Wraz z ewolucją i wzrostem zaawansowania badań w dziedzinie neuronauki, analiza struktur i obwodów mózgowych wymaga coraz większej dokładności i wyższej rozdzielczości. Opracowaliśmy metodę przygotowania i implantacji przewlekłego systemu infuzyjnego w mózgu, wykorzystującą borokrzemianową mikrokanulę o średnicy końcówki wynoszącej 50 mikronów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Konstrukcja i implantacja systemu mikroinfuzyjnego do przedłużonego podawania czynników neuroaktywnych.
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Przedłużone podawanie substancji neuroaktywnych jest powszechnie stosowane w neuronauce, jednak wiąże się z wieloma wyzwaniami technicznymi. Konieczne jest precyzyjne dostarczenie substancji przy jednoczesnym minimalizowaniu lokalnych urazów i stanów zapalnych. Pożądaną cechą jest również możliwość dostosowania systemu do zwierząt różnych gatunków i wielkości. Niniejsza prezentacja wideo demonstruje konstrukcję systemu infuzyjnego, który można dopasować do konkretnego zwierzęcia laboratoryjnego. Średnica mikrokaniuli podającej jest około 10-krotnie mniejsza niż w większości obecnie stosowanych kaniul infuzyjnych. Przekłada się to na zwiększoną dokładność i zredukowanie urazów w badanym obszarze mózgu. Kaniulę podającą można również ukształtować zgodnie z konturem powierzchni czaszki zwierzęcia, co umożliwia staranne zamknięcie nacięcia skóry nad systemem infuzyjnym, eliminuje potrzebę stosowania podstawy montowanej na czaszce, zmniejsza ryzyko infekcji i zapewnia zwierzęciu większy komfort. System jest montowany w środowisku pozbawionym powietrza i wymaga od badacza wykonania szklanych mikropipet przy użyciu źródła ciepła. Metody konstrukcyjne te wