Przygotowanie zdecelularyzowanych przeszczepów ludzkiego nerwu obwodowego z wykorzystaniem wodorotlenku sodu i deoksycholanu sodu

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje standaryzowaną metodę decelularyzacji wspomaganej alkalicznie, która łączy opracowanie wodorotlenkiem sodu z systemem wymiany roztworu napędzanym pompą perystaltyczną, w celu wytworzenia decelularyzowanych przeszczepów ludzkich nerwów obwodowych przy jednoczesnym skutecznym usunięciu komórek i zachowaniu architektury rodzimej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Streszczenie

Urazy nerwów obwodowych często wymagają zastosowania materiałów przeszczepowych, które zapewniają prowadzenie strukturalne dla regeneracji aksonów. Choć autologiczne przeszczepy nerwów pozostają złotym standardem klinicznym, ich stosowanie jest ograniczone przez powikłania w miejscu pobrania oraz ograniczoną dostępność tkanek. Ograniczenia te spowodowały wzrost zainteresowania zdecelularyzowanymi ludzkimi przeszczepami nerwów obwodowych jako alternatywnym biomateriałem do regeneracji nerwów. Jednak powszechnie stosowane protokoły decelularyzacji oparte na detergentach mogą naruszać architekturę macierzy pozakomórkowej (ECM) i pozostawiać cytotoksyczne pozostałości, które mogą obniżyć jakość przeszczepu. W niniejszym artykule opisano standaryzowany protokół przygotowania zdecelularyzowanych ludzkich przeszczepów nerwów obwodowych z wykorzystaniem metody decelularyzacji wspomaganej zasadami. Procedura rozpoczyna się od obróbki wodorotlenkiem sodu (NaOH) w celu promowania efektywnej destrukcji komórek, a następnie łagodnego etapu z użyciem deoksycholanu sodu (SDC), który usuwa pozostałe komponenty komórkowe i immunogenne, zachowując jednocześnie natywną organizację ECM. Strategia ta ogranicza ekspozycję na detergenty, wspierając zachowanie natywnej architektury ECM. Przepływ pracy obejmuje przygotowanie nerwu dawcy, kontrolowaną obróbkę NaOH, późniejszą łagodną obróbkę SDC oraz intensywne płukanie przy ciągłej wymianie roztworu za pomocą systemu napędzanego pompą perystaltyczną, aby ułatwić usunięcie pozostałości środków przetwarzania. Wdrożono dalsze etapy obróbki końcowej w celu utrzymania integralności strukturalnej i przygotowania przeszczepów do końcowego pakowania i sterylizacji. Efektywność decelularyzacji oceniono za pomocą analizy histologicznej i ilościowego oznaczania resztkowego DNA, a zachowanie struktury ECM zbadano przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej. Brak resztek SDC oraz biokompatybilność przetworzonych przeszczepów potwierdzono za pomocą testów cytotoksyczności. Niniejszy protokół zapewnia praktyczne podejście do produkcji zdecelularyzowanych ludzkich przeszczepów nerwów obwodowych na potrzeby badań nad regeneracją nerwów obwodowych i zastosowań translacyjnych.

Wprowadzenie

Uszkodzenia nerwów obwodowych mogą prowadzić do poważnych upośledzeń funkcjonalnych i pozostają istotnym wyzwaniem klinicznym w medycynie regeneracyjnej oraz chirurgii rekonstrukcyjnej. Regeneracja segmentowych ubytków nerwowych wymaga materiałów przeszczepowych, które nie tylko wypełniają lukę powstałą w wyniku urazu, ale także zapewniają prowadzenie strukturalne i sygnały biochemiczne wspierające regenerację aksonów i reinnerwację. Autologiczne przeszczepy nerwów są powszechnie uznawane za kliniczny złoty standard, ponieważ zachowują natywną architekturę macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i zapewniają sprzyjające mikrośrodowisko dla regeneracji nerwów^1,2. Jednak ich zastosowanie kliniczne jest ograniczone przez ograniczoną dostępność tkanki dawcy, konieczność przeprowadzenia dodatkowych procedur chirurgicznych oraz zachorowalność w miejscu pobrania przeszczepu^3,4. Ograniczenia te napędziły rozwój alternatywnych materiałów do przeszczepów, w szczególności zdecelularyzowanych przeszczepów nerwów obwodowych, które zachowują natywną architekturę ECM przy jednoczesnym zminimalizowaniu immunogennych komponentów komórkowych^5,6,7,8.

