miR-486-3p hamuje fenotypy złośliwe i wiąże się z obniżoną ekspresją WNT5B, DVL1 oraz β-kateniny w komórkach gruczolakoraka płuca

Wanli Cheng; Weibo Qi; Niu Niu; Junjie Zhao

doi:10.3791/71545

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł badawczy

miR-486-3p hamuje fenotypy złośliwe i wiąże się z obniżoną ekspresją WNT5B, DVL1 oraz β-kateniny w komórkach gruczolakoraka płuca

44 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71545

⸱

21 sierpnia 2026

Wanli Cheng^*¹ , Weibo Qi^*¹ , Niu Niu¹ , Junjie Zhao¹

¹Department of Thoracic Surgery, The First Hospital of Jiaxing

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Wymuszona nadekspresja miR-486-3p hamuje aktywność związaną z proliferacją, wzrost klonogenny, gojenie ran oraz migrację przez Matrigel w liniach komórkowych gruczolakoraka płuca A549 i H358. Efekty te towarzyszą obniżonej ekspresji WNT5B, DVL1, β-catenin oraz BCL-2, co wskazuje na powiązanie in vitro ze zmianami zależnymi od szlaku Wnt, bez ustanowienia bezpośredniego celowania lub związku przyczynowo-skutkowego w obrębie tego szlaku.

Streszczenie

Gruczolak płuca (LUAD) jest dominującym podtypem histologicznym niedrobnokomórkowego raka płuca i pozostaje związany ze znaczną zachorowalnością oraz śmiertelnością. Poprzednie badania zidentyfikowały funkcje supresyjne miR-486-3p w LUAD, jednak jego związek ze zmianami ekspresji WNT5B, DVL1 i β-kateniny nie został jasno określony. W niniejszej pracy zbadano wyjściową liczebność miR-486-3p w komórkach LUAD A549 i H358 i porównano ją z liczebnością w komórkach nabłonka oskrzeli Beas-2b utrzymywanych w ich rutynowych warunkach. Stabilne modele z nadekspresją miR-486-3p wygenerowano za pomocą transdukcji lentiwirusowej. Aktywność związaną z wzrostem komórek, wzrost klonogenny, zamykanie rany oraz przenikanie przez membrany powlekane Matrigelem oceniono za pomocą zestawu Cell Counting Kit-8, testu tworzenia kolonii, testu gojenia ran oraz testu Transwell. Ilość białek WNT5B, DVL1, β-kateniny i BCL-2 oceniono metodą Western blotting, a poziomy mRNA WNT5B, DVL1, CTNNB1 i BCL2 dodatkowo zbadano za pomocą RT-qPCR. W zastosowanych warunkach hodowli liczebność miR-486-3p była niższa w komórkach A549 i H358 niż w komórkach Beas-2b, a transdukcja lentiwirusowa doprowadziła do stabilnej nadekspresji w obu liniach komórkowych LUAD. Wymuszona nadekspresja miR-486-3p zredukowała sygnał CCK-8, tworzenie kolonii, zamykanie rany oraz przenikanie przez membrany powlekane Matrigelem, co towarzyszyło obniżonej liczebności białek WNT5B, DVL1, całkowitej β-kateniny i BCL-2. RT-qPCR wykazało ponadto niższą liczebność transkryptów WNT5B, DVL1, CTNNB1 i BCL2 w obu liniach komórkowych LUAD po nadekspresji miR-486-3p. Wyniki te potwierdzają związek in vitro między wymuszoną ekspresją miR-486-3p, osłabieniem kilku parametrów komórek złośliwych a zmienioną ekspresją związaną z szlakiem Wnt; nie ustalają one jednak bezpośredniego wiązania miRNA z celem, aktywności szlaku ani przyczynowego, liniowego mechanizmu sygnalizacyjnego.

Wprowadzenie

Gruczolakorak płuca (LUAD) jest najczęstszym podtypem histologicznym niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) i w znacznym stopniu przyczynia się do zachorowalności oraz śmiertelności z powodu raka płuca na całym świecie¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Klasyfikacja molekularna i terapie celowane poprawiły rokowania dla wybranych grup pacjentów, jednak zaawansowany LUAD pozostaje trudny do leczenia i jest biologicznie heterogenny¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Zdefiniowanie procesów regulacyjnych przyczyniających się do złośliwego zachowania komórek pozostaje zatem istotne dla opracowania sprawdzalnych hipotez terapeutycznych.

