Izolacja, oczyszczanie i charakterystyka funkcjonalnych mitochondriów pochodzących z ludzkiego mięśnia szkieletu w celu przeszczepu mitochondriów

Podsumowanie

Ustalono zstandaryzowany protokół łączący trawienie trypsyną i dyferencyjną wirówkę do izolacji, oczyszczania i funkcjonalnej charakterystyki mitochondriów z ludzkiego mięśnia szkieletu, a także do oceny ich zastosowania w przeszczepach mitochondrialnych.

Streszczenie

Mitochondria są podstawowymi organellami, które regulują metabolizm energetyczny, przekaźnictwo sygnałów i homeostazę komórkową w komórkach eukariotycznych. Dysfunkcja mitochondriów przyczynia się do patogenezy wielu chorób i spowodowała rozwój transplantacji mitochondriów jako strategii terapeutycznej regeneracyjnej. Skuteczne zastosowanie transplantacji mitochondriów zależy od dostępności wysoce oczyszczonych i funkcjonalnie nienaruszonych mitochondriów. Mięsień szkieletowy jest odpowiednim źródłem dawcy ze względu na wysoką zawartość mitochondriów, aktywność metaboliczną i dostępność. To badanie ustanowiło zstandaryzowany, powtarzalny protokół izolacji, oczyszczania i charakteryzacji funkcjonalnych mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i oceniło ich zastosowanie w transplantacji mitochondriów. Procedura składała się z dwóch głównych etapów. Po pierwsze, mitochondria zostały izolowane z mięśni szkieletowych myszy C57BL/6 za pomocą trawienia trypsyną, a następnie różnicowej centrifugacji. Po drugie, izolowane mitochondria zostały scharakteryzowane w celu oceny czystości, ultrastruktury i aktywności funkcjonalnej. Czystość mitochondrialna została oszacowana przez ilościową analizę białek metodą bicinchoninic acid (BCA) i analizę Western blot. Integralność ultrastrukturalną badano za pomocą mikroskopii elektronowej transmisyjnej. Aktywność funkcjonalną oceniono za pomocą JC-1 i fluorescencyjnego oznakowania mitochondriów wraz z pomiarami zużycia tlenu, zdolności produkcji ATP i wskaźnika kontroli oddechowej za pomocą systemu wysokiej rozdzielczości respirometrii. Izolowanych mitochondria wykazywały zachowany potencjał membranowy, nienaruszoną ultrastrukturę i stabilną aktywność oddechową, co wskazuje na przydatność do dalszych badań funkcjonalnych i zastosowań w transplantacji mitochondriów.

Wprowadzenie

Mitochondria są głównymi miejscami produkcji adenozynotrifosforanowej (ATP) i odgrywają kluczową rolę w apoptozie, homeostazie wapnia oraz metabolizmie reaktywnych form tlenu (ROS). Funkcjonalna integralność mitochondriów jest zatem krytyczna dla utrzymania homeostazy komórkowej i wyznaczania losu komórki^1,2. Dysfunkcja mitochondriów, w tym mutacje mitochondrialnego DNA (mtDNA) oraz nieprawidłowości łańcucha transportu elektronów (ETC), prowadzi do upośledzonego metabolizmu energetycznego, stresu oksydacyjnego i nieregulowanej apoptozy^3,4. Te nieprawidłowości są związane z szerokim spektrum chorób, w tym dziedziczonymi zaburzeniami mitochondrialnymi, chorobami neurodegeneracyjnymi i chorobami układu krążenia^5,6. Konwencjonalne strategie terapeutyczne dla dysfunkcji mitochondriów, takie jak przeciwutleniacze i kofaktory metaboliczne, ogólnie zapewniają ograniczoną skuteczność, ponieważ łagodzą objawy bez bezpośredniego przywracania funkcji mitochondrialnych^7,8. W związku z tym, przeszczepianie mitochondriów stało się obiecującą metodą terapeutyczną w medycynie regeneracyjnej. Ta strategia polega na dostarczeniu całych zewnętrznych mitochondriów do uszkodzonych lub dysfunkcyjnych komórek, aby przywrócić aktywność mitochondrialną i metabolizm energetyczny komórek^9,10. Poprzednie badania wykazały, że zewnętrzne mitochondria mogą być internalizowane przez komórki-odbiorcy i włączone do endogennej sieci mitochondrialnej, co prowadzi do poprawy funkcji bioenergetycznych i zwiększonego przeżycia komórek^11,12,13.

