Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS): Otwarte, przyjazne dla użytkownika narzędzie do ilościowej analizy morfologii mikrogleju

Podsumowanie

Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS) to przyjazny dla użytkownika system analityczny, który nie wymaga znajomości kodowania i półautomatycznie analizuje morfologię pojedynczych komórek mikrogleju na obrazach immunofluorescencyjnych. MMPS, zweryfikowane w modelu neurozapalenia wywołanego lipopolisacharydem u gryzoni, w sposób powtarzalny wykrywa zmiany morfologiczne związane z aktywacją i umożliwia standaryzowane, skalowalne fenotypowanie mikrogleju.

Streszczenie

Mikroglia są pochodzącymi z komórek szpiku komórkami odpornościowymi ośrodkowego układu nerwowego, które pośredniczą w degradacji i przebudowie tkanek po urazie neurologicznym i stały się obiecującymi celami terapeutycznymi w wielu chorobach neurodegeneracyjnych. Ilościowa analiza morfologii mikroglii może ujawnić subtelne różnice między subpopulacjami mikroglii, zachowując ważne informacje in situ. Jednak wiele obecnie dostępnych platform do analizy morfologii mikroglii jest albo niedostępnych publicznie, albo wymaga specjalistycznej wiedzy komputerowej, co ogranicza ich szerokie stosowanie. Aby przeciwdziałać tym ograniczeniom, stworzona została platforma do analizy morfologii mikroglii o nazwie Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), korzystająca z Pythona 3.11. MMPS jest kompatybilny z procesami opartymi na immunofluorescencji i nie wymaga wiedzy programistycznej do instalacji ani obsługi. Oprogramowanie semi-automatyzuje analizę morfologii pojedynczych komórek mikroglii za pomocą przystępnego graficznego interfejsu użytkownika i zawiera konfigurowalne procesy przetwarzania obrazów i generowaniu masek. Badanie polega na walidacji MMPS przy użyciu modelu neurozapalenia indukowanego lipopolisacharydem (LPS) u gryzoni. Ilościowa analiza na poziomie zwierząt wykazała, że mikroglia zwierząt leczonych LPS wykazywała znacznie większą powierzchnię somy (p < 0,01) i mniejszy obwód komórek (p < 0,05) w porównaniu z kontrolą leczoną substancją wypełniającą, co jest zgodne z cechami morfologicznymi związanymi z aktywacją mikroglii i neurozapaleniem. Ogólnie rzecz biorąc, MMPS zapewnia standaryzowaną, powtarzalną platformę do ilościowej analizy morfologii mikroglii w laboratoriach.

Wprowadzenie

Mikrogle to wrodzone komórki układu odpornościowego ośrodkowego układu nerwowego (CNS), które ciągle przeglądają otoczenie w poszukiwaniu patogenów i uszkodzeń tkankowych¹. Po aktywacji mikrogle zawijają swoje wypustki i przechodzą z homeostatycznej, rozgałęzionej morfologii w ameboidny fenotyp^2,3. W chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak udar niedokrwienny^4,5 i choroba Alzheimera^6,7, mikrogle często utrzymują stan neuroinflamacji poprzez ciągłą produkcję cytokin, rozległą degradację tkanki i fagocytozę². Te procesy przyczyniają się do zaburzenia jednostki neuronaczyniowej, co jeszcze bardziej nasila aktywację mikrogli i uszkodzenie CNS⁸, co sprawia, że mikrogle są obiecującymi celami terapeutycznymi^9,10.

Jedna z metod identyfikacji subtelnych różnic między subpopulacjami mikrogli w chorobach neurodegeneracyjnych polega na analizie morfologicznej. Zwykle wykonuje się ją za pomocą zwierząt Cx3CR1-GFP z mikroskopią dwufotonową in vivo¹¹ lub poprzez oznaczanie fluorescencyjnym (IF) uznanych markerów mikrogli, takich jak jonizowana cząsteczka łącząca wapń-1 (Iba1) lub receptor purynergiczny P2Y¹². Chociaż mikrogle często przechodzą między homeostatycznymi i ameboidnymi morfologiami po urazie, poprzednie badania wykazały, że mikrogle mogą również przyjąć dodatkowe fenotypy, w tym hiper-rozgałęzione mikrogle^3,13, mikrogle sześciokątne^3,14, mikrogle reaktywne¹⁵ i mikrogle prętowate^3,16. Jednak badania morfologii mikrogli często polegają na ręcznej klasyfikacji fenotypu homeostatycznego i ameboidnego. Takie podejścia wymagają specjalistycznych pipeline'ów analitycznych, które często brakuje standaryzacji między laboratoriami i utrudniają różnicowanie podobnych morfologii, takich jak fenotypy homeostatyczne i hiper-rozgałęzione, nawet dla wyszkolonego personelu¹⁷. Ponadto analiza oparta na IF subtelnych zmian morfologicznych wymaga obrazowania wysokiej rozdzielczości, co może stwarzać dodatkowe wyzwania techniczne.

Aby zapobiec tym ograniczeniom, opracowano kilka platform analitycznych, które pół-automatycznie¹¹ lub automatycznie¹⁸ wykrywają mikrogle i generują wiele binarnych reprezentacji komórek, zwanych "maskami", na obszarach docelowych zdefiniowanych przez użytkownika (np. 200–800 μm²). Takie podejścia zmniejszają subiektywność użytkownika, poprawiają reprodukcyjność i zwiększają efektywność analityczną. Pomimo tych postępow, wiele obecnie dostępnych platform oprogramowania ma ograniczenia, które uniemożliwiają szerokie przyjęcie, w tym brak dostępności open-source¹⁷, wymagania dotyczące doświadczenia w kodowaniu^11,19,20, zależność od systemów mikroskopii dwufotonowej in vivo^11,19, brak intuicyjnych interfejsów graficznych użytkownika^11,21,22, wolne prędkości przetwarzania¹¹ lub opieranie się na komercyjnych platformach oprogramowania^12,19,21. Chociaż ostatnie badania zaczęły rozwiązywać kilka z tych problemów, wiele istniejących platform nadal jest słabo przystosowanych do przepływów pracy opartych na IF, które są nadal szeroko stosowane do badania morfologii mikrogli.

