Budowa i wszczepienie systemu mikroinfuzyjnego do ciągłego dostarczania środków neuroaktywnych.

Podsumowanie

W miarę jak neuronauka staje się coraz bardziej wyrafinowana, badanie struktur i obwodów mózgu wymaga poprawy poziomu dokładności i wyższej rozdzielczości. Opracowaliśmy metodę przygotowania i implantacji przewlekłego systemu infuzyjnego w obrębie mózgu z wykorzystaniem mikrokaniuli borokrzemianowej o średnicy końcówki 50 mikronów.

Streszczenie

Ciągłe dostarczanie środków neuroaktywnych jest szeroko stosowane w neurobiologii, ale wiąże się z wieloma wyzwaniami technicznymi. Konieczne jest dostarczenie środka z dużą precyzją przy jednoczesnej minimalizacji miejscowego urazu i stanu zapalnego. Pożądana jest również możliwość dostosowania systemu do zwierząt różnych gatunków i rozmiarów. Ta prezentacja wideo demonstruje budowę systemu infuzyjnego, który może być dopasowany do każdego konkretnego zwierzęcia badawczego. Średnica mikrokaniuli jest około 10-krotnie mniejsza niż w przypadku większości obecnie stosowanych kaniul infuzyjnych. Przekłada się to na zwiększoną dokładność i zmniejszenie urazów badanego obszaru mózgu. Kaniulę podającą można również wyprofilować tak, aby pasowała do konturu powierzchni czaszki zwierzęcia, umożliwiając w ten sposób dokładne zamknięcie nacięcia skóry głowy nad systemem infuzyjnym, wykluczając potrzebę stosowania cokołu montowanego na czaszce, zmniejszając ryzyko infekcji i zapewniając zwierzęciu większy poziom komfortu. System jest montowany w środowisku wolnym od powietrza i wymaga od badacza stworzenia szklanych mikropipet ze źródłem ciepła. Te metody budowy wymagają specjalnych umiejętności, które najlepiej nabyć, jeśli nie osobiście, za pomocą instrukcji wideo. (Ten artykuł jest oparty na pracy po raz pierwszy opisanej w J Neurosci Methods. 2008, 30 stycznia; 167(2):213-20. EPUB 2007, 28 sierpnia).

Protokół

Wprowadzenie

Bezpośrednia infuzja środków neuroaktywnych pozwala na badanie określonych obszarów mózgu, omijając barierę krew-mózg. Zastosowania tego podejścia w neuronauce są zróżnicowane i obejmują zmianę poziomu aktywności mózgu w dyskretnych podregionach (Berretta i wsp., 2004; Gliddon i wsp., 2005; Kim i wsp., 2000), badając działanie środków psychotropowych (Clinton i wsp., 2006; Di Benedetto i wsp., 2004), dostarczając kontrolowanych modeli zapalenia mózgu (Hauss-Węgrzyniak i wsp., 1998; Marchalant i wsp., 2007; Rosi i wsp., 2004), badając mechanizmy uzależnienia (Kim i wsp., 2005; Lockman i wsp., 2005; Zhang i wsp., 2006) oraz umożliwienie długoterminowego podawania czynników troficznych (Naert i wsp., 2006; Radecki i wsp., 2005; Takahashi i wsp., 2006).

Standardowe metody przewlekłego dostarczania środków często wykorzystują mini-pompę osmotyczną (np. ALZET Osmotic Pumps, Cupertino, CA) załadowaną środkiem neuroaktywnym, który jest dostarczany do mózgu przez kaniulę ze stali nierdzewnej o średnicy, która może wahać się od 0,25 mm (Williams et al., 1987) do 0,5 mm, ale najczęściej wynosi około 0,3 mm (Plastics One, Roanoke, Wirginia ; patrz rys. 6A). Podczas gdy kaniule porodowe tego rozmiaru mogą być odpowiednie do wielu zastosowań, w których nie jest wymagany wysoki poziom precyzji, a uraz mikrośrodowiska nie stanowi poważnego problemu, kaniule te są nieoptymalne do dostarczania środków do małych, delikatnych miejsc, w których kaniula jest porównywalna pod względem wielkości (lub większa) niż sama struktura docelowa, lub w przypadku gdy funkcja nie może być zagrożona przez traumatyczną zniewagę.