Mięśnie szkieletowe są uważane za odpowiednego dawczynię do izolacji mitochondriów ze względu na ich wysoką zawartość mitochondriów, aktywność metaboliczną i dostępność^14,15,16. Przeszczepianie mitochondriów wymaga kilku kluczowych kroków, w tym izolacji, oczyszczania mitochondriów, funkcjonalnej charakteryzacji oraz efektywnego dostarczenia do komórek-odbiorców. Jednakże, znaczna różnorodność metodologiczna pozostaje wśród protokołów zgłaszanych do tej pory, szczególnie w procedurach dotyczących homogenizacji tkanki, trawienia enzymatycznego, kontroli temperatury i oczyszczania. Taka różnorodność może wpływać na wydajność, czystość i funkcjonalną integralność mitochondriów, ograniczając tym samym reproduktywalność eksperymentu.

Aby poprawić spójność metodologiczną i reproduktywalność, niniejsze badanie przedstawia standaryzowany protokół do izolacji i charakteryzacji funkcjonalnych mitochondriów z mysiej tkanki mięśniowej szkieletowej za pomocą trawienia trypsyną i dyferencyjnej centryfugacji. Izolowane mitochondria zostały oceniane pod kątem czystości, integralności ultrastrukturalnej oraz aktywności funkcjonalnej za pomocą biuretu bicinchoninic acid (BCA) do ilościowego oznaczania białek, Western blottingu, mikroskopii elektronowej transmisyjnej, fluorescencyjnych testów potencjału membranowego i wysokorozdzielczej rezyfrometrii. Ponadto, ocena została dokonana w zakresie przyjęcia izolowanych mitochondriów przez komórki-odbiorcy, aby ocenić ich przydatność do zastosowań w przeszczepianiu mitochondriów. Niniejszy protokół zapewnia reproduktywalny przepływ pracy w celu uzyskania funkcjonalnych mitochondriów pochodzących z tkanki mięśniowej szkieletowej do dalszych badań eksperymentalnych.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono w specjalnej placówce wolnej od patogenów (SPF) i zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki i Wykorzystywania Zwierząt Trzeciego Szpitala Afiliacyjnego Uniwersytetu Medycznego Sił Powietrznych (Numer zgody: IACUC-2024kq-065).

Samce myszy C57BL/6 (6-8 tygodni, 18-20 g) zakupiono w Laboratorium Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Medycznego Sił Powietrznych (Licencja produkcyjna: SCXK (Shaanxi) 2024-002). Myszy były trzymane w indywidualnie wentylowanych klatkach (IVC) pod nadciśnieniem i czystymi warunkami, w temperaturze 20-26 °C, wilgotności względnej 40%-70%, cyklu 12 godzinnym światła i ciemności oraz co najmniej 15 zmian powietrza na godzinę. Podawano sterylną dietę, wodę pitną oraz środowisko wzbogacone.

Reaktanty, chemikalia i instrumenty eksperymentalne użyte w protokołach są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Uśmiercanie zwierząt i pobieranie tkanek

1. Umieść mysz w hermetycznej komorze do eutanazji i wykonaj eutanazję poprzez stopniowe wdychanie dwutlenku węgla (CO₂), 30%-70% objętości komory na minutę.
2. Potwierdź śmierć przez zaprzestanie spontanicznego oddychania i bicia serca, utratę odruchu źrenic i brak reakcji na stymulację mechaniczną.
3. Zanurz uśmiercone myszy C57BL/6 w 75% alkoholu etylowym na 5 min w celu dezynfekcji.
   UWAGA: Aby uniknąć fiksacji tkanek i uszkodzenia komórkowego wywołanego alkoholem, ogranicz czas zanurzenia do 10 min. Przez cały protokół należy używać świeżej tkanki, ponieważ zamrażanie kompromituję żywotność i funkcjonalną integralność mitochondriów.
4. Umieść mysz w sterylnej dani Petrego w komorze laminarnej z brzuchem skierowanym w górę, aby w pełni eksponować obszary brzuszne i tylnych kończyn.
5. Podnieś skórę dolnej części brzucha w okolicy narządów płciowych za pomocą kleszczy i wykonaj mały nacięcie. Przeprowadź tępą dysekcję, aby oddzielić skórę od tkanki podstawowej. Przedłuż nacięcie ku górze wzdłuż linii środkowej do kostki i w kierunku bocznym do obu tylnych kończyn, aby w pełni eksponować grupy mięśni kończyn tylnych.
6. Zidentyfikuj mięsień czworogłowy uda na przedniej stronie uda i ostrożnie oddziel mięsień wzdłuż kierunku włókien mięśniowych za pomocą tępej dysekcji. Przetnij dystalne więzadło rzepki i proksymalny ścięgno, aby całkowicie odizolować tkankę mięśniową.
   UWAGA: Przemyj tkankę trzykrotnie w zimnym buforze fosforanowym (PBS) uzupełnionym o 2% penicylinę i streptomycynę za pomocą nowej dani Petrego na każde przemywanie, aby zminimalizować skażenie.
7. Należy natychmiast umieścić odizolowaną tkankę mięśniową w zimnym buforze PBS i dokładnie przepłukać, aby usunąć włosy i krew z powierzchni tkanki.
8. Delikatnie osusz nadmiar wilgoci z tkanki za pomocą sterylnej gazy. Podziel tkankę na 1,5 mL mikroprobówki i zważ próbki. Użyj około 100 mg tkanki na próbkę, aby zachować spójność między przygotowaniami.

