Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł badawczy

Identyfikacja potencjalnych biomarkerów związanych z mitochondriami dla Ligustri Lucidi Fructus w nefropatii cukrzycowej

57 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71592

⸱

15 września 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Pharmaceutical and Food Engineering, Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Shanxi Key Laboratory of Integrative Systemic Regulation for Qi-Blood Homeostasis, 2College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Nefropatia cukrzycowa (DN) wiąże się z dysfunkcją mitochondriów. Wykorzystując transkryptomikę, farmakologię sieciową i uczenie maszynowe, zidentyfikowano CAT, FABP1, MAOA oraz MAOB jako potencjalne biomarkery związane z mitochondriami dla Ligustri Lucidi Fructus. W myszach db/db LLF zwiększył ekspresję CAT oraz MAOA, co stanowi podstawę do dalszych badań nad mechanizmami działania.

Streszczenie

Dysfunkcja mitochondriów oraz nadmierny stres oksydacyjny w obrębie mitochondriów są kluczowymi czynnikami patologicznymi napędzającymi uszkodzenie kanalików nerkowych w nefropatii cukrzycowej (DN). Chociaż Ligustri Lucidi Fructus (LLF) jest tradycyjnie stosowany w leczeniu DN, mechanizmy z tym związane, w szczególności te odnoszące się do genów i szlaków związanych z mitochondriami, pozostają słabo poznane. W niniejszym badaniu wykorzystano analizę różnicowej ekspresji zbioru danych GSE142025 w celu zidentyfikowania genów różnicowo wyrażonych (DEGs) związanych z DN. Geny cech wyselekcjonowano poprzez porównanie wyników czterech modeli uczenia maszynowego. Geny, które wykazały istotną różnicową ekspresję i spójne wzorce ekspresji w obu zbiorach danych, poddano dalszej ocenie za pomocą analizy krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC). Jako potencjalne biomarkery zdefiniowano te, których pole pod krzywą (AUC) było > 0,7 w obu zbiorach danych. Przeprowadzono analizy wzbogacenia funkcjonalnego, infiltracji immunologicznej, konstrukcji sieci oraz dokowania molekularnego. W celu oceny glikemii, mikroalbuminurii w moczu, histopatologii oraz ekspresji potencjalnych biomarkerów za pomocą RT-qPCR wykorzystano mysi model DN. CAT oraz MAOA były istotnie upregulowane in vivo. Potencjalne biomarkery były wzbogacone w szlaki związane z funkcją rybosomów, degradacją waliny, leucyny i izoleucyny, interakcjami cytokina-receptor cytokiny oraz peroksysomami. Wykazano ich negatywną korelację z komórkami T CD8+ i aktywowanymi komórkami tucznymi oraz pozytywną korelację z aktywowanymi komórkami NK i naiwnymi limfocytami B. Taksifolina, beta-sitosterol i eriodyktyol wykazały energie wiązania poniżej -5 kcal/mol z potencjalnymi biomarkerami. CAT i MAOA są obiecującymi kandydatami, które wymagają dalszych badań mechanistycznych.

Wprowadzenie

Nefropatia cukrzycowa (DN), będąca główną przyczyną schyłkowej niewydolności nerek na całym świecie, jest jedną z najczęstszych powikłań cukrzycy. Pod względem patologicznym charakteryzuje się nadmiernym gromadzeniem macierzy zewnątrzkomórkowej zarówno w kłębuszkach, jak i w kanalikach nerkowych, a także pogrubieniem i stwardnieniem wewnątrznerkowych naczyń krwionośnych2. DN jest powszechnie powiązana z białkomoczem i nadciśnieniem tętniczym3. Jej rozwój jest ściśle związany z uszkodzeniem komórek śródbłonka naczyniowego, nasiloną odpowiedzią zapalną oraz zwiększonym stresem oksydacyjnym wynikającym z przedłużonej hiperglikemii4. Częstość występowania DN rośnie na całym świecie, szczególnie wśród osób w średnim i starszym wieku cierpiących na cukrzycę. W miarę postępu choroby może ona prowadzić do schyłkowej niewydolności nerek, a nawet do powikłań sercowo-naczyniowych, co znacząco pogarsza jakość życia i rokowania pacjentów5. Pomimo postępów w podejściach diagnostycznych i terapeutycznych w przypadku DN, wczesne i dokładne biomarkery kandydackie do diagnozy pozostają nieuchwytne, a skuteczne strategie leczenia mające na celu odwrócenie procesów patologicznych są wciąż niedostępne. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania nowych, celowanych leków przeciwnefropatycznych.

Mitochondria są kluczowe dla bioenergetyki komórkowej, syntezy prekursorów metabolicznych, homeostazy wapniowej, produkcji reaktywnych form tlenu (ROS), sygnalizacji odpornościowej oraz apoptozy, z których wszystkie są niezbędne do utrzymania stabilności komórek i organizmu6. Jako centra energetyczne komórki, mitochondria odgrywają kluczową rolę w podstawowych procesach, takich jak glikoliza, cykl kwasu trójkarboksylowego i fosforylacja oksydacyjna7. Otyłość zaburza cykl Krebsa i mitochondrialny łańcuch oddechowy, co prowadzi do dysfunkcji mitochondriów i zwiększonej produkcji ROS. Podwyższone poziomy ROS w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym mogą indukować stres oksydacyjny, który nasila odpowiedź zapalną związaną z otyłością i promuje apoptozę8. Niedawne badania podkreśliły istotną rolę dysfunkcji mitochondriów w patogenezie i progresji DN, w tym zaburzenia metabolizmu energetycznego, nadmierną generację ROS oraz nasiloną sygnalizację apoptozy9. Przewlekła dysfunkcja mitochondriów przyspiesza postęp choroby nerek10. Zatem poprawa funkcji mitochondriów mogłaby stanowić kluczową strategię ochronną przeciwko DN.