Skuteczność decelularyzowanych przeszczepów nerwowych jest w dużym stopniu zależna od procesu decelularyzacji. Konwencjonalne metody opierają się zazwyczaj na odczynnikach detergentowych, takich jak Triton X-100 i deoksycholan sodu (SDC), które usuwają komponenty komórkowe poprzez solubilizację błon lipidowych^9,10,11. Jednak przedłużona ekspozycja na te detergenty może naruszyć mikrostrukturę macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) oraz pozostawić resztkowe substancje cytotoksyczne, które negatywnie wpływają na żywotność komórek i wyniki regeneracyjne^12,13. W związku z tym aktywnie bada się alternatywne strategie decelularyzacji, które umożliwiają efektywne usuwanie komórek przy jednoczesnym zachowaniu integralności ECM¹⁴. Decelularyzacja alkaliczna z użyciem wodorotlenku sodu (NaOH) pojawiła się jako potencjalne podejście alternatywne, ponieważ ekstremalne wartości pH mogą skutecznie degradować komponenty komórkowe, kwasy nukleinowe i lipidy^15,16,17. Niemniej jednak niekontrolowana ekspozycja na silne warunki alkaliczne może naruszyć integralność ECM, co podkreśla znaczenie precyzyjnie kontrolowanych warunków przetwarzania^16,18.

W niniejszym opracowaniu przedstawiono standaryzowany protokół decelularyzacji wspomaganej zasadami dla ludzkich przeszczepów nerwów obwodowych, wykorzystujący system ciągłej wymiany roztworu sterowany pompą perystaltyczną. W porównaniu z konwencjonalnymi metodami zanurzeniowymi statycznymi, ten dynamiczny proces umożliwia ciągłą wymianę roztworu, co ułatwia usuwanie szczątków komórkowych i pozostałości czynników procesowych. Artykuł ten oferuje wizualną demonstrację krok po kroku całego przebiegu prac, w tym przygotowania nerwu dawcy, kontrolowanej decelularyzacji wspomaganej zasadami oraz ciągłej wymiany roztworu przy użyciu systemu z pompą perystaltyczną. Otrzymane przeszczepy oceniono za pomocą analizy histologicznej, ilościowego oznaczenia pozostałego DNA oraz skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), aby potwierdzić efektywną decelularyzację i zachowanie ultrastruktury ECM. Dzięki umożliwieniu wyraźnej wizualizacji krytycznych etapów technicznych, artykuł ten dostarcza ściśle zdefiniowanych ram przygotowania decelularyzowanych przeszczepów nerwowych oraz podstaw do przyszłego skalowania procesu.

Protokół

Otrzymano ludzkie obwodowe nerwy pochodzące z amerykańskiego banku tkanek na podstawie wyłącznej umowy z L&C BIO, zgodnie z przepisami American Association of Tissue Banks (AATB) i amerykańskiego Urzędu dla Żywności i Leków (FDA). Informacje o dawcach, w tym wiek i płeć, wywiad medyczny oraz wyniki badań serologicznych, zostały dostarczone razem z materiałami tkankowymi i przeanalizowane oraz zatwierdzone przez certyfikowanego dyrektora medycznego. Po otrzymaniu wszystkie tkanki zostały poddane kontroli przyjęcia, w tym weryfikacji badań przesiewowych dawców, badań serologicznych oraz testów na obecność istotnych patogenów; do niniejszego badania wykorzystano wyłącznie te tkanki, które spełniały ustalone kryteria akceptacji. Wszystkie procedury związane z ludzkimi materiałami biologicznymi przeprowadzono zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej. Ponieważ w badaniu nie uczestniczyły bezpośrednio osoby ludzkie, nie wydano oddzielnego numeru zatwierdzenia przez Komitet ds. Etyki Badań (IRB).