2. Drobnienie tkanek i homogenizacja

1. Umieść mikroprobówkę zawierającą tkankę z Krok 1.8 na lodzie. Drobnieć tkankę na małe fragmenty o wielkości około 1-2 mm³ za pomocą sterylnych nożyczek.
2. Dodaj 8 objętości zimnego 0,25% trypsyny i traw włosów tkankę na lodzie przez 15 min.
   UWAGA: Oblicz wymaganą objętość trypsyny według masy tkanki (1 mg ≈ 1 μL). Na przykład dodaj 640 μL 0,25% trypsyny do 80 mg tkanki.
3. Wiruj mieszaninę przy 1000 × g przez 5 min w 4 °C. Odcedź nadstan i zachowaj pellet tkankowy. Resuspenduj pellet w 1 mL zimnego buforu do izolacji mitochondrialnej zawierającego D-mannitol (215 mM), sacharozę (75 mM), HEPES (20 mM), EGTA (1 mM) i wolną od kwasów tłuszczowych frakcję albuminy surowicy bydlęcej (0,5% w/v).
4. Przenieś zawiesinę do szkła homogenizatora trzymanego na lodzie. Homogenizuj tkankę za pomocą 10-12 delikatnych ruchów w górę i w dół, aż zawiesina stanie się mętna.
   UWAGA: Unikaj obracania szkła tłoczkowego w poziomie na dnie homogenizatora, ponieważ nadmierne siły mechaniczne mogą uszkodzić błony mitochondrialne i upośledzić funkcję mitochondriów.

3. Diffenerencyjne wirowanie

1. Przenieś homogenat do 1,5 mL mikroprobówki i wiruj przy 1000 × g przez 5 min w 4 °C.
2. Przenieś nadstan do świeżej 1,5 mL mikroprobówki i wiruj przy 12 000 × g przez 5 min w 4 °C, aby uz

Wyniki

Schematyczny przegląd procesu izolacji i oczyszczania mitochondriów przedstawiono na Ryc. 1. Wszystkie procedury przeprowadzano w temperaturze 4 °C, aby zachować integralność i aktywność funkcjonalną mitochondriów. Świeżo wyizolowaną tkankę mięśni szkieletowych posiekano i poddano trawieniu trypsyną w celu ułatwienia dysocjacji tkanki, a następnie zhomogenizowano w izotonicznym buforze izolacyjnym przy użyciu homogenizatora szklanego. Następnie przeprowadzono wirowanie różnicowe, aby oddzielić mitochondria od resztek tkankowych i zanieczyszczeń cytozolowych. Wstępne wirowanie przy 1 000 × g pozwoliło na usunięcie jąder komórkowych i dużych resztek, natomiast kolejne wirowanie przy 12 000 × g dało nieoczyszczony osad mitochondrialny. Dodatkowe etapy przemywania i wirowania pozwoliły na dalszą redukcję zanieczyszczeń cytozolowych, w wyniku czego otrzymano oczyszczone mitochondria odpowiednie do dalszych analiz strukturalnych i funkcjonalnych (Ryc. 1).

Rysunek 1: Schemat izolacji i oczyszczania mitochondriów. Mitochondria o wysokim stopniu czystości wyizolowano, stosując łączone podejście polegające na kontrolowanym trawieniu trypsyną oraz wirowaniu różnicowym. Wszystkie procedury przeprowadzono w temperaturze 4 °C w celu zachowania integralności strukturalnej i funkcjonalnej mitochondriów. Świeżo wyizolowaną tkankę mięśnia szkieletowego poddano trawieniu enzymatycznemu, homogenizacji oraz sekwencyjnym etapom wirowania, aby uzyskać oczyszczone mitochondria odpowiednie do dalszych analiz funkcjonalnych i strukturalnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Aktywność funkcjonalną wyizolowanych mitochondriów oceniono za pomocą barwienia JC-1 oraz fluorescencyjnego znakowania mitochondriów (Rysunek 2). Barwienie JC-1 wykazało silną czerwoną fluorescencję w świeżo wyizolowanych mitochondriach w warunkach bazalnych, co wskazuje na zachowanie potencjału błony mitochondrialnej. Po zastosowaniu cyjanorku karbonylowego m-chlorofenylhydrazonu (CCCP) fluorescencja czerwona zmalała, a fluorescencja zielona wzrosła, co jest zgodne z depolaryzacją błony mitochondrialnej. Wyniki te potwierdziły, że wyizolowane mitochondria zachowały zdolność reagowania potencjału błony i pozostały funkcjonalnie aktywne po izolacji. Znakowanie fluorescencyjne dodatkowo wykazało, że mitochondria miały postać oddzielnych, jednorodnie rozłożonych struktur punktowych w całym polu widzenia, bez wyraźnej agregacji lub precypitacji barwnika. Niska fluorescencja tła oraz jednorodny wzór barwienia sugerowały zachowanie integralności mitochondriów i potencjału błony po izolacji.