Prezentujemy tutaj zorientowany na użytkownika program do analizy morfologii mikrogli o nazwie Mapping Microglial Parameters Software (MMPS). MMPS nie wymaga doświadczenia w kodowaniu, integruje się z uznanymi przepływami pracy opartymi na ImageJ i jest zaprojektowany specjalnie do użycia z obrazami IF. Oprogramowanie zostało opracowane w Python 3.11 i zawiera koncepcje z wcześniej opublikowanych platform morfologicznych open-source¹¹. MMPS ma intuicyjny interfejs graficzny użytkownika, który umożliwia użytkownikom importowanie i przetwarzanie dużych partii obrazów IF przy użyciu wielu opcji przetwarzania obrazu. Platforma zawiera również ręczną selekcję komórek w celu zminimalizowania artefaktów przekształcenia wprowadzeń podczas obracania IF, a także ręczne obrysowanie somy w celu uniknięcia zawierania wypustek komórkowych w pomiarach somy. Ponadto MMPS zawiera konfigurowalne parametry generowania masek i wiele funkcji zapewniania jakości w celu poprawy dokładności maski. Oprogramowanie oblicza kilka często stosowanych parametrów morfologicznych, w tym obwód, średnią odległość centroidów, obszar maski, mimośród, okrągłość i obszar somy. Do bardziej zaawansowanych badań, wy

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnej Komisji ds. Opieki i Korzyści Zwierząt Uniwersytetu Wirginii Zachodniej (protokół nr 2109047180) oraz Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych wspieranym przez Narodowe Instytuty Zdrowia. Sprzęt, odczynniki i oprogramowanie wykorzystane w tej metodzie wymienione są w Tabeli materiałów.

1. Zwierzęta doświadczalne

1. Pozyskać 10 samców szczurów linii Sprague-Dawley (w wieku 2-3 miesięcy). Po dostarczeniu szczurów do zoologicznego zakładu doświadczalnego powinny być one trzymane w grupach w cyklu 12 h światła/ciemności z dostępem ad libitum do pokarmu i wody. Po przyjeździe szczury poddawane są aklimatyzacji przez 3 dni przed rozpoczęciem badań.
2. Losowo przypisać szczury do grupy kontrolnej (vehicle) lub grupy traktowanej LPS (n = 5 szczurów/grupa).
   UWAGA: Ze względu na małą liczbę wykorzystanych szczurów można zastosować prostą strategię randomizacji, wykorzystując wygenerowane komputerowo liczby losowe do przydzielenia zwierząt do grupy badawczej.
3. Monitorować szczury po podaniu preparatu pod kątem wystąpienia „zachowań chorobowych” (sickness behavior): utraty masy ciała (>15%), wydzielania porfiryny, nieprawidłowości oddechowych lub obniżonej aktywności.
   UWAGA: Objawy zachowań chorobowych często pojawiają się w ciągu pierwszych 12 h po podaniu, dlatego należy wstrzyknąć preparaty wcześnie rano (6:00-8:00), monitorować zachowanie w ciągu dnia i zwrócić szczury do pomieszczenia hodowlanego późnym popołudniem (17:00-19:00).

2. Model neurostanu zapalnego

1. Przygotować roztwór zapasowy LPS (O111:B4) (10 mg/mL), rozpuszczając 50 mg LPS w 5 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym.
   UWAGA: LPS jest endotoksyną. Badacze powinni przestrzegać SOP swojej instytucji dotyczącej obchodzenia się z tą substancją i jej utylizacji.
2. Zważyć szczury, a następnie wykonać wstrzyknięcie domięśniowe LPS (10 mg/kg) lub PBS (nośnik).
3. W zależności od masy szczurów przewidywana objętość wstrzyknięcia wynosi od 150–300 µL.
4. Uśmiercić szczury 24 h po wstrzyknięciu poprzez perfuzję przezsercową, a następnie dekapitację.
5. Zanestetyzować szczury izofluranem podawanym drogą wziewną (5% w O₂) przez 5–10 min. Potwierdzić znieczulenie brakiem odruchu wycofania łapy.
6. Podczas znieczulenia wykonać nacięcie w linii środkowej klatki piersiowej, aby odsłonić przeponę i mostek. Z clampować wyrostek mieczykowaty za pomocą kleszczyków hemostatycznych, aby odsłonić jamę klatki piersiowej.
7. Przeciąć przeponę i klatkę piersiową w kierunku przednich kończyn, aby odsłonić serce.
8. Zclampować aortę zstępującą i żyłę główną dolną kleszczykami hemostatycznymi. Wprowadzić igłę motylkową 25G do lewej komory.
9. Przeprowadzić perfuzję szczurów lodowatym PBS (25 mL przy 30 mL/min) za pomocą pompy perystaltycznej. W ciągu kilku sekund od rozpoczęcia perfuzji naciąć lewy przedsionek, aby umożliwić odpływ perfuzatu.
10. Przeprowadzić perfuzję szczurów 4% paraformaldehydem (25 mL przy 30 mL/min).
    OSTROŻNIE: Paraformaldehyd należy obsługiwać przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. Odpady z paraformaldehydu należy utylizować zgodnie z przepisami instytucjonalnymi i lokalnymi.
11. Po perfuzji dokonać dekapitacji szczurów za pomocą gilotyny.
    UWAGA: Należy przestrzegać wytycznych danej instytucji dotyczących rejestrowania dekapitacji i ostrzenia ostrzy.
12. Odsłonić czaszkę, odsuwając skórę głowy w kierunku małżowiny usznej.
13. Przełamać kość czołową za pomocą kleszczyków hemostatycznych lub kleszczyków kostnych wprowadzonych do oczodołów.
14. Wprowadzić pęsetę do otworu wielkiego i oddzielić kości ciemieniowe.
15. Wyjąć mózg za pomocą precyzyjnej pęsety i inkubować przez noc w 4% paraformaldehydzie.
16. W celu krioprotekcji przenieść mózgi sekwencyjnie do 20% sacharozy, a następnie do 30% sacharozy na noc.