Sygnalizacja Wnt obejmuje gałęzie zależne i niezależne od β-kateniny, które regulują proliferację, przeżywalność, polarność oraz ruchliwość⁶^,⁷^,⁸^,⁹. WNT5B jest najczęściej kojarzony z sygnalizacją niekanoniczną, choć jego efekty biologiczne różnią się w zależności od receptora i kontekstu komórkowego¹⁰^,¹¹. DVL1 jest cytoplazmatycznym białkiem transdukcji sygnału współdzielonym przez kilka gałęzi Wnt i zostało powiązane z zachowaniem zależnym od β-kateniny w raku płuca¹². W związku z tym jednoczesne zmiany poziomu WNT5B, DVL1 i β-kateniny nie powinny być same w sobie interpretowane jako dowód na istnienie jednej linearnej ścieżki.

MikroRNA (miRNA) to krótkie niekodujące RNA, które regulują ekspresję genów poprzez zależne od sekwencji oddziaływania z transkryptami docelowymi¹³^,¹⁴^,¹⁵. Ponieważ jedna cząsteczka miRNA może wpływać na wiele cząsteczek RNA, zmiana poziomu miRNA może oddziaływać na różnorodne fenotypy związane z nowotworami¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Kilka rodzajów miRNA powiązano z wzrostem, ruchliwością i sygnalizacją w raku płuca, a interakcje między miRNA a sieciami związanymi z szlakiem Wnt zostały opisane w wielu kontekstach nowotworowych¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰.

Locus MIR486 daje początek dojrzałym niciom miR-486-3p i miR-486-5p. Wykazano, że miR-486-3p posiada aktywność supresorową w raku jamy ustnej i glejakach, podczas gdy w przypadku raka płaskonabłonkowego skóry zgłaszano efekt pronowotworowy²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵. miR-486-3p został wybrany do niniejszego badania zgodnie ze strategią opartą na hipotezie, bazując na jego obniżonej liczebności w publicznych danych dotyczących LUAD, wcześniej zgłaszanej aktywności supresorowej w LUAD oraz przewidywaniach bioinformatycznych wiążących go z kandydowanymi transkryptami związanymi z WNT. Tomioka i wsp. wykazali efekty supresorowe obu nici miR-486 w LUAD i zidentyfikowali GINS4 za pomocą genomowego przesiewu celów²⁶. W związku z tym niniejsze badanie nie pretenduje do bycia pierwszym dowodem na występowanie fenotypu przeciwnowotworowego. Zamiast tego ocenia ono, czy wymuszona ekspresja miR-486-3p wiąże się ze zmianami w liczebności WNT5B, DVL1 i β-catenin oraz z powtarzalnymi zmianami fenotypowymi w dwóch liniach komórkowych LUAD. Analizy te oceniają korelacje i nie ustanawiają bezpośredniego celowania, aktywności szlaku ani liniowego mechanizmu WNT5B/DVL1/β-catenin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Użyte odczynniki i sprzęt wymieniono w Tabeli Materiałów.

Hodowla komórkowa

Wykorzystano linie komórkowe gruczolaka płuca człowieka (LUAD) A549 i H358 oraz unieśmiertelnioną linię komórek nabłonkowych oskrzeli Beas-2b. Linie A549 (KRAS G12S) i H358 (KRAS G12C; niedobór STK11) wybrano jako powszechnie stosowane modele LUAD o odmiennych profilach mutacji KRAS, natomiast linię Beas-2b włączono jako niemaligniczny komparator nabłonkowy oskrzeli. Komórki A549 i H358 hodowano w podłożu RPMI-1640, a komórki Beas-2b w podłożu DMEM; każde z podłoży zawierało 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Komórki hodowano w temperaturze 37 °C w atmosferze uwilgotnionej zawierającej 5% CO₂. Ze względu na to, że linie komórkowe guza i komparatora nabłonkowego utrzymywano w różnych rutynowych podłożach, porównania bazowej ekspresji między różnymi liniami komórkowymi interpretowano z ostrożnością.