1. Przygotowanie roztworów (dzień 1)

1. Przygotuj 0,25 N roztwór wodorotlenku sodu (NaOH), rozpuszczając 10 g NaOH w 1 L wody destylowanej podczas mieszania magnetycznego.
2. Przygotuj 4% roztwór deoksycholanu sodu (SDC), rozpuszczając 40 g SDC w 1 L wody destylowanej podczas mieszania magnetycznego.
3. Przelej każdy przygotowany roztwór do sterylnych butelek szklanych.
   OSTRZEŻENIE: Dezoksycholan sodu (SDC) należy obsługiwać w okapie wentylacyjnym. Należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice, fartuch laboratoryjny i ochronę oczu, aby zapobiec wdychaniu i kontaktowi z skórą.

2. Przygotowanie odcinków nerwów obwodowych do usunięcia komórek

1. Odkaż zewnętrzną powierzchnię opakowanej surowej nerwu obwodowego i otwórz opakowanie w sposób bezpieczny pod względem mikrobiologicznym.
2. Przemyj nerw obwodowy kilkakrotnie sterylizowaną wodą destylowaną.
3. Usunięcie resztek tkanki tłuszczowej, tkanki łącznej, niepotrzebnych odgałęzień oraz uszkodzonej tkanki nerwowej za pomocą sterylnej pęsety i nożyczek. Ponownie przemyj nerw obwodowy sterylizowaną wodą destylowaną.
4. Przekrój nerw obwodowy na odcinki długości 2–5 cm. Podziel przygotowane odcinki na trzy grupy długości: 2–3 cm, >3–4 cm oraz >4–5 cm.
   UWAGA: Każdą grupę długości należy przetwarzać oddzielnie, ponieważ różne długości odcinków nerwowych wymagają różnych czasów traktowania IPA, NaOH i SDC, jak podsumowano w Tabela 1.

3. Skonfiguruj układ pompy perystaltycznej

1. Do obu końców kolumny chromatograficznej przyłącz chemicznie odporny wężyk silikonowy o odpowiedniej długości.
2. Jeden koniec wężyka połącz z pompą perystaltyczną.
3. Wolne końce wężyka połącz z butelką szklaną o pojemności 1 L zawierającą alkohol izopropylowy (IPA), używając wężyka do pompy, aby utworzyć zamknięty obieg cyrkulacyjny.
   UWAGA: Wszystkie połączenia wężyków należy dobrze zabezpieczyć, ponieważ ciśnienie i wibracje pompy perystaltycznej mogą spowodować odłączenie się wężyka od kolumny lub butelki.

4. Usuń lipidy z nerwu obwodowego

UWAGA: Chyba że wskazano inaczej, wszystkie kroki wymiany roztworów należy wykonywać w temperaturze pokojowej (20–25 °C) przy użyciu pompy perystaltycznej ustawionej na 90–186 mL/min, w zależności od konfiguracji wężyka. Utrzymuj wybraną stałą prędkość przepływu przez cały czas trwania każdego cyklu procesowania.