3. Immunofluorescencja

1. Zamrozić krioprotekcjonowane mózgi w związku Tissue Tek O.C.T. na suchym lodzie.
2. Przygotować skrawki mózgu o grubości 30 µm przy użyciu kriostatu.
3. Zebrać skrawki do PBS i przenieść je do koszyczków z siatką umieszczonych w płytce 12-dołkowej.
4. Wybrać co najmniej dwa skrawki od każdego szczura, zawierające przednią część grzbietową hipokampa.
5. Przemyć skrawki w PBS dwukrotnie po 5 min, kołysząc płytką.
6. Przeprowadzić permeabilizację skrawków w 0,3% Triton X-100/PBS przez 45 min, kołysząc płytką.
   UWAGA: Stosować 3 mL roztworu na każdy etap płukania lub inkubacji, chyba że określono inaczej.
7. Przemyć skrawki w PBS dwukrotnie po 5 min.
8. Rozcieńczyć roztwór do odzyskiwania antygenu do stężenia 1x w PBS i dodać 2 mL do każdego dołka.
9. Inkubować skrawki w temperaturze 80°C przez 20 min w kąpieli wodnej.
10. Pozostawić skrawki do ostygnięcia do temperatury pokojowej przed przejściem do kolejnego kroku.
11. Przemyć skrawki w PBS dwukrotnie po 5 min.
12. Zablokować skrawki w 10% surowicy osła/0,05% Triton X-100/PBS przez 2 h w temperaturze 37°C przy wstrząsaniu z prędkością 75 rpm.
13. Przemyć skrawki w 1% surowicy osła/0,05% Triton X-100/PBS trzykrotnie po 5 min.
14. Przenieść skrawki do nowej płytki 12-dołkowej (bez koszyczków z siatką) zawierającej 500 µL roztworu pierwszego przeciwciała anty-Iba1 przygotowanego w 1% surowicy osła/0,05% Triton X-100/PBS.
15. Przygotować kontrole negatywne poprzez pominięcie pierwszego przeciwciała w roztworze inkubacyjnym.
16. Inkubować wszystkie skrawki przez noc w temperaturze 4°C na kołysarce orbitalnej.
17. Przenieść skrawki z powrotem do koszyczków z siatką.
18. Przemyć skrawki w 1% surowicy osła/0,05% Triton X-100/PBS trzykrotnie po 10 min.
19. Inkubować skrawki z wtórnym przeciwciałem anty-króliczym (rozcieńczenie 1:1000) w 1% surowicy osła/0,05% Triton X-100/PBS przez 1,5 h w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Zminimalizować ekspozycję na światło podczas wszystkich kolejnych procedur i owinąć płytki folią aluminiową, aby zapobiec degradacji fluoroforu.
20. Przemyć skrawki w PBS dwukrotnie po 5 min.
21. Zamontować skrawki na szkiełkach mikroskopowych.
22. Suszyć szkiełka na powietrzu w ciemności przez >2 h.
23. Przykryć skrawki szkiełkami dedykowanymi przy użyciu związków rozpuszczalnych w wodzie.
24. Przygotować szkiełka kontrolne negatywne, stosując medium montażowe.
25. Przechowywać szkiełka w kasecie do szkiełek w temperaturze pokojowej, w ciemnym miejscu.

4. Obrazowanie

1. Określ rozmiar piksela systemu obrazowania przy powiększeniu 40x. Jeśli skala nie jest dostępna, dodaj pasek skali do każdego obrazu.
2. Wykorzystaj barwienie DAPI, aby przy niskim powiększeniu zidentyfikować gęsty pas jąder korowych odpowiadający IV warstwie kory.
3. Ustaw ostrość obrazu na zidentyfikowanym obszarze kory.
4. Przełącz na powiększenie 40x.
5. Dostosuj ustawienia ekspozycji kanałów, aby zmaksymalizować oddzielenie sygnałów DAPI i Iba1 od fluorescencji tła.
6. Wykonaj serię obrazów Z-stack (> 30 kroków) obejmującą pełną głębokość mikrogleju.
7. Wygeneruj i zapisz kompozytowy obraz projekcji maksymalnej intensywności z pozyskanego stosu Z-stack dla obu barwień.
   UWAGA: Zoptymalizuj ustawienia ekspozycji i stosu Z-stack dla każdego obrazu, aby zmaksymalizować oddzielenie sygnału DAPI/Iba1 od fluorescencji tła. Słabe oddzielenie sygnału obniża dokładność generowania masek.

5. Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS)

