Określanie wskaźnika śmiertelności embrionalnej u Caenorhabditis elegans

Podsumowanie

Ten protokół zapewnia prostą, niedrogą procedurę ilościowego określania wskaźnika śmiertelności zarodkowej u Caenorhabditis elegans. Umożliwia bezpośrednie wykrywanie zaburzeń zarodkowych w populacjach bez specjalistycznego sprzętu lub doświadczenia w wybieraniu dżdżownic. Protokół może być stosowany do ilościowego określania wpływu mutacji genetycznych, wyciszenia genów za pośrednictwem interferencji RNA i diety.

Streszczenie

Letalność embrionalna jest kluczowy fenotypem stosowanym w badaniach nad Caenorhabditis elegans w celu scharakteryzowania defektów rozwojowych wynikających z czynników takich jak ekspozycja na toksyny i mutacje genetyczne. Dlatego dokładne ilościowe określenie penetracji letalności embrionalnej jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmów i wpływu tych zakłóceń na rozwój zwierząt. Chociaż istnieją zautomatyzowane platformy do oceny, podejścia te często wymagają znacznych inwestycji finansowych oraz specjalistycznego sprzętu lub oprogramowania. W artykule tym opisano tanią i prostą metodę, która ilościowo określa letalność embrionalną poprzez pomiar odsetka zarodków, które z powodzeniem nie wykluwają się. Warto zauważyć, że ta wersja testu eliminuje potrzebę szczypc do robaków, co sprawia, że jest on szczególnie odpowiedni dla początkujących. Dodatkową zaletą tej metody jest to, że każdy powtórzenie techniczne bada potomstwo z wielu zwierząt, unikając potencjalnych stronniczości testów na pojedynczym robaku. Protokół ten zawiera dyskusję na temat kluczowych parametrów, takich jak minimalna liczba potomstwa wymagana do dokładnego uchwycenia penetracji fenotypu oraz uzasadnienie metodologii. Wreszcie, zapewniamy wskazówki dotyczące dostosowania testu do oceny efektów wyciszenia genów poprzez interferencję RNA, leczenie farmakologiczne lub suplementację żywieniową, dodając wszechstronne i dostępne narzędzie do zestawu narzędzi badaczy C. elegans.

Wprowadzenie

Lethality embrionalna jest krytycznym fenotypem do oceny ról genów i czynników środowiskowych we wczesnym rozwoju. C. elegans jest potężnym modelem do badania procesów rozwojowych ze względu na jego niezmienny ród komórkowy, przezroczyste ciało i szybki cykl życia¹. Lethality embrionalna C. elegans może być wykorzystana do oceny integralności rozwoju pod wpływem perturbacji chemicznych, farmakologicznych, żywieniowych i genetycznych^2,3,4,5. Dlatego dostępne i wszechstronne metody do dokładnego ilościowego określania wskaźnika lethality embrionalnej przyniosą korzyści dla społeczności naukowej.

Zaawansowane metody o wysokiej wydajności i wysokim udziale, które badają embriogenezę, polegają na specjalistycznych systemach obrazowania i oprogramowaniu, często wymagając substancjalnych inwestycji finansowych^4,6,7, podczas gdy prostsze podejścia o wysokiej wydajności zapewniają przede wszystkim jakościowe odczyty^8,9. Metody klasyczne, w przeciwieństwie do nich, wykorzystują manualne, nisko-kosztowe podejście, które zazwyczaj obejmuje wielokrotne przenoszenie pojedynczych hermafrodytów za pomocą szpilki do robaków w celu oceny lethality embrionalnej całej potomstwa^2,10. Jednak metoda ta może być technicznie wymagająca dla początkujących i ma ograniczoną skalowalność. Ponadto klasyczne testy oparte na wielkości potomstwa oceniają żywotność embrionalną w potomstwie pojedynczej matki, co może wprowadzać niezamierzoną tendencję.

Głównym celem tej metody jest zapewnienie alternatywnego, prostego, nisko-kosztowego i wszechstronnego podejścia do ilościowego określania żywotności embrionalnej o średniej wydajności. Ta metoda mierzy wskaźniki lethality embrionalnej w potomstwie wielu zwierząt na replikę, nie wymaga użycia szpilki do robaków i unika wszelkiego specjalistycznego lub kosztownego sprzętu. Badanie pokazuje również, jak metoda może być zastosowana do typowych perturbacji, takich jak interferencja RNA i testowanie leków lub składników odżywczych.