Transdukcja lentiwirusowa i selekcja stabilnych linii komórkowych

W stabilnym modelu wzmocnienia funkcji (gain-of-function) zastosowano wektory lentiwirusowe przenoszące prekursor hsa-miR-486-3p (LV-miR-486-3p) lub sekwencję kontrolną typu scrambled (LV-NC). Komórki A549 i H358 wysiano na płytki 6-dołkowe w zagęszczeniu 5 × 10⁴ komórek/dołek i inkubowano przez noc. Następnego dnia komórki poddano transdukcji lentiwirusem przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 10 w obecności 8 µg/mL polybrene. Po 24 h inokulum wirusowe zastąpiono świeżą pożywką kompletną. Przetransdukowane komórki selekcjonowano puromycyną w stężeniu 2 µg/mL przez 7 dni. Po selekcji przeżywającym komórkom pozwolono na regenerację, a następnie namnożono je do kolejnych analiz molekularnych i funkcjonalnych. W badaniu nie zastosowano inhibitora miR-486-3p, ponieważ eksperyment został zaprojektowany specjalnie w celu oceny efektów stabilnej, wymuszonej nadekspresji.

UWAGA: MOI, czas ekspozycji na polybrene oraz warunki selekcji puromycyną muszą być identyczne dla grup LV-NC i LV-miR-486-3p, aby zminimalizować różnice w żywotności komórek wynikające z zastosowanego zabiegu.

RT-qPCR

Przeprowadzono analizę RT-qPCR w celu określenia poziomów ekspresji miR-486-3p oraz potwierdzenia wydajności nadekspresji lentiwirusowej w komórkach A549 i H358. Całkowity RNA wyizolowano przy użyciu odczynnika TRIzol zgodnie z instrukcjami producenta. Stężenie i czystość RNA oceniono spektrofotometrycznie, przyjmując stosunek A260/A280 w zakresie 1,8–2,1 za akceptowalny. Do analizy mRNA 1 µg całkowitego RNA poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA z wykorzystaniem komercyjnego zestawu do syntezy cDNA zgodnie z protokołem producenta. W przypadku analizy microRNA syntezę cDNA przeprowadzono z użyciem specyficznego dla miRNA primera do odwrotnej transkrypcji w formie stem-loop. Ilościowy PCR wykonano w całkowitej objętości reakcji 20 µL zawierającej 10 µL 2× SYBR Green Master Mix, 0,4 µM każdego primera oraz 2 µL matrycy cDNA. Protokół amplifikacji obejmował wstępny etap denaturacji w 95 °C przez 5 min, a następnie 40 cykli denaturacji w 95 °C przez 10 s oraz przyłączania/elongacji w 60 °C przez 30 s. Następnie przeprowadzono analizę krzywej topnienia w celu weryfikacji specyficzności amplifikacji. Małe jądrowe RNA U6 służyło jako kontrola wewnętrzna do ilościowego oznaczenia miRNA, natomiast GAPDH wykorzystano jako gen referencyjny do normalizacji mRNA. Względne poziomy ekspresji wyznaczono metodą 2^−ΔΔCq.

Sekwencje primerów miRNA były następujące: primer do odwrotnej transkrypcji typu stem-loop, 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′; primer forward dla miR-486-3p, 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′; uniwersalny primer reverse, 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′; primer forward dla U6, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′ oraz primer reverse dla U6, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. Sekwencje primerów dla WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2 i GAPDH, wraz z długościami amplikonów i wydajnością amplifikacji, przedstawiono w Tabeli 1. Ekspresję mRNA znormalizowano względem GAPDH, natomiast ekspresję miR-486-3p znormalizowano względem U6. Każdy eksperyment obejmował trzy niezależne powtórzenia biologiczne, z trzema powtórzeniami technicznymi na każde powtórzenie biologiczne.