1. Przechowaj wszystkie obrazy złożone w jednym katalogu obrazów.
2. Utwórz oddzielny katalog wyjściowy dla wyników generowanych przez MMPS.
3. Pobierz samodzielny pakiet MMPS lub skrypt MMPS.py z repozytorium GitHub.
4. Zainstaluj wszystkie zależności wymienione w pliku requirements.txt, jeśli uruchamiasz MMPS za pomocą skryptu MMPS.py.
5. Otwórz pakiet MMPS lub uruchom skrypt MMPS.py.
6. Wybierz „Select the Image Folder” i wskaż katalog obrazów.
7. Wybierz „Select Output Folder” i wskaż katalog wyjściowy.
8. Przyznaj uprawnienia do dostępu do folderów, jeśli zostaniesz o to poproszony przez system operacyjny.
   UWAGA: Dodatkowe instrukcje instalacji, pomoc w rozwiązywaniu problemów i przykłady użycia znajdują się w dokumentacji uzupełniającej oraz w repozytorium GitHub.
9. Wybierz „Image Labeling” i przypisz identyfikatory zwierząt oraz grupy traktowania do każdego obrazu.
   UWAGA: Jeśli pominięto etykietowanie obrazów, MMPS poprosi o podanie identyfikatorów grup traktowania i zwierząt przed eksportem danych.
10. Wprowadź rozmiar piksela w karcie „Parameters”.
11. Wybierz „Calibrate from scale bar”, jeśli rozmiar piksela jest nieznany. Po wyświetleniu komunikatu zaznacz punkty początkowy i końcowy paska skali. Wprowadź znaną odległość paska skali w mikrometrach.
12. Wybierz kanał fluorescencji zawierający sygnał mikroglialny.
13. Wybierz obrazy do przetworzenia, zaznaczając pole obok nazwy każdego obrazu. Przetwarzaj obrazy pojedynczo, gdy fluorescencja tła różni się znacząco między obrazami.
14. Przejrzyj karty „Original”, „Preview”, „Processed” oraz „Masks”, aby porównać etapy przetwarzania obrazu.
15. Wybierz „Preview Current Image”, aby ocenić ustawienia przetwarzania obrazu.
16. W razie potrzeby dostosuj ustawienia odejmowania tła metodą toczącej się kuli (rolling-ball), odszumiania i wyostrzania.
17. Do odejmowania tła stosuj wartości rolling-ball w zakresie od 5–150 pikseli.
18. Do redukcji artefaktów nierównomiernego oświetlenia stosuj wartości odszumiania w zakresie od 3–7 pikseli.
19. Do poprawy definicji krawędzi stosuj wartości wyostrzania w zakresie od 1–2.
20. Po optymalizacji ustawień przetwarzania obrazu wybierz „Process Selected Images”.
    UWAGA: Czas przetwarzania obrazów różni się w zależności od liczby obrazów i wybranych parametrów.
21. Wybierz „Pick Somas (All Images)”.
22. Wybierz „Show Color (C)”, aby wyświetlić złożone obrazy RGB. Jeśli kolorystyka obrazu wydaje się zniekształcona, wybierz „Channels…” i odznacz nieużywane kanały.
23. Zaznacz somaty mikrogleju wykazujące kolokalizację DAPI i Iba1. Unikaj zaznaczania komórek stykających się z krawędziami obrazu. Usuń błędnie zaznaczone markery somat za pomocą klawisza „Backspace” lub „Delete”.
24. Naciśnij „Enter” lub „Return”, aby przejść do następnego obrazu.
25. Po zakończeniu wyboru somat wybierz „Outline Somas (All)”.
26. Obrysuj obwód somy każdej wybranej komórki mikroglialnej. Wyklucz wypustki komórkowe z obrysu somy i użyj co najmniej ośmiu punktów obrysu na jedną somę. Usuń błędnie umieszczone punkty obrysu za pomocą funkcji „Undo Last Point”, „Delete” lub klawisza „Backspace”.
27. Naciśnij „Enter”, „Return”, dwukrotnie kliknij lub kliknij prawym przyciskiem myszy, aby sfinalizować każdy obrys somy.
28. W razie potrzeby wybierz „Redo Last Outline”, aby powtórzyć poprzedni obrys somy.
29. Po zakończeniu obrysowywania som wybierz „Generate All Masks”.
30. Zastosuj minimalną wartość progu, aby ograniczyć włączanie pikseli tła o niskiej intensywności do masek.
    UWAGA: Wyższe wartości zachowują dokładność somy kosztem rozgałęzień, natomiast niższe wartości zachowują dokładność rozgałęzień kosztem somy. Wartości progowe między 10–30% zazwyczaj zapewniają zrównoważoną supresję tła i zachowanie rozgałęzień.
    UWAGA: Czas generowania masek różni się w zależności od liczby wybranych komórek.
31. Wybierz „QA All Masks”, aby rozpocząć kontrolę jakości masek.
32. Przejrzyj maski prezentowane od największych (800 µm²) do najmniejszych (200 µm²).
33. Porównaj każdą maskę z odpowdającą jej mikrogleją, korzystając z kart „Processed” i „Mask”.
34. Akceptuj maski za pomocą skrótu klawiszowego „A”. Odrzucaj maski za pomocą skrótu klawiszowego „R”. Naciśnij „B”, aby cofnąć akceptację lub odrzucenie. Poruszaj się po rozmiarach masek za pomocą strzałek na klawiaturze.
35. Wybierz największą akceptowalną maskę, która dokładnie oddaje rozgałęzienia mikrogleju, nie obejmując sąsiednich komórek, nadmiarowego tła, krawędzi obrazu ani pasków skali.
    UWAGA: Odrzuć maski, jeśli istnieje niepewność co do ich dokładności.
    UWAGA: Jeśli większość masek jest niedokładna, wybierz „Clear All Masks”, a następnie wygeneruj maski ponownie z inną wartością progu.
36. Po zakończeniu kontroli jakości masek wybierz „Calculate Simple Characteristics”, aby
    obliczyć średnią odległość centroidu, pole powierzchni maski, obwód, ekscentryczność, okrągłość i rozmiar somy, korzystając z zaakceptowanych masek i obrysów som.
37. Definicje parametrów oraz trendy mikroglialne w zapaleniu neurologicznym znajdują się w Tabeli 1.
38. Pobierz pliki „Sholl.py”, „FractalAnalysis_ImageJ.py” i „SkeletonAnalysisImageJ.py”, aby przeprowadzić dodatkowe analizy.
39. Otwórz „FractalAnalysis_ImageJ.py” jako wtyczkę Fiji do analiz fraktalnych i analiz otoczki (hull).
40. Po wyświetleniu komunikatu wprowadź lokalizację katalogu wyjściowego i rozmiar piksela. Wybierz opcję „largest mask only”, jeśli pożądana jest analiza tylko największej zaakceptowanej maski.
41. Otwórz „Sholl.py” jako wtyczkę Fiji do analizy Sholla.
42. Po wyświetleniu komunikatu wprowadź lokalizację katalogu wyjściowego i rozmiar piksela.
43. Wprowadź pożądany krok analizy Sholla. Wybierz „Use soma radius as start radius”, aby wykorzystać promienie som pochodzące z MMPS jako promień początkowy analizy Sholla. Wprowadź stałą wartość promienia somy, jeśli nie używasz promieni pochodzących z MMPS.
44. Otwórz „SkeletonAnalysisImageJ.py” jako wtyczkę Fiji do analizy szkieletowej.
45. Po wyświetleniu komunikatu wprowadź lokalizację katalogu wyjściowego, rozmiar piksela i lokalizację folderu z maskami.
46. Po zakończeniu wyeksportuj wszystkie wyniki wygenerowane przez wtyczki jako pliki CSV do katalogu wyjściowego.

6. Formuły stosowane w MMPS do obliczeń morfologii mikrogleju

UWAGA: Wszystkie obliczenia są wykonywane automatycznie przez MMPS po naciśnięciu przycisku „Calculate Simple Characteristics”. Obliczenia parametrów przedstawiono poniżej.