Protokół

1. C. elegans utrzymanie

UWAGA: Szczegółowe wytyczne dotyczące hodowli C. elegans można znaleźć w WormBook¹¹.

1. Przygotuj płytki z pożywką Nematode Growth Medium (NGM) do utrzymania.
   1. Aby przygotować 1 L NGM, połącz 3 g NaCl, 2,5 g peptonu bakteriologicznego i 17 g agaru w butelce na 2 L. Dodaj 975 mL wody destylowanej i sztywnik mieszający, następnie autoklawuj przez 20 min w 121 °C.
   2. Pozwól pożywce ostygnąć do 55 °C w kąpieli wodnej. Umieść butelkę na płycie mieszającej i, stosując technikę aseptyczną, dodaj 25 mL 1 M buforu fosforanowego potasu i 1 mL z każdego z następujących: 1 M MgSO₄, 1 M CaCl₂ oraz 5 mg/mL cholesterolu. Wylej około 25 mL do każdej 100 mm płytki.
2. Przygotuj kultury E. coli OP50 na noc.
   1. Stosując technikę aseptyczną, napełnij kolbę Erlenmeyera o pojemności 1 L do jednej piątej objętości (200 mL) pożywką LB. Zakaż środowisko pojedynczą kolonią E. coli OP50 za pomocą sterylnej pętli inokulatora. Inkubuj na noc w 37 °C na mieszadle orbitalnym z prędkością 200 rpm.
3. Zasiej płytki NGM do utrzymania E. coli OP50 (Rysunek 1A).
   1. Przenieś kulturę E. coli OP50 do sterylnych butelek do wirówki i wiruj przez 30 min przy 3500 x g w temperaturze pokojowej. Zawiesz osiadłość bakteryjną w jednej dwudziestej pierwotnego objętości. Użyj 1–1,5 mL skoncentrowanej kultury do zasiewu każdej 100 mm płytki NGM.
   2. Inkubujej płytki na noc w temperaturze pokojowej, aby bakterie mogły się rozwijać.
      UWAGA: Te płytki do utrzymania mają wysoką gęstość bakterii, aby wspierać do 4000 robaków na płytkę, co jest pożądane podczas przeprowadzania dużej liczby badań lub pracy z powoli rosnącym szczepem C. elegans. Zasiane płytki do utrzymania można przechowywać w lodówce w 4 °C przez maksymalnie 1 miesiąc.
4. Ustaw pierwotną kulturę C. elegans (Rysunek 1A).
   1. Użyj sterylnej końcówki pipetowej, aby wyciąć mały kawałek agaru zawierający około 1000 robaków z wygłodniałej płytki do utrzymania. Umieść kawałek agaru na zasianej płytce NGM.
   2. Umieść nową płytkę w plastikowym pojemniku i inkubujej w 20 °C przez 3 dni, aż robaki będą ciężarne i składają jaja. Upewnij się, że warstwa bakterii jest wystarczająca, a populacja robaków nie głoduje. W tym momencie populacja robaków jest gotowa do eksperymentu.

2. Przygotowanie pożywek eksperymentalnych i kultur bakteryjnych

UWAGA: Na tym etapie przejdź do Metody 1, aby przetestować efekt RNAi-mediated gene knockdown, lub Metody 2, aby zbadać suplementy pokarmowe.

1. Metoda 1: Przygotuj eksperymentalne płytki NGM do RNAi przez karmienie.
   1. Przygotuj 1 L NGM zgodnie z opisem w kroku 1.1, a następnie, stosując technikę aseptyczną, dodaj 1 mL 1 M IPTG i 1 mL 50 mg/mL ampicyliny. Wylej około 5 mL do każdej 35 mm płytki.
   2. Zasiej pożądaną liczbę bakterii E. coli HT115 RNAi feeding clones zawierających plazmidy L4440 ukierunkowane na geny C. elegans o zainteresowaniu, razem z kontrolą wektora pustego. Wybierz pojedynczą kolonię za pomocą pętli inokulatora i przenieś ją do 1,5 mL LB zawierającego 50 µg/mL ampicyliny. Inkubuj przez 18 h w 37 °C na mieszadle orbitalnym z prędkością 200 rpm.
   3. Zasej 35 mm płytki NGM zawierające ampicylinę i IPTG z 100 μL nocnej kultury E. coli HT115, przygotowując dwie repliki techniczne na każdą warunkę. Inkubuj płytki na noc w temperaturze pokojowej, aby umożliwić wzrost bakterii i indukować produkcję dwuniciowego RNA. Przechowuj równą liczbę niezasianych płytek w 4 °C na późniejsze użycie w przenoszeniu jaj.
2. Metoda 2: Przygotuj eksperymentalne płytki NGM z suplementem pokarmowym lub lekiem.
   1. Przygotuj 1,5x skoncentrowaną NGM zgodnie z instrukcjami w kroku 1.1, ale dodaj 642 mL wody destylowanej zamiast 975 mL. Trzymaj przygotowaną pożywkę w kąpieli wodnej w 55 °C.
   2. Przygotuj wodny stok suplemenu o zainteresowaniu w 3x wyższym stężeniu docelowym (na przykład, aby przygotować płyt