Ligustri Lucidi Fructus (LLF) to suszone, dojrzałe owoce z rodziny Luteaceae, znane ze swoich właściwości odżywczych dla wątroby i nerek, a także z możliwości przyciemniania włosów i poprawy widzenia. Zidentyfikowano naturalnie występujący heteropolisacharyd ekstrahowany z LLF, który wykazuje potencjał w ochronie nerek przed włóknieniem1. W ostatnich latach coraz większą uwagę poświęca się zastosowaniu LLF w leczeniu DN, wykazując znaczące efekty renoprotekcyjne1,12,13. Ponadto szeroko badano i potwierdzono złożoną relację między LLF a mitochondriami. W szczególności badanie wykazało, że LLF wywiera korzystne działanie poprzez modulowanie funkcji mitochondriów poprzez aktywację szlaku sygnalizacyjnego AMPK14. Mechanizm ten skutecznie chroni mitochondria przed uszkodzeniami spowodowanymi stresem oksydacyjnym. Wyniki te dodatkowo podkreślają kluczową rolę LLF w utrzymaniu komórkowego metabolizmu energetycznego i poprawie odporności komórek na stres oksydacyjny. Jednak dokładny mechanizm terapeutyczny, zwłaszcza w odniesieniu do przywracania funkcji mitochondriów, pozostaje słabo poznany.

Celem niniejszego badania było wyjaśnienie mechanizmów biologicznych leżących u podstaw terapeutycznego działania LLF na funkcje mitochondrialne w DN. Wykorzystując narzędzia bioinformatyczne, przeszukano publiczne bazy danych w celu zidentyfikowania potencjalnych biomarkerów związanych z efektami nefroprotekcyjnymi LLF, integrując dane transkryptomiczne z informacjami o składnikach aktywnych. Dalsze analizy, obejmujące infiltrację immunologiczną, powiązanie z cechami klinicznymi, modyfikację RNA m6A, wzbogacenie funkcjonalne, konstrukcję sieci regulacyjnych oraz dokowanie molekularne, wykazały, że biomarkery te odgrywają kluczową rolę w regulacji funkcji mitochondrialnych podczas leczenia DN. Walidacja in vivo dodatkowo potwierdziła ich znaczenie. Ta kompleksowa analiza pogłębia nasze zrozumienie mechanizmów, dzięki którym LLF leczy DN, i stanowi solidną podstawę do opracowania nowych celów terapeutycznych opartych na dysfunkcji mitochondriów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Gromadzenie danych
Macierze ekspresji genów oraz odpowiadające im dane kliniczne dla zestawów danych GSE142025 i GSE96804, dotyczących DN, pobrano z bazy danych Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)15. Zbiór treningowy (GSE142025) obejmował próbki tkanki nerkowej od 27 pacjentów z DN oraz dziewięciu osób z grupy kontrolnej, które zostały zsekwencjonowane przy użyciu platformy GPL20301. Zbiór walidacyjny (GSE96804) składał się z danych sekwencyjnych od 41 pacjentów z DN i 20 osób z grupy kontrolnej, przetworzonych przy użyciu platformy GPL17586. Oba zestawy danych koncentrują się na tkance nerkowej; zestaw GSE96804 bada konkretnie kłębuszki nerkowe, będące główną jednostką filtracyjną nerki (Rysunek 1). Zestaw GSE142025 (zbiór treningowy) obejmuje próbki całej tkanki nerkowej i zapewnia szeroki przegląd krajobrazu transkryptomicznego DN. Z kolei zestaw GSE96804 (zbiór walidacyjny) skupia się specyficznie na tkance kłębuszkowej, która jest głównym miejscem uszkodzenia filtracji kłębuszkowej. Ponieważ te dwa zestawy danych nie zostały bezpośrednio połączone ze względu na różnice w platformach i tkankach, nie zastosowano korekcji efektu serii (batch effect). Zamiast tego przeprowadzono niezależną walidację między zestawami danych. Geny wykazujące spójne zmiany kierunkowe oraz powierzchnię pod krzywą (AUC) większą niż 0,7 w obu zestawach danych wybrano jako wiarygodne kandydaty, co potwierdza możliwość generalizacji wyników w różnych przedziałach tkanki nerkowej.

Łącznie 1 136 genów związanych z mitochondriami (MRGs) zostało pobranych z bazy danych MitoCarta3.0 (https://www.broadinstitute.org/mitocarta). Składniki aktywne LLF przewidziano przy użyciu bazy danych Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology (TCMSP) (http://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php), w oparciu o próg biodostępności doustnej (OB) ≥30% oraz próg podobieństwa do leku (DL) ≥0,18. Następnie potencjalne geny docelowe dla składników aktywnych przewidziano przy użyciu bazy danych Swiss Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/).

