Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wywoływanie przesunięć fazy dobowej za pomocą metod chemogenetycznych i spektralnych

280 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71594

⸱

12 czerwca 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Section on Light and Circadian Rhythms, National Institute of Mental Health (NIMH), National Institutes of Health (NIH)

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie wprowadza strategie chemogenową i opartą na świetle fioletowym, aby umożliwić niezawodne przesunięcie fazy dobowej w ciągu dnia.

Streszczenie

U ssaków przesuwanie fazy circadiannej w ciągu dnia jest ograniczone przez zmniejszoną światłoczułość jądra nadkomorowego (SCN), co ogranicza możliwość eksperymentalnej manipulacji zegarem circadiannym w tej fazie. Niezawodne metody indukowania przesunięć fazowych w ciągu dnia są zatem niezbędne do badania mechanizmów plastyczności circadiannej i synchronizacji świetlnej. Opisano uzupełniające strategie genetyczne i spektralne, aby umożliwić trwałe, czasowo precyzyjne manipulowanie zegarem circadiannym w ciągu dnia. Pierwsze podejście, obecnie ograniczone do myszy, wykorzystuje strategię chemiogenetyczną z użyciem dożylnej dostarczenia ekskluzywnie aktywowanych przez projektowane leki receptorów (DREADDs) do selektywnej aktywacji światłoczułych ganglionów siatkówki (ipRGC). To podejście umożliwia kontrolowane aktywowanie szlaku wzrokowo-podwzgórzowego i indukuje powtarzalne przesunięcia fazowe w ciągu dnia niezależne od warunków oświetlenia otoczenia. Drugie podejście wykorzystuje stymulację optyczną o określonej długości fali jako nieinwazyjną alternatywę. Ekspozycja na fioletowe światło wykorzystuje spektralną wrażliwość ipRGC do zmniejszenia blokady depolaryzacji i promowania trwałego aktywowania, umożliwiając niezawodne resetowanie fazy w ciągu podmiotowego dnia. Metoda ta jest szeroko stosowana w systemach ssaków i nie wymaga manipulacji genetycznych ani interwencji farmakologicznej. Dostarczono szczegółowe protokoły dotyczące przygotowania eksperymentalnego, czasowania stymulacji, walidacji przesunięć fazowych przy użyciu aktywności lokomocyjnej oraz oceny aktywacji neuronów poprzez immunohistochemiczną analizę c-Fos. Kluczowe zagadnienia, w tym czasowanie circadianne, parametry stymulacji i kontrole eksperymentalne, są opisane, aby ułatwić powtarzalność. Razem, podejścia te zapewniają wszechstronne i eksperymentalnie uchwytne narzędzia do indukowania przesunięć fazowych circadiannych w ciągu dnia i umożliwiają bezpośrednie badanie mechanizmów leżących u podstaw circadiannej odpowiedzialności w ciągu dnia.

Wprowadzenie

Jądro nadchiasmatyczne (SCN), główny zegar cyrkulacyjny mózgu ssaków, koordynuje niezbędne codzienne rytmy w fizjologii i zachowaniach, w tym cykle snu i czuwania oraz wzorce żerowania. Aby zachować synchronizację ze środowiskiem zewnętrznym, SCN odbiera bezpośrednie bodźce świetlne z wrażliwych na światło ganjlionów siatkówki (ipRGC), które przekazują informacje o świetle z siatkówki, aby zsynchronizować wewnętrzne rytmy cyrkulacyjne ze słonecznym dniem1,2.

Definującą cechą systemów cyrkulacyjnych w różnych organizmach jest zależna od fazy zdolność do reagowania: ten sam bodziec dostarczony o różnych godzinach cyrkulacyjnych może wywoływać znacznie różne efekty. U ssaków nocne światło niezawodnie indukuje zmiany fazy zegara SCN, podczas gdy ekspozycja w subiektywnym dniu powoduje niewielką lub żadną resetację3,4. Ta pozorna niewrażliwość na dzień była konsekwentnie obserwowana zarówno w preparatach in vivo, jak i in vitro , gdzie próby naśladowania bodźców świetlnych nie powodowały istotnych zmian fazy5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16.