Przedstawiona tutaj jest metoda przygotowania i wszczepienia przewlekłego systemu infuzyjnego do dostarczania środków neuroaktywnych do mózgu za pomocą "mikrokaniuli" o znacznie zmniejszonej średnicy końcówki. Technika ta pozwala na celowanie w małe podstruktury i zmniejsza uraz w obszarze zainteresowania. Obecna procedura jest zatem nauczana jako alternatywa dla konwencjonalnych metod dla badaczy, którzy chcą zminimalizować zakłócenia w badanym obszarze mózgu.

Materiały i metody

Zwierzęta i design

Osiemnaście dorosłych (400-450 g) samców szczurów rasy Sprague-Dawley zostało wykorzystanych do zademonstrowania procedury i przetestowania funkcji obecnej metody. Dwunastu zwierzętom wszczepiono systemy mikroinfuzji i przyczyniono się do oceny w czasie trwania funkcji przez 4 dni. Sześć zwierząt wykorzystano do porównania poziomu urazu i reaktywnej glejozy 5 dni po wszczepieniu standardowej kaniuli podawczej 28 ga (N = 3) lub mikrokaniuli (N = 3) podłączonej do minipompy osmotycznej wypełnionej solą fizjologiczną. Zwierzęta trzymano w przezroczystych plastikowych klatkach i utrzymywano w 12-godzinnym harmonogramie światła/ciemności, z jedzeniem i wodą dostarczaną ad libitum. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Szpitalu McLean, zgodnie z obowiązującymi federalnymi i lokalnymi wytycznymi dotyczącymi eksperymentalnego wykorzystania zwierząt.

Zespół systemu mikroinfuzji

Rysunek 1 ilustruje komponenty i montaż systemu mikroinfuzji. Zalecamy wykonanie i wszczepienie systemu techniką sterylną. Ponadto, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do systemu, jest on montowany w zanurzeniu w kąpieli solankowej. Do przeprowadzenia niniejszych testów wykorzystano minipompy osmotyczne (MOP) (ALZET, model #1002, Cupertino, CA) o czasie trwania 14 dni, natężeniu przepływu 0,25 μL/h i pojemności napełniania 98,6 μL. Ponieważ jednak nadmierne natężenie przepływu może zalać mniejsze obszary zainteresowania w mózgu i spowodować uszkodzenia strukturalne, szybkość przepływu w tych badaniach została zmniejszona do 0,125 μl / godz. poprzez pokrycie połowy MOP parafiną zgodnie z instrukcjami producenta. W celu oceny miejscowego urazu MOPy wypełniono sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Do oceny trwałej funkcji systemów mikroinfuzji wybrano Fast Green (1% w soli fizjologicznej, Fisher Scientific, Park Lane Pittsburgh, PA) jako roztwór testowy ze względu na jego niską toksyczność, zdolność do dyfuzji w żywotnej tkance mózgowej oraz dlatego, że ma masę cząsteczkową (808,84) w górnej granicy zakresu dla "małych cząsteczek" (<1000), które są powszechnie interesujące w przewlekłej infuzji (np. muscymol, pikrotoksyna, fluoksetyna itp.).

Rysunek 1: Montaż systemu do mikroinfuzji. (A) Części składowe systemu umieszczone w odpowiednich pozycjach do montażu. Zwróć uwagę, że kołnierz rurki modulatera przepływu został oderwany. Zalecamy zabezpieczenie drutu wyrównującego tuż przed implantacją (patrz tekst). (B) Zmontowany system mikroinfuzji przed założeniem drutu wyrównującego i implantacją.