Analiza ekspresji różnicowej
Analizę ekspresji różnicowej GSE142025 (DN vs. kontrola) przeprowadzono przy użyciu pakietu limma (v3.54.1), przyjmując kryteria istotności P.adj < 0,05 oraz |log2FoldChange| > 0,516. Wykresy wulkaniczne oraz mapy ciepła zwizualizowano odpowiednio przy użyciu pakietów ggplot2 (v 3.3.6) i ComplexHeatmap (v 2.14.0)17,18. Wykonano analizę części wspólnej dla genów DEGs, MRGs oraz potencjalnych genów docelowych składników aktywnych, a nakładające się geny zdefiniowano jako geny kandydackie. Sieć łączącą składniki aktywne z genami kandydackimi skonstruowano za pomocą oprogramowania Cytoscape (v 3.9.0)19.

Analiza wzbogacenia funkcjonalnego i konstrukcja sieci oddziaływań białko-białko (PPI)
Analizy wzbogacenia Gene Ontology (GO) oraz Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) dla genów kandydackich przeprowadzono przy użyciu pakietu clusterProfiler (v 4.6.2), aby zbadać ich funkcje biologiczne i powiązane szlaki sygnalizacyjne (P.adjust < 0.05). Następnie geny kandydackie wprowadzono do bazy danych STRING (https://cn.string-db.org/) w celu pobrania relacji PPI (poziom ufności ≥ 0.4), a następnie skonstruowano sieć PPI przy użyciu programu Cytoscape (v 3.9.0)20.

Uczenie maszynowe
Cztery algorytmy uczenia maszynowego, w tym las losowy (RF), k-najbliższych sąsiadów (KNN), częściowe najmniejsze kwadraty (PLS) oraz maszyna wektorów nośnych z radialną funkcją bazową (SVM), zostały zaimplementowane przy użyciu pakietu caret (v6.0-93) w oparciu o zbiór danych GSE142025. Geny kandydackie zidentyfikowane w poprzedniej analizie posłużyły jako zmienne predykcyjne, a status choroby (DN lub kontrola) jako wynik. Dla modelu KNN zastosowano 10-krotną walidację krzyżową przy użyciu funkcji trainControl z parametrem tuneLength = 10. Model RF dopasowano dla 20 drzew (ntree = 20); modele PLS i SVM dopasowano zgodnie z ustawieniami zaimplementowanymi w oryginalnym przepływie pracy pakietu caret.

Rozkłady residuów modelu oceniono przy użyciu pakietu DALEX (v2.4.3). Następnie przeprowadzono ocenę zmiennych opartą na permutacjach za pomocą funkcji variable_importance pakietu DALEX, określając pierwiastek błędu średniokwadratowego (RMSE) jako funkcję straty. Wynikowy dropout_loss reprezentuje RMSE uzyskany po permutacji odpowiadającej zmiennej21,2. W oryginalnym schemacie analitycznym zachowano zmienne z wartością dropout loss < 0,281 we wszystkich modelach, a geny wspólne dla wszystkich czterech modeli zdefiniowano jako konsensusowe geny cech do późniejszej walidacji.

Cztery modele uczenia maszynowego zostały wykorzystane przede wszystkim do ustalenia priorytetów cech, a nie do budowy końcowego klasyfikatora klinicznego. W związku z tym dyskryminacja diagnostyczna została następnie oceniona na poziomie pojedynczych genów przy użyciu analizy ROC w zbiorach danych odkrywczych i walidacyjnych.

Identyfikacja potencjalnych biomarkerów
W zbiorach danych GSE142025 i GSE96804 różnice w ekspresji genów cech między próbkami z DN a grupą kontrolną oceniano za pomocą testu Wilcoxona. Do analizy krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) wybrano jedynie geny wykazujące istotną różnicową ekspresję (P < 0,05) oraz zgodne trendy ekspresji w obu zbiorach danych. Do generowania krzywych ROC i obliczania pola pod krzywą (AUC) wykorzystano pakiet pROC (v1.18.0), a geny z AUC > 0,7 w obu zbiorach danych sklasyfikowano jako potencjalne biomarkery23.

Analiza wzbogacenia zestawów genów (GSEA)
Funkcje biologiczne i szlaki sygnalizacyjne powiązane z potencjalnymi biomarkerami poddano dalszej analizie z wykorzystaniem GSEA na zbiorze danych GSE142025. W pierwszej kolejności, przy użyciu pakietu psych (v2.2.9), przeprowadzono analizę korelacji Spearmana potencjalnych biomarkerów ze wszystkimi pozostałymi genami.24Obliczono i uszeregowano współczynniki korelacji (od najwyższego do najniższego). Jako zestaw genów referencyjnych wykorzystano c2.cp.kegg.v2023.1.Hs.symbols.gmt z bazy Molecular Signatures Database (MSigDB, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/). Następnie, przy użyciu pakietu clusterProfiler (v4.6.2), przeprowadzono analizę GSEA w celu oceny wzbogacenia uszeregowanych genów w tle genetycznym. Zastosowano korektę dla wielokrotnych testów. poprzez metoda FDR oraz skorygowane P-wartości (oznaczone jako P.adjust) uznano za istotne, jeśli < 0.05.