1. Obwód
   1. Oblicz obwód, korzystając z następującego równania:
      
   2. Zdefiniuj jako obwód, liczbę pikseli krawędzi oraz rozmiar piksela w µm.
2. Średnia odległość centroidu
   UWAGA: Średnią odległość centroidu określa się również jako rozpiętość komórki¹¹.
   1. Zidentyfikuj cztery końce wypustek na podstawie współrzędnych komórki:
      wypustka górna: minimalna współrzędna y,
      wypustka dolna: maksymalna współrzędna y,
      wypustka lewa: minimalna współrzędna x,
      ​wypustka prawa: maksymalna współrzędna x.
   2. Oblicz współrzędne centroidu, korzystając z następujących równań:
      
      
   3. Zdefiniuj c_x i c_y jako współrzędne centroidu, x_i i y_i jako współrzędne pikseli oraz jako całkowitą liczbę pikseli.
   4. Oblicz odległość wypustki, korzystając z następującego równania:
      
   5. Zdefiniuj d jako odległość wypustki, x_i i y_i jako współrzędne końców wypustek oraz c_x i c_y jako współrzędne centroidu.
   6. Oblicz średnią odległość centroidu, korzystając z następującego równania:
      
   7. Zdefiniuj jako średnią odległość centroidu, odległość wypustki d_i oraz rozmiar piksela w µm.
3. Pole maski
   1. Oblicz pole maski, korzystając z następującego równania:
      
   2. Zdefiniuj jako pole maski w µm², liczbę pikseli wewnątrz maski oraz rozmiar piksela w µm.
4. Ekscentryczność
   1. Oblicz drugie momenty centralne, korzystając z następujących równań:
      
      
      
   2. Zdefiniuj μ₂₀, μ₀₂ i μ₁₁ jako drugie momenty centralne, x_i i y_i jako współrzędne pikseli, c_x i c_y jako współrzędne centroidu oraz N jako całkowitą liczbę pikseli.
   3. Oblicz wartości własne macierzy kowariancji, korzystając z następującego równania:
      
   4. Zdefiniuj λ₁ ≥ λ₂.
   5. Oblicz długości osi głównej i pomocniczej, korzystając z następujących równań:
      
   6. Zdefiniuj a jako długość osi głównej, a b jako długość osi pomocniczej.
   7. Oblicz ekscentryczność, korzystając z następującego równania:
      
   8. Zdefiniuj jako ekscentryczność.
5. Okrągłość
   1. Oblicz okrągłość, korzystając z następującego równania:
      
   2. Zdefiniuj jako okrągłość, długość osi głównej oraz długość osi pomocniczej.
6. Rozmiar somy
   1. Oblicz pole somy, korzystając z następującego równania:
      
   2. Zdefiniuj Sa jako pole somy w µm², liczbę pikseli wewnątrz maski somy oraz S jako rozmiar piksela w µm.

7. Analiza statystyczna

1. Wszystkie analizy statystyczne należy przeprowadzić przy użyciu programu R w wersji 4.3.2.
2. Zestawy danych należy przefiltrować, stosując największą zaakceptowaną maskę dla każdej komórki.
3. Przed analizą statystyczną należy obliczyć średnie parametry komórkowe na poziomie zwierzęcia.
4. Normalność rozkładu i jednorodność wariancji należy ocenić za pomocą testów Shapiro–Wilk oraz Levene.
5. W przypadku spełnienia założeń parametrycznych należy przeprowadzić testy t Studenta lub analizę ANOVA z powtarzanymi pomiarami, a następnie zastosować post-hoc testy t dla par z poprawką Holma.
6. W przypadku niespełnienia założeń parametrycznych należy przeprowadzić testy sum rang Wilcoxona lub testy Friedmana, a następnie zastosować testy znakowe Wilcoxona dla par z poprawką Holma.
7. Istotność statystyczną określono jako p < 0,05.

Wyniki

Opracowano otwartoźródłową, samodzielną platformę do analizy morfologii mikrogleju, nazwaną Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), aby zapewnić dostępny i ustandaryzowany proces analizy morfologii mikrogleju w oparciu o immunofluorescencję (IF). Platforma opiera się na wcześniejszych metodologiach analizy morfologicznej, nie wymaga wiedzy z zakresu programowania i posiada przystępny interfejs graficzny użytkownika. Program MMPS został zaprojektowany w celu poprawy wykrywania subtelnych rozgałęzień mikrogleju, przy jednoczesnym zastosowaniu wielu zabezpieczeń minimalizujących ryzyko przeszacowania masek mikrogleju.

MMPS zostało zwalidowane z wykorzystaniem modelu neurostanu zapalnego u gryzoni indukowanego LPS. Po obróbce tkanek i akwizycji obrazów (Rycina 1), swoistość IF potwierdzono przy użyciu przekrojów kontrolnych negatywnych, pozbawionych barwienia przeciwciałem pierwotnym (Rycina uzupełniająca 1). Przetwarzanie w MMPS rozpoczyna się od importu obrazów IF do interfejsu oprogramowania (Rycina 2A). Oprogramowanie oferuje wiele opcji przetwarzania obrazu w celu poprawy detekcji sygnału mikrogleju i separacji tła. Obowiązkowe odejmowanie tła jest wykonywane za pomocą algorytmu rolling-ball zaimplementowanego w pakiecie Scikit-image, natomiast opcjonalne filtry odszumiające i wyostrzające są dostępne poprzez filtrowanie gaussowskie oparte na SciPy. Po przetwarzaniu obrazu somy mikrogleju są zaznaczane ręcznie i identyfikowane za pomocą czerwonych znaczników wyboru (Rycina 2B). Granice som są następnie obrysowywane ręcznie w celu przeprowadzenia dalszych obliczeń morfologicznych (Rycina 2C).