Western blotting

Po zakończeniu 7-dniowej selekcji puromycyną i okresie regeneracji komórki lizeowano w buforze RIPA zawierającym inhibitory proteaz. Stężenia białek określono za pomocą testu białkowego BCA. Równe ilości białka (20 µg na ścieżkę) rozdzielono na 10% żelach SDS-PAGE i przeniesiono na membrany PVDF metodą transferu mokrego przy 300 mA przez 120 min. Membrany blokowano 5% mlekiem odtłuszczonym przygotowanym w buforze Tris-buffered saline zawierającym 0,1% Tween-20 (TBST) przez 1 h w temperaturze pokojowej. Membrany inkubowano przez noc w 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko WNT5B (1:1 000), DVL1 (1:1 000), β-catenin (1:1 000), BCL-2 (0,5 µg/mL) lub β-actin (1:5 000). Producenci i numery katalogowe wszystkich przeciwciał podano w Tabeli Materiałów. Po trzykrotnym 10-minutowym płukaniu w TBST membrany inkubowano przez 1 h w temperaturze pokojowej z koniugowanym z HRP kozim przeciwciałem wtórnym przeciwko króliczemu IgG w rozcieńczeniu 1:5 000. Następnie membrany przemyto trzykrotnie buforem TBST, a prążki białkowe wizualizowano za pomocą substratu chemiluminescencyjnego i obrazowano przy użyciu systemu dokumentacji i obrazowania żeli. Intensywność prążków ilościowo określono programem ImageJ. Ilość każdego białka docelowego znormalizowano względem sygnału odpowiadającej mu β-actin z tej samej próbki biologicznej. Do analizy densytometrycznej wykorzystano wyłącznie ekspozycje w liniowym, nienasyconym zakresie detekcji. Przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty biologiczne.

Test CCK-8 (Cell Counting Kit-8)

Komórki A549 i H358 stabilnie transdukowane LV-NC lub LV-miR-486-3p wysiano na płytki 96-dołkowe w zagęszczeniu 1,5 × 10⁴ komórek/dołek w 100 µL pełnej pożywki. Po przylgnięciu komórek przez noc pożywkę wymieniono, a absorbancję w czasie 0 h zmierzono niezwłocznie po dodaniu odczynnika Cell Counting Kit-8. W godzinach 0 h, 24 h, 48 h, 72 h i 96 h do każdego dołka dodano 10 µL odczynnika i inkubowano przez 1 h w 37 °C przed odczytem absorbancji przy 450 nm. Dla skorygowanej analizy przebiegu czasowego każdą grupę znormalizowano do jej własnej wartości w czasie 0 h przed wykreśleniem wyników. Przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty biologiczne, a wartości z powtórzeń technicznych w obrębie każdego eksperymentu uśredniono przed analizą statystyczną.

Test tworzenia kolonii

Stabilnie wyselekcjonowane komórki A549 i H358 przygotowano w formie zawiesiny pojedynczych komórek o stężeniu 5 × 10² komórek/mL. Do każdej studzienki płytki 6-dołkowej naniesiono jeden mililitr zawiesiny komórkowej, a następnie dodano 3 mL pożywki kompletnej. Komórki hodowano przez 14 dni, wymieniając pożywkę co 5 dni. Kolonie przemyto PBS, utrwalono 4% paraformaldehydem przez 20 min, zbarwiono fioletem krystalicznym przez 20 min, przemyto i wysuszono na powietrzu. W programie ImageJ policzono kolonie zawierające co najmniej 50 komórek. Przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty biologiczne.

UWAGA: Aby zapobiec sztucznemu skupianiu się komórek, wymagane jest przygotowanie jednorodnej zawiesiny pojedynczych komórek oraz minimalne zakłócanie płytki podczas tworzenia kolonii.

Test migracji komórek

Stabilnie transdukowane komórki A549 i H358 wysiano do płytek 6-dołkowych i hodowano do czasu powstania konfluentnej monowarstwy. Za pomocą sterylnej końcówki pipety o pojemności 10 µL wykonano liniowe zadrapanie, usunięto oderwane komórki, a następnie obrazowano te same wyznaczone pola w czasie 0 h, 24 h, 48 h i 72 h. Pole powierzchni rany zmierzono w programie ImageJ, a stopień zamknięcia rany obliczono według wzoru: (pole w 0 h − pole w wskazanym punkcie czasowym) / pole w 0 h × 100%. Przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty biologiczne. Nie stosowano farmakologicznych blokerów proliferacji, w związku z czym wynik testu interpretowano jako pomiar zamknięcia rany, a nie jako odczyt specyficzny dla migracji.