Analiza modyfikacji m6A
W celu zbadania modyfikacji metylacyjnych RNA potencjalnych biomarkerów, wykorzystano bazę danych SRAMP (http://www.cuilab.cn/sramp/) do przewidywania miejsc modyfikacji m6A w biomarkerach, koncentrując się na pozycjach o wysokim stopniu pewności w obrębie ich struktur drugorzędowych. Następnie użyto bazy danych ENCORI (https://starbase.sysu.edu.cn/) do identyfikacji białek zmodyfikowanych przez m6A, które oddziałują z potencjalnymi biomarkerami, stosując parametr |HepG2 (shRNA)| > 1 w celu przesiewania kluczowych białek. W kolejnym kroku wykorzystano bazę danych RPISeq (http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/) do przewidywania prawdopodobieństwa oddziaływań pomiędzy kluczowymi białkami a potencjalnymi biomarkerami. Sekwencje RNA obu cząsteczek przesłano w formacie tekstowym w celu wygenerowania wyników predykcji klasyfikatorów RF i SVM. Oddziaływanie uznano za istotne, gdy wynik przekroczył 0,525. Analizę SRAMP przeprowadzono z progiem „High” dla predykcji miejsc m6A, korzystając z trybu „Transcript” i parametrów domyślnych. W analizie ENCORI wykorzystano funkcję oddziaływań „miRNA-mRNA” z parametrem „HepG2 (shRNA)” > 1. Analiza RPISeq została wykonana przy użyciu klasyfikatora RF z parametrami domyślnymi; wyniki > 0,5 wskazywały na pozytywne oddziaływanie. Powyższe dane stanowią predykcje obliczeniowe, a nie dowody eksperymentalne na występowanie modyfikacji m6A lub oddziaływań RNA-białko w tkance nerek. Kryterium HepG2 shRNA zostało wyprowadzone z wstępnie obliczonych zbiorów danych ENCORI i może nie odzwierciedlać regulacji specyficznej dla nerek.

Analiza infiltracji immunologicznej
Algorytm CIBERSORT zastosowano w celu oszacowania proporcji 2 typów komórek odpornościowych w próbkach kontrolnych oraz próbkach DN z zestawu GSE142025, a wyniki zwizualizowano za pomocą mapy ciepła wygenerowanej przy użyciu pakietu ggplot2 (v3.3.6)26. Program CIBERSORT uruchomiono z wykorzystaniem macierzy sygnatur LM2, stosując 1 0 permutacji i wyłączając normalizację kwantylową (zgodnie z zaleceniami dla danych z mikromacierzy). Do dalszej analizy zakwalifikowano próbki z wartością p < 0,05 w CIBERSORT. CIBERSORT szacuje frakcje komórek odpornościowych na podstawie ekspresji z tkanki nerkowej w formie bulk, co nie pozwala na rozróżnienie infiltracji w konkretnych przedziałach (np. kłębuszkowej vs. cewkowo-śródmiąższowej) ani na odróżnienie leukocytów infiltrujących od rezydentnych komórek odpornościowych. Zatem zgłaszane korelacje dotyczą poziomu tkanki i powinny zostać zwalidowane za pomocą metod przestrzennych. Analizę korelacji Spearmana pomiędzy komórkami odpornościowymi o różnej liczebności a potencjalnymi biomarkerami przeprowadzono przy użyciu pakietu psych.

Konstrukcja sieci i dokowanie molekularne
MikroRNA (miRNA) oddziałujące z biomarkerami kandydackimi przewidziano z wykorzystaniem bazy danych miRNet (https://www.mirnet.ca). Następnie, za pomocą baz danych TarBase (http://www.diana.pcbi.upenn.edu/tarbase) oraz starbase (http://starbase.sysu.edu.cn/), przewidziano długie niekodujące RNA (lncRNA) celujące w zidentyfikowane miRNA. Do konstrukcji sieci wybrano lncRNA wspólne dla obu baz danych. Następnie, przy użyciu oprogramowania Cytoscape, zbudowano regulacyjną sieć lncRNA-miRNA-mRNA. W celu stworzenia sieci składnik aktywny-biomarker wybrano potencjalne składniki aktywne celujące w biomarkery kandydackie. Dodatkowo, składniki aktywne, biomarkery kandydackie oraz szlaki zidentyfikowane w GSEA wprowadzono do programu Cytoscape, aby stworzyć sieć składnik aktywny-biomarker-szlak.

Przeprowadzono analizę dokowania molekularnego w celu oceny powinowactwa wiązania między potencjalnymi składnikami aktywnymi a kandydującymi biomarkerami. Struktury 3D białek biomarkerowych pobrano z bazy danych Protein Data Bank Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB PDB, https://www.rscb.org/pdb) w formacie plików PDB. Struktury 2D potencjalnych składników aktywnych pobrano w formacie SDF z bazy danych PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). Dokowanie molekularne wykonano przy użyciu platformy CB-Dock (http://clab.labshare.cn/cb-dock/php/blinddock.php). Energia wiązania mniejsza niż -5 kcal/mol wskazywała na silne powinowactwo wiązania27.

Przygotowanie i uwierzytelnienie Ligustri Lucidi Fructus
W niniejszym opracowaniu Ligustri Lucidi Fructus (LLF) odnosi się do suszonych dojrzałych owoców Ligustrum lucidum W. T. Aiton (Oleaceae). Materiał botaniczny został uwierzytelniony zgodnie z Farmakopeą Chińską, a próbki referencyjne nr 20240506, 2024091, 2024103 zostały zdeponowane w Shanxi University of Traditional Chinese Medicine.

W celu przygotowania odwaru 20 g odpowiednio przygotowanych plastrów LLF namaczano w 1,0 mL wody destylowanej przez 30 min w temperaturze pokojowej. Mieszaninę doprowadzono do gwałtownego wrzenia, a następnie gotowano na małym ogniu przez 60 min. Zebrano filtrat, a pozostałe materiały roślinne poddano ponownemu gotowaniu z kolejnymi 1,0 mL wody destylowanej przez 60 min. Oba filtraty połączono, przefiltrowano, odwirowano i zagęszczono pod zmniejszonym ciśnieniem, aby uzyskać końcowe stężenie zapasu wynoszące 1 g surowca/mL (całkowita objętość 10 mL). Przygotowany odwar przechowywano w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego użycia lub w −20 °C do długotrwałego przechowywania. Jakość LLF oraz jego odwaru została rygorystycznie zidentyfikowana i zweryfikowana zgodnie ze standardami Farmakopei Chińskiej, aby zapewnić wiarygodność i powtarzalność eksperymentów.