1. Otwórz jeden koniec kolumny chromatograficznej i częściowo wypełnij ją roztworem IPA, aby zapewnić natychmiastowe zanurzenie tkanki nerwowej bezpośrednio po jej umieszczeniu.
2. Za pomocą sterylnych szczypczyków delikatnie uchwycić zewnętrzną tkankę z jednego końca pojedynczego przygotowanego odcinka nerwu obwodowego. Unikać bezpośredniego ucisku lub chwytania głównego ciała nerwu. Ostrożnie opuścić odcinek nerwu do roztworu wewnątrz kolumny.
3. Szczypczykami delikatnie wyprostować odcinek nerwu i ustawić go wzdłużnie, równolegle do kierunku przepływu cieczy. Upewnić się, że odcinek nie jest zgięty, zwinięty ani przyciśnięty do wewnętrznej ściany kolumny lub filtra wylotowego.
4. Zamknąć kolumnę i ustawić ją pod lekkim nachyleniem w górę w kierunku wylotu, tak aby wylot znajdował się nieco wyżej niż wlot. Taka orientacja pomaga zapobiegać opadaniu odcinka nerwu na jeden z filtrów końcowych, szczególnie na filtr wylotowy.
   UWAGA: Przetwarzać jeden odcinek nerwu obwodowego na jedną kolumnę w ramach jednej procedury. Nie wymaga się dodatkowych urządzeń mechanicznego mocowania. Naturalna pływalność tkanki nerwowej oraz stosunkowo delikatny przepływ cieczy pomagają utrzymać odcinek w zawieszeniu i wyprostowanej pozycji. Podczas przetwarzania należy kontrolować położenie tkanki i w razie przylepienia się do ściany kolumny, filtra lub samego siebie delikatnie przestawić ją sterylnymi szczypczykami.
5. Połączyć roztwór IPA z systemem pompy perystaltycznej. Przeprowadzić ciągłą wymianę roztworu przez kolumnę przez 1,5 h dla odcinków nerwu o długości 2–3 cm, przez 2 h dla odcinków o długości >3–4 cm lub przez 2,5 h dla odcinków o długości >4–5 cm.
6. Odpompować roztwór z kolumny.
7. Dodać 40 mL sterylnej wody destylowanej do kolumny. Delikatnie odwrócić lub wstrząsnąć kolumną pięć razy, aby opłukać nerw obwodowy.
8. Powtórzyć kroki 4.6 i 4.7 łącznie pięciokrotnie.
9. Połączyć zbiornik zawierający 5 L sterylnej wody destylowanej z systemem pompy perystaltycznej. Przeprowadzić ciągłą wymianę roztworu przez kolumnę przez całą noc.
   PUNKT PRZERWANIA: Po zakończeniu nocnego płukania procedurę można przerwać. Zatrzymać pompę perystaltyczną i przechowywać nerw obwodowy całkowicie zanurzony w sterylnej wodzie destylowanej w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 godziny przed przejściem do kroku 5.1.
   UWAGA: Minimalizować obecność pęcherzyków powietrza wewnątrz kolumny, aby zapewnić skuteczną wymianę roztworu. Dostosować położenie odcinka nerwu obwodowego w razie potrzeby, aby utrzymać go w zawieszeniu w roztworze i zapobiec przylepianiu się do wewnętrznej ściany kolumny lub filtra.

5. Przeprowadź pierwsze usunięcie komórek (dzień 2)

1. Podłącz roztwór 0,25 N NaOH do systemu pompy perystaltycznej. Przeprowadź ciągłą wymianę roztworu przez kolumnę przez 6 h dla odcinków nerwów o długości 2–3 cm, 8 h dla odcinków o długości >3–4 cm lub 10 h dla odcinków o długości >4–5 cm.
2. Odprowadź roztwór z kolumny.
3. Przepłucz nerw obwodowy zgodnie z opisem w krokach 4.6–4.8.
4. Podłącz zbiornik zawierający 5 L sterylnej wody destylowanej do systemu pompy perystaltycznej. Przeprowadź ciągłą wymianę roztworu przez kolumnę przez noc.
   PUNKT PRZERWANIA: Po zakończeniu nocnego przepłukania procedurę można przerwać. Zatrzymaj pompę perystaltyczną i przechowuj nerw obwodowy całkowicie zanurzony w sterylnej wodzie destylowanej w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 h przed przejściem do kroku 6.1.

6. Przeprowadź drugą decelularyzację (dzień 3)

1. Podłącz roztwór SDC o stężeniu 4% (w/v) do systemu pompy perystaltycznej. Przeprowadź ciągłą wymianę roztworu przez kolumnę przez 6 h dla odcinków nerwów o długości 2–3 cm, 8 h dla odcinków o długości >3–4 cm lub 10 h dla odcinków o długości >4–5 cm.
2. Odpompuj roztwór z kolumny.
3. Przepłucz nerw obwodowy zgodnie z opisem w krokach 4.6–4.8.
4. Podłącz zbiornik zawierający 5 L sterylnej wody destylowanej do systemu pompy perystaltycznej. Przeprowadź ciągłą wymianę roztworu przez kolumnę przez całą noc.
   PUNKT PRZERWANIA: Po zakończeniu nocnego przepłukania procedurę można przerwać. Wyłącz pompę perystaltyczną i przechowuj nerw obwodowy całkowicie zanurzony w sterylnej wodzie destylowanej w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 h przed przejściem do kroku 7.1.