Przygotowanie mikrokaniuli

Mikrokaniulę można wykonać za pomocą standardowego poziomego lub pionowego ściągacza elektrod (Stoelting Co., Wood Dale, IL) z ustawieniami do produkcji elektrody szklanej z długim, delikatnie zwężającym się trzpieniem (Rys. 2A). Do tego celu nadają się rurki borokrzemianowe (część 1B100F-6, 1.0 mm, 6 cali; World Precision Instruments, Inc., Sarasota, Floryda), ponieważ ma stosunkowo niską temperaturę topnienia, co pozwala na późniejsze gięcie przy skupionym cieple. Najbardziej dystalną część prostej mikrokaniuli można przeciąć nożyczkami do preparowania lub wykonać kontrolowaną przerwę za pomocą mikrokleszczyków (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL), aby uzyskać pożądaną ostateczną średnicę końcówki (50 μm dla obecnych demonstracji), a mikrometr stolikowy mikroskopu jest przydatny do prowadzenia i potwierdzania pożądanej średnicy. Przyciętą końcówkę można krótko podgrzać lub "wypolerować ogniowo", aby usunąć szorstkie lub ostre krawędzie. Cewka grzewcza ściągacza elektrod lub palnika Bunsena jest następnie używana do nałożenia kąta prostego na mikrokaniulę w określonej odległości od końcówki mikrokaniuli (rys. 2B) poprzez umieszczenie rurki borokrzemianowej w wężownicy grzewczej (lub płomieniu Bunsena) i przyłożenie delikatnej siły do dystalnej części za pomocą kleszczy podczas podgrzewania rurki. Z góry określona długość mikrokaniuli dystalnie do wymuszonego kąta prostego jest ustalana na podstawie głębokości obszaru mózgu, który ma być docelowy (np. 5 mm) oraz biorąc pod uwagę grubość czaszki (~1 mm) i odległość roboczą nad czaszką (np. 1-2 mm). Tak więc z góry określona odległość od końcówki mikrokaniuli do narzuconego kąta prostego dla obecnych demonstracji wynosiła 7-8 mm. Następnie ołówek diamentowy jest używany do cięcia rurki borokrzemianowej około 8 mm proksymalnie do kąta prostego.

Rysunek 2: Przygotowanie mikrokaniuli. (A) Ściągacz elektrod (Stoelting Co. Wood Dale, IL) służy do produkcji mikrokaniuli z długim, zwężającym się trzpieniem. (B) Wężownicę grzewczą można zmienić w celu ułatwienia użytkowania, a mikrokaniulę umieszcza się w wężownicy, umożliwiając uformowanie zagięcia pod kątem prostym za pomocą kleszczy podczas podgrzewania szklanej rurki.

Po wykonaniu pożądanej liczby mikrokaniul zalecamy sterylizację tlenkiem etylenu lub przy użyciu autoklawu. Najbardziej dystalna 1-2 mm mikrokaniuli może być pokolorowana sterylnym markerem chirurgicznym (lub trwałym tuszem przed sterylizacją), aby umożliwić łatwą wizualizację końcówki mikrokaniuli podczas zabiegu chirurgicznego.