UWAGA: Zadrapania powinny być wykonywane z zachowaniem stałej szerokości i nacisku, a w trakcie całego przebiegu czasowego należy obserwować te same pola.

Test inwazji komórkowej

Testy inwazji Transwell przeprowadzono przy użyciu wkładek z membraną poliwęglanową w płytkach 24-dołkowych o rozmiarze porów 8 µm. Górną powierzchnię każdej wkładki pokryto 100 µL macierzy błony podstawnej Matrigel rozcieńczonej 1:8 w bezsurowiczym medium DMEM do przybliżonego stężenia końcowego białka 1 mg/mL i inkubowano w 37 °C przez 4 h. Komórki A549 i H358 resuspendowano w bezsurowiczym medium RPMI-1640 w zagęszczeniach odpowiednio 8 × 10⁵ komórek/mL i 4 × 10⁵ komórek/mL. Do górnej komory dodano 200 µL alikwotu zawiesiny komórkowej, co odpowiadało 1,6 × 10⁵ komórek A549 lub 8 × 10⁴ komórek H358 na wkładkę. Dolną komorę wypełniono 500 µL medium RPMI-1640 zawierającego 20% płodowej surowicy bydlęcej jako chemoatraktanta. Po inkubacji w 37 °C w nawilżonej atmosferze zawierającej 5% CO₂ przez 48 h, komórki nieinwazyjne pozostałe na górnej powierzchni membrany delikatnie usunięto patyczkiem bawełnianym. Komórki, które przeniknęły przez membranę, utrwalono 4% paraformaldehydem przez 20 min i zabarwiono 0,1% fioletem krystalicznym przez 20 min w temperaturze pokojowej. Dla każdej wkładki wykonano zdjęcia pięciu losowo wybranych pól mikroskopowych, a liczbę inwazyjnych komórek określono za pomocą programu ImageJ. Średnią liczbę komórek z pięciu pól uznano za jedną wartość dla każdej wkładki, a jako jednostkę eksperymentalną traktowano wkładkę, a nie pojedyncze pole mikroskopowe. Wykonano trzy niezależne eksperymenty biologiczne.

UWAGA: Należy ostrożnie i konsekwentnie usuwać komórki, które nie zainwadowały, aby uniknąć uszkodzenia membrany lub odczepienia komórek, które zmigrowały na jej dolną powierzchnię.

Analiza statystyczna

Dane przedstawiono jako średnia ± SD, a n oznacza niezależne eksperymenty biologiczne, chyba że zaznaczono inaczej. Powtórzenia techniczne lub wiele pól mikroskopowych z tej samej jednostki eksperymentalnej uśredniono przed wykonaniem testów wnioskowania. Do porównania trzech linii komórkowych zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie parzyste porównania z poprawką Tukeya. W przypadku przebiegów czasowych testu CCK-8 oraz czasu zamykania rany zastosowano dwuczynnikową analizę wariancji z powtarzanymi pomiarami w celu oceny wpływu traktowania, czasu oraz interakcji traktowanie-czas, a następnie porównania z poprawką Šídáka w poszczególnych punktach czasowych. Porównania dwóch grup analizowano za pomocą dwustronnych nieparzystych testów t Studenta. Analizy statystyczne i wizualizacja danych zostały wykonane przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej i tworzenia wykresów. Dokładne wartości p podano na panelach rycin lub w tabelach danych źródłowych. Istotność statystyczną określono jako p < 0,05; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 oraz ****p < 0,0001.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analiza TCGA/starBase wykazuje obniżoną zawartość miR-486-3p w LUAD, a TargetScan identyfikuje potencjalne miejsca wiązania

