Przygotowanie zdecelularyzowanych przeszczepów ludzkiego nerwu obwodowego z wykorzystaniem wodorotlenku sodu i deoksycholanu sodu

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje standaryzowaną metodę decelularyzacji wspomaganej alkalicznie, która łączy opracowanie wodorotlenkiem sodu z systemem wymiany roztworu napędzanym pompą perystaltyczną, w celu wytworzenia decelularyzowanych przeszczepów ludzkich nerwów obwodowych przy jednoczesnym skutecznym usunięciu komórek i zachowaniu architektury rodzimej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Streszczenie

Urazy nerwów obwodowych często wymagają zastosowania materiałów przeszczepowych, które zapewniają prowadzenie strukturalne dla regeneracji aksonów. Choć autologiczne przeszczepy nerwów pozostają złotym standardem klinicznym, ich stosowanie jest ograniczone przez powikłania w miejscu pobrania oraz ograniczoną dostępność tkanek. Ograniczenia te spowodowały wzrost zainteresowania zdecelularyzowanymi ludzkimi przeszczepami nerwów obwodowych jako alternatywnym biomateriałem do regeneracji nerwów. Jednak powszechnie stosowane protokoły decelularyzacji oparte na detergentach mogą naruszać architekturę macierzy pozakomórkowej (ECM) i pozostawiać cytotoksyczne pozostałości, które mogą obniżyć jakość przeszczepu. W niniejszym artykule opisano standaryzowany protokół przygotowania zdecelularyzowanych ludzkich przeszczepów nerwów obwodowych z wykorzystaniem metody decelularyzacji wspomaganej zasadami. Procedura rozpoczyna się od obróbki wodorotlenkiem sodu (NaOH) w celu promowania efektywnej destrukcji komórek, a następnie łagodnego etapu z użyciem deoksycholanu sodu (SDC), który usuwa pozostałe komponenty komórkowe i immunogenne, zachowując jednocześnie natywną organizację ECM. Strategia ta ogranicza ekspozycję na detergenty, wspierając zachowanie natywnej architektury ECM. Przepływ pracy obejmuje przygotowanie nerwu dawcy, kontrolowaną obróbkę NaOH, późniejszą łagodną obróbkę SDC oraz intensywne płukanie przy ciągłej wymianie roztworu za pomocą systemu napędzanego pompą perystaltyczną, aby ułatwić usunięcie pozostałości środków przetwarzania. Wdrożono dalsze etapy obróbki końcowej w celu utrzymania integralności strukturalnej i przygotowania przeszczepów do końcowego pakowania i sterylizacji. Efektywność decelularyzacji oceniono za pomocą analizy histologicznej i ilościowego oznaczania resztkowego DNA, a zachowanie struktury ECM zbadano przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej. Brak resztek SDC oraz biokompatybilność przetworzonych przeszczepów potwierdzono za pomocą testów cytotoksyczności. Niniejszy protokół zapewnia praktyczne podejście do produkcji zdecelularyzowanych ludzkich przeszczepów nerwów obwodowych na potrzeby badań nad regeneracją nerwów obwodowych i zastosowań translacyjnych.

Wprowadzenie

Uszkodzenia nerwów obwodowych mogą prowadzić do poważnych upośledzeń funkcjonalnych i pozostają istotnym wyzwaniem klinicznym w medycynie regeneracyjnej oraz chirurgii rekonstrukcyjnej. Regeneracja segmentowych ubytków nerwowych wymaga materiałów przeszczepowych, które nie tylko wypełniają lukę powstałą w wyniku urazu, ale także zapewniają prowadzenie strukturalne i sygnały biochemiczne wspierające regenerację aksonów i reinnerwację. Autologiczne przeszczepy nerwów są powszechnie uznawane za kliniczny złoty standard, ponieważ zachowują natywną architekturę macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i zapewniają sprzyjające mikrośrodowisko dla regeneracji nerwów^1,2. Jednak ich zastosowanie kliniczne jest ograniczone przez ograniczoną dostępność tkanki dawcy, konieczność przeprowadzenia dodatkowych procedur chirurgicznych oraz zachorowalność w miejscu pobrania przeszczepu^3,4. Ograniczenia te napędziły rozwój alternatywnych materiałów do przeszczepów, w szczególności zdecelularyzowanych przeszczepów nerwów obwodowych, które zachowują natywną architekturę ECM przy jednoczesnym zminimalizowaniu immunogennych komponentów komórkowych^5,6,7,8.

