotności (p = 0,06) oraz mRNA BCL2 do 0,259-krotności (p = 0,03).
Podobne zmiany na poziomie transkrypcji wykryto w komórkach H358. Poziom mRNA CTNNB1 spadł do 0,28-krotności w stosunku do grupy LV-NC (p = 0,028), mRNA WNT5B do 0,250-krotności (p = 0,019), mRNA DVL1 do 0,271-krotności (p = 0,020), a mRNA BCL2 do 0,534-krotności (p = 0,03). Zatem kierunek zmian na poziomie transkrypcji był zgodny z odpowiadającymi im wynikami na poziomie białek w obu liniach komórkowych. Wyniki te wskazują na skoordynowane zmiany w ekspresji, lecz nie dowodzą bezpośredniego celowania ani aktywności liniowego mechanizmu sygnałowego WNT5B/DVL1/β-catenin.
Wymuszona ekspresja miR-486-3p redukuje sygnał CCK-8 związany z wzrostem
Pomiary CCK-8 znormalizowano do odpowiadającej im wartości z godziny 0 dla każdej grupy eksperymentalnej. Znormalizowany sygnał CCK-8 wzrastał w czasie zarówno w komórkach transdukowanych LV-NC, jak i LV-miR-486-3p, jednak zazwyczaj obserwowano niższe wartości po wymuszonej ekspresji miR-486-3p (Rycina 5).
W komórkach A549 porównania z zastosowaniem poprawki Šídáka po dwuczynnikowej analizie wariancji z powtarzanymi pomiarami wykazały istotnie niższe sygnały CCK-8 w grupie LV-miR-486-3p po 24, 48 i 96 h niż w grupie LV-NC (p < 0,05), natomiast różnica po 72 h nie była istotna statystycznie (Rysunek 5A). W komórkach H358 sygnał CCK-8 był istotnie niższy w grupie LV-miR-486-3p po 24, 48, 72 i 96 h (p < 0,05; Rysunek 5B). Wyniki te wskazują, że wymuszona ekspresja miR-486-3p zredukowała związaną ze wzrostem aktywność metaboliczną, wykazując bardziej spójny efekt w przebiegu czasowym dla komórek H358.
Wymuszona ekspresja miR-486-3p redukuje wzrost klonogenny
Przeprowadzono testy tworzenia kolonii w celu oceny długoterminowego wzrostu klonogennego. Komórki A549 transdukowane LV-miR-486-3p tworzyły znacznie mniej kolonii niż odpowiadające im komórki LV-NC (p = 0,013; Rysunek 6A). Znaczną redukcję liczby kolonii zaobserwowano również w komórkach H358 (p = 0,06; Rysunek 6B). Redukcja była bardziej wyraźna w komórkach H358 niż w komórkach A549, co wskazuje, że skala efektu klonogennego różniła się pomiędzy tymi dwoma modelami LUAD.
Wymuszona ekspresja miR-486-3p hamuje gojenie rany
Zamknięcie rany ilościowo określono po 24 h, 48 h i 72 h od wykonania zacięcia (Rysunek 7). W hodowlach A549 grupa LV-miR-486-3p wykazała istotnie niższy stopień zamknięcia rany niż grupa LV-NC w 24, 48 i 72 h (p < 0,05 dla każdego porównania; Rysunek 7A,C).
Podobnie, zamknięcie rany było zmniejszone w kulturach H358 transdukowanych LV-miR-486-3p po 24 h i 48 h (p < 0,05) oraz po 72 h (p < 0,01; Rysunek 7B,D). Ponieważ test przeprowadzono bez zastosowania farmakologicznego inhibitora proliferacji, wyniki te zinterpretowano jako zmniejszone zamknięcie rany, a nie jako dowód na efekt wyłącznie specyficzny dla migracji.
Wymuszona ekspresja miR-486-3p redukuje przenikanie przez membrany pokryte Matrigelami
Zdolność komórek do przenikania przez membrany Transwell pokryte Matrigelem oceniono po 48 h. W grupie A549 LV-miR-486-3p na dolnej powierzchni membrany wykryto znacznie mniej komórek zabarwionych fioletem krystalicznym niż w grupie A549 LV-NC (p = 0,01; Rysunek 8A). Podobny spadek zaobserwowano w komórkach H358 (p = 0,07; Rysunek 8B).