Dane dotyczące ekspresji pochodzące z TCGA, uzyskane za pośrednictwem bazy starBase v3.0, wykazały, że miR-486-3p obfitość była znacznie niższa w 512 próbkach gruczolakowatego raka płuca (LUAD) niż w 20 nieguzowych próbkach płuca (test sum rang Wilcoxona, p = 3.2 × 10⁻⁵; Rysunek 1). Program Target...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejsze badanie typu gain-of-function oceniało efekty stabilnej, wymuszonej ekspresji miR-486-3p w komórkach gruczolakoraka płuca (LUAD) linii A549 i H358. W obu modelach nadekspresja miR-486-3p wiązała się z obniżeniem sygnałów CCK-8 związanych z wzrostem, zmniejszonym wzrostem klonogennym, wolniejszyme gojeniem rany oraz mniejszą liczbą komórek migrujących przez membrany Transwell pokryte Matrigelem. Zmianom fenotypowym tym towarzyszyło obniżenie poziomu białek WNT5B, DVL1, całkowitej β-kateniny oraz BCL-2, wraz z ni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Wsparcie finansowe dla niniejszego badania zapewniły Plan Nauki i Technologii Medycznej i Zdrowotnej Prowincji Zhejiang (2025KY349) oraz Kluczowa Dyscyplina Wspierająca Miasta Jiaxing (2023-zc-014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 M Tris-HCl (pH 6.8)	Solarbio	T1020	Przygotowanie żelu skupiającego SDS-PAGE
1,5 M Tris-HCl (pH 8,8)	Solarbio	T1010	Przygotowanie żelu rozdzielczego SDS-PAGE
20× bufor TBS	Solarbio	71080	Bufor roboczy do przemywania western blot i rozcieńczania przeciwciał
30% roztwór akrylamidu/bis-akrylamidu (29:1)	Solarbio	A1010	Przygotowanie żeli SDS-PAGE
4% utrwalacz paraformaldehydowy	Servicebio	G1101	Utrwalanie do testów tworzenia kolonii i testów Transwell
5× bufor do nakładania białek	Beyotime	P0015	Przygotowanie próbek białek do SDS-PAGE
Wodoropersulfian amonu	Solarbio	427A038	Inicjator polimeryzacji żelu SDS-PAGE
Zestaw do oznaczania białek BCA	Beyotime	P0009-1	Oznaczanie stężenia białka
Przeciwciało BCL-2	Boster Biological Technology	A00040-2	Królicze przeciwciało poliklonalne; western blotting w rozcieńczeniu 1:5 000
Zestaw do liczenia komórek-8 (CCK-8)	TargetMol	C0005	Test aktywności metabolicznej związanej ze wzrostem komórek; 10 μL na 100 μL pożywki hodowlanej
System obrazowania chemiluminescencyjnego	Bio-Rad	ChemiDoc MP	Obrazowanie western blot
Chloroform	Servicebio	G3005	Rozdział faz podczas ekstrakcji RNA metodą TRIzol
Roztwór barwiący fioletem krystalicznym	Servicebio	G1014	Barwienie kolonii i membran Transwell
DMEM	Servicebio	G4511	Standardowa pożywka hodowlana dla komórek Beas-2b
Przeciwciało DVL1	Signalway Antibody	53180	Królicze przeciwciało pierwotne; western blotting w rozcieńczeniu 1:5 000
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Biosharp	BL203B	Suplement 10% (v/v) do rutynowej hodowli komórkowej; 20% (v/v) w dolnej komorze Transwell
GraphPad Prism 8	GraphPad Software	Version 8	Przygotowanie wykresów i analiza statystyczna
Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)	Yeasen Biotechnology	11201ES08	Ilościowa PCR oparta na SYBR Green
Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)	Yeasen Biotechnology	11141ES60	Transkrypcja odwrotna dla mRNA RT-qPCR