Rysunek 1: Graficzny przegląd modelu neurostanu zapalnego i procedury przetwarzania. Szczurom wstrzyknięto LPS lub PBS, a po 24 h pobrano próbki poprzez perfuzję sercową z następującą po niej dekapitacją. Wyekstrahowano mózgi i wykonano przekroje o grubości 30 µm, które następnie wykorzystano w IF dla markera mikroglei Iba1, a następnie przetworzono za pomocą MMPS. Stworzone w Biorender. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przegląd zastosowania MMPS. (A) Przykład obrazu mikrogleju korowego (czerwony, Iba1) z jądrami komórkowymi (niebieski, DAPI) do analizy w MMPS (pasek skali = 75 µm, 40x). Po przetworzeniu obrazu za pomocą MMPS tło zostanie zredukowane, a morfologie zostaną dokładnie ocenione (B) Po przetworzeniu obrazu w MMPS somy są ręcznie zaznaczane czerwonym okręgiem do wykorzystania w kolejnych krokach szczegółowo opisanych w metodach (pasek skali = 75 µm, 40x). (C) Dwie reprezentatywne komórki mikrogleju zostały ręcznie obrysowane; poniżej przedstawiono zapisane obrazy obrysów somy. (D) Generowanie maski wybranych komórek automatycznie śledzi rozgałęzienia mikrogleju do 800 µm², jednak wymaga to ręcznej kontroli jakości. Tutaj przedstawiono niedokładną maskę 800 µm², a następnie dokładniejszą maskę 700 µm². Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Po obrysowaniu somy, program MMPS iteracyjnie generuje maski w zakresie wielkości 200–800 µm² , stosując adaptacyjne progowanie ograniczone przez zdefiniowane przez użytkownika progi minimalnej intensywności. Mniejsze maski ściślej przestrzegają zdefiniowanego progu, natomiast w przypadku większych masek ograniczenia progowe są stopniowo rozluźniane, aby zmaksymalizować uwzględnienie wypustek. Wygenerowane maski poddawane są ręcznej kontroli jakości, aby zapobiec włączeniu sąsiednich komórek, nadmiernemu uwzględnieniu tła lub ucięciu przez krawędzie obrazu lub paski skali. Jak pokazano na Rysunku 2D, maska o wielkości 800 µm² dla reprezentatywnej komórki mikrogleju rozciągała się na sąsiednią komórkę. Odrzucenie maski 800 µm² i wybór maski 700 µm² pozwoliło skorygować błąd segmentacji, zachowując jednocześnie dokładne wyznaczenie granic docelowej mikroglei.

Po przetworzeniu metodą MMPS oceniono aktywację mikrogleju, wykorzystując największą zaakceptowaną maskę dla każdej komórki, ponieważ maski te najdokładniej oddawały dystalne rozgałęzienia, minimalizując jednocześnie włączanie tła. Obliczone parametry morfologiczne podsumowano w Tabeli 1 i przedstawiono na Rysunku 3. Podanie LPS istotnie zmniejszyło średnią odległość centroidu oraz obwód komórki w porównaniu z kontrolą traktowaną nośnikiem (p < 0,05; Rysunek 3A,B), co jest zgodne z retrakcją wypustek mikrogleju podczas aktywacji. Nie zaobserwowano istotnych różnic w powierzchni maski, zaokrągleniu ani ekscentryczności pomiędzy grupami badawczymi (Rysunek 3C–E), pomimo wcześniejszych doniesień wiążących te parametry z fenotypami aktywowanego mikrogleju^3,23. Niniejsza analiza nie posiadała mocy statystycznej pozwalającej na wykrycie subtelnych różnic w kształcie somy lub powierzchni maski, a subpopulacje mikrogleju mogą przyjmować heterogeniczne morfologie zapalne, które nie wykazują tych trendów w sposób jednolity³. Z kolei powierzchnia somy była istotnie zwiększona u zwierząt traktowanych LPS w porównaniu z grupą kontrolną z nośnikiem (p < 0,01; Rysunek 3F), co dodatkowo potwierdza przebudowę morfologiczną związaną z aktywacją²².

Rysunek 3: Porównanie parametrów morfologicznych mikrogleju. Dla wszystkich paneli przeprowadzono testy normalności (Shapiro-Wilka i Levene'a), w których we wszystkich przypadkach uzyskano wartości nieistotne (p>0,05), co doprowadziło do zastosowania testów t-Studenta. Kropki reprezentują poszczególne zwierzęta (n=5 na grupę leczoną) (A) Średnia odległość centroidu była istotnie większa w grupie kontrolnej (vehicle) w porównaniu z grupą leczoną LPS. (B) Obwód komórek mikrogleju był istotnie większy w grupie kontrolnej w porównaniu z grupą leczoną LPS. (C) Nie stwierdzono istotnej różnicy w powierzchni maski pomiędzy grupami leczonymi. (D) Nie stwierdzono istotnej różnicy w ekscentryczności somy pomiędzy grupami. (E) Nie ma istotnej różnicy w okrągłości somy pomiędzy grupami leczonymi. (F) Odnotowano istotny wzrost powierzchni somy w grupie LPS * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Parametr	Definicja	Związek z aktywacją mikrogleju
Średnia odległość centroidów	Średnia odległość najdalszej gałęzi w pozycjach: górnej, prawej, dolnej i lewej	Zmniejszenia
Obwód	Pomiar obwodu komórki	Zmniejsza
Pole maskowania	Rzeczywisty obszar komórki, a nie obszar maski celu	Zmniejszenia
Ekscentryczność	Pomiar przybliżonego wydłużenia somy komórki (0: okrągła, 1: silnie wydłużona)	Zmniejszenia
Okrągłość	Pomiar przybliżonej kolistości somy komórki (0: wydłużona, 1: kolista)	Wzrosty
Wielkość somy	Pole powierzchni somy komórki	Zwiększenia

Tabela 1: Parametry obliczone za pomocą programu MMPS i przewidywana zmiana w odpowiedzi na aktywację mikrogleju.Tabela podsumowuje parametry morfologiczne obliczone przez program Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), w tym obwód, średnią odległość od centroidu, powierzchnię maski, ekscentryczność, okrągłość oraz powierzchnię somy.

Następnie oceniono powtarzalność międzyużytkownikową, przekazując ten sam zestaw obrazów do niezależnej analizy osobom zaślepionym i wcześniej nieszkolonym (Supplementary Figure 2). Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic między użytkownikami, a wszyscy oni odtworzyli trendy morfologiczne zgodne z aktywacją mikrogleju u zwierząt traktowanych LPS.

MMPS dodatkowo umożliwia zaawansowane analizy morfologiczne w dalszych etapach. Analiza korelacyjna parametrów wygenerowanych na Rysunku 3 wykazała związki między odrębnymi cechami morfologicznymi. U szczurów traktowanych placebo zaobserwowano jedynie słabą korelację między okrągłością a obwodem mikrogleju (R² = 0,17), natomiast u szczurów traktowanych LPS stwierdzono silniejszą korelację (R² = 0,64), co sugeruje, że zwiększona aktywacja mikrogleju wiązała się z jednoczesnym zmniejszeniem okrągłości i obwodu (Rysunek 4A). Ponadto pole maski wykazało silne dodatnie korelacje z przeciętną odległością centroidu w obu grupach – traktowanej placebo oraz LPS (odpowiednio R² = 0,71 i 0,88), co jest zgodne ze zmianami w złożoności rozgałęzień związanych ze stanem aktywacji mikrogleju (Rysunek 4B).