Do identyfikacji jakościowej przeprowadzono chromatografię cienkowarstwową. W skrócie, odpowiednią objętość przygotowanego odwaru odwirowano, a nadosad ekstrahowano metanolem. Po filtracji roztwór próbki oraz roztwór wzorca specnuezhenide naniesiono na tę samą płytkę z żelem krzemianowym G. Po rozwinięciu, wysuszeniu i analizie w świetle ultrafioletowym plamka roztworu próbki wykazała zgodność koloru i położenia z związkiem referencyjnym, co potwierdziło obecność charakterystycznego składnika biologicznie czynnego w LLF.

W celu ilościowej kontroli jakości przeprowadzono detekcję za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Analizę wykonano przy użyciu kolumny C18 z mieszaniną metanol–woda jako fazą ruchomą. Długość fali detekcji ustawiono na 24 nm. Zawartość specnuezhenide w odwarze określono na podstawie krzywej wzorcowej. Wyniki wykazały stabilny i jednorodny skład chemiczny przygotowanego odwaru, co zapewniło spójną jakość leku podczas całego eksperymentu z interwencją na zwierzętach.

Doświadczenia na zwierzętach
Dwanaście samców myszy db/db klasy SPF (w wieku 8–9 tygodni) oraz sześć myszy db/m w tym samym wieku utrzymywano w zwierzęcej jednostce SPF Uniwersytetu Medycyny Tradycyjnej Chińskiej w Shanxi. Przed rozpoczęciem eksperymentów zwierzęta poddano 7-dniowej aklimatyzacji w cyklu 12 h światła / 12 h ciemności, z dostępem do pożywienia i wody ad libitum. Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersytetu Medycyny Tradycyjnej Chińskiej w Shanxi (numer zatwierdzenia 2022DW167). Zwierzęta wykazujące utratę masy ciała >20%, stan agonalny lub niezdolność do przyjmowania pokarmu i wody poddano humanitarnej eutanazji przed planowanym zakończeniem badania. Po zakończeniu badania wszystkie pozostałe myszy uśmiercono poprzez dostresycyjne wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu do jamy otrzewnej, a następnie zwichnięcie kręgów szyjnych zgodnie z protokołami instytucjonalnymi.

Po okresie aklimatyzacji ustanowienie modelu DN u myszy db/db potwierdzono, stwierdzając poziom glukozy we krwi pobranej z żyły ogonowej ≥ 16 mmol/L oraz mikroalbuminurię, wskazaną przez dodatni wynik testu paskowego na mikroalbuminurię w moczu. Po pomyślnym ustanowieniu modelu DN myszy db/db podzielono losowo na dwie grupy (n = 6 na grupę): grupę modelu DN (DN) oraz grupę leczoną LLF (Treatment). Ponadto myszy db/m (n = 6) wykorzystano jako grupę kontrolną (Control). Dawkę wybrano na podstawie wcześniejszych badań farmakodynamicznych LLF u szczurów z cukrzycą i przeliczono na dawkę równoważną dla ludzi z zastosowaniem normalizacji powierzchni ciała28. Grupy Control i DN otrzymywały wodę destylowaną, natomiast grupa leczona otrzymywała 3,5 g/kg LLF przez 8 tygodni. Po 8 tygodniach podawania wszystkie myszy zostały uśmiercone w celu pobrania surowicy, moczu i tkanki nerek do dalszych badań.

Wskaźniki krwi i moczu
Poziomy glukozy w surowicy analizowano przy użyciu w pełni automatycznego analizatora biochemii krwi. Stężenie mikroalbuminurii w moczu zmierzono zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu (Plik uzupełniający 1).

Obserwacja patomorfologiczna tkanek nerek myszy
Tkanki nerek przygotowano do badania histopatologicznego. Po utrwaleniu w 4% paraformaldehydzie tkanki przemyto, odwodniono, zatopiono w parafinie i pocięto na skrawki. Następnie wykonano barwienie hematoksyliną i eozyną (HE), a zabarwione skrawki zbadano pod mikroskopem optycznym w celu oceny zmian patologicznych.

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR)
Do oznaczenia ekspresji potencjalnych biomarkerów w tkance nerek myszy wykorzystano metodę RT-qPCR. Całkowity RNA wyekstrahowano zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie oceniono jego stężenie i jakość (Tabela 1). cDNA zsyntetyzowano z wyekstrahowanego RNA przy użyciu zestawu cDNA Synthesis Kit. Amplifikację przeprowadzono z użyciem par starterów wymienionych w Tabela 1z użyciem GAPDH jako gen referencyjny. Poziomy ekspresji względnej obliczono przy użyciu metody 2-−ΔΔCt metoda13,26.

Analiza statystyczna
Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania R (wersja 4.2.2) wraz z oprogramowaniem wymaganym dla odpowiednich procedur eksperymentalnych. O ile nie wskazano inaczej, wszystkie testy statystyczne były dwustronne, a różnice uznano za statystycznie istotne przy P < 0.05. Analizę różnicowej ekspresji transkryptomicznej przeprowadzono przy użyciu pakietu limma. Geny z dostosowanym P < 0.05 i wartością bezwzględną log2fold change większą niż 0.5 zdefiniowano jako różnicowo wyrażone.