Dla każdego insertu wyciągnięto średnią z pięciu pól mikroskopowych, a insert potraktowano jako jednostkę eksperymentalną. Wyniki te wykazują zmniejszoną zdolność do przenikania przez membrany powlekane Matrigel po wymuszonej ekspresji miR-486-3p w warunkach zastosowanych w tym teście.
DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:
Wszystkie dane źródłowe stanowiące podstawę rycin znajdują się w Supplementary File 1, w tym pliki źródłowe bazy danych, dane RT-qPCR, nieprzycięte obrazowania Western blot, wartości densytometryczne, obrazy mikroskopowe, zapisy z liczenia, pomiary CCK-8 oraz pliki z analizą statystyczną.
Rycina 1Obfitość miR-486-3p w próbkach LUAD oraz prawidłowych próbkach płuc z bazy danych TCGA/starBase. Dane dotyczące ekspresji pochodzące z TCGA zostały pobrane za pośrednictwem starBase v3.0 w maju 2026 roku i obejmowały 512 próbek gruczolaka płuca (LUAD) oraz 20 próbek prawidłowej tkanki płuca. Grupy porównano za pomocą testu sum rang Wilcoxona (p = 3.2 × 10⁻5). LUAD, gruczolak płuca. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rysunek 2przewidziane przez TargetScan potencjalne miejsca wiązania miR-486-3p w DVL1 i WNT5B Regiony 3′ UTR. Program TargetScanHuman zidentyfikował potencjalną sekwencję wiązania typu 7mer-m8 w pozycjach 468–474 DVL1 region 3′ nietranslacyjny (3′ UTR) oraz potencjalna sekwencja 8mer w pozycjach 913–920 WNT5B 3′ UTR. Adresy URL źródeł znajdują się w Tabela 2Przewidywania obliczeniowe te posłużyły do sformułowania hipotez i nie stanowią dowodu eksperymentalnego na bezpośrednie wiązanie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3Poziom wyjściowy miR-486-3p oraz weryfikacja nadekspresji lentiwirusowej. (A) Analiza RT-qPCR w celu określenia miR-486-3p obecność w komórkach A549, H358 i Beas-2b hodowanych w ich odpowiednich rutynowych pożywkach hodowlanych. (B,C) weryfikacja metodą RT-qPCR miR-486-3p nadekspresja w A549 (B) oraz H358 (C) komórki transdukowane LV-NC lub LV-miR-486-3p. Ekspresję znormowano do U6. Dane przedstawiono jako średnia ± SD z trzech niezależnych eksperymentów biologicznych. (A) poddano analizie za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie przeprowadzono wielokrotne porównania z zastosowaniem poprawki Tukeya. (B, C) poddano analizie przy użyciu obustronnego nieparzystego testu t Studenta t-testy. *p < 0.01; **p < 0.01. LV-NC, lentiwirus kontrolny ujemny; RT-qPCR, ilościowa PCR z odwrotną transkrypcją; SD, odchylenie standardowe. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4Wymuszona ekspresja miR-486-3p wiąże się z obniżoną ekspresją genu kandydującego. (A) Reprezentatywne analizy Western blot wykazujące zawartość β-kateniny, WNT5B, DVL1, BCL-2 oraz β-aktyny w komórkach A549 i H358 transdukowanych LV-NC lub LV-miR-486-3p. Masy cząsteczkowe podano w kilodaltonach. (B–E) Ilościowe oznaczenie densytometryczne β-kateniny (B), WNT5B (C), DVL1 (D), i BCL-2 (E), znormalizowane do β-aktyny. (F–I) analiza RT-qPCR CTNNB1 (F), WNT5B (G), DVL1 (H), oraz BCL2 (I) obfitość transkryptów, znormalizowana względem GAPDHDane przedstawiono jako średnia ± SD z trzech niezależnych eksperymentów biologicznych; poszczególne punkty reprezentują niezależne powtórzenia biologiczne. Grupy porównywano za pomocą obustronnego nieparzystego testu t-Studenta t-testy. Dokładne pWartości p oraz krotność zmian (fold change) przedstawiono na odpowiadających im panelach. kDa, kilodaltony; LV-NC, lentiwirus kontrolny ujemny; RT-qPCR, ilościowa PCR z odwrotną transkrypcją; SD, odchylenie standardowe. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.