przygotowanie MOP

MOPy zostały przygotowane zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko mówiąc, plastikowy kołnierz z rurki MOP ze stali nierdzewnej ("modulator przepływu") jest najpierw usuwany za pomocą nożyczek lub rongeursów. długość rurki polietylenowej (Plastics One, Roanoke, VA, #C312 VT; Średnica zewnętrzna, 1,22 mm; ID: 0,72 mm) mocuje się do obszaru rurki ze stali nierdzewnej wcześniej zajmowanego przez kołnierz (~4 mm) poprzez włożenie rurki ze stali nierdzewnej w światło rurki polietylenowej i zabezpieczenie odpowiednim klejem na zewnętrznym obwodzie połączenia. LumaBond (myNeuroLab, Inc., St. Louis, MO) jest szczególnie przydatny, ponieważ utwardza się w ciągu kilku sekund po wystawieniu na działanie skupionego światła (np. z lampy światłowodowej). Długość rurki powinna być zbliżona do odległości między podstawą czaszki zwierzęcia a najbardziej rostralną częścią łopatki (np. około 1,5-3,0 cm w przypadku szczurów laboratoryjnych). Pompa jest napełniana zgodnie z instrukcją, a rurka ALZET ze stali nierdzewnej, z długością rurki polietylenowej przymocowaną do jej końca, jest wkładana do napełnionej pompy. Niewielka objętość roztworu z pompy zostanie wtłoczona na zewnątrz interfejsu pompa-rurka (i powinna zostać wklepana), a także do proksymalnego obszaru rurki polietylenowej. Napełnioną pompę z dołączonym rurką inkubuje się następnie w sterylnym roztworze soli fizjologicznej przez 12 godzin w temperaturze 37°C. Jeśli pompa działa prawidłowo, po tym okresie inkubacji będzie widać, że płyn przemieścił się na kilka milimetrów w rurkach polietylenowych.

Budowa systemu mikroinfuzji

Pompa z dołączonym wężem jest zanurzona w 10 cm szalce Petriego zawierającej sterylną sól fizjologiczną, a pozostałe powietrze w rurkach polietylenowych jest usuwane za pomocą strzykawki wypełnionej tym samym roztworem, który znajduje się w pompie i która została wyposażona w rurkę o małej średnicy, którą można włożyć do rurki polietylenowej. W ten sposób roztwór można wstrzyknąć do rurki polietylenowej w celu zastąpienia powietrza. Podobnie mikrokaniulę zanurza się w kąpieli solankowej, a powietrze usuwa się przez wstrzyknięcie roztworu. Można to łatwo osiągnąć za pomocą drugiej strzykawki wypełnionej roztworem wyposażonej w elastyczną (np. silikonową) rurkę, która pasuje do dużego (proksymalnego) końca mikrokaniuli.

Bliższy koniec rurki borokrzemianowej jest następnie wkładany do rurki polietylenowej. Należy pamiętać, że może to wymagać rozszerzenia rurki polietylenowej poprzez mocne wciśnięcie zamkniętych końcówek mikrokleszczyków w światło, rozszerzając w ten sposób otwór w celu łatwego włożenia rurki borokrzemianowej. Bezpowietrzny system infuzyjny wyjmuje się następnie z kąpieli solankowej i umieszcza na sterylnej powierzchni i delikatnie suszy gazą lub wacikiem. Połączenie rurki mikrokaniula z polietylenem jest zabezpieczone obwodową warstwą kleju (np. LumaBond).

Jeśli system został prawidłowo zmontowany, a MOP nadal działa tak, jak powinien, podczas końcowego kroku tej procedury kropla roztworu zwykle pojawia się na końcu mikrokaniuli, ponieważ mechanizm osmotyczny w pompie jest kontynuowany podczas przygotowania. Natężenie przepływu MOP można proporcjonalnie zmniejszyć, pokrywając odpowiednią powierzchnię parafiną zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku obecnych demonstracji 50% każdego MOP zostało pokryte przez krótkie zanurzenie go w stopionej parafinie i pozostawienie do ostygnięcia, zmniejszając w ten sposób natężenie przepływu o połowę do 0,125 μl/h. Gotowy system do mikroinfuzji jest następnie zanurzany w sterylnym roztworze soli fizjologicznej i przechowywany w temperaturze 37°C do momentu implantacji.