Rysunek 2: Charakterystyka aktywności funkcjonalnej wyizolowanych mitochondriów. (A) Ocena potencjału błony mitochondrialnej za pomocą barwienia JC-1. Oczyszczone mitochondria zabarwiono JC-1 i obserwowano pod mikroskopem fluorescencyjnym. W grupie kontrolnej mitochondriów zaobserwowano wyraźne czerwone agregaty fluorescencyjne, co wskazuje na zachowany potencjał błony mitochondrialnej. Po zastosowaniu odsprzęgacza CCCP fluorescencja przesunęła się głównie w stronę zielonych monomerów JC-1, co wskazuje na depolaryzację błony i zanik potencjału błonowego (pasek skali = 50 µm). (B) Fluorescencyjne znakowanie oczyszczonych mitochondriów. Mitochondria znakowane fluorescencyjnie pojawiły się jako rozproszone struktury punktowe bez wyraźnej agregacji i z minimalną fluorescencją tła, co świadczy o zachowanej integralności mitochondriów i stabilnym potencjale błonowym (pasek skali = 100 µm). (C) Ilościowa analiza stosunków intensywności fluorescencji JC-1 w różnych grupach po barwieniu JC-1. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM (n = 3). Istotność statystyczną analizowano przy użyciu nieparzystego testu t (****P < 0.0001). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Integralność ultrastrukturalną wyizolowanych mitochondriów zbadano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Rysunek 3). Obrazowanie przy małym powiększeniu ukazało oczyszczone mitochondria o przeważnie owalnej morfologii, natomiast obrazowanie przy dużym powiększeniu wykazało nienaruszone błony zewnętrzne i wyraźnie zdefiniowane struktury grzebieni. Nie zaobserwowano oczywistych obrzęków, pęknięć ani zaburzeń strukturalnych. W ramach oceny ilościowej przeanalizowano pięć losowo wybranych pól zawierających około 40-60 mitochondriów na pole. Obserwacje te wykazały, że procedura izolacji skutecznie zachowała ultrastrukturę mitochondriów i pozwoliła na uzyskanie mitochondriów odpowiednich do dalszych badań funkcjonalnych.

Rycina 3: Integralność ultrastrukturalna wyizolowanych mitochondriów mięśni szkieletowych oceniona za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. (Po lewej) Reprezentatywny obraz TEM przy niskim powiększeniu (4,000×; pasek skali = 2 µm) przedstawiający oczyszczone mitochondria o przeważnie owalnej morfologii. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

(Prawo) Zdjęcie TEM przy dużym powiększeniu (40 000×; pasek skali = 200 nm) wykazujące gładkie i ciągłe zewnętrzne błony mitochondrialne oraz wyraźnie zdefiniowane struktury grzebieni mitochondrialnych. Żółte strzałki wskazują nienaruszone zewnętrzne błony mitochondrialne, natomiast białe strzałki wskazują dobrze zorganizowane grzebienie mitochondrialne. Nie zaobserwowano oznak obrzęku, pęknięć ani zaburzeń strukturalnych. Przeanalizowano pięć losowo wybranych pól zawierających około 40-60 mitochondriów na pole. Wyniki te dowodzą, że protokół izolacji zachował integralność ultrastrukturalną mitochondriów i zapewnił wiarygodną podstawę strukturalną dla dalszych analiz funkcjonalnych.

Wydajność i czystość mitochondriów oceniono następnie poprzez oznaczanie ilości białka oraz analizę immunoblotową (Rysunek 4). Porównanie metody trawienia trypsyną (TD) oraz standardowej ekstrakcji (NE) wykazało, że metoda TD pozwoliła na uzyskanie około 2,3-2,4 µg białka mitochondrialnego na mg tkanki, podczas gdy metoda NE pozwoliła na uzyskanie około 1,7-1,8 µg/mg tkanki. Analiza immunoblotowa wykazała silne wzbogacenie frakcji mitochondrialnych w markery mitochondrialne, oksydazę cytochromu c oraz COX IV, przy minimalnej detekcji w frakcjach cytozolowych. Z kolei marker cytozolowy β-actin wykazywał jedynie słabe sygnały w frakcjach mitochondrialnych, co wskazuje na ograniczoną kontaminację cytozolową. Porównanie grup TD i NE sugeruje, że trawienie trypsyną poprawiło wydajność i czystość uzyskiwanych mitochondriów. Wspólnie wyniki te dowiodły, że protokół pozwolił na otrzymanie mitochondriów odpowiednich do dalszych analiz molekularnych i funkcjonalnych.