7. Zdezenfekuj dekomórkowy nerw obwodowy (dzień 4)

1. Usuń niewielką objętość wody destylowanej z kolumny. Ostrożnie wyjmij zdecelularyzowany nerw obwodowy, zachowując jego zawieszenie w pozostałej cieczy.
2. Upakuj nerw obwodowy razem z wodą destylowaną w warunkach sterylnych.
3. Sterylizuj upakowany nerw obwodowy za pomocą napromieniowania gamma w dawce 25 kGy.
   UWAGA: Nie należy całkowicie opróżniać kolumny z wody destylowanej. Należy utrzymać odcinek nerwu w zawieszeniu w wystarczającej objętości pozostałej cieczy, aby zapobiec jego przyleganiu do wewnętrznej ścianki kolumny oraz umożliwić delikatne manipulowanie bez przelania cieczy.

Wyniki

An overview of the preparation process for decellularized human peripheral nerve grafts is shown in Figure 1. The workflow included trimming of the raw peripheral nerve, delipidization with IPA, sequential chemical decellularization with NaOH and SDC, followed by extensive washing and sterilization (Figure 1).

The peristaltic pump-driven solution-exchange system used for delipidization, decellularization, and washing is shown in Figure 2A. Trimming and segmenting of the nerve were illustrated in Figure 2B–D. After completion of the process, the peripheral nerve maintained its overall morphology without visible structural disruption (Figure 2E).

Histological evaluation of the decellularization is shown in Figure 3. Hematoxylin and eosin (H&E) staining of the native peripheral nerve revealed abundant nuclei, whereas nuclei were largely absent in the decellularized samples (Figure 3A). Quantification of residual DNA, expressed as ng DNA/mg of dry tissue, demonstrated a substantial reduction in DNA content following decellularization (Figure 3B).

Ultrastructural analysis using scanning electron microscopy (SEM) is presented in Figure 4. The fibrous organization of the extracellular matrix (ECM) remained clearly visible after decellularization, indicating preservation of the native ECM architecture (Figure 4).

Assessment of residual detergent and cytocompatibility is shown in Figure 5. Residual SDC levels were minimal following the washing steps (Figure 5A). Cytotoxicity testing showed no significant cytotoxic response in cultured cells exposed to the decellularized peripheral nerve grafts (Figure 5B).

Figure 1: Schematic workflow for the preparation of decellularized human peripheral nerve grafts. Donated human peripheral nerve segments are first prepared by trimming and segmenting to remove surrounding connective tissue. The nerve segments then undergo delipidization using IPA-based solution exchange (Day 1). Sequential decellularization is performed using NaOH (Day 2) and SDC (Day 3) under continuous solution exchange in a peristaltic pump-driven system. The processed grafts are subsequently packaged and sterilized (Day 4) to obtain decellularized peripheral nerve grafts. Abbreviations: IPA = isopropanol; NaOH = sodium hydroxide; SDC = sodium deoxycholate. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2: Representative images of the peripheral nerve processing workflow. (A) Peristaltic pump-driven solution exchange system used for delipidization, decellularization, and washing. (B) Donated human peripheral nerve before trimming. (C) Peripheral nerve during trimming. (D) Peripheral nerve after trimming and segmenting. (E) Peripheral nerve after completion of the entire decellularization process. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 3: Evaluation of decellularization efficiency. (A) Representative hematoxylin and eosin (H&E)-stained images of native and decellularized human peripheral nerve tissues showing reduced cellular components after decellularization. Scale bars = 100 µm. (B) Quantification of residual DNA content in native and decellularized nerve tissues, expressed as ng DNA/mg of dry tissue. Data are presented as mean ± SD (n = 3). *p < 0.05. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 4: Scanning electron microscopy (SEM) analysis of nerve microarchitecture. Representative SEM images of native (left) and decellularized (right) human peripheral nerve tissues showing preserved extracellular matrix architecture following the decellularization process. Scale bars = 2 µm. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 5: Evaluation of residual detergent and cytotoxicity. (A) Chromatograms of the SDC standard (left) and extracts from decellularized nerve grafts (right) used to assess residual detergent. The red box indicates the region corresponding to the SDC retention time (~3.2 min). (B) Cytotoxicity assessment of extracts from decellularized nerve grafts using L929 fibroblasts following ISO 10993-5 guidelines. Representative images after 48 h incubation show the reagent control, extract from decellularized nerve grafts, negative control, and positive control groups. Scale bars = 50 µm. Please click here to view a larger version of this figure.