Skuteczność decelularyzowanych przeszczepów nerwowych jest w dużym stopniu zależna od procesu decelularyzacji. Konwencjonalne metody opierają się zazwyczaj na odczynnikach detergentowych, takich jak Triton X-100 i deoksycholan sodu (SDC), które usuwają komponenty komórkowe poprzez solubilizację błon lipidowych^9,10,11. Jednak przedłużona ekspozycja na te detergenty może naruszyć mikrostrukturę macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) oraz pozostawić resztkowe substancje cytotoksyczne, które negatywnie wpływają na żywotność komórek i wyniki regeneracyjne^12,13. W związku z tym aktywnie bada się alternatywne strategie decelularyzacji, które umożliwiają efektywne usuwanie komórek przy jednoczesnym zachowaniu integralności ECM¹⁴. Decelularyzacja alkaliczna z użyciem wodorotlenku sodu (NaOH) pojawiła się jako potencjalne podejście alternatywne, ponieważ ekstremalne wartości pH mogą skutecznie degradować komponenty komórkowe, kwasy nukleinowe i lipidy^15,16,17. Niemniej jednak niekontrolowana ekspozycja na silne warunki alkaliczne może naruszyć integralność ECM, co podkreśla znaczenie precyzyjnie kontrolowanych warunków przetwarzania^16,18.

W niniejszym opracowaniu przedstawiono standaryzowany protokół decelularyzacji wspomaganej zasadami dla ludzkich przeszczepów nerwów obwodowych, wykorzystujący system ciągłej wymiany roztworu sterowany pompą perystaltyczną. W porównaniu z konwencjonalnymi metodami zanurzeniowymi statycznymi, ten dynamiczny proces umożliwia ciągłą wymianę roztworu, co ułatwia usuwanie szczątków komórkowych i pozostałości czynników procesowych. Artykuł ten oferuje wizualną demonstrację krok po kroku całego przebiegu prac, w tym przygotowania nerwu dawcy, kontrolowanej decelularyzacji wspomaganej zasadami oraz ciągłej wymiany roztworu przy użyciu systemu z pompą perystaltyczną. Otrzymane przeszczepy oceniono za pomocą analizy histologicznej, ilościowego oznaczenia pozostałego DNA oraz skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), aby potwierdzić efektywną decelularyzację i zachowanie ultrastruktury ECM. Dzięki umożliwieniu wyraźnej wizualizacji krytycznych etapów technicznych, artykuł ten dostarcza ściśle zdefiniowanych ram przygotowania decelularyzowanych przeszczepów nerwowych oraz podstaw do przyszłego skalowania procesu.

Protokół

Otrzymano ludzkie obwodowe nerwy pochodzące z amerykańskiego banku tkanek na podstawie wyłącznej umowy z L&C BIO, zgodnie z przepisami American Association of Tissue Banks (AATB) i amerykańskiego Urzędu dla Żywności i Leków (FDA). Informacje o dawcach, w tym wiek i płeć, wywiad medyczny oraz wyniki badań serologicznych, zostały dostarczone razem z materiałami tkankowymi i przeanalizowane oraz zatwierdzone przez certyfikowanego dyrektora medycznego. Po otrzymaniu wszystkie tkanki zostały poddane kontroli przyjęcia, w tym weryfikacji badań przesiewowych dawców, badań serologicznych oraz testów na obecność istotnych patogenów; do niniejszego badania wykorzystano wyłącznie te tkanki, które spełniały ustalone kryteria akceptacji. Wszystkie procedury związane z ludzkimi materiałami biologicznymi przeprowadzono zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej. Ponieważ w badaniu nie uczestniczyły bezpośrednio osoby ludzkie, nie wydano oddzielnego numeru zatwierdzenia przez Komitet ds. Etyki Badań (IRB).