Rycina 5Wymuszona ekspresja miR-486-3p zmniejsza sygnały CCK-8 związane z wzrostem w czasie. A549 (A) oraz H358 (Bkomórki transdukowane LV-NC lub LV-miR-486-3p analizowano w punktach czasowych 0 h, 24 h, 48 h, 72 h i 96 h. Wartości OD450 znormalizowano do odpowiadającej im wartości z godziny 0 w obrębie każdej grupy. Dane przedstawiono jako średnia ± SD z trzech niezależnych eksperymentów biologicznych. Wpływ traktowania, czasu oraz interakcję między traktowaniem a czasem analizowano za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami, a następnie przeprowadzono porównania między grupami w każdym punkcie czasowym z zastosowaniem poprawki Šídáka. *p < 0,05. CCK-8, zestaw do liczenia komórek 8; LV-NC, negatywny lentiwirus kontrolny; OD450, gęstość optyczna przy 450 nm; SD, odchylenie standardowe. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 6Wymuszona ekspresja miR-486-3p ogranicza wzrost klonogenny. Przedstawiono reprezentatywne obrazy całych studzienek oraz ilościowe zliczenia kolonii dla A549 (A) oraz H358 (B) komórki transdukowane LV-NC lub LV-miR-486-3p. Liczbę kolonii określono za pomocą programu ImageJ, stosując identyczne ustawienia analizy dla wszystkich grup. Dane przedstawiono jako średnia ± SD z trzech niezależnych eksperymentów biologicznych i przeanalizowano przy użyciu dwustronnego nieparzystego testu t Studenta t-testy. Dokładne pWartości p są podane na odpowiednich panelach. LV-NC: lentiwirus kontrolny negatywny; SD: odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 7Wymuszona ekspresja miR-486-3p ogranicza zamykanie się rany. Przedstawiono reprezentatywne obrazy oraz ilościowe pomiary zamykania rany dla A549 (A,C) oraz H358 (B,D) komórki w 0 h, 24 h, 48 h i 72 h po wykonaniu zarysowania. Zamknięcie rany obliczono według następującego wzoru: (pole rany w 0 h − pole rany w wskazanym punkcie czasowym) / pole rany w 0 h × 10%. Dane przedstawiono jako średnia ± SD z trzech niezależnych eksperymentów biologicznych. Efekty leczenia, czasu oraz interakcji leczenie-czas przeanalizowano za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami, a następnie zastosowano porównania między grupami w każdym punkcie czasowym z korektą według testu Šídáka. Paski skali, 200 µm. *p < 0.05; **p < 0,01. LV-NC, lentiwirus kontrolny ujemny; SD, odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 8Wymuszona ekspresja miR-486-3p ogranicza przenikanie przez membrany Transwell pokryte Matrigelem. Przedstawiono reprezentatywne pola mikroskopowe barwione fioletem krystalicznym oraz ilościowe zliczenia komórek na poziomie wkładki dla A549 (A) oraz H358 (B) komórki transdukowane LV-NC lub LV-miR-486-3p. Wkładki Transwell z 8-µm wykorzystano wielkość porów. Dla każdego insertu wyciągnięto średnią z pięciu pól mikroskopowych, a każdy insert traktowano jako jedną jednostkę eksperymentalną. Dane przedstawiono jako średnia ± SD z trzech niezależnych eksperymentów biologicznych; analizę przeprowadzono przy użyciu obustronnego nieparzystego testu t Studenta t-testy. Paski skali, 200 µmDokładny pWartości p są podane w odpowiednich panelach. LV-NC – lentiwirus kontrolny ujemny; SD – odchylenie standardowe. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Gen | Sekwencje starterów | Długość amplikonów | Wydajność amplifikacji | |
| WNT5B | Forward: 5'-AAATGCCACGGCGTCTCG-3', | 18 bp | 101% | |
| Reverse: 5'-GGGTGAAGCGGCTGTTGA-3' | ||||
| DVL1 | Forward: 5'-GAGGGTGCTCACTCGGATG-3', | 158 bp | 95.60% | |
| Reverse: 5'-GTGCCTGTCTCGTTGTCCA-3' | ||||
| CTNNB1 | Forward: 5'- GCGCCATTTTAAGCCTCG -3', | 140 bp | 96.30% | |
| Reverse: 5'-AAATACCCTCAGGGGAACAGG-3' | ||||
| BCL2 | Forward: 5'- GTCATGTGGAGCGT-3', | 139 bp | 97.20% | |
| Reverse: 5'-ATAGTTCCACAAAGGCATCC-3' | ||||
| GAPDH | Forward: 5'-GACTTCAACAGCAACTCCCACTC-3', | 107 bp | 98.30% | |
| Reverse: 5'-TAGCCGTATTCATTGTCATACCAG-3' | ||||
Tabela 1: Sekwencje starterów użytych do RT-qPCR.