Niewrażliwość na dzień została przypisana, przynajmniej częściowo, do niewystarczającego napędu siatkówkowego do zaangażowania mechanizmów resetujących fazę, obok mechanizmów bramkowania cyrkulacyjnego wewnątrz SCN. Zgodnie z tym pomysłem, ipRGC nie są jednolicie reaktywne w warunkach fotopicznych; podzbiór wchodzi w blok depolaryzacji, ograniczając trwałe wyładowanie potencjałów akcji17,18,19. Ta fizjologiczna ograniczona może zmniejszyć skuteczność konwencjonalnej stymulacji świetlnej w ciągu dnia. Pokonywanie tej ograniczenia umożliwiłoby bezpośrednie badanie plastyczności zegara dziennego, fazy tradycyjnie uważanej za niewrażliwą na resetowanie świetlne.

Opisano dwie komplementarne metodologie, które umożliwiają mocne przesunięcie fazy zegara cyrkulacyjnego w subiektywnym dniu. Pierwsze podejście wykorzystuje strategię chemogenową do selektywnej aktywacji ipRGC niezależnie od warunków oświetlenia otoczenia. W szczególności myszy Opn4Cre/+ otrzymują dożylne wstrzyknięcia adeno-związanego wirusa (AAV) kodującego ekscytujący Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADD), hM3Dq, w sposób zależny od Cre. Podanie klozapindy-N-tlenek (CNO) o godzinie cyrkulacyjnej 4 (CT4) wywołuje wyładowania przypominające bursztynowe wyładowania ipRGC, zapewniając trwałe aktywowanie szlaku retino-podwzgórzowego19. Przesunięcia faz są ilościowo oceniane za pomocą zapisów aktywności ruchowej, a aktywność molekularna w SCN jest oceniane za pomocą immunohistochemii c-Fos.

Drugie podejście wykorzystuje stymulację optyczną o określonej długości fali jako nieinwazyjną strategię o szerszym zastosowaniu. Myszy dzikiego typu są narażone na fioletowe światło (385 nm) o godzinie cyrkulacyjnej 6 (CT6), w środku subiektywnego dnia. Fioletowe światło powoduje zmniejszony blok depolaryzacji i wspiera trwałe aktywowanie ipRGC w porównaniu do światła niebieskiego lub białego19. Przesunięcia faz są ilościowo oceniane zgodnie z wyżej opisanymi metodami.

Obie metody mają na celu wzmocnienie sygnalizowania ipRGC do SCN, a tym samym pokonanie zmniejszonej wrażliwości świetlnej charakterystycznej dla subiektywnego dnia. Razem te metodologie zapewniają mocne, eksperymentalnie nadające się do manipulacji strategie dla sterowania zegarem cyrkulacyjnym w fazie tradycyjnie odpornej na resetowanie świetlne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zwierzęce zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Stosowania (ASP-SLCR-01) Narodowego Instytutu Zdrowia Psychicznego (NIMH). Wszystko zostało zrobione, aby zminimalizować ból i zmniejszyć liczbę użytych zwierząt. Zastosowane narzędzia badawcze są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Strategia chemogenowcoa