Do porównania ekspresji genów kandydackich pomiędzy niezależnymi próbkami DN i kontrolnymi, tam gdzie wskazano w pierwotnym schemacie analizy, zastosowano nieparametryczne testy sum rang Wilcoxona. Korelacje między kandydackimi biomarkerami a frakcjami komórek odpornościowych oceniono za pomocą korelacji rang Spearmana.

Dane eksperymentalne przedstawiono jako średnia ± SD. Porównania pomiędzy trzema niezależnymi grupami zwierząt przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji, gdy spełnione były założenia analizy parametrycznej. Do porównań post hoc zastosowano test najmniejszej istotnej różnicy w przypadku jednorodności wariancji, natomiast test T3 Dunnetta w przypadku wariancji niejednorodnych. Pomiary farmakodynamiczne z poziomu wyjściowego oraz z 8. tygodnia przeanalizowano i przedstawiono oddzielnie; nie wyciągnięto wniosków dotyczących interakcji grupa-czas. Skrypty R oraz dane źródłowe wykorzystane w analizach bioinformatycznych i uczeniu maszynowym znajdują się w Pliku uzupełniającym 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby systematycznie zbadać potencjalne biomarkery kandydackie związane z mitochondriami dla LLF w leczeniu DN, zaprojektowaliśmy czteroetapowy schemat analityczny (Rycina 1). W Etapie I zintegrowaliśmy dane transkryptomiczne z zestawu danych GSE142025 (zbiór treningowy, cała nerka, n=36) oraz GSE96804 (zbiór walidacyjny, kłębuszek, n = 61) z 1 136 genami związanymi z mitochondriami z bazy danych MitoCarta 3.0 oraz 517 przewidywanymi celami 9 aktywnych składników z bazy danych TCMSP. Nałożenie tych trzech ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

LLF jest powszechnie stosowanym tradycyjnym lekiem chińskim, wykorzystywanym przede wszystkim w celu odżywienia wątroby i nerek oraz w leczeniu cukrzycy i jej powikłań. Obecnie nie istnieją specyficzne leki ani terapie na DN, a jego leczenie opiera się głównie na terapiach hipoglikemicznych, hipolipemicznych i hipotensyjnych30,31,32. Jednakże terapie te mogą spowolnić postęp uszkodzeń nerek jedynie u niewielkiej grupy pacjentów<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Pragniemy wyrazić naszą szczerą wdzięczność wszystkim osobom i organizacjom, które wspierały nas i pomagały nam w trakcie prowadzenia tych badań. Niniejsze badanie zostało sfinansowane przez National Natural Science Foundation of China (nr 81973486 i 82173974), projekty badawcze Shanxi Province Traditional Chinese Medicine Administration (nr 2024ZYYA021), projekt dyscypliny Shanxi University of Chinese Medicine (nr 2026XK24) oraz projekt z funduszu badań naukowych Shandong University of Chinese Medicine (nr KYZK2024Q13). Dziękujemy dr Qinqing Li, profesorowi nadzwyczajnemu na Shanxi University of Chinese Medicine, za autentykację materiału botanicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4% roztwór utrwalający tkanki z paraformaldehyduSaiyin Biotechnology Co., Ltd.71033600
Etanol absolutnySinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10009218
GlukometrSinocare Inc.GA-3
Zestaw do oznaczania azotu mocznika we krwi (BUN)Nanjing Jianwei Bioengineering InstituteC03-2-1
myszy C57BLKS/J db/dbChangzhou Cavens Experimental Animal Co., Ltd.SCXK (Su) 2021-013
myszy C57BLKS/J db/mChangzhou Cavens Experimental Animal Co., Ltd.SCXK (Su) 2021-0013
WirówkaHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.HI650
Hydrat chloraluShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.302-17-0
Cytoscape (v3.9.0)https://cytoscape.org
Baza danych dla m6Predykcja modyfikacjihttp://www.cuilab.cn/sramp/
Baza danych składników aktywnych w tradycyjnej medycynie chińskiejhttp://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php
ENCORI / Starbasehttps://starbase.sysu.edu.cn/
Gene Expression Omnibus (GEO)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Zestaw do barwienia hematoksyliną i eozyną (HE)Servicebio C0105S
Wirówka wysokoprędkościowaLabnet, USAC2500-R-230V
Narzędzie do analizy infiltracji immunologicznejhttps://cibersort.stanford.edu/
Owoc Ligustru błyszczącegoSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20240506
Mieszadło magnetyczneJintan Zhongtian Instrument Factory, JiangsuT8-1
MikroskopOlympusBX53
MikrotomLeica, NiemcyRM 2016
Spektrofotometr mikrokubetowyHangzhou Aosheng Instrument Co., Ltd.Nano-300
miRNethttps://www.mirnet.ca
MitoCarta 3.0https://www.broadinstitute.org/mitocarta
Pakiet R do interpretacji modelihttps://cran.r-project.org/package=DALEX
Platforma dokowania molekularnegohttp://clab.labshare.cn/cb-dock/
Zestaw ELISA do oznaczania mikroalbuminurii u myszyTest precyzyjnyEM0632
pasek testowy do oznaczania mikroalbuminurii u myszyGuangzhou Huadu Gaoerbao Biotechnology Co., Ltd.20211203
Zestaw ELISA do oznaczania kreatyniny w surowicy mysiejAbmartAB590A
MSigDBhttps://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/
Termocykler do PCRRocheRoche LightCycler 480
Oprogramowanie R (wersja 4.2.2) + pakiety Rhttps://www.r-project.org / CRAN/Bioconductor
RCSB PDBhttps://www.rcsb.org
Zestaw do izolacji RNABeijing Jumei Biotech Co., Ltd.MF-036-01
RPISeqhttp://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/
Zestaw do RT-qPCRBeijing Jumei Biotech Co., Ltd.MF949-T
SalidrozydSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20211009
Zestaw do oznaczania kreatyniny w surowicyNanjing Jianwei Bioengineering InstituteC01-2-1
wybieg dla zwierząt SPFUniwersytet Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Shanxi
SRAMPhttp://www.cuilab.cn/sramp/
Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.https://cn.string-db.org/
SwissTargetPredictionhttp://www.swisstargetprediction.ch/
TCMSPhttp://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php
Tezhi PiganSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20210602
Kąpiel flotacyjna do tkanekWuhan JunjieJK-6