Rysunek 4: Zaawansowana analiza parametrów mikrogleju. Wszystkie panele przedstawiają linie dopasowania na poziomie zwierząt, obliczone metodą zwykłych najmniejszych kwadratów, wraz z współczynnikiem determinacji (R²) oraz zacieniowanym 95% przedziałem ufności. (A) Okrągłość somy mikrogleju i całkowita długość obwodu wykazują słabą tendencję w mikrogleju z grupy nośnika (R² = 0,17), natomiast korelacja jest silniejsza po ekspozycji na LPS (R² = 0,64). (B) Średnia odległość od centroidu koreluje z powierzchnią mikrogleju w grupach z nośnikiem (R² = 0,71) i LPS (R² = 0,88). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca 1: Walidacja protokołu IF za pomocą kontroli negatywnej. Jeden skrawek mózgu z tego samego obszaru dla każdego szczura poddano protokołowi IF bez dodania przeciwciała pierwszorzędowego, aby potwierdzić brak autofluorescencji (pasek skali = 75 µm) (A) Reprezentatywny obraz tkanki barwionej nośnikiem dla DAPI (niebieski). (B) Reprezentatywny obraz tkanki barwionej nośnikiem dla Iba1 (czerwony). (C) Reprezentatywny obraz tkanki barwionej nośnikiem dla DAPI (niebieski) i Iba1 (czerwony). (D) Reprezentatywny obraz tkanki barwionej LPS dla DAPI (niebieski). (E) Reprezentatywny obraz tkanki barwionej LPS dla Iba1 (czerwony). (F) Reprezentatywny obraz tkanki barwionej LPS dla DAPI (niebieski) i Iba1 (czerwony). Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina dodatkowa 2: Ocena zmienności międzyużytkownikowej MMPS. Kilku oślepionych użytkowników zastosowało MMPS w tych samych próbkach z Ryciny 3, a następnie porównano wyniki na poziomie zwierząt. Dla wszystkich próbek testy normalności (Shapiro-Wilka i Levene'a) okazały się nieistotne (p>0.05), co doprowadziło do zastosowania ANOVA dla pomiarów powtarzanych z post-hoc skorygowanym testem t dla par według metody Holma (p>0.05). (A) W każdej grupie nie stwierdzono istotnej różnicy między użytkownikami pod względem średniej odległości centroidu (p>0.05). (B) W każdej grupie nie stwierdzono istotnej różnicy między użytkownikami pod względem obwodu (p>0.05). (C) W każdej grupie nie stwierdzono istotnej różnicy między użytkownikami pod względem powierzchni maski (p>0.05). (D) W każdej grupie nie stwierdzono istotnej różnicy między użytkownikami pod względem ekscentryczności (p>0.05). (E) W każdej grupie nie stwierdzono istotnej różnicy między użytkownikami pod względem okrągłości (p>0.05). (F) W każdej grupie nie stwierdzono istotnej różnicy między użytkownikami pod względem powierzchni somy (p>0.05). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Głównym celem tej metodologii jest rozszerzenie dostępności do analizy morfologii mikrogleju poprzez redukcję typowych barier technicznych, zachowując jednocześnie zalety uznanych podejść do oceny morfologicznej. MMPS umożliwia wykrywanie subtelnych zmian morfologicznych mikrogleju, zachowując kompatybilność z zaawansowanymi analizami, w tym z analizami fraktalnymi, szkieletowymi, otoczkowymi i Sholl. W porównaniu z wcześniej opublikowanymi podejściami, MMPS zapewnia dostępny graficzny interfejs użytkownika, zintegrowane obliczenia dla powszechnie stosowanych parametrów morfologicznych oraz eliminację wymagań dotyczących kodowania, zachowując jednocześnie kompatybilność z bardziej zaawansowanymi analizami poniżej.

Kilka krytycznych kroków metodologicznych wpływa mocno na dokładność analityczną i reproduktywalność. Wysokiej jakości obrazowanie immunofluorescencyjne (IF) jest niezbędne do niezawodnego generowania masek i obliczeń morfologicznych. Specyficzność przeciwciał jest głównym czynnikiem wpływającym na jakość obrazu, ponieważ niespecyficzne znaczenie zwiększa tło fluorescencyjne i zmniejsza separację sygnału między mikroglejem a otaczającą tkanką. Podobnie, nieoptymalne stężenia przeciwciał mogą zmniejszyć intensywność fluorescencji i zmniejszyć rozdzielczość obrazu. Pozyskiwanie obrazów Z-stack jest również krytyczne, ponieważ pominięcie obrazowania Z-stack może sztucznie zmienić pozorna złożoność rozgałęziania mikrogleju i rozprzestrzenianie procesów, tym samym uprzedniając obliczenia morfologiczne.

Kilka dodatkowych zagadnień jest ważnych podczas przetwarzania MMPS. Chociaż MMPS obsługuje przetwarzanie wsadowe obrazów, często lepiej jest optymalizować pojedyncze obrazy, ponieważ cechy tła i jakość barwienia mogą znacznie różnić się między obrazami. Jakość obrazu bezpośrednio wpływa na dokładność generowania masek; dlatego optymalizacja podczas przetwarzania wstępnego obrazów znacznie poprawia reproduktywalność i wytrzymałość analiz poniżej. Staranna selekcja soma mikrogleju jest również ważna, szczególnie unikanie komórek stykających się z granicami obrazu, ponieważ selekcja części komórek może sztucznie zmniejszać pomiary soma i zniekształcać generowaną maskę. Podczas przeglądu jakości maski należy odrzucić maski, które zawierają sąsiednie komórki, nadmierne tło lub granice obrazu. Z drugiej strony, mniejsze maski nie powinny być odrzucane wyłącznie dlatego, że nie uchwytują wszystkich dalszych procesów, ponieważ iteracyjny algorytm generowania masek celowo dostosowuje lokalne parametry progowania zgodnie z wielkością maski i regionalną intensywnością pikseli.