  1. Zastrzyk wewnątrzgałkowy wirusa związanego z adenowirusem u myszy Opn4Cre/+
    1. Wyczyść i wysterylizuj podstawę stereotaktyczną i wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą odpowiednich procedur sterylizacji. Skonfiguruj aparat do wstrzykiwań i podłącz szklany wstrzykiwacz.
    2. Znieczulić mysz za pomocą izofluranu. Ustaw przepływ tlenu na około 1,5 L/min. Dostosuj izofluran do 3%–5% w celu indukcji i zmniejsz do 1–3% na potrzeby utrzymania podczas całego zabiegu.
    3. Weryfikuj odpowiednie znieczulenie za pomocą szczypania palca. Uważa się, że zwierzę jest w pełni znieczulone, gdy nie zaobserwuje się wycofania się ani skurczowego odruchu.
    4. Umieść mysz na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała podczas całego zabiegu.
    5. Wyciągnij igły kapilarne ze szkła. Igły zostały oznakowane na 2,0 mm od końca za pomocą drobnego markera pod mikroskopem stereoskopowym, aby zapewnić jednolitą głębokość wnikania.
    6. Delikatnie naciśnij dolną powiekę za pomocą tępych kleszczy, aby lekko wysunąć gałkę oczną i odsłonić grzbietowy limbus. Używając dostępu grzbietowego, włóż igłę stycznie do powierzchni oka i przekłuj twardówkę 0,5–1 mm powyżej limbus, unikając naczyniowych regionów limbus.
      UWAGA: Maści okulistycznej nie stosuje się podczas zastrzyków wewnątrzgałkowych u myszy, ponieważ może zanieczyścić lub zablokować igłę wstrzykiwacza, zostać przypadkowo wprowadzoną do jamy szklistych, powodując uszkodzenie tkanek i zwiększyć ryzyko infekcji lub stanu zapalnego w gałce ocznej.
    7. Włóż igłę do komory szklistej na wstępnie ustaloną głębokość. Wycofaj lekko, aby złagodzić ciśnienie wewnątrzgałkowe i zapobiec zablokowaniu końcówki igły przez tkankę.
    8. Wstrzyknij całkowitą objętość 1,5 µL roztworu AAV (w koncentracji 2,4 x 1013 GC/ml), dostarczając jako pięć kolejnych wstrzyknięć po 300 nL każde (z szybkością 50 nl/s). Zrobić 10-sekundową przerwę między wstrzyknięciami, aby umożliwić dyfuzję i zminimalizować refluks. Po ostatnim wstrzyknięciu poczekać 30 s, zanim powoli wycofamy igłę. Powtórz ten sam proces w przeciwległym oku, stosując identyczne parametry, dbac o minimalizację urazu i refluksu.
    9. Podaj ketoprofen (10 mg/kg podskórnie) natychmiast po zabiegu.
    10. Pozwól myszom odzyskać siły przez co najmniej 2 tygodnie, aby zapewnić odpowiednią ekspresję wirusa przed przeniesieniem ich do centrum badań nad zachowaniem.
  2. Aktywność na kołowrotku i podawanie CNO (Rysunek 1A)
    1. Mieszczą myszy indywidualnie w klatkach wyposażonych w koła do biegania. Rejestruj aktywność na kołowrotku za pomocą zautomatyzowanego systemu akwizycji danych.
    2. Wytrenuj myszy do 12:12 h cyklu światło–cień przez 4–7 dni. Potwierdź stabilne wytrenowanie, a następnie przenieś zwierzęta do stałej ciemności (DD).
    3. Wyznacz początek aktywności za pomocą oprogramowania analitycznego. Zdefiniuj początek aktywności jako CT12 u gryzoni nocnych. Oblicz CT4 odpowiednio.
    4. W dniu 8 w DD, myszy otrzymują dootrzewnowe wstrzyknięcia CNO (1 mg/kg) lub fizjologicznego roztworu soli w CT4 w słabym czerwonym świetle.
    5. Przenieś zwierzęta do swoich domowych klatki i utrzymuj je w stałej ciemności. Rejestruj aktywność ruchomią ciągle przez 8 dni.
    6. Wyznacz początki aktywności i wykonaj analizę regresji na okresy przed i po wstrzyknięciu. Oblicz przesunięcia faz jako różnicę między przewidzianym i obserwowanym początkiem aktywności.
  3. Imunohistochemia c-Fos SCN po aktywacji chemogenowcoa
    1. Wytrenuj myszy do 12:12 h cyklu światło–cień i zwolnij je do stałej ciemności. Drugiego dnia w DD, podaj CNO w CT6. Przetnij zwierzęta 30 min po wstrzyknięciu.
      Uwaga: CT4 był używany w eksperymentach behawioralnych, aby zminimalizować możliwość, że efekty CNO przedłużają się do subiektywnej nocy, ponieważ CNO może pozostawać aktywny przez kilka godzin. W przeciwieństwie do tego, CT6 był używany w eksperymentach immunohistochemicznych w celu oceny ostrych efektów CNO na zegar biologiczny, zwierzęta przetnięte