Implantacja systemu mikroinfuzyjnego

System mikroinfuzji jest wszczepiany przy użyciu standardowych metod stereotaktycznych, jak opisano wcześniej (Cooley, 1990). Po przygotowaniu pola operacyjnego wierci się otwór na zadziory do wprowadzenia mikrokaniuli. W razie potrzeby czaszkowe mogą być również ustawione w celu ustabilizowania masy wiążącej używanej do mocowania mikrokaniuli. Związek używany w tym laboratorium (Geribond, Den-Mat Inc., Santa Maria, CA) nie wymaga dodatkowego kotwienia; Jednak powierzchnia czaszki musi być przygotowana przez oczyszczenie za pomocą wacika nasączonego acetonem. Na dystalnym końcu drutu wyrównującego wykonuje się "haczyk" o średnicy 1-2 mm (patrz rys. 1), dzięki czemu otacza on zagięcie w rurce borokrzemianowej. Następnie jest on zabezpieczany (za pomocą LumaBond) w orientacji wzdłuż tej samej osi, co dystalna część mikrokaniuli (która ma być wsunięta do mózgu, patrz ryc. 3B). System infuzyjny jest następnie montowany na nośniku stereotaktycznym (rys. 3), zaciskając drut wyrównujący na uchwycie. Sterylny szew służy do przywiązania pompy infuzyjnej do górnej części manipulatora stereotaktycznego, zawieszając ją w ten sposób i zapobiegając utracie orientacji podczas zabiegu z powodu ciężaru (i momentu obrotowego) pompy (ryc. 3B). Mikrokaniulę można następnie ustawić w żądanej orientacji (np. dokładnie w pionie) za pomocą kleszczy, aby delikatnie zgiąć drut wyrównujący dystalnie do zacisku nośnego. Końcówka mikrokaniuli jest umieszczana nad punktem odniesienia (np. bregma lub lambda), a następnie manewrowana do punktu wejścia do mózgu. Współrzędne użyte dla zwierząt w tych eksperymentach to: Bregma +0,2 mm, boczna 3,2 mm i brzuszna 5,0 mm poniżej opony twardej z głową zwierzęcia w pozycji płaskiej czaszki.

Po przesunięciu mikrokaniuli na odpowiednią głębokość w mózgu, system jest mocowany na miejscu za pomocą postumentu (np. Geribond). Cokół może być wyrzeźbiony blisko powierzchni czaszki, aby ułatwić zamknięcie rany. Po utwardzeniu mieszanki cokołowej (~2 min), drut wyrównujący jest cięty równo z cokołem za pomocą tarczy tnącej wiertarki. Niewielką ilość związku można użyć do pokrycia i wygładzenia pozostałego zadzioru z odciętego drutu. MOP jest następnie wprowadzany podskórnie, umieszczany między łopatkami zwierzęcia. Na koniec ranę przepłukuje się jałową solą fizjologiczną, a nacięcie zamyka się za pomocą szwów lub klipsów do ran (ryc. 3, panel D).

Rysunek 3: Implantacja systemu mikroinfuzyjnego. (A) Umieszczenie systemu mikroinfuzji na przyrządzie stereotaktycznym. (B) MOP jest uwiązany za pomocą sterylnego szwu, aby zapobiec zakłóceniu orientacji mikrokaniuli pod względem ciężaru. Mikrokaniula jest ustawiona w taki sposób, aby precyzyjnie wejść pionowo do mózgu za pomocą drutu wyrównującego. (C) System mikroinfuzji jest umieszczony w celu umieszczenia i utrwalenia w zwierzęciu. (D) Konstrukcja systemu mikroinfuzji umożliwia łatwe zamknięcie nacięcia na niskoprofilowym cokole, zmniejszając ryzyko infekcji i minimalizując dyskomfort zwierzęcia.

Przygotowanie i implantacja standardowego systemu infuzyjnego

Procedura przygotowania standardowego systemu infuzyjnego jest identyczna jak w przypadku systemu mikroinfuzyjnego, z wyjątkiem tego, że mikrokaniula została zastąpiona przez "kaniulę złącza pompy osmotycznej" o średnicy 300 μm (28 ga; Tworzywa sztuczne One, Roanoke, VA, #3300PM/SPC; patrz rys. 5a). Implantacja standardowego systemu jest również identyczna z implantacją systemu mikroinfuzyjnego, w tym zamocowanie drutu wyrównującego, aby umożliwić precyzyjne pionowe ustawienie kaniuli wejściowej do mózgu.