Rysunek 4: Porównanie wydajności i czystości oczyszczonych mitochondriów. (A) Porównanie wydajności białka mitochondrialnego na jednostkę masy tkanki otrzymanej przy użyciu metody trawienia trypsyną (TD) oraz normalnej ekstrakcji (NE). Grupa TD dała wydajność około 2,3-2,4 µg/mg tkanki, natomiast grupa NE około 1,7-1,8 µg/mg tkanki. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM (n = 3). Istotność statystyczną analizowano za pomocą nieparzystego testu t (*P < 0,05). (B) Analiza immunoblot białek markerowych mitochondriów i cytozolu w frakcjach mitochondrialnych wyizolowanych metodami TD i NE. (C-D) Analiza ilościowa białek markerowych mitochondriów: oksydazy cytochromu c oraz COX IV. Markery mitochondrialne były silnie wzbogacone w frakcjach mitochondrialnych, ale wykazywały minimalną ekspresję w frakcjach cytozolowych. Marker cytozolowy β-aktyna wykazywał jedynie słabą ekspresję w frakcjach mitochondrialnych, co wskazuje na efektywne usunięcie zanieczyszczeń cytozolowych. W porównaniu z grupą NE, grupa TD wykazała lepszą czystość mitochondriów. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM (n = 3). Istotność statystyczną analizowano za pomocą nieparzystego testu t (*P < 0,05; **P < 0,01). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Aby dalej ocenić funkcję oddychania mitochondrialnego, zmierzono zużycie tlenu za pomocą respirometrii wysokiej rozdzielczości (Rycina 5). Mitochondria wyizolowane metodą TD wykazały wartości wskaźnika kontroli oddychania (RCR) wynoszące około 9-10, natomiast mitochondria wyizolowane metodą NE wykazały wartości RCR około 8-9. Ponieważ wartości RCR większe niż 4 są zazwyczaj uznawane za wskaźnik zachowanej aktywności oddechowej mitochondriów, wyniki te wykazały, że mitochondria wyizolowane obiema metodami zachowały integralność funkcjonalną. Wyższe wartości RCR zaobserwowane w grupie TD sugerowały lepsze zachowanie funkcji oddechowej mitochondriów niż w grupie NE. Oceniono również wydajność sprzężenia biochemicznego przy użyciu równania 1 − (szybkość oddychania przeciekowego/szybkość oddychania transportu elektronów), gdzie wartości zbliżające się do 1 wskazują na ściślejsze sprzężenie oddechowe i bardziej wydajną produkcję ATP. W obu grupach wydajność sprzężenia była bliska 1, co wskazuje, że funkcja bioenergetyczna mitochondriów została zachowana po izolacji.

Rysunek 5: Ocena funkcji oddechowych w oczyszczonych mitochondriach. (A) Porównanie mitochondrialnego wskaźnika kontroli oddychania (RCR) między grupą z trawieniem trypsyną (TD) a grupą z normalną ekstrakcją (NE). Wartości RCR w obu grupach były większe niż 4, co wskazuje na zachowanie aktywności oddechowej mitochondriów po izolacji. Grupa TD wykazała nieco wyższe wartości RCR niż grupa NE, co sugeruje lepsze zachowanie funkcji oddechowych. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM (n = 3). Istotność statystyczną analizowano za pomocą nieparzystego testu t (**P < 0.01). (B) Porównanie biochemicznej wydajności sprzężenia mitochondrialnego i zdolności do syntezy ATP między grupami TD i NE. Wartości wydajności sprzężenia w obu grupach zbliżały się do 1, co wskazuje na silnie sprzężone oddychanie i wydajną produkcję ATP. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM (n = 3). Istotność statystyczną analizowano za pomocą nieparzystego testu t (*P < 0.05). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wchłanianie wyizolowanych mitochondriów przez komórki biorcze oceniono z wykorzystaniem komórek L929 (Rycina 6). Komórki inkubowano wspólnie z mitochondriami pochodzącymi z mięśnia szkieletowego, znakowanymi czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym, a cytoszkielet aktynowy wizualizowano za pomocą fluorescencyjnej sondy do aktyny. Mikroskopia konfokalna ujawniła punktowe struktury fluorescencyjne o czerwonym zabarwieniu, rozproszone w całej cytoplazmie, co wskazało na wchłonięcie egzogennych mitochondriów przez komórki L929. Analiza ilościowa wykazała zależny od czasu wzrost wchłaniania mitochondriów w 12, 24 i 48 h. Zaobserwowano jednak jedynie niewielki wzrost między 24 h a 48 h, co sugeruje, że efektywność wchłaniania zbliżyła się do nasycenia po 24 h. Ponadto komórki biorcze L929 wykazały zwiększony potencjał błony mitochondrialnej po wchłonięciu mitochondriów, co wskazuje na poprawę ich funkcji. Wyniki te wykazały, że mitochondria pochodzące z mięśnia szkieletowego, wyizolowane zgodnie z tym protokołem, mogą być skutecznie internalizowane przez komórki biorcze przy zachowaniu aktywności funkcjonalnej.