Nerve segment length (cm)	IPA treatment (h)	NaOH treatment (h)	SDC treatment (h)
2–3	1.5	6	6
>3–4	2	8	8
>4–5	2.5	10	10

Table 1: Length-specific processing durations for peripheral nerve segments within the range evaluated in this study.

Dyskusja

Niniejsza praca przedstawia zestandaryzowany protokół decelularyzacji wspomaganej alkalicznie w celu wytwarzania decelularyzowanych przeszczepów ludzkich nerwów obwodowych do regeneracji nerwów obwodowych. Protokół integruje wstępne przygotowanie nerwu dawcy, kontrolowaną decelularyzację chemiczną oraz system wymiany roztworu napędzany pompą perystaltyczną w ramach ściśle określonego schematu postępowania, co umożliwia efektywne usuwanie komponentów komórkowych i immunogennych przy jednoczesnym zachowaniu natywnej architektury ECM.

Kluczową cechą tej metody jest połączenie traktowania zasadami z ograniczoną ekspozycją na detergent. Konwencjonalne protokoły oparte na detergentach, takie jak metoda Sondella (3% Triton X-100 i 4% SDC) oraz metoda Hudsona (sulfobetaina-10, sulfobetaina-16 i Triton X-200), opierają się na przedłużonych, wieloetapowych zabiegach z użyciem detergentów w celu uzyskania skutecznej decelularyzacji^9,10. Choć podejścia te skutecznie usuwają komponenty komórkowe, przedłużona ekspozycja na detergenty może naruszyć integralność ECM i przyczynić się do resztkowej cytotoksyczności związanej z detergentami^19,20,21. W przeciwieństwie do nich, niniejszy protokół wykorzystuje NaOH w celu usprawnienia usuwania komórek przy jednoczesnym ograniczeniu ekspozycji na SDC, co zmniejsza całkowite obciążenie detergentami i sprzyja zachowaniu naturalnej architektury ECM.

Kolejnym krytycznym aspektem tego protokołu jest system wymiany roztworów napędzany pompą perystaltyczną. W przeciwieństwie do metod opartych na perfuzji, które mogą wywierać ciśnienie wewnętrzne na tkankę i stwarzać ryzyko naruszenia jej struktury²¹, system ten umożliwia ciągłą i kontrolowaną wymianę roztworów w kolumnie chromatograficznej. Skuteczność tego podejścia potwierdzają liczne wyniki analityczne. Analiza histologiczna oraz ilościowe oznaczenie pozostałego DNA potwierdziły efektywne usunięcie składników komórkowych, natomiast analiza SEM wykazała zachowanie natywnej architektury ECM. Ponadto niski poziom pozostałego SDC oraz korzystne wyniki cytokompatybilności potwierdziły biokompatybilność otrzymanego przeszczepu. Wspólnie wyniki te sugerują, że protokół pozwala na osiągnięcie równowagi między skuteczną decelularyzacją a zachowaniem struktury tkanki.