Histologia i analiza

Aby zbadać zdolność systemu mikroinfuzji do zapewnienia trwałego dostarczania Fast Green, grupy trzech zwierząt zostały uśmiercone po 12 godzinach, 1 dniu, 2 dniach i 4 dniach po operacji. Badani zostali głęboko znieczuleni pentobarbitalem sodu (120 mg / kg, ip) i przezsercowo perfuzji 200 ml 0,1M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), a następnie 400 ml 4% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym. Roztwory perfuzyjne utrzymywano w temperaturze 4°C, o pH 7,4 i perfundowano z szybkością 50 ml na minutę za pomocą pompy perystaltycznej. W celu usunięcia kaniul bez uszkodzenia tkanki pośmiertnej, perfundowane zwierzę umocowano w stereotaktycznej ramie, postument przymocowano klejem do sztywnego drutu przymocowanego do zacisku ramienia manipulatora, a czaszkę ostrożnie usunięto z okolic postumentu za pomocą wiertła dentystycznego. Cokół i leżąca pod nim kaniula zostały w ten sposób usunięte na tej samej trajektorii, na której kaniula została wysunięta do umieszczenia. Mózgi zostały następnie wyjęte z kalwarii i zanurzone na 12 godzin w tym samym utrwalaczu.

Do oceny długotrwałej infuzji Fast Green, odcinki o grubości 200 μm zostały wycięte za pomocą Vibratome (myNeuroLab, St. Louis, MO) i zamontowane na mokro na szkiełkach podstawowych. Reprezentatywne sekcje zostały zobrazowane za pomocą skanera Canon CanoScan LiDE 600F. W celu oceny miejscowego urazu i reaktywnej glejaku, skrawki wibratomu o grubości 70 μm zostały najpierw zamontowane na mokro i sfotografowane w stanie niebarwionym, aby zapobiec zniekształceniu tkanki, które może wystąpić podczas procesów histologicznych, takich jak suszenie, barwienie i odwodnienie. Te same sekcje pozostawiono następnie do wyschnięcia na szkiełkach pokrytych żelatyną, a następnie zabarwiono je hematoksyliną i eozyną (H&E), odwodniono stopniowanymi alkoholami i przykryto Permountem.

Sąsiadujące sekcje o wielkości 70 μm zostały poddane standardowej procedurze immunofluorescencji w celu wykrycia kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP), które ulega ekspresji przez astrocyty podczas procesu reaktywnego glejozy w odpowiedzi na uraz (Ding et al., 2000; Ma i wsp., 1991). Krótko mówiąc, swobodnie pływające skrawki przepłukiwano PBS i blokowano 10% normalną surowicą osła (NDS) i 3% albuminą surowicy bydlęcej w 0,1 M PBS z 0,3% Triton X-100 (PBS/Triton) przez godzinę, a następnie inkubowano w króliczym przeciwciałie anty-GFAP (1:500; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) w PBS/Triton z 1% NDS przez 12 godzin w temperaturze 4°C. Sekcje następnie przepłukano PBS i inkubowano z przeciwciałem drugorzędowym przeciwko ośliemu Fluor® 594 (1:500; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) w PBS z 5% NDS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Skrawki zostały ponownie dokładnie przepłukane PBS i wybarwione antybarwionym zielonym fluorescencyjnym barwnikiem Nissl NeuroTrace® (1:500 w PBS przez 5 minut; Sondy molekularne, Inc., Eugene, Oregon). Po ostatnim płukaniu PBS, sekcje zostały zamontowane na szkiełkach pokrytych żelatyną i przykryte sondami molekularnymi Slow-Fade (Molecular Probes). Wszystkie mikrofotografie zostały uzyskane przy użyciu mikroskopu Zeiss Axioskop z oprogramowaniem AxioVision (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY).