1. Przygotowanie roztworów (dzień 1)

1. Przygotuj 0,25 N roztwór wodorotlenku sodu (NaOH), rozpuszczając 10 g NaOH w 1 L wody destylowanej podczas mieszania magnetycznego.
2. Przygotuj 4% roztwór deoksycholanu sodu (SDC), rozpuszczając 40 g SDC w 1 L wody destylowanej podczas mieszania magnetycznego.
3. Przelej każdy przygotowany roztwór do sterylnych butelek szklanych.
   OSTRZEŻENIE: Dezoksycholan sodu (SDC) należy obsługiwać w okapie wentylacyjnym. Należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice, fartuch laboratoryjny i ochronę oczu, aby zapobiec wdychaniu i kontaktowi z skórą.

2. Przygotowanie odcinków nerwów obwodowych do usunięcia komórek

1. Odkaż zewnętrzną powierzchnię opakowanej surowej nerwu obwodowego i otwórz opakowanie w sposób bezpieczny pod względem mikrobiologicznym.
2. Przemyj nerw obwodowy kilkakrotnie sterylizowaną wodą destylowaną.
3. Usunięcie resztek tkanki tłuszczowej, tkanki łącznej, niepotrzebnych odgałęzień oraz uszkodzonej tkanki nerwowej za pomocą sterylnej pęsety i nożyczek. Ponownie przemyj nerw obwodowy sterylizowaną wodą destylowaną.
4. Przekrój nerw obwodowy na odcinki długości 2–5 cm. Podziel przygotowane odcinki na trzy grupy długości: 2–3 cm, >3–4 cm oraz >4–5 cm.
   UWAGA: Każdą grupę długości należy przetwarzać oddzielnie, ponieważ różne długości odcinków nerwowych wymagają różnych czasów traktowania IPA, NaOH i SDC, jak podsumowano w Tabela 1.

3. Skonfiguruj układ pompy perystaltycznej

1. Do obu końców kolumny chromatograficznej przyłącz chemicznie odporny wężyk silikonowy o odpowiedniej długości.
2. Jeden koniec wężyka połącz z pompą perystaltyczną.
3. Wolne końce wężyka połącz z butelką szklaną o pojemności 1 L zawierającą alkohol izopropylowy (IPA), używając wężyka do pompy, aby utworzyć zamknięty obieg cyrkulacyjny.
   UWAGA: Wszystkie połączenia wężyków należy dobrze zabezpieczyć, ponieważ ciśnienie i wibracje pompy perystaltycznej mogą spowodować odłączenie się wężyka od kolumny lub butelki.

4. Usuń lipidy z nerwu obwodowego

UWAGA: Chyba że wskazano inaczej, wszystkie kroki wymiany roztworów należy wykonywać w temperaturze pokojowej (20–25 °C) przy użyciu pompy perystaltycznej ustawionej na 90–186 mL/min, w zależności od konfiguracji wężyka. Utrzymuj wybraną stałą prędkość przepływu przez cały czas trwania każdego cyklu procesowania.