Bibliografia

  1. Thipsawat S. Early detection of diabetic nephropathy in patient with type 2 diabetes mellitus: a review of the literature. Diabetes Vasc Dis Res. 2021;18(6):14791641211058856.
  2. Kanwar YS, Sun L, Xie P, Liu FY, Chen S. A glimpse of various pathogenetic mechanisms of diabetic nephropathy. Annu Rev Pathol. 2011;6:395-423.
  3. Santulli G, et al. Prediabetes increases the risk of frailty in prefrail older adults with hypertension: beneficial effects of metformin. Hypertension. 2024;81(7):1637-43.
  4. Jin Q, et al. Oxidative stress and inflammation in diabetic nephropathy: role of polyphenols. Front Immunol. 2023;14:1185317.
  5. Alicic RZ, Rooney MT, Tuttle KR. Diabetic kidney disease: challenges, progress, and possibilities. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12(12):2032-45.
  6. Harrington JS, et al. Mitochondria in health, disease, and aging. Physiol Rev. 2023;103(4):2349-422.
  7. Peña FJ, et al. An integrated overview on the regulation of sperm metabolism (glycolysis-Krebs cycle-oxidative phosphorylation). Anim Reprod Sci. 2022;246:106805.
  8. de Mello AH, Costa AB, Engel JDG, Rezin GT. Mitochondrial dysfunction in obesity. Life Sci. 2018;192:26-32.
  9. Shen Y, et al. Notoginsenoside Fc, a novel renoprotective agent, ameliorates glomerular endothelial cells pyroptosis and mitochondrial dysfunction in diabetic nephropathy through regulating HMGCS2 pathway. Phytomedicine. 2024;126:155445.
  10. Zhang PN, et al. Mitochondrial dysfunction and diabetic nephropathy: nontraditional therapeutic opportunities. J Diabetes Res. 2021;2021:1010268.
  11. Zhang JL, et al. Structural characterization and protective effect against renal fibrosis of polysaccharide from Ligustrum lucidum Ait. J Ethnopharmacol. 2023;302(Pt A):115898.
  12. Luan R, et al. The protective effect of ethyl acetate and n-butanol fractions of wine-steamed Ligustri Lucidi Fructus on diabetic nephropathy in rats. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:6512242.
  13. Luan R, et al. Pharmacodynamics, pharmacokinetics, and kidney distribution of raw and wine-steamed Ligustri Lucidi Fructus extracts in diabetic nephropathy rats. Molecules. 2023;28(2):791.
  14. Seo HL, et al. Liqustri lucidi Fructus inhibits hepatic injury and functions as an antioxidant by activation of AMP-activated protein kinase in vivo and in vitro. Chem Biol Interact. 2017;262:57-68.
  15. Yan M, et al. Identification of pyroptosis-related genes and potential drugs in diabetic nephropathy. J Transl Med. 2023;21(1):490.
  16. Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43(7):e47.
  17. Gustavsson EK, et al. ggtranscript: an R package for the visualization and interpretation of transcript isoforms using ggplot2. Bioinformatics. 2022;38(15):3844-6.
  18. Gu Z, Eils R, Schlesner M. Complex heatmaps reveal patterns and correlations in multidimensional genomic data. Bioinformatics. 2016;32(18):2847-9.
  19. Shannon P, et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 2003;13(11):2498-504.
  20. Wu T, et al. clusterProfiler 4.0: a universal enrichment tool for interpreting omics data. Innovation (Camb). 2021;2(3):100141.
  21. Dong H, et al. Identification through machine learning of potential immune-related gene biomarkers associated with immune cell infiltration in myocardial infarction. BMC Cardiovasc Disord. 2023;23(1):163.
  22. Pei B, et al. The development of prediction model for cuffed tracheal tube size from the middle finger in pediatrics: a concise and feasible approach. Transl Pediatr. 2023;12(12):2222-31.
  23. Robin X, et al. pROC: an open-source package for R and S+ to analyze and compare ROC curves. BMC Bioinformatics. 2011;12:77.
  24. Robles-Jimenez LE, et al. Worldwide traceability of antibiotic residues from livestock in wastewater and soil: a systematic review. Animals (Basel). 2021;12(1):60.
  25. Wang Y, et al. Bioinformatics analysis combined with clinical sample screening reveals that leptin may be a biomarker of preeclampsia. Front Physiol. 2022;13:1031950.
  26. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^−ΔΔCT method. Methods. 2001;25(4):402-8.
  27. Klejborowska G, et al. Synthesis, anticancer activity and molecular docking studies of N-deacetylthiocolchicine and 4-iodo-N-deacetylthiocolchicine derivatives. Bioorg Med Chem. 2021;32:116014.
  28. Reagan-Shaw S, Nihal M, Ahmad N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB J. 2008;22(3):659-61.
  29. An Y, Duan H. The role of m6A RNA methylation in cancer metabolism. Mol Cancer. 2022;21(1):14.