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Myszy Opn4Cre/+ wykazujące ekspresję AAV-DREADD, które otrzymały sól fizjologiczną w CT4, nie wykazały istotnego przesunięcia fazy w aktywności biegania w kołowrotku (n = 5; Rycina 1B). W przeciwieństwie do nich, podanie CNO w CT4 wywołało istotne opóźnienie fazy rozpoczęcia aktywności (średnia ± SEM: 5,03 ± 0,48 h; n = 5; Rycina 1C, D), co dowodzi, że aktywacja DREADD w tym czasie okołodobowym przesuwa rytmy aktywności lokomotoryczne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wyniki pokazują, że aktywowanie ipRGC podczas subiektywnej pory dziennej może indukować zmiany fazy cyrkadalnej u myszy, czyli czasu charakteryzującego się zmniejszoną wrażliwością na stymulację świetlną. Chemogenetyczne podejście umożliwiło selektywne aktywowanie ipRGC niezależnie od zewnętrznego światła i wywołało znaczne opóźnienia fazy w zachowaniu biegania na kole. Ta aktywność wywołała również ostre występowanie c-Fos w SCN, potwierdzając aktywację centralnego zegara cyrkadalnego. Te ustalenia wskazują, że silna st...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują członkom SLCR w NIMH oraz Johns Hopkins Biology Mouse Tri-Lab za pomocne dyskusje. Źródła finansowania: Grant Narodowego Instytutu Zdrowia Psychicznego  ZIAMH002964 (S.H.)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AAV2-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherryAddgene44361Wirusowy wektor zależny od Cre kodujący ekscytujący DREADD (hM3Dq) połączony z mCherry w celu selektywnej aktywacji ipRGC
Przeciwciało przeciwko c-Fos (monoklonalne królicze)Cell Signaling Technology2250SPierwotne przeciwciało używane do wykrywania c-Fos jako markera aktywacji neuronów
Przeciwciało przeciwko tdTomato (kozie)LSBioLS-C340696Pierwotne przeciwciało używane do wykrywania ekspresji reportera mCherry/tdTomato
Niebieski sterownik LEDThorlabsLEDD1BZasilacz sterujący intensywnością i wydajnością niebieskiego diody LED
Niebieskie źródło światła LEDThorlabsM470L5Źródło LED emitujące niebieskie światło (λmax ≈ 470 nm) do stymulacji fotonicznej
Oprogramowanie ClockLabActimetricsWersja 6.0.53Oprogramowanie do pozyskiwania i analizy danych dotyczących aktywności lokomotorycznej rytmicznej
Klozapin-N-tlenek (CNO)Sigma-AldrichC0832-5MGLigand stosowany do aktywacji receptorów DREADD hM3Dq in vivo
DAPIInvitrogen62248Fluorescencyjne barwienie jąder komórkowych do oznaczania jąder komórek
Przeciwciało kozła przeciwko kozie Alexa Fluor 555InvitrogenA21432Fluorescencyjne przeciwciało wtórne do wykrywania pierwotnych przeciwciał kóz
Przeciwciało kozła przeciwko królikowi Alexa Fluor 488InvitrogenA21206Fluorescencyjne przeciwciało wtórne do wykrywania pierwotnych przeciwciał króliczych
Fluoromount-GInvitrogen00-4958-02Środek montażowy stosowany do zachowania fluorescencji w sekcjach tkankowych
Oprogramowanie ImageJ (Fiji)NIHWersja 2.16.0/1.54gOprogramowanie open-source do przetwarzania obrazu i analizy ilościowej
Myszy Opn4creThe Jackson LaboratryRRID:IMSR_JAX:035925Myszy używane do aktywacji chemiogennej
Fioletowy sterownik LEDMightexSLA-1000-2Zasilacz sterujący wyjściem fioletowej diody LED
Fioletowe źródło światła LEDMightexBLS-LCS-0385-04-22Źródło LED emitujące fioletowe światło (λmax ≈ 385 nm) do stymulacji o określonej długości fali
Myszy typu dzikiegoThe Jackson LaboratrySzczeniątko Jackson #101043Myszy używane do eksperymentu z fioletowym światłem