IBM SPSS Statistics	IBM	Version 22.0	Analiza statystyczna
ImageJ	National Institutes of Health	Version 1.53	Densytometria western blot, pomiar powierzchni rany, liczenie kolonii i liczenie komórek Transwell
Mikroskop odwrócony	Olympus	CKX53	Obrazowanie testów gojenia ran i testów Transwell
Izopropanol	Servicebio	G3006	Wytrącanie RNA podczas ekstrakcji metodą TRIzol
Preparaty lentiwirusowe LV-miR-486-3p i LV-NC	GenePharma	Custom synthesis	Stabilny wektor nadekspresyjny miR-486-3p i wektor kontrolny ulegający przetasowaniu
Macierz błony podstawnej Matrigel	Corning	354234	Rozcieńczona 1:8 w DMEM bez surowicy; końcowe stężenie białka około 1 mg/mL
Metanol	Xilong Scientific	GB/T 683-2006	Aktywacja membrany PVDF
Czytnik mikropłytek	BioTek	ELx800	Pomiar absorbancji przy 450 nm
Mikroobjętościowy spektrofotometr UV-Vis	Allsheng	Nano-600	Ocena stężenia RNA i czystości A260/A280
Penicylina-streptomycyna	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15240062	Suplement 1% (v/v) do rutynowej hodowli komórkowej
Bufor fosforanowy (PBS)	Servicebio	G0002	Przemywanie komórek i membran
Koktajl inhibitorów proteaz	APExBIO	K1007	Dodany do buforu lizującego RIPA
Marker białek	Biosharp	BL712A	Referencja masy cząsteczkowej dla western blotting
Membrana PVDF	Millipore	K2MA8350E	Membrana do transferu białek dla western blotting
System PCR czasu rzeczywistego QuantStudio 5	Thermo Fisher Scientific	QuantStudio 5	Pozyskiwanie danych RT-qPCR
Bufor lizujący RIPA	Beyotime	P0013B	Ekstrakcja całkowitego białka komórkowego
Odczynnik do ekstrakcji RNA (typu TRIzol)	Servicebio	G3013	Ekstrakcja całkowitego RNA
Pożywka RPMI 1640	Servicebio	G4510	Standardowa pożywka hodowlana dla komórek A549 i H358 oraz bezsurowicza zawiesina komórek Transwell
SDS	Solarbio	S8010	Odczynnik do SDS-PAGE
Mleko w proszku odtłuszczone	BD	2271470	5% roztwór blokujący do western blotting
StarBase v3.0	Sun Yat-sen University	https://rnasysu.com/encori/	Analiza ekspresji miR-486-3p na podstawie danych TCGA
TargetScanHuman	Whitehead Institute for Biomedical Research	https://www.targetscan.org/vert_80/	Przewidywanie potencjalnych miejsc wiązania miR-486-3p
TEMED	Sigma-Aldrich	T8090	Katalizator polimeryzacji żelu SDS-PAGE
Wkładki Transwell, 24-dołkowe, wielkość porów 8 μm	Corning	3428	Test migracji przez membranę powlekaną Matrigel
Trypsyna	Servicebio	G4000	Odrywanie komórek
Tween-20	Solarbio	815A043	Przygotowanie buforu do przemywania western blot
Pionowy system elektroforetyczny	Liuyi Biotechnology	DYCZ-24DN	Rozdział białek metodą SDS-PAGE
Odczynnik luminolowy HRP do western blot	Affinity Biosciences	KF001	Chemiluminescencyjna detekcja western blot
System transferu mokrego	Bio-Rad	1703930	Transfer białek na membranę PVDF
Przeciwciało WNT5B	Signalway Antibody	56808	Królicze przeciwciało pierwotne; western blotting w rozcieńczeniu 1:5 000
β-aktyna przeciwciało	Abcam	ab8227	Kontrola ładowania; western blotting w rozcieńczeniu 1:5 000
β-katenina przeciwciało	Signalway Antibody	21725	Królicze przeciwciało pierwotne; western blotting w rozcieńczeniu 1:5 000