Rysunek 6: Pobieranie mitochondriów pochodzących z mięśni szkieletowych przez komórki L929. (A) Pobieranie oczyszczonych mitochondriów przez komórki L929 w różnych czasach inkubacji (12 h, 24 h i 48 h). Mitochondria znakowane barwnikiem fluorescencyjnym (czerwony) wykryto w cytoplazmie komórek biorców, natomiast barwienie falloidyną (zielony) wykorzystano do wizualizacji cytoszkieletu aktynowego. Barwienie jąder wykonano przy użyciu DAPI (niebieski). Mikroskopia konfokalna potwierdziła internalizację egzogennych mitochondriów przez komórki L929 (pasek skali = 50 µm). (B) Analiza ilościowa wydajności pobierania mitochondriów przez komórki L929 w różnych punktach czasowych. (C) Analiza barwienia JC-1 potencjału błony mitochondrialnej w komórkach L929 po pobraniu mitochondriów pochodzących z mięśni szkieletowych. (D) Analiza ilościowa stosunków fluorescencji agregatów do monomerów JC-1 w komórkach biorców L929 po pobraniu mitochondriów. Potencjał błony mitochondrialnej uległ znacznemu zwiększeniu po internalizacji aktywnych mitochondriów pochodzących z mięśni szkieletowych. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM (n = 3). Istotność statystyczną analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Transplantacja mitochondria to nowa strategia w terapii komórkowej i medycynie regeneracyjnej, która przywraca fizjologiczną funkcję w komórkach z upośledzonym metabolizmem energetycznym poprzez dostarczanie funkcjonalnie nietkniętych mitochondria. Oprócz regulacji metabolizmu energetycznego komórek, ta technika może modulować kluczowe procesy biologiczne, takie jak apoptoza i stres oksydacyjny, zapewniając tym samym nowe możliwości terapeutyczne dla różnorodnych chorób^4,17,18,19. Jednakże, kliniczne zastosowanie transplantacji mitochondria nadal napotyka na szereg wyzwań, wśród nich brak zstandaryzowanych, wydajnych i powtarzalnych protokołów izolacji mitochondria, które nadal stanowią główną przeszkodę.

Aby rozwiązać ten problem, niniejsze badanie ustanowiło zstandaryzowany i wizualizowany protokół eksperymentalny oparty na dyferencyjnej wirowanianiu dla wydajnej izolacji funkcjonalnych wolnych mitochondria z mięśni szkieletowych myszy C57BL/6. Poprzez optymalizację procedury oczyszczania i włączenie pre-digestji trypsyną, mycia i kroków oczyszczania, ta metoda skutecznie poprawia dysocjację tkanki, zachowuje integralność strukturalną mitochondria i zmniejsza skażenie przez niedocelowe komponenty komórkowe.

Zaproponowany protokół osiąga korzystną równowagę między czystością a wydajnością mitochondria. W porównaniu z konwencjonalnymi metodami ekstrakcji opartymi na rozdrabnianiu, niniejsza metoda jest szybsza, bardziej praktyczna i bardziej opłacalna, co czyni ją odpowiednią do rutynowych zastosowań laboratoryjnych i przygotowania mitochondria dawczych. Istniejące podejścia do izolacji mitochondria mają każde pewne ograniczenia. Na przykład, wirowanie gradientowe o gęstości i oczyszczanie immunoaffinity mogą osiągnąć wyższą czystość, ale są czasochłonne i kosztowne, podczas gdy podejścia oparte na nanoskalowych sondach pozostają niedostatecznie rozwinięte do rutynowego użytku^20,21. Dla gęstych tkanek, takich jak mięśnie szkieletowe, zoptymalizowany krok pre-digestji trypsyną (0,25% trypsyny w 37 °C przez 10-15 min), w połączeniu z delikatnym homogenizowaniem, lepiej zachowuje integralność mitochondria niż konwencjonalne wirowanie dyferencyjne samo w sobie.