Bibliografia

  1. Hattar S, Liao HW, Takao M, Berson DM, Yau KW. Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity. Science. 2002;295(5557):1065–70.
  2. Jones JR, Simon T, Lones L, Herzog ED. SCN VIP neurons are essential for normal light-mediated resetting of the circadian system. J Neurosci. 2018;38(37):7986–95.
  3. Coursey PJ. Daily light sensitivity rhythm in a rodent. Science. 1960;131:33–35.
  4. Kornhauser JM, Ginty DD, Greenberg ME, Mayo KE, Takahashi JS. Light entrainment and activation of signal transduction pathways in the SCN. Prog Brain Res. 1996;111:133–46.
  5. Ding JM, Weber ET, Faiman LE, Rea MA, Gillette MU. Resetting the biological clock: mediation of nocturnal circadian shifts by glutamate and NO. Science. 1994;266(5191):1713.
  6. Mintz EM, Gillespie CF, Price KM, Albers HE. Activation of NMDA receptors in the suprachiasmatic nucleus produces light-like phase shifts of the circadian clock in vivo. J Neurosci. 1999;19(12):5124–30.
  7. Shirakawa T, Moore RY. Glutamate shifts the phase of the circadian neuronal firing rhythm in the rat suprachiasmatic nucleus in vitro. Neurosci Lett. 1994;178(1):47–50.
  8. Shibata S, Watanabe A, Hamada T, Ono M, Watanabe S. N-methyl-D-aspartate induces phase shifts in circadian rhythm of neuronal activity of rat SCN in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 1994;267(2):R360–R364.
  9. Asai M, Yamaguchi S, Isejima H, Jonouchi M, Moriya T, et al. Visualization of mPer1 transcription in vitro: NMDA induces a rapid phase shift of mPer1 gene in cultured SCN. Curr Biol. 2001;11(19):1524–27.
  10. Sladek M, Sumova A. Modulation of NMDA-mediated clock resetting in the suprachiasmatic nuclei of mPer2 (Luc) mouse by endocannabinoids. Front Physiol. 2019;10:361.
  11. Shibata S, Moore RY. Neuropeptide Y and optic chiasm stimulation affect suprachiasmatic nucleus circadian function in vitro. Brain Res. 1993;615(1):95–100.
  12. Jones JR, Tackenberg MC, McMahon DG. Manipulating circadian clock neuron firing rate resets molecular circadian rhythms and behavior. Nat Neurosci. 2015;18(3):373–75.
  13. Kim S, McMahon DG. Light sets the brain’s daily clock by regional quickening and slowing of the molecular clockworks at dawn and dusk. Elife. 2021;10:e70137.
  14. de Vries MJ, Treep JA, de Pauw ES, Meijer JH. The effects of electrical stimulation of the optic nerves and anterior optic chiasm on the circadian activity rhythm of the Syrian hamster: involvement of excitatory amino acids. Brain Res. 1994;642(1-2):206–12.
  15. Rusak B, Groos G. Suprachiasmatic stimulation phase shifts rodent circadian rhythms. Science. 1982;215(4538):1407–09.
  16. Duy PQ, Komal R, Richardson ME, Hahm KS, Fernandez DC, et al. Light has diverse spatiotemporal molecular changes in the mouse suprachiasmatic nucleus. J Biol Rhythms. 2020;35(6):576–87.
  17. Liu A, Milner ES, Peng YR, Blume HA, Brown MC, et al. Encoding of environmental illumination by primate melanopsin neurons. Science. 2023;379(6630):376–81.
  18. Milner ES, Do MTH. A population representation of absolute light intensity in the mammalian retina. Cell. 2017;171(4):865–876.e16.
  19. Komal R, Beier C, Nath A, et al. ipRGC properties prevent light from shifting the SCN clock during daytime. Nature. 2026;650(8103):942–50. .
  20. Jewett ME, Rimmer DW, Duffy JF, Klerman EB, Kronauer RE, et al. Human circadian pacemaker is sensitive to light throughout subjective day without evidence of transients. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 1997;273(5):R1800–R1809.
  21. Revell VL, Molina TA, Eastman CI. Human phase response curve to intermittent blue light using a commercially available device. J Physiol. 2012;590(19):4859–68.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Aktywacja chemogenetycznastymulacja spektralnadroga siatk wkowo podwzg rzowawewn trznie wiat oczu e kom rki zwojowe siatk wkiaktywacja DREADDsstymulacja wiat em fioletowymimmunohistochemia c Fosaktywno lokomotorycznaplastyczno oko odobowa
Wywoływanie przesunięć fazy dobowej za pomocą metod chemogenetycznych i spektralnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.