Wyniki

Badania in vitro

Przed oceną na zwierzętach, trzy systemy mikroinfuzji zostały przygotowane, umieszczając ich MOPy wypełnione Fast Green w jednej komorze (15 ml stożkowa probówka) i umieszczając ich mikrokaniule w drugiej komorze (1 ml probówka Eppendorfa), obie zawierające sterylną sól fizjologiczną w temperaturze 37°C. Każdy system wykazywał ciągły przepływ barwnika przez 12 godzin obserwacji. Rysunek 4 ilustruje działanie typowego systemu w ciągu 3 godzin.

Rysunek 4: Demonstracja in vitro funkcji systemu mikroinfuzyjnego. (A) Przepływ barwnika Fast Green jest łatwo widoczny bez przeszkód z mikrokaniuli na początku okresu badania in vitro. (B) W miarę kontynuowania przepływu roztwór w zbiorniku staje się nasycony (B) i ostatecznie nieprzezroczysty z zabarwieniem (C).

Ocena systemu mikroinfuzji in vivo

Po perfuzji, usunięte mikrokaniule i ich połączenia zostały dokładnie sprawdzone i okazało się, że wszystkie są całkowicie nienaruszone. Nie doszło więc do pęknięcia szkła borokrzemianowego w obrębie tkanki, ani do wad połączeń elementów układu. A 10 . Strzykawka Hamilton wypełniona solą fizjologiczną L z krótkim odcinkiem silikonowej rurki przymocowanej do igły została użyta do przyłożenia delikatnego przepływu do odciętego końca rurki polietylenowej przymocowanej do mikrokaniuli. Wszystkie dwanaście mikrokaniul pozwalało na ciągły przepływ i nie wydawało się być zatkane. Ponadto, po usunięciu każdego MOP od zwierząt, objętość pozostałego roztworu została zmierzona i stwierdzono, że jest odpowiednia do natężenia przepływu MOP (0,125 μL/h) i czasu, w którym mógł działać.

Dostawa in vivo

Ocena przekrojów koronalnych tkanki nasyconej Fast Green wykazała niewielką zmienność w dystrybucji między zwierzętami w obrębie grup w dowolnym punkcie czasowym (12 godzin, 1 dzień, 2 dni i 4 dni). Rysunek 5 ilustruje reprezentatywne obszary dyfuzji Fast Green w tych punktach czasowych wykazujących postępujący wzrost infiltracji barwnika w ciągu czterech dni. Należy zauważyć, że wcześniejsze eksperymenty z użyciem wyższych stężeń Fast Green (np. 5-15%) skutkowały szybkim zmętnieniem miąższu, co zaciemniało dokładną ocenę funkcji systemu mikroinfuzyjnego w czasie. Podczas gdy pełny zakres 1% dyfuzji barwnika może być trudny do dokładnego określenia na podstawie ogólnych oględzin, obszary infiltracji były łatwo dostrzegalne przy 2,5-krotnym powiększeniu i są oznaczone liniami przerywanymi na rysunku 5.

Rysunek 5: Demonstracja in vivo długotrwałej mikroinfuzji Fast Green. (A) Dwanaście godzin po doprążkowiowym umieszczeniu systemu mikroinfuzyjnego Fast Green, barwnik dyfunduje do miąższu otaczającego miejsce mikrokaniuli. Obserwacje po 1 dniu (B), 2 dniach (C) i 4 dniach (D) wskazują na ciągłe dostarczanie roztworu Fast Green ze zwiększającymi się obszarami infiltracji barwnika. Zewnętrzna granica dyfuzji została zaobserwowana pod mikroskopią małej mocy i jest tutaj oznaczona liniami przerywanymi. Podziałka, 2 mm.