W niniejszym badaniu, komercyjnie dostępny zestaw do wirowania dyferencyjnego był używany w niskich temperaturach przez cały proces i zgodnie ze zstandaryzowanym przepływem pracy, umożliwiając szybkie pozyskiwanie strukturalnie nietkniętych mitochondria. Aby rozwiązać potencjalne problemy napotkane podczas procesu ekstrakcji, w tym niską wydajność, zanieczyszczenie białkami i nienormalny potencjał błony, zaproponowano kilka strategii rozwiązywania problemów.

Niski poziom wydajności mitochondria jest zwykle spowodowany niewystarczającym homogenizowaniem, nieodpowiednią ilością tkanki lub utratą wirowania. Te problemy można zminimalizować poprzez zapewnienie odpowiedniej pre-digestji, wykonywanie delikatnego homogenizowania (10-15 przejść przy użyciu ściśle dopasowanego homogenizatora), użycie co najmniej 100-150 mg świeżego tkanki mięśniowej szkieletowej, ścisłą kontrolę warunków wirowania (1000 × g do usunięcia osadu i 10 000-12 000 × g do wirowania pellet mitochondria) oraz resuspendowanie próbek za pomocą końcówek pipet szeroko ujściowych. Zanieczyszczenie białkami wynika głównie z niekompletnego usuwania osadu lub interferencji lipidów; dlatego zaleca się powtórzenie kroku wirowania 1000 × g, włączenie dodatkowych dwóch kroków mycia 12 000 × g oraz ostrożne usunięcie tkanki tłuszczowej. Nienormalny potencjał błony mitochondria jest często związany z uszkodzeniami mechanicznymi lub wahaniami temperatury. Dlatego należy unikać nadmiernego homogenizowania, cały proces powinien być wykonywany na lodzie i ukończony w ciągu 60-90 min, a buforów do izolacji należy uzupełniać o EGTA i 0,5% BSA. Niekompletne homogenizowanie można poprawić poprzez zapewnienie odpowiedniej enzymatycznej digestji, wybór odpowiedniego homogenizatora i przeprowadzenie filtracji po homogenizacji.

Chociaż obecny protokół znacznie poprawia wydajność i czystość izolacji mitochondria, nadal istnieją pewne ograniczenia. Po pierwsze, procedura jest mocno zależna od świeżości tkanki; idealnie, próbki tkankowe powinny być przetwarzane w ciągu 1 h po śmierci. Po drugie, resztki trypsyny mogą rozkładać białka powierzchniowe mitochondria, w tym białka związane z translokazą, jeśli nie zostaną odpowiednio usunięte podczas mycia, co może potencjalnie wpłynąć na późniejszą wydajność przyjęcia przez komórki. Po trzecie, czas przechowywania mitochondria pozostaje ograniczony, ponieważ przedłużone przechowywanie w 4 °C lub krioprezerwacja znacznie zmniejszają aktywność mitochondria.