| Cel | Informacje o przewidywaniu | Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. | ||
| DVL1 | 7-mer-m8, pozycje 468–474 | URL TargetScan (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST00397196.2&taxid=9606&członkowie=miR-486-3p&showcnc=1& wyświetlona liczba = 1&wyświetl_nc=1&wyświetlcf1=1&pokazywaniecf2=1&podzbiór=1) | ||
| WNT5B | 8-mer, pozycje 913–920 | Adres URL TargetScan (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST0037891.5&taxid=9606&członkowie=miR-486-3p&showcnc=1& wyświetl zawartość=1&pokazanc_nc=1&pokazanycf1=1&wyświetlcf2=1&podzbiór=1) | ||
Tabela 2: Baza danych TargetScan i odpowiadający jej adres URL.
Plik uzupełniający 1: Dane wspierające wyniki niniejszego badania.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Niniejsze badanie typu gain-of-function oceniało efekty stabilnej, wymuszonej ekspresji miR-486-3p w komórkach gruczolakoraka płuca (LUAD) linii A549 i H358. W obu modelach nadekspresja miR-486-3p wiązała się z obniżeniem sygnałów CCK-8 związanych z wzrostem, zmniejszonym wzrostem klonogennym, wolniejszyme gojeniem rany oraz mniejszą liczbą komórek migrujących przez membrany Transwell pokryte Matrigelem. Zmianom fenotypowym tym towarzyszyło obniżenie poziomu białek WNT5B, DVL1, całkowitej β-kateniny oraz BCL-2, wraz z niższymi poziomami transkrypcji WNT5B, DVL1, CTNNB1 oraz BCL2. Zbiorczo wyniki te potwierdzają związek między wymuszoną ekspresją miR-486-3p, osłabieniem kilku fenotypów komórek złośliwych a skoordynowanymi zmianami w wybranych cząsteczkach związanych z szlakiem Wnt. Nie ustalają one jednak bezpośredniego wiązania miRNA z celem, aktywności szlaku ani przyczynowej sekwencji sygnalizacyjnej.
Ogólny fenotyp supresji nowotworowej zaobserwowany w niniejszym badaniu jest zgodny z wcześniejszymi doniesieniami i nie powinien być interpretowany jako główny, nowy wniosek. Tomioka i wsp. wykazali wcześniej, że zarówno miR-486-3p, jak i miR-486-5p hamują fenotypy złośliwe w komórkach LUAD i zidentyfikowali GINS4 za pomocą bezstronnej strategii przesiewowej celów molekularnych26. Wkład niniejszego badania jest bardziej specyficzny: wymuszona ekspresja miR-486-3p wiązała się z redukcją poziomu WNT5B, DVL1 i β-kateniny w dwóch modelach komórkowych LUAD. Ponadto badanie przedstawia zintegrowany schemat doświadczalny łączący stabilną transdukcję lentiwirusową, RT-qPCR, western blotting, analizę CCK-8, tworzenie kolonii, testy gojenia ran (wound closure) oraz testy Transwell z powłoką z Matrigelu. Rozróżnienie to jest istotne, ponieważ niniejsza praca rozszerza obserwacje molekularne związane z nadekspresją miR-486-3p, nie pretendując do bycia pierwszym dowodem na jego działanie przeciwnowotworowe w LUAD.
Wnioski dotyczące szlaku Wnt wymagają ostrożnej interpretacji. WNT5B jest powszechnie opisywany jako niekanoniczny ligand Wnt i może aktywować sygnalizację polarności komórkowej (PCP) lub szlak Wnt/Ca2⁺ w sposób zależny od receptora i kontekstu. W niektórych układach komórkowych niekanoniczna sygnalizacja Wnt może również antagonistować sygnalizację zależną od β-kateniny10,11. DVL1 jest wspólnym wewnątrzkomórkowym mediatorem, który może uczestniczyć zarówno w kanonicznej, jak i niekanonicznej sygnalizacji Wnt i był wiązany z fenotypami związanymi z β-kateniną w niedrobnokomórkowym raku płuca12. Zatem jednoczesna redukcja WNT5B, DVL1 i całkowitej ilości β-kateniny nie dowodzi istnienia liniowego szlaku WNT5B→DVL1→β-katenina. Przedstawione dane wskazują natomiast na współwystępujący spadek ekspresji WNT5B oraz poziomu DVL1 i β-kateniny po wymuszonej ekspresji miR-486-3p.