Kilka kroków technicznych ma krytyczne znaczenie dla zminimalizowania zmienności proceduralnej i utrzymania kontrolowanych warunków przetwarzania. Po pierwsze, niezbędna jest ostrożna manipulacja fragmentem nerwu podczas przycinania, przenoszenia i płukania. Tkanka nerwu obwodowego jest mechanicznie krucha, a nadmierna kompresja, zagięcia lub naprężenia mogą zniszczyć strukturę wewnętrzną i upośledzić zachowanie ECM^19,20. Dlatego tkanki powinny być utrzymywane w wilgotnym stanie i traktowane delikatnie przez cały czas trwania procedury. Po drugie, jednolita wymiana roztworu wewnątrz kolumny jest kluczowym czynnikiem determinującym wydajność procesu. Należy zminimalizować obecność pęcherzyków powietrza w kolumnie, a tkanka powinna pozostać całkowicie zanurzona i zawieszona w roztworze, zamiast przylegać do ścianki kolumny lub filtra. Przyleganie tkanki może prowadzić do nierównomiernej wymiany roztworu, co obniża wydajność płukania i powoduje niespójną ekspozycję na odczynniki procesowe^21,22. Po trzecie, system sterowany pompą perystaltyczną musi pracować stabilnie przez całą procedurę. Ciągła cyrkulacja jest wymagana do delipidyzacji, decelularyzacji i płukania; w związku z tym wszystkie połączenia rurek powinny być bezpiecznie zamocowane, aby zapobiec ich rozłączeniu wskutek ciśnienia lub wibracji wywołanych przez pompę. Podczas odzyskiwania próbki należy unikać całkowitego opróżnienia kolumny. Utrzymanie odpowiedniej objętości cieczy pomaga zapobiec przyleganiu tkanki i ułatwia delikatne manipulowanie nią podczas zbierania.

Segmenty nerwów o długości 2–3 cm poddano obróbce za pomocą IPA, NaOH i SDC odpowiednio przez 1,5, 6 i 6 h. Segmenty o długości >3–4 cm były przetwarzane odpowiednio przez 2, 8 i 8 h, natomiast segmenty o długości >4–5 cm przez 2,5, 10 i 10 h. Zatem czasy obróbki wynosiły od 1,5 do 2,5 h dla delipidacji IPA oraz od 6 do 10 h dla każdego etapu decelularyzacji. Wszystkie pozostałe parametry obróbki, w tym stężenia odczynników, objętości roztworów i procedury płukania, pozostawały spójne dla wszystkich grup długości. W zależności od konfiguracji przewodów, szybkość przepływu została ustawiona w określonym zakresie i utrzymywana na stałym poziomie podczas każdego cyklu obróbki. Warunki obróbki zależne od długości podsumowano w Tabeli 1. Korekty w zależności od średnicy nerwu, grubości, struktury pęczkowej lub składu komórkowego i macierzy nie były systematycznie oceniane i wymagają dalszych badań^23,24. W zastosowaniach w skali przemysłowej wielokanałowy system pomp perystaltycznych może zwiększyć wydajność; należy jednak starannie zweryfikować spójność warunków przepływu w poszczególnych kanałach, aby zapewnić jednolitość obróbki.

Pozostaje kilka kwestii wymagających dalszej optymalizacji. Choć niniejszy protokół znacząco ogranicza całkowitą ekspozycję na detergenty, wciąż stosowany jest SDC; przyszłe udoskonalenia mogą skupić się na minimalizacji lub zastąpieniu detergentów przy jednoczesnym zachowaniu wydajności decelularyzacji i integralności ECM^25,26. Ponadto tkanka nerwów obwodowych jest z natury trudna do standaryzacji ze względu na zmienność w strukturze pęczków, średnicy, grubości oraz składzie komórkowym i macierzy^23,24. Podczas produkcji na dużą skalę różnice te, wraz ze zmiennością w obciążeniu tkanki i warunkach przepływu, mogą przyczyniać się do zmienności między partiami. Niemniej jednak w niniejszym badaniu nie przeprowadzono systematycznej oceny powtarzalności między dawcami oraz między partiami. W związku z tym konieczna będzie dalsza walidacja z wykorzystaniem tkanek od wielu dawców i niezależnych partii produkcyjnych, aby ustalić odpowiednie kryteria akceptacji tkanek, zestandaryzować procesy i zapewnić powtarzalność partii.

