To badanie wprowadza strategie chemogenową i opartą na świetle fioletowym, aby umożliwić niezawodne przesunięcie fazy dobowej w ciągu dnia.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wywoływanie przesunięć fazy dobowej za pomocą metod chemogenetycznych i spektralnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
U ssaków przesuwanie fazy circadiannej w ciągu dnia jest ograniczone przez zmniejszoną światłoczułość jądra nadkomorowego (SCN), co ogranicza możliwość eksperymentalnej manipulacji zegarem circadiannym w tej fazie. Niezawodne metody indukowania przesunięć fazowych w ciągu dnia są zatem niezbędne do badania mechanizmów plastyczności circadiannej i synchronizacji świetlnej. Opisano uzupełniające strategie genetyczne i spektralne, aby umożliwić trwałe, czasowo precyzyjne manipulowanie zegarem circadiannym w ciągu dnia. Pierwsze podejście, obecnie ograniczone do myszy, wykorzystuje strategię chemiogenetyczną z użyciem dożylnej dostarczenia ekskluzywnie aktywowanych przez projektowane leki receptorów (DREADDs) do selektywnej aktywacji światłoczułych ganglionów siatkówki (ipRGC). To podejście umożliwia kontrolowane aktywowanie szlaku wzrokowo-podwzgórzowego i indukuje powtarzalne przesunięcia fazowe w ciągu dnia niezależne od warunków oświetlenia otoczenia. Drugie podejście wykorzystuje stymulację optyczną o określonej długości fali jako nieinwazyjną alternatywę. Ekspozycja na fioletowe światło wykorzystuje spektralną wrażliwość ipRGC do zmniejszenia blokady depolaryzacji i promowania trwałego aktywowania, umożliwiając niezawodne resetowanie fazy w ciągu podmiotowego dnia. Metoda ta jest szeroko stosowana w systemach ssaków i nie wymaga manipulacji genetycznych ani interwencji farmakologicznej. Dostarczono szczegółowe protokoły dotyczące przygotowania eksperymentalnego, czasowania stymulacji, walidacji przesunięć fazowych przy użyciu aktywności lokomocyjnej oraz oceny aktywacji neuronów poprzez immunohistochemiczną analizę c-Fos. Kluczowe zagadnienia, w tym czasowanie circadianne, parametry stymulacji i kontrole eksperymentalne, są opisane, aby ułatwić powtarzalność. Razem, podejścia te zapewniają wszechstronne i eksperymentalnie uchwytne narzędzia do indukowania przesunięć fazowych circadiannych w ciągu dnia i umożliwiają bezpośrednie badanie mechanizmów leżących u podstaw circadiannej odpowiedzialności w ciągu dnia.
Wprowadzenie
Jądro nadchiasmatyczne (SCN), główny zegar cyrkulacyjny mózgu ssaków, koordynuje niezbędne codzienne rytmy w fizjologii i zachowaniach, w tym cykle snu i czuwania oraz wzorce żerowania. Aby zachować synchronizację ze środowiskiem zewnętrznym, SCN odbiera bezpośrednie bodźce świetlne z wrażliwych na światło ganjlionów siatkówki (ipRGC), które przekazują informacje o świetle z siatkówki, aby zsynchronizować wewnętrzne rytmy cyrkulacyjne ze słonecznym dniem1,2.