Bibliografia

Herbst RS, Heymach JV, Lippman SM. Lung cancer. N Engl J Med. 2008;359(13):1367-1380.
Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin. 2019;69(1):7-34.
Han B, et al. Cancer incidence and mortality in China, 2022. J Natl Cancer Cent. 2024;4(1):47-53.
Lin JJ, et al. Five-year survival in EGFR-mutant metastatic lung adenocarcinoma treated with EGFR-TKIs. J Thorac Oncol. 2016;11(4):556-565.
She J, Yang P, Hong Q, Bai C. Lung cancer in China: challenges and interventions. Chest. 2013;143(4):1117-1126.
Barker N, Clevers H. Mining the Wnt pathway for cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2006;5(12):997-1014.
Komiya Y, Habas R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 2008;4(2):68-75.
Stewart DJ. Wnt signaling pathway in non-small cell lung cancer. J Natl Cancer Inst. 2014;106(1):djt356.
Zhang Z, et al. Wnt/β-catenin signaling in the development and therapeutic resistance of non-small cell lung cancer. J Transl Med. 2024;22(1):565.
Zhang Q, et al. WNT5B exerts oncogenic effects and is negatively regulated by miR-5587-3p in lung adenocarcinoma progression. Oncogene. 2020;39(7):1484-1497.
Suthon S, et al. WNT5B in physiology and disease. Front Cell Dev Biol. 2021;9:667581.
Ji H, et al. SPATA2 suppresses epithelial-mesenchymal transition to inhibit metastasis and radiotherapy sensitivity in non-small cell lung cancer via. impairing DVL1/β-catenin signaling. Thorac Cancer. 2023;14(11):969-982.
Wang Y, Wang L, Chen C, Chu X. New insights into the regulatory role of microRNA in tumor angiogenesis and clinical implications. Mol Cancer. 2018;17(1):22.
Iqbal MA, Arora S, Prakasam G, Calin GA, Syed MA. MicroRNA in lung cancer: role, mechanisms, pathways and therapeutic relevance. Mol Aspects Med. 2019;70:3-20.
Lee YS, Dutta A. MicroRNAs in cancer. Annu Rev Pathol. 2009;4:199-227.
Lin G, et al. MiR-26a enhances invasive capacity by suppressing GSK3β in human lung cancer cells. Exp Cell Res. 2017;352(2):364-374.
Jiang W, et al. MicroRNA-1258 suppresses tumor progression via. GRB2/Ras/Erk pathway in non-small-cell lung cancer. Cell Prolif. 2018;51(6):e12502.
Xie Y, Xue C, Guo S, Yang L. MicroRNA-520a suppresses pathogenesis and progression of non-small-cell lung cancer through targeting the RRM2/Wnt axis. Anal Cell Pathol (Amst). 2021;2021:9652420.
Peng Y, Zhang X, Feng X, Fan X, Jin Z. The crosstalk between microRNAs and the Wnt/β-catenin signaling pathway in cancer. Oncotarget. 2017;8(8):14089-14106.
Wang X, et al. MiR-214 inhibits cell growth in hepatocellular carcinoma through suppression of β-catenin. Biochem Biophys Res Commun. 2012;428(4):525-531.
Lulli V, et al. MicroRNA-486-3p regulates γ-globin expression in human erythroid cells by directly modulating BCL11A. PLoS One. 2013;8(4):e60436.
Chou ST, et al. MicroRNA-486-3p functions as a tumor suppressor in oral cancer by targeting DDR1. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1):281.
Wu H, et al. Overexpression of miR-486-3p promoted by allicin enhances temozolomide sensitivity in glioblastoma via. targeting MGMT. Neuromolecular Med. 2020;22(3):359-369.
Garajei A, et al. Evaluation of the expression of miR-486-3p, miR-548-3p, miR-561-5p and miR-509-5p in tumor biopsies of patients with oral squamous cell carcinoma. Pathogens. 2022;11(2):211.
Li X, et al. MicroRNA-486-3p promotes the proliferation and metastasis of cutaneous squamous cell carcinoma by suppressing flotillin-2. J Dermatol Sci. 2022;105(1):18-26.
Tomioka Y, et al. The molecular pathogenesis of tumor-suppressive miR-486-5p and miR-486-3p target genes: GINS4 facilitates aggressiveness in lung adenocarcinoma. Cancers (Basel). 2023;15(13):3408.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspresja WNT5B ekspresja DVL1 beta-katenina transdukcja lentiwirusowa tworzenie kolonii test gojenia ran Western blot RT-qPCR