Kolejne ograniczenie dotyczy długości przeszczepu. Efektywność regeneracji spada wraz ze wzrostem długości przeszczepu, a to zależne od długości ograniczenie może być bardziej wyraźne w przypadku acellularnych alloprzeszczepów nerwowych niż w autoprzeszczepach^3,27. Ponieważ acellularne alloprzeszczepy nerwowe nie zawierają żywych komórek Schwanna, regeneracja aksonów zależy od migracji i proliferacji komórek Schwanna gospodarza²⁷. Saheb-Al-Zamani i współpracownicy donieśli, że ograniczona regeneracja w długich acellularnych alloprzeszczepach nerwowych była powiązana ze zwiększoną senescencją komórek Schwanna²⁷.

Niemniej jednak wcześniejsza analiza in vivo wykazała, że odkomórkowione przeszczepy ludzkich nerwów przygotowane w oparciu o NaOH wspomagały regenerację funkcjonalną i strukturalną porównywalną z autoprzeszczepami w przypadku 15-mm ubytku nerwu kulszowego u królika²⁸. Contreras i wsp. wykazali również regenerację aksonalną i powrót funkcji z wykorzystaniem odkomórkowanego alloprzeszczepu nerwu w 70-mm ubytku nerwu strzałkowego u owiec²⁹. Badania te potwierdzają potencjał regeneracyjny odkomórkowanych przeszczepów nerwowych, choć wymagana jest dalsza ocena przeszczepów przygotowanych zgodnie z niniejszym protokołem przy klinicznie istotnych długościach przeszczepów. Autoprzeszczepy są również ograniczone dostępnością nerwu dawcy i wymagają dodatkowej procedury pobrania, co skutkuje powstaniem drugiego miejsca operacyjnego oraz zachorowalnością w miejscu pobrania⁴. Bezkomórkowe alloprzeszczepy nerwowe mogą zatem stanowić klinicznie istotną alternatywę, gdy dostępna ilość tkanki autologicznej jest niewystarczająca lub gdy pobranie nerwu od dawcy jest niepraktyczne.

Podsumowując, niniejszy protokół stanowi praktyczne i elastyczne rozwiązanie w zakresie przygotowywania decelularyzowanych przeszczepów nerwów obwodowych. Położenie nacisku na ograniczenie ekspozycji na detergenty, kontrolowaną wymianę roztworów oraz standaryzację procesu wspiera zarówno zastosowania badawcze, jak i potencjalne wykorzystanie translacyjne w regeneracji nerwów obwodowych. Przyszłe badania powinny skoncentrować się na dalszym rozwoju metod wolnych od detergentów, skalowalności systemu oraz kompleksowej ocenie wydajności regeneracyjnej in vivo.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wielokanałowa pompa perystaltyczna BT100-1L	Pompa o zwiększonej wydajności	BT100-1L	Stosowane do zapewnienia ciągłej cyrkulacji i wymiany roztworu podczas delipidyzacji, decelularyzacji i płukania.
Kolumna do chromatografii Econo-Column, 2,5 × 10 cm	Bio-Rad	737-2512	Służy do unieruchomienia odcinków nerwów obwodowych podczas ciągłej wymiany roztworu.
Alkohol izopropylowy (IPA)	Daejeong Chemicals	5035-4410	Stosowane do delipidacji tkanki nerwów obwodowych.
Przewody do pompy Masterflex Tygon E-LFL	Thermo Scientific	06440-16	Służy do połączenia pompy perystaltycznej, kolumny chromatograficznej i zbiorników z roztworami w celu zapewnienia ciągłej cyrkulacji roztworu.
Deoksycholan sodu (SDC)	Sigma-Aldrich	30970-100G	Stosowany jako detergent w drugim etapie decelularyzacji w celu usunięcia pozostałych komponentów komórkowych.
Wodorotlenek sodu, NaOH	Duksan	1636	Do rozbijania komórek.