  30. Mazzieri A, Porcellati F, Timio F, Reboldi G. Molecular targets of novel therapeutics for diabetic kidney disease: a new era of nephroprotection. Int J Mol Sci. 2024;25(7):3969.
  31. Breyer MD, Susztak K. The next generation of therapeutics for chronic kidney disease. Nat Rev Drug Discov. 2016;15(8):568-88.
  32. Leoncini G, et al. Blood pressure reduction and RAAS inhibition in diabetic kidney disease: therapeutic potentials and limitations. J Nephrol. 2020;33(5):949-63.
  33. Pofi R, et al. Diabetic nephropathy: focus on current and future therapeutic strategies. Curr Drug Metab. 2016;17(5):497-502.
  34. Arellano Buendía AS, et al. Immunomodulatory effects of the nutraceutical garlic derivative allicin in the progression of diabetic nephropathy. Int J Mol Sci. 2018;19(10):3107.
  35. Zhang X, Agborbesong E, Li X. The role of mitochondria in acute kidney injury and chronic kidney disease and its therapeutic potential. Int J Mol Sci. 2021;22(20):11253.
  36. Liu Y, et al. DsbA-L interacting with catalase in peroxisome improves tubular oxidative damage in diabetic nephropathy. Redox Biol. 2023;66:102855.
  37. Zhong Y, et al. Jujuboside A ameliorates high fat diet and streptozotocin induced diabetic nephropathy via suppressing oxidative stress, apoptosis, and enhancing autophagy. Food Chem Toxicol. 2022;159:112697.
  38. Zhong Y, et al. Dioscin relieves diabetic nephropathy via suppressing oxidative stress and apoptosis, and improving mitochondrial quality and quantity control. Food Funct. 2022;13(6):3660-73.
  39. Issac PK, et al. Protective effect of morin by targeting mitochondrial reactive oxygen species induced by hydrogen peroxide demonstrated at a molecular level in MDCK epithelial cells. Mol Biol Rep. 2022;49(6):4269-79.
  40. Abo El-Asrar M, Ismail EAR, Elnhrawy AM, Thabet RA. Fatty acid binding protein 1 (FABP1) and fatty acid binding protein 2 (FABP2) as a link between diabetic nephropathy and subclinical atherosclerosis in children and adolescents with type 1 diabetes. J Diabetes Complications. 2023;37(3):108414.
  41. Gholaminejad A, Fathalipour M, Roointan A. Comprehensive analysis of diabetic nephropathy expression profile based on weighted gene co-expression network analysis algorithm. BMC Nephrol. 2021;22(1):245.
  42. Tanaka M, et al. Urinary fatty acid-binding protein 4 is a promising biomarker for glomerular damage in patients with diabetes mellitus. J Diabetes Investig. 2025;16(4):670-9.
  43. Liu Y, et al. Gastric cancer adapts high lipid microenvironment via suppressing PPARG-FABP1 axis after arriving in the lymph node. Redox Biol. 2025;85:103759.
  44. Borús DL, et al. Fatty acid binding protein 1 (FABP1) depletion promotes an oxidative metabolic shift in Caco-2 colorectal cancer cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 2025;1870(7):159661.
  45. Chu Y, et al. Glutathione peroxidase-1 overexpression reduces oxidative stress, and improves pathology and proteome remodeling in the kidneys of old mice. Aging Cell. 2020;19(6):e13154.
  46. Zhang F, et al. Mesenchymal stem cells alleviate rat diabetic nephropathy by suppressing CD103+ DCs-mediated CD8+ T cell responses. J Cell Mol Med. 2020;24(10):5817-31.
  47. Cao Q, et al. Renal F4/80+ CD11c+ mononuclear phagocytes display phenotypic and functional characteristics of macrophages in health and in adriamycin nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2015;26(2):349-63.
  48. Zhou W, et al. The landscape of immune cell infiltration in the glomerulus of diabetic nephropathy: evidence based on bioinformatics. BMC Nephrol. 2022;23(1):303.
  49. Bloch K, Shichman E, Vorobeychik M, Bloch D, Vardi P. Catalase expression in pancreatic alpha cells of diabetic and non-diabetic mice. Histochem Cell Biol. 2007;127(2):227-32.
  50. Zhao Y, et al. Taxifolin attenuates diabetic nephropathy in streptozotocin-induced diabetic rats. Am J Transl Res. 2018;10(4):1205-10.
  51. Ding S, Wang W, Song X, Ma H. Based on network pharmacology and molecular docking to explore the underlying mechanism of Huangqi Gegen Decoction for treating diabetic nephropathy. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:9928282.
  52. Guo S, et al. Correction: Eriodictyol: a review of its pharmacological activities and molecular mechanisms related to ischemic stroke. Food Funct. 2023;14(10):4949.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Dysfunkcja mitochondriówróżnicowa ekspresjamodele uczenia maszynowegowzbogacenie funkcjonalneinfiltracja immunologicznadokowanie molekularnefunkcja rybosomów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.