Ta metodologia jest bardzo elastyczna i może być zmodyfikowana, aby spełnić określone wymagania eksperymentalne. Ponieważ MMPS jest oprogramowaniem open source, platformę można rozwijać w celu analizy pojedynczych klatek Z-stack lub włączenia zautomatyzowanych algorytmów wykrywania komórek w celu stworzenia w pełni zautomatyzowanego potoku analizy morfologicznej. Ponadto, wygenerowane maski i kontury soma pozostają kompatybilne z pracami opartymi na ImageJ do analiz fraktalnych, otoczkowych, szkieletowych i Sholl. Ponieważ MMPS został opracowany w Python 3.11, dodatkowe analizy mogą być również bezpośrednio włączone do oprogramowania za pomocą powszechnie dostępnych naukowych pakietów Python bez konieczności korzystania z zewnętrznych platform oprogramowania.

Mimo tych zalet należy wziąć pod uwagę kilka ograniczeń. MMPS został zweryfikowany za pomocą modelu neurozapalenia w określonej części mózgu u samców szczurów Sprague-Dawley, a różne regiony mózgu, modele chorobowe, gatunki lub płeć biologiczna mogą wpływać na wyniki morfologiczne. Stosowanie MMPS do alternatywnych paradygmatów eksperymentalnych powinno zatem zostać zweryfikowane poprzez badania pilotażowe lub wsparte porównaniami z poprzednią literaturą. Ponadto, obrazowanie oparte na IF niekompletnie uchwytuje trójwymiarowe struktury rozgałęziające, ponieważ procesy rozciągające się bezpośrednio nad lub pod płaszczyzną ogniskową mogą nie być wykryte na obrazach maksymalnej projekcji. Zwiększenie liczby analizowanych komórek może pomóc złagodzić to ograniczenie. MMPS pozostaje również zależny od jakości pozyskiwania obrazu, dlatego wymaga optymalizacji dla indywidualnych systemów obrazu, protokołów barwienia i preparatów przeciwciał. Obrazy o niskiej rozdzielczości mogą sztucznie powiększać wielkość maski z powodu rozmazania granic otaczających soma i ciasno upakowanych gałęzi. Z tego powodu, obecny protokół obejmuje wolno pływające metody IF i wiele opcji przetwarzania obrazów, aby zmaksymalizować jakość obrazu.

MMPS dodatkowo zachowuje pewną potencjalną zmienność zależną od użytkownika, ponieważ użytkownicy ręcznie wybierają komórki i obrysują soma. Jednak użycie kolokalizacji DAPI i Iba1 znacznie zmniejsza niejednoznaczność podczas selekcji komórek. Co więcej, zaślepiona analiza między użytkownikami wykazała minimalną zmienność między wcześniej nieprzygotowanymi użytkownikami, co wspiera reproduktywalność procesu analitycznego.

W przeciwieństwie do kilku wcześniej opublikowanych platform do morfologii mikrogleju, MMPS nie jest w pełni zautomatyzowany. Jednak taki projekt został wybrany, aby

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
12-well plate	Fisher Scientific	07-200-82	Plate used for incubation and washing of tissue sections.
Aluminum foil	Fisher Scientific	01-213-101	Used to protect fluorescent samples from light exposure.
Antigen Retrieval Buffer (10×)	ThermoFisher Scientific	00-4955-58	Used to improve antigen accessibility during immunofluorescence staining.
Anti-Iba1 primary antibody	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	019-19741	Primary antibody used for immunofluorescent labeling of microglia.
Cryostat	Fisher Scientific	95-710-0L	Instrument used to section frozen brain tissue at defined thicknesses.
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21428	Fluorescent secondary antibody used for visualization of rabbit primary antibodies.
Donkey Serum	Fisher Scientific	50-413-115	Blocking reagent used to reduce nonspecific antibody binding.
EVOS FL Auto 2 Imaging System	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Fluorescence microscope used for image acquisition.
Fiji (ImageJ) 2.16.0	NIH	fiji.sc	Image-processing platform used for downstream morphology analyses and plugins.
Fluoromount-G	ThermoFisher Scientific	00-4959-52	Mounting medium used to preserve fluorescence and secure coverslips.
Isoflurane	EntirelyPets Pharmacy	MWI502017	Inhalation anesthetic used during animal procedures.
Lipopolysaccharide	Millipore Sigma	L2630	Used to induce systemic neuroinflammation and microglial activation in rodents.
Matplotlib	https://pypi.org/project/matplotlib/		Python plotting library used for data visualization and figure generation.
MMPS (Mapping Microglial Parameters Software) v1.00	This work	https://github.com/NeurodegenerativePharmaceuticalLab/Mapping-Microglia-Parameters-Software/releases/tag/v1.00	Open-source software platform developed for microglial morphology analysis.
Net wells	Millipore Sigma	CLS3477	Inserts used to hold free-floating tissue sections during staining procedures.
Numpy	https://pypi.org/project/numpy/		Python library used for numerical computations within MMPS.
Objective lens (4×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4922	Low-magnification objective used for anatomical orientation and region identification.
Objective lens (40×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4625	High-magnification objective used for microglial morphology imaging.
opencv-python	https://pypi.org/project/opencv-python/		Computer vision library used for image-processing functions within MMPS.
Paraformaldehyde	ThermoFisher Scientific	169650025	Fixative used for tissue perfusion and preservation prior to sectioning.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	Permanent mounting medium used for slide preservation.
Phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	BP3991	Buffer solution used for tissue washing and reagent preparation.
Pillow	https://pypi.org/project/Pillow/		Python imaging library used for image processing operations.
PyQt5	https://pypi.org/project/PyQt5/		Python GUI framework used to generate the MMPS graphical user interface.
Python 3.11	Python Software Foundation	python.org	Programming language environment used to develop and run MMPS.
R 4.3.2	R Foundation for Statistical Computing	r-project.org	Statistical software used for data analysis and graph generation.
Scikit-image	https://pypi.org/project/scikit-image/		Python image-analysis library used for image processing and segmentation.
Scipy	https://pypi.org/project/scipy/		Python scientific-computing package used for filtering and image-processing operations.
Sprague-Dawley Rats	Evingo	002	Experimental animals used for validation of the neuroinflammation model.
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3	Cryoprotectant used prior to freezing brain tissue.
Tifffile	https://pypi.org/project/tifffile/		Python package used for reading and writing TIFF image files.
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	Embedding medium used for cryosectioning frozen tissue samples.
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Detergent used for membrane permeabilization during immunofluorescence.