1. Otwórz jeden koniec kolumny chromatograficznej i częściowo wypełnij ją roztworem IPA, aby zapewnić natychmiastowe zanurzenie tkanki nerwowej bezpośrednio po jej umieszczeniu.
2. Za pomocą sterylnych szczypczyków delikatnie uchwycić zewnętrzną tkankę z jednego końca pojedynczego przygotowanego odcinka nerwu obwodowego. Unikać bezpośredniego ucisku lub chwytania głównego ciała nerwu. Ostrożnie opuścić odcinek nerwu do roztworu wewnątrz kolumny.
3. Szczypczykami delikatnie wyprostować odcinek nerwu i ustawić go wzdłużnie, równolegle do kierunku przepływu cieczy. Upewnić się, że odcinek nie jest zgięty, zwinięty ani przyciśnięty do wewnętrznej ściany kolumny lub filtra wylotowego.
4. Zamknąć kolumnę i ustawić ją pod lekkim nachyleniem w górę w kierunku wylotu, tak aby wylot znajdował się nieco wyżej niż wlot. Taka orientacja pomaga zapobiegać opadaniu odcinka nerwu na jeden z filtrów końcowych, szczególnie na filtr wylotowy.
   UWAGA: Przetwarzać jeden odcinek nerwu obwodowego na jedną kolumnę w ramach jednej procedury. Nie wymaga się dodatkowych urządzeń mechanicznego mocowania. Naturalna pływalność tkanki nerwowej oraz stosunkowo delikatny przepływ cieczy pomagają utrzymać odcinek w zawieszeniu i wyprostowanej pozycji. Podczas przetwarzania należy kontrolować położenie tkanki i w razie przylepienia się do ściany kolumny, filtra lub samego siebie delikatnie przestawić ją sterylnymi szczypczykami.
5. Połączyć roztwór IPA z systemem pompy perystaltycznej. Przeprowadzić ciągłą wymianę roztworu przez kolumnę przez 1,5 h dla odcinków nerwu o długości 2–3 cm, przez 2 h dla odcinków o długości >3–4 cm lub przez 2,5 h dla odcinków o długości >4–5 cm.
6. Odpompować roztwór z kolumny.
7. Dodać 40 mL sterylnej wody destylowanej do kolumny. Delikatnie odwrócić lub wstrząsnąć kolumną pięć razy, aby opłukać nerw obwodowy.
8. Powtórzyć kroki 4.6 i 4.7 łącznie pięciokrotnie.
9. Połączyć zbiornik zawierający 5 L sterylnej wody destylowanej z systemem pompy perystaltycznej. Przeprowadzić ciągłą wymianę roztworu przez kolumnę przez całą noc.
   PUNKT PRZERWANIA: Po zakończeniu nocnego płukania procedurę można przerwać. Zatrzymać pompę perystaltyczną i przechowywać nerw obwodowy całkowicie zanurzony w sterylnej wodzie destylowanej w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 godziny przed przejściem do kroku 5.1.
   UWAGA: Minimalizować obecność pęcherzyków powietrza wewnątrz kolumny, aby zapewnić skuteczną wymianę roztworu. Dostosować położenie odcinka nerwu obwodowego w razie potrzeby, aby utrzymać go w zawieszeniu w roztworze i zapobiec przylepianiu się do wewnętrznej ściany kolumny lub filtra.

5. Przeprowadź pierwsze usunięcie komórek (dzień 2)

1. Podłącz roztwór 0,25 N NaOH do systemu pompy perystaltycznej. Przeprowadź ciągłą wymianę roztworu przez kolumnę przez 6 h dla odcinków nerwów o długości 2–3 cm, 8 h dla odcinków o długości >3–4 cm lub 10 h dla odcinków o długości >4–5 cm.
2. Odprowadź roztwór z kolumny.
3. Przepłucz nerw obwodowy zgodnie z opisem w krokach 4.6–4.8.
4. Podłącz zbiornik zawierający 5 L sterylnej wody destylowanej do systemu pompy perystaltycznej. Przeprowadź ciągłą wymianę roztworu przez kolumnę przez noc.
   PUNKT PRZERWANIA: Po zakończeniu nocnego przepłukania procedurę można przerwać. Zatrzymaj pompę perystaltyczną i przechowuj nerw obwodowy całkowicie zanurzony w sterylnej wodzie destylowanej w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 h przed przejściem do kroku 6.1.