Wyniki na poziomie transkrypcyjnym były spójne z wynikami analizy Western blot pod względem kierunku zmian. Wymuszona ekspresja miR-486-3p zmniejszyła obfitość transkryptów WNT5B, DVL1 i CTNNB1 w komórkach A549 oraz H358. Ta zgodność sugeruje, że obserwowane zmiany w białkach mogą towarzyszyć zmianom w obfitości transkryptów, a nie wynikać wyłącznie ze zmian w stabilności białek. Niemniej jednak, obniżone poziomy transkryptów i białek nie potwierdzają bezpośredniego wiązania miR-486-3p z przewidywanymi 3′ niezakodowanymi regionami. Do ustalenia, czy WNT5B lub DVL1 są bezpośrednio regulowane przez miR-486-3p, wymagane byłyby badania z użyciem podwójnego reportera lucyferazy z wykorzystaniem miejsc wiązania typu dzikiego oraz zmutowanych, a także eksperymenty ratunkowe. Podobnie, zmniejszenie obfitości BCL-2 wskazuje na zmianę w białku związanym z przeżyciem, ale w obliczu braku zwalidowanych testów śmierci komórkowej nie może być interpretowane jako dowód na zwiększoną apoptozę.
Testy funkcjonalne mają również ograniczenia specyficzne dla danej metody. Test CCK-8 mierzy aktywność metaboliczną komórek, a nie bezpośrednio liczbę komórek, a zmiany absorbancji mogą odzwierciedlać zmiany w proliferacji, metabolizmie lub żywotności. Tworzenie kolonii pozwala na długoterminowy pomiar zdolności klonogennej, jednak skala efektu różniła się pomiędzy obiema liniami komórkowymi – odnotowano niewielki spadek w komórkach A549 i większy spadek w komórkach H358. Różnica ta sugeruje, że odpowiedź na wymuszoną ekspresję miR-486-3p może zależeć od kontekstu molekularnego i komórkowego.
W obu liniach komórkowych zaobserwowano zmniejszone zamykanie rany, jednak podczas testu nie zastosowano inhibitora proliferacji. Ponieważ wymuszona ekspresja miR-486-3p wpłynęła również na pomiary związane ze wzrostem, do fenotypu zamykania rany mógł przyczynić się zmniejszony poziom proliferacji. Wyniki należy zatem interpretować jako zmniejszone zamykanie rany, a nie jako efekt specyficzny dla migracji. Podobnie, test Transwell z powłoką z Matrigelu trwający 48 h może być pod wpływem różnic w przechodzeniu przez błonę, proliferacji, przeżywalności lub adhezji. Zaobserwowany spadek liczby komórek na dolnej powierzchni błony potwierdza w konsekwencji upośledzone przechodzenie w testowanych warunkach, ale nie pozwala na wyizolowanie konkretnego mechanizmu inwazji.
Dodatkowym aspektem do rozważenia jest skala nadekspresji miR-486-3p. Transdukcja lentiwirusowa zwiększyła poziom miR-486-3p około 1470-krotnie w komórkach A549 i 220-krotnie w komórkach H358 w stosunku do odpowiednich grup kontrolnych. Tak suprafizjologiczna ekspresja może zwiększać zależną od sekwencji seed represję efektów off-target, wpływać na dostępność komponentów kompleksu RISC (RNA-induced silencing complex) lub indukować nieswoisty stres komórkowy. Ponieważ nie przeprowadzono serii badań zależnych od dawki, nie można było określić związku między poziomem miR-486-3p a obserwowanymi fenotypami. Ponadto brak eksperymentu typu loss-of-function z wykorzystaniem inhibitora uniemożliwia wyciągnięcie wniosków dotyczących endogennej roli fizjologicznej miR-486-3p w komórkach LUAD. Przedstawione wyniki należy zatem interpretować ściśle jako konsekwencje stabilnej, wymuszonej nadekspresji.