Definującą cechą systemów cyrkulacyjnych w różnych organizmach jest zależna od fazy zdolność do reagowania: ten sam bodziec do....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zwierzęce zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Stosowania (ASP-SLCR-01) Narodowego Instytutu Zdrowia Psychicznego (NIMH). Wszystko zostało zrobione, aby zminimalizować ból i zmniejszyć liczbę użytych zwierząt. Zastosowane narzędzia badawcze są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Strategia chemogenowcoa
- Zastrzyk wewnątrzgałkowy wirusa związanego z adenowirusem u myszy Opn4Cre/+
- Wyczyść i wysterylizuj podstawę stereotaktyczną i wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą odpowiednich procedur ster....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Myszy Opn4Cre/+ wykazujące ekspresję AAV-DREADD, które otrzymały sól fizjologiczną w CT4, nie wykazały istotnego przesunięcia fazy w aktywności biegania w kołowrotku (n = 5; Rycina 1B). W przeciwieństwie do nich, podanie CNO w CT4 wywołało istotne opóźnienie fazy rozpoczęcia aktywności (średnia ± SEM: 5,03 ± 0,48 h; n = 5; Rycina 1C, D), co dowodzi, że aktywacja DREADD w tym czasie okołodobowym przesuwa rytmy aktywności lokomotoryczne.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wyniki pokazują, że aktywowanie ipRGC podczas subiektywnej pory dziennej może indukować zmiany fazy cyrkadalnej u myszy, czyli czasu charakteryzującego się zmniejszoną wrażliwością na stymulację świetlną. Chemogenetyczne podejście umożliwiło selektywne aktywowanie ipRGC niezależnie od zewnętrznego światła i wywołało znaczne opóźnienia fazy w zachowaniu biegania na kole. Ta aktywność wywołała również ostre występowanie c-Fos w SCN, potwierdzając aktywację centralnego zegara cyrkadalnego. Te ustalenia wskazują, że silna st.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| AAV2-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | Wirusowy wektor zależny od Cre kodujący ekscytujący DREADD (hM3Dq) połączony z mCherry w celu selektywnej aktywacji ipRGC |
| Przeciwciało przeciwko c-Fos (monoklonalne królicze) | Cell Signaling Technology | 2250S | Pierwotne przeciwciało używane do wykrywania c-Fos jako markera aktywacji neuronów |
| Przeciwciało przeciwko tdTomato (kozie) | LSBio | LS-C340696 | Pierwotne przeciwciało używane do wykrywania ekspresji reportera mCherry/tdTomato |
| Niebieski sterownik LED | Thorlabs | LEDD1B | Zasilacz sterujący intensywnością i wydajnością niebieskiego diody LED |
| Niebieskie źródło światła LED | Thorlabs | M470L5 | Źródło LED emitujące niebieskie światło (λmax ≈ 470 nm) do stymulacji fotonicznej |
| Oprogramowanie ClockLab | Actimetrics | Wersja 6.0.53 | Oprogramowanie do pozyskiwania i analizy danych dotyczących aktywności lokomotorycznej rytmicznej |
| Klozapin-N-tlenek (CNO) | Sigma-Aldrich | C0832-5MG | Ligand stosowany do aktywacji receptorów DREADD hM3Dq in vivo |
| DAPI | Invitrogen | 62248 | Fluorescencyjne barwienie jąder komórkowych do oznaczania jąder komórek |
| Przeciwciało kozła przeciwko kozie Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21432 | Fluorescencyjne przeciwciało wtórne do wykrywania pierwotnych przeciwciał kóz |
| Przeciwciało kozła przeciwko królikowi Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Fluorescencyjne przeciwciało wtórne do wykrywania pierwotnych przeciwciał króliczych |
| Fluoromount-G | Invitrogen | 00-4958-02 | Środek montażowy stosowany do zachowania fluorescencji w sekcjach tkankowych |
| Oprogramowanie ImageJ (Fiji) | NIH | Wersja 2.16.0/1.54g | Oprogramowanie open-source do przetwarzania obrazu i analizy ilościowej |
| Myszy Opn4cre | The Jackson Laboratry | RRID:IMSR_JAX:035925 | Myszy używane do aktywacji chemiogennej |
| Fioletowy sterownik LED | Mightex | SLA-1000-2 | Zasilacz sterujący wyjściem fioletowej diody LED |
| Fioletowe źródło światła LED | Mightex | BLS-LCS-0385-04-22 | Źródło LED emitujące fioletowe światło (λmax ≈ 385 nm) do stymulacji o określonej długości fali |
| Myszy typu dzikiego | The Jackson Laboratry | Szczeniątko Jackson #101043 | Myszy używane do eksperymentu z fioletowym światłem |
Bibliografia
- Hattar S, Liao HW, Takao M, Berson DM, Yau KW. Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity. Science. 2002;295(5557):1065–70.
- Jones JR, Simon T, Lones L, Herzog ED. SCN VIP neurons are essential for normal light-mediated resetting of the circadian system. J Neurosci. 2018;38(37):7986–95.
- Coursey PJ. Daily light sensitivity rhythm in a rodent. Science. 1960;131:33–35.
- Kornhauser JM, Ginty DD, Greenberg ME, Mayo KE, Takahashi JS. Light entrainment and activation of signal transduction pathways in the SCN. Prog Brain Res. 1996;111:133–46.
- Ding JM, Weber ET, Faiman....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