Na poziomie translacji, nadal pozostają dodatkowe wyzwania, w tym poprawa wydajności dostarczania in vivo, zrozumienie długoterminowych mechanizmów integracji mitochondria oraz wyjaśnienie potencjalnych interakcji między transplantowanymi mitochondriami a genomem gospodarza. Przy ciągłym postępcie w technologiach izolacji i oczyszczania mitochondria, oczekuje się, że dalsze innowacje metodologiczne przyspieszą kliniczne zastosowanie terapii transplantacji mitochondria.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Anti-Cytochrome C antibody	Abcam	EPR1327	Mitochondrial Characterization
Anti-fade mounting medium	PlantChemMed	PC-90016	Reduce photobleaching of fluorescent dyes
BCA Protein Assay Kit	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PQ003	Protein concentration assay
Beta-actin antibody	Cell Signaling technology	3700s	Beta-actin antibody was used to detect the purity of isolated mitochondria
BSA	Sigma	A6003	During isolation, it binds free fatty acids to protect mitochondrial activity.
Centrifuge	Eppendorf	5418R	4 °C Centrifugation
CCCP	Solarbio	C6700	to uncouple mitochondrial oxidative phosphorylation and induce maximal proton leakage
Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus Corporation	FV4000	Immunofluorescence Staining Observation
COX IV polyclonal antibody	Proteintech	11242-1-AP	Mitochondrial Characterization
DAPI	Plant Chem Medicine	PC-90004	For nuclear counterstaining
D-mannitol	Solarbio	IM00402	maintain osmotic balance and prevent mitochondrial swelling during isolation
EGTA	Sigma	E4378	Commonly used in mitochondrial isolation buffers to protect mitochondrial function by specifically binding Ca2+
Fetal bovine serum	Every Green	11011-08611	Culture of L929 cells
Forceps	RWD Life Science Co., Ltd.	F11003-11	Used to grasp, hold and lift tissues
Glass homogenizer	Beyotime	FGH005	Used for tissue homogenization and isolation of mitochondria
Glutaraldehyde	LEAGENE	DF0151	It rapidly fixes and stabilizes cellular ultrastructure by cross-linking proteins, preventing autolysis to preserve the natural morphology of organelles.
HEPES	Thermo Fisher	J67485	Provides a stable pH environment.
Incubator	Thermo Fisher	51032874	Culture of L929 cells
JC-1	Solarbio	M8650	Detecting changes in the membrane potential of purified mitochondria.
L929 cell line	Procell	CL-0137	For mitochondrial endocytosis assay
Lead citrate	Sigma	15326	to stain ultrathin sections for fine subcellular structure observation.
MEM Alpha basic (1x)	Gibco	6125510	Culture of L929 cells
Methanol	Fuyu Chemical (China)	67-56-1	As a component of the transfer buffer, it is used to remove SDS and facilitate the transfer of proteins from the gel to the solid-phase membrane.
Microplate Reader	Thermo Fisher	Varioskan LUX	Measure the absorbance of JC-1-stained mitochondria
Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit	Solarbio	M8650	Detection of Mitochondrial Membrane Potential in Skeletal Muscle
Mitochondrial isolation Buffer	Solarbio	SM0020	Kits for Extraction Based on Differential Centrifugation
Mitochondria Storage Buffer	Solarbio	SM0020	For mitochondrial preservation
Mito Tracker  Red CMXRos	Yeasen Biotechnology	40741ES50	Mitochondrial Characterization
MOPS	MedChemExpress	HY-D0859	AS a buffer in solution preparation
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Mouse Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAM001	RGAM001 targets Mouse IgG (H+L) in Western blot
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Rabbit Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAR001	RGAR001 targets to Rabbit IgG (H+L) in ELISA and Western blot
Non-fat dry milk	NCM Biotech	WB6503	It is mainly used as a blocking agent to reduce background signal by occupying non-specific binding sites on the membrane.
O2k-FluoRespirometer	Oroboros Instruments	O2K	Determine mitochondrial respiratory function and oxygen metabolism.
Osmium tetroxide	Sigma	75633	or postfixation to preserve lipids and enhance membrane contrast in TEM samples.
PBS (1x)	Plant Chem Medicine	PC-00003	Clean Muscle Tissue
Penicillin-Streptomycin	Procell	PB180120	Culture of L929 cells
Phalloidin-488	Beyotime	C1035	Label cytoskeletal F-actin for fluorescence microscopic imaging
Polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane	Millipore (Merck)	IPVH00010	Western blotting
PowerPac Basic	BIO-RAD	164-5050	For protein separation by SDS-PAGE electrophoresis
Precast gradient polyacrylamide gel (4–12%)	ACE Bioscience	ET12412LGel	Used for SDS-PAGE separation of mitochondrial and cellular total proteins
Protease inhibitor	Shaanxi Zhonghui Hecai Biomedical Technology	PL032	Inhibits the activity of endogenous and exogenous proteases, preventing the degradation of target proteins during sample processing.
RIPA lysis buffer	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PL001-2A	Used for total protein extraction of animal and cellular tissues
Sodium Chloride Injection (0.9%)	Xi’an Jingshuang Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd.	Approval No. H61020014	Cell/tissue experimental buffering, rinsing and osmotic pressure maintenance
Sterile gloves	Jiangsu Yangzi Lide Medical Devices Co., Ltd.	YMZ000-1	Isolate contamination and protect operators and experimental samples
Sucrose	Sucrose	S818048	Provides osmotic support and maintains mitochondrial morphology and functional integrity.
TBST	NCM Biotech	WB20500	Washing to reduce background, serving as a diluent for antibodies and blocking solutions, while protecting the stability of antigen-antibody binding by maintaining a stable pH and ionic environment.
Tissue Homogenate Assay Kit(contains Adenosine diphosphate (ADP),Succinate,Rotenone,Antimycin A,Oligomycin,Pyruvate,Malate, Glutamate,Ascorbate,N,N,N','N'- tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD))	Beijing Huawei Zhongyi Technology Co., Ltd.	023012	Detection of mitochondrial OCR in tissue homogenate adapted for Oroboros O2k respirometer
Tissue scissors	RWD Life Science Co., Ltd.	S12003-09	For cutting and dissecting soft tissues, separating organs and fascia in animal dissection
Transmission electron microscope	HITACHI	HT7800	Analyze the ultrastructural morphology of mitochondria
Trypsin	Plant Chem Medicine	PC-90001	Organ pre-digestion
Universal Antibody Diluent	NCM Biotech	WB100D