6. Przeprowadź drugą decelularyzację (dzień 3)

1. Podłącz roztwór SDC o stężeniu 4% (w/v) do systemu pompy perystaltycznej. Przeprowadź ciągłą wymianę roztworu przez kolumnę przez 6 h dla odcinków nerwów o długości 2–3 cm, 8 h dla odcinków o długości >3–4 cm lub 10 h dla odcinków o długości >4–5 cm.
2. Odpompuj roztwór z kolumny.
3. Przepłucz nerw obwodowy zgodnie z opisem w krokach 4.6–4.8.
4. Podłącz zbiornik zawierający 5 L sterylnej wody destylowanej do systemu pompy perystaltycznej. Przeprowadź ciągłą wymianę roztworu przez kolumnę przez całą noc.
   PUNKT PRZERWANIA: Po zakończeniu nocnego przepłukania procedurę można przerwać. Wyłącz pompę perystaltyczną i przechowuj nerw obwodowy całkowicie zanurzony w sterylnej wodzie destylowanej w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 h przed przejściem do kroku 7.1.

7. Zdezenfekuj dekomórkowy nerw obwodowy (dzień 4)

1. Usuń niewielką objętość wody destylowanej z kolumny. Ostrożnie wyjmij zdecelularyzowany nerw obwodowy, zachowując jego zawieszenie w pozostałej cieczy.
2. Upakuj nerw obwodowy razem z wodą destylowaną w warunkach sterylnych.
3. Sterylizuj upakowany nerw obwodowy za pomocą napromieniowania gamma w dawce 25 kGy.
   UWAGA: Nie należy całkowicie opróżniać kolumny z wody destylowanej. Należy utrzymać odcinek nerwu w zawieszeniu w wystarczającej objętości pozostałej cieczy, aby zapobiec jego przyleganiu do wewnętrznej ścianki kolumny oraz umożliwić delikatne manipulowanie bez przelania cieczy.

Wyniki

An overview of the preparation process for decellularized human peripheral nerve grafts is shown in Figure 1. The workflow included trimming of the raw peripheral nerve, delipidization with IPA, sequential chemical decellularization with NaOH and SDC, followed by extensive washing and sterilization (Figure 1).

The peristaltic pump-driven solution-exchange system used for delipidization, decellularization, and washing ...

Dyskusja

Niniejsza praca przedstawia zestandaryzowany protokół decelularyzacji wspomaganej alkalicznie w celu wytwarzania decelularyzowanych przeszczepów ludzkich nerwów obwodowych do regeneracji nerwów obwodowych. Protokół integruje wstępne przygotowanie nerwu dawcy, kontrolowaną decelularyzację chemiczną oraz system wymiany roztworu napędzany pompą perystaltyczną w ramach ściśle określonego schematu postępowania, co umożliwia efektywne usuwanie komponentów komórkowych i immunogennych przy jednoczesnym zachowaniu natywnej archit...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wielokanałowa pompa perystaltyczna BT100-1L	Pompa o zwiększonej wydajności	BT100-1L	Stosowane do zapewnienia ciągłej cyrkulacji i wymiany roztworu podczas delipidyzacji, decelularyzacji i płukania.
Kolumna do chromatografii Econo-Column, 2,5 × 10 cm	Bio-Rad	737-2512	Służy do unieruchomienia odcinków nerwów obwodowych podczas ciągłej wymiany roztworu.
Alkohol izopropylowy (IPA)	Daejeong Chemicals	5035-4410	Stosowane do delipidacji tkanki nerwów obwodowych.
Przewody do pompy Masterflex Tygon E-LFL	Thermo Scientific	06440-16	Służy do połączenia pompy perystaltycznej, kolumny chromatograficznej i zbiorników z roztworami w celu zapewnienia ciągłej cyrkulacji roztworu.
Deoksycholan sodu (SDC)	Sigma-Aldrich	30970-100G	Stosowany jako detergent w drugim etapie decelularyzacji w celu usunięcia pozostałych komponentów komórkowych.
Wodorotlenek sodu, NaOH	Duksan	1636	Do rozbijania komórek.