Ocena traumy i glejozy reaktywnej

Ogólna obserwacja świeżo wyciętych, niebarwionych skrawków tkanek wykazała, że system mikroinfuzji spowodował zmniejszenie miejscowego urazu, w miejscu porodu. Niezmiennie zaobserwowano, że standardowa kaniula zakłóca i przemieszcza większy obszar tkanki (ryc. 6B i C), co jest lepiej doceniane przy wyższej mocy z H i E (ryc. 6D i E). Ponadto często obserwowano nagromadzenie krwi w standardowym miejscu infuzji (ryc. 6D), co sugeruje większy stopień naruszenia układu krwionośnego i sugeruje zmniejszoną integralność bariery krew-mózg.

System mikroinfuzji spowodował również znaczne zmniejszenie reaktywnej glejozy, czego dowodem jest zmniejszona immunoreaktywność GFAP w pobliżu infuzji za pomocą mikrokaniuli (Ryc. 6G) w porównaniu do standardowej kaniuli (Ryc. 6F). Podczas gdy barwienie GFAP wywołane mikrokaniulą było podwyższone powyżej normalnego poziomu (ryc. 6H), uderzająca eskalacja w reaktywnej glejozie ze standardowym umieszczeniem kaniuli i infuzją (6F) nie była obserwowana, gdy zastosowano system mikroinfuzji.

Rycina 6: Miejscowy uraz spowodowany przez mikrokaniulę w porównaniu ze standardową kaniulą porodową po 5 dniach infuzji soli fizjologicznej. (A) Mikrokaniula wyciągnięta z rurki borokrzemianowej o średnicy końcówki 50 μm umożliwia swobodny, nieograniczony przepływ większości środków neuroaktywnych, a jednocześnie jest 6 razy mniejsza niż standardowa kaniula dostarczająca (28 ga, 0,30 mm). (B, C) Niebarwione, mokre mocowania przekrojów koronalnych (grubość, 70 μm) ilustrujące większe miejscowe uszkodzenia tkanek (strzałki) spowodowane przez standardową kaniulę (B) w porównaniu z mikrokaniulą (C). (D, E) Mikrofotografie o większej mocy przekrojów barwionych H&E pokazane odpowiednio w B i C. Standardowa kaniula powodowała bardziej rozległe obrażenia pourazowe, jak pokazano na rysunku D, powodując przemieszczenie większego obszaru tkanki i powodując większe uszkodzenie układu krwionośnego, o czym świadczy nagromadzenie krwi w jamie zmiany chorobowej (strzałka). Zmiana spowodowana przez mikrokaniulę jest jednak znacznie mniejsza i mniej destrukcyjna dla tkanki w miejscu infuzji. (F, G, H) Immunofluorescencja przeciwko GFAP wykazuje radykalnie zwiększoną liczbę astrocytów GFAP+ wokół uszkodzenia standardowej kaniuli (F) w porównaniu z mikrokaniulą (G) i normalnym, niezmienionym prążkowiem (H). Podziałka: A i B, 1 mm; D - H, 250 μm.

Dyskusja

Różne badania wykazały, że poprzez zmniejszenie rozmiaru kaniuli podającej do infuzji domózgowych, zmniejsza się uraz tkanek i uszkodzenie bariery krew-mózg (Perry i wsp., 1993), zmniejsza się stan zapalny i osłabia odpowiedź immunologiczną (Finsen i wsp., 1991), a glejoza reaktywna jest zmniejszona (Nikkhah i wsp., 1994). Przedstawiamy tutaj metodę przewlekłego dostarczania czynników neuroaktywnych do mózgu za pomocą mikrokaniuli o średnicy 6-krotnie zmniejszonej w porównaniu z konwencjonalnie stosowanymi kaniulami poro...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Minipompy osmotyczne (MOPs)	Narzędzie	ALZET	model #1002
Ściągacz elektrod	Narzędzie	Stoelting Co.
Rurki borokrzemianowe	Świat chirurgii	Precision Instruments, Inc.	1B100F-6
Chirurgia	mikrokleszczowa	Świat Precision Instruments, Inc.
Rurki polietylenowe	Chirurgia	Tworzywa sztuczne One	#C312 VT
Odczynnik LumaBond		myNeuroLab, Inc