Wyniki

Test śmiertelności embrionalnej przeprowadzono na dwóch szczepach: dzikiego typu N2 i nadwrażliwej na RNAi odmiany rrf-3(pk1426). Stosując RNAi przez karmienie, tłumiliśmy geny, o których wcześniej donoszono, że powodują śmiertelność embrionalną w wysokowydajnych badaniach przesiewowych^9,12. Rysunek 2 przedstawia przykładowe wyniki testu. T04G9.4 tłumienie wywołało prawie w pełni penetrującą śmiertelność embrionalną zarówno ...

Dyskusja

Kilka kroków jest kluczowych dla reprodukowalności i dokładności testu. Po pierwsze, krok blanszowania musi być starannie czasomierzony, aby rozpuścić dorosłe robaki bez uszkodzenia zarodków. Kolejnym ważnym punktem jest przeniesienie wystarczającej liczby zarodków do liczenia: zbyt mało zmniejszy precyzję, podczas gdy zbyt wiele sprawią, że liczenie będzie niepotrzebnie żmudne. Następnie przeniesienie zarodków powinno być przeprowadzone przed początkiem ich wylęgania. W przeciwnym razie wylęgające się robaczki zostaną z...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518
Bacteriological peptone	Fischer Scientific	DF0118-17-0
C. elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center	N2	wild type
C. elegans NL2099	Caenorhabditis Genetics Center	NL2099	rrf-3(pk1426) II. RNAi hypersensitive
Calcium chloride, anhydrous	Sigma-Aldrich	746495
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C3045
Conical tubes, 15 mL	VWR	60818-725
Culture tubes, 14 mL	VWR	470150-966
Diaphragm vacuum pump	Amazon	TC-100
Dissecting microscope	AmScope	SM-2
Escherichia coli HT115	Caenorhabditis Genetics Center		RNAse III-deficient, used for RNAi by feeding experiments
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center
Granulated agar	Fischer Scientific	BP97445
Handheld tally counter	LabDepot	HTCP01
IPTG, dioxane free (Isopropyl-b-D-thiogalactoside)	US Biological	I8500
LB Broth (Miller)	US Biological	L1520	To make LB medium dissolve 25 g of LB powder in 1 L of distilled water. Autoclave for 20 min at 121.1 °C.
Luer Lok disposable syringe	BH Supplies	BH20LL
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643
Microscopy slides	Sail Brand	7101
Petri dishes, 100 mm	Tritech Research	T3371
Petri dishes, 35 mm	Tritech Research	T3501
Potassium Phosphate Buffer (PPB)			To make potassium phosphate buffer (1 M), dissolve 98 g of potassium phosphate monobasic and 48 g of potassium phosphate dibasic in 1 L of distilled water. Adjust the pH to 6. Autoclave for 20 min at 121 °C.
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	795496
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	529568
Rocker (nutating mixer)	Corning LSE	6720
Serological pipettes, 25 mL	Corning	4489
Serological pipettes, 5 mL	Celltreat	229235
Shaking incubator Infors Multitron	INFORS HT	NA
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium hydroxide solution, 5 N	Fisher Scientific	SS256-500
Sodium hypochlorite, 5%	LabDepot	LC246302
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sorvall ST1 Plus Centrifuge	Thermo Scientific	75016030
Stir plate	ONilab	ONi28-S
Syringe filters	Semmerfeld	JQP033022QE1
Water bath	FOUR E's Scientific	WB401