Należy wziąć pod uwagę kilka ograniczeń. zbadano tylko dwie linie komórkowe LUAD z mutacją KRAS, a stosowanie różnych rutynowych pożywek ogranicza interpretację porównań z komórkami Beas-2b. W trakcie badania nie przeprowadzono autentykacji linii komórkowych ani testów na obecność Mycoplasma, a jako jedyny punkt odniesienia do ilościowego oznaczania miR-486-3p wykorzystano U6. W badaniu zabrakło również testów utraty funkcji, testów zależności dawka-odpowiedź, analiz z użyciem reporterów, doświadczeń typu rescue oraz funkcjonalnych analiz szlaku Wnt. Co więcej, wyniki testu gojenia rany i testu Transwell mogły zostać beeinflencjonowane przez różnice w proliferacji, żywotności lub adhezji. Wreszcie nie uwzględniono modeli zwierzęcych, próbek pacjentów ani kohort walidacji klinicznej. W związku z tym wnioski ograniczają się do tego systemu wymuszonej ekspresji in vitro i nie potwierdzają bezpośredniego targetowania, przyczynowości szlaku ani użyteczności klinicznej.
Podsumowując, stabilna wymuszona ekspresja miR-486-3p spowodowała obniżenie kilku parametrów związanych z wzrostem i mobilnością w komórkach LUAD A549 i H358, czemu towarzyszyła niższa ekspresja WNT5B, DVL1, całkowitej β-catenin oraz BCL-2. Wyniki te stanowią podstawę do dalszych badań mechanistycznych, jednak nie potwierdzają, że WNT5B lub DVL1 są bezpośrednimi celami, nie dowodzą istnienia liniowego szlaku WNT5B/DVL1/β-catenin ani nie określają wartości klinicznej miR-486-3p.
Oświadczenia
Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Wsparcie finansowe dla niniejszego badania zapewniły Plan Nauki i Technologii Medycznej i Zdrowotnej Prowincji Zhejiang (2025KY349) oraz Kluczowa Dyscyplina Wspierająca Miasta Jiaxing (2023-zc-014).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | Przygotowanie żelu skupiającego SDS-PAGE |
| 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) | Solarbio | T1010 | Przygotowanie żelu rozdzielczego SDS-PAGE |
| 20× bufor TBS | Solarbio | 71080 | Bufor roboczy do przemywania western blot i rozcieńczania przeciwciał |
| 30% roztwór akrylamidu/bis-akrylamidu (29:1) | Solarbio | A1010 | Przygotowanie żeli SDS-PAGE |
| 4% utrwalacz paraformaldehydowy | Servicebio | G1101 | Utrwalanie do testów tworzenia kolonii i testów Transwell |
| 5× bufor do nakładania białek | Beyotime | P0015 | Przygotowanie próbek białek do SDS-PAGE |
| Wodoropersulfian amonu | Solarbio | 427A038 | Inicjator polimeryzacji żelu SDS-PAGE |
| Zestaw do oznaczania białek BCA | Beyotime | P0009-1 | Oznaczanie stężenia białka |
| Przeciwciało BCL-2 | Boster Biological Technology | A00040-2 | Królicze przeciwciało poliklonalne; western blotting w rozcieńczeniu 1:5 000 |
| Zestaw do liczenia komórek-8 (CCK-8) | TargetMol | C0005 | Test aktywności metabolicznej związanej ze wzrostem komórek; 10 μL na 100 μL pożywki hodowlanej |
| System obrazowania chemiluminescencyjnego | Bio-Rad | ChemiDoc MP | Obrazowanie western blot |
| Chloroform | Servicebio | G3005 | Rozdział faz podczas ekstrakcji RNA metodą TRIzol |
| Roztwór barwiący fioletem krystalicznym | Servicebio | G1014 | Barwienie kolonii i membran Transwell |
| DMEM | Servicebio | G4511 | Standardowa pożywka hodowlana dla komórek Beas-2b |
| Przeciwciało DVL1 | Signalway Antibody | 53180 | Królicze przeciwciało pierwotne; western blotting w rozcieńczeniu 1:5 000 |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Biosharp | BL203B | Suplement 10% (v/v) do rutynowej hodowli komórkowej; 20% (v/v) w dolnej komorze Transwell |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | Version 8 | Przygotowanie wykresów i analiza statystyczna |
| Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | Yeasen Biotechnology | 11201ES08 | Ilościowa PCR oparta na SYBR Green |
| Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | Yeasen Biotechnology | 11141ES60 | Transkrypcja odwrotna dla mRNA RT-qPCR |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Version 22.0 | Analiza statystyczna |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.53 | Densytometria western blot, pomiar powierzchni rany, liczenie kolonii i liczenie komórek Transwell |
| Mikroskop odwrócony | Olympus | CKX53 | Obrazowanie testów gojenia ran i testów Transwell |
| Izopropanol | Servicebio | G3006 | Wytrącanie RNA podczas ekstrakcji metodą TRIzol |
| Preparaty lentiwirusowe LV-miR-486-3p i LV-NC | GenePharma | Custom synthesis | Stabilny wektor nadekspresyjny miR-486-3p i wektor kontrolny ulegający przetasowaniu |
| Macierz błony podstawnej Matrigel | Corning | 354234 | Rozcieńczona 1:8 w DMEM bez surowicy; końcowe stężenie białka około 1 mg/mL |
| Metanol | Xilong Scientific | GB/T 683-2006 | Aktywacja membrany PVDF |
| Czytnik mikropłytek | BioTek | ELx800 | Pomiar absorbancji przy 450 nm |
| Mikroobjętościowy spektrofotometr UV-Vis | Allsheng | Nano-600 | Ocena stężenia RNA i czystości A260/A280 |
| Penicylina-streptomycyna | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Suplement 1% (v/v) do rutynowej hodowli komórkowej |
| Bufor fosforanowy (PBS) | Servicebio | G0002 | Przemywanie komórek i membran |
| Koktajl inhibitorów proteaz | APExBIO | K1007 | Dodany do buforu lizującego RIPA |
| Marker białek | Biosharp | BL712A | Referencja masy cząsteczkowej dla western blotting |
| Membrana PVDF | Millipore | K2MA8350E | Membrana do transferu białek dla western blotting |
| System PCR czasu rzeczywistego QuantStudio 5 | Thermo Fisher Scientific | QuantStudio 5 | Pozyskiwanie danych RT-qPCR |
| Bufor lizujący RIPA | Beyotime | P0013B | Ekstrakcja całkowitego białka komórkowego |
| Odczynnik do ekstrakcji RNA (typu TRIzol) | Servicebio | G3013 | Ekstrakcja całkowitego RNA |
| Pożywka RPMI 1640 | Servicebio | G4510 | Standardowa pożywka hodowlana dla komórek A549 i H358 oraz bezsurowicza zawiesina komórek Transwell |
| SDS | Solarbio | S8010 | Odczynnik do SDS-PAGE |
| Mleko w proszku odtłuszczone | BD | 2271470 | 5% roztwór blokujący do western blotting |
| StarBase v3.0 | Sun Yat-sen University | https://rnasysu.com/encori/ | Analiza ekspresji miR-486-3p na podstawie danych TCGA |
| TargetScanHuman | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://www.targetscan.org/vert_80/ | Przewidywanie potencjalnych miejsc wiązania miR-486-3p |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T8090 | Katalizator polimeryzacji żelu SDS-PAGE |
| Wkładki Transwell, 24-dołkowe, wielkość porów 8 μm | Corning | 3428 | Test migracji przez membranę powlekaną Matrigel |
| Trypsyna | Servicebio | G4000 | Odrywanie komórek |
| Tween-20 | Solarbio | 815A043 | Przygotowanie buforu do przemywania western blot |
| Pionowy system elektroforetyczny | Liuyi Biotechnology | DYCZ-24DN | Rozdział białek metodą SDS-PAGE |
| Odczynnik luminolowy HRP do western blot | Affinity Biosciences | KF001 | Chemiluminescencyjna detekcja western blot |
| System transferu mokrego | Bio-Rad | 1703930 | Transfer białek na membranę PVDF |
| Przeciwciało WNT5B | Signalway Antibody | 56808 | Królicze przeciwciało pierwotne; western blotting w rozcieńczeniu 1:5 000 |
| β-aktyna przeciwciało | Abcam | ab8227 | Kontrola ładowania; western blotting w rozcieńczeniu 1:5 000 |
| β-katenina przeciwciało | Signalway Antibody | 21725 | Królicze przeciwciało pierwotne; western blotting w rozcieńczeniu 1:5 000 |
Bibliografia
- Herbst RS, Heymach JV, Lippman SM. Lung cancer. N Engl J Med. 2008;359(13):1367-1380.
- Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin. 2019;69(1):7-34.
- Han B, et al. Cancer incidence and mortality in China, 2022. J Natl Cancer Cent. 2024;4(1):47-53.
- Lin JJ, et al. Five-year survival in EGFR-mutant metastatic lung adenocarcinoma treated with EGFR-TKIs. J Thorac Oncol. 2016;11(4):556-565.
- She J, Yang P, Hong Q, Bai C. Lung cancer in China: challenges and interventions. Chest. 2013;143(4):1117-1126.
- Barker N, Clevers H. Mining the Wnt pathway for cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2006;5(12):997-1014.
- Komiya Y, Habas R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 2008;4(2):68-75.
- Stewart DJ. Wnt signaling pathway in non-small cell lung cancer. J Natl Cancer Inst. 2014;106(1):djt356.
- Zhang Z, et al. Wnt/β-catenin signaling in the development and therapeutic resistance of non-small cell lung cancer. J Transl Med. 2024;22(1):565.
- Zhang Q, et al. WNT5B exerts oncogenic effects and is negatively regulated by miR-5587-3p in lung adenocarcinoma progression. Oncogene. 2020;39(7):1484-1497.
- Suthon S, et al. WNT5B in physiology and disease. Front Cell Dev Biol. 2021;9:667581.
- Ji H, et al. SPATA2 suppresses epithelial-mesenchymal transition to inhibit metastasis and radiotherapy sensitivity in non-small cell lung cancer via. impairing DVL1/β-catenin signaling. Thorac Cancer. 2023;14(11):969-982.
- Wang Y, Wang L, Chen C, Chu X. New insights into the regulatory role of microRNA in tumor angiogenesis and clinical implications. Mol Cancer. 2018;17(1):22.
- Iqbal MA, Arora S, Prakasam G, Calin GA, Syed MA. MicroRNA in lung cancer: role, mechanisms, pathways and therapeutic relevance. Mol Aspects Med. 2019;70:3-20.
- Lee YS, Dutta A. MicroRNAs in cancer. Annu Rev Pathol. 2009;4:199-227.
- Lin G, et al. MiR-26a enhances invasive capacity by suppressing GSK3β in human lung cancer cells. Exp Cell Res. 2017;352(2):364-374.
- Jiang W, et al. MicroRNA-1258 suppresses tumor progression via. GRB2/Ras/Erk pathway in non-small-cell lung cancer. Cell Prolif. 2018;51(6):e12502.
- Xie Y, Xue C, Guo S, Yang L. MicroRNA-520a suppresses pathogenesis and progression of non-small-cell lung cancer through targeting the RRM2/Wnt axis. Anal Cell Pathol (Amst). 2021;2021:9652420.
- Peng Y, Zhang X, Feng X, Fan X, Jin Z. The crosstalk between microRNAs and the Wnt/β-catenin signaling pathway in cancer. Oncotarget. 2017;8(8):14089-14106.
- Wang X, et al. MiR-214 inhibits cell growth in hepatocellular carcinoma through suppression of β-catenin. Biochem Biophys Res Commun. 2012;428(4):525-531.
- Lulli V, et al. MicroRNA-486-3p regulates γ-globin expression in human erythroid cells by directly modulating BCL11A. PLoS One. 2013;8(4):e60436.
- Chou ST, et al. MicroRNA-486-3p functions as a tumor suppressor in oral cancer by targeting DDR1. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1):281.
- Wu H, et al. Overexpression of miR-486-3p promoted by allicin enhances temozolomide sensitivity in glioblastoma via. targeting MGMT. Neuromolecular Med. 2020;22(3):359-369.
- Garajei A, et al. Evaluation of the expression of miR-486-3p, miR-548-3p, miR-561-5p and miR-509-5p in tumor biopsies of patients with oral squamous cell carcinoma. Pathogens. 2022;11(2):211.
- Li X, et al. MicroRNA-486-3p promotes the proliferation and metastasis of cutaneous squamous cell carcinoma by suppressing flotillin-2. J Dermatol Sci. 2022;105(1):18-26.
- Tomioka Y, et al. The molecular pathogenesis of tumor-suppressive miR-486-5p and miR-486-3p target genes: GINS4 facilitates aggressiveness in lung adenocarcinoma. Cancers (Basel). 2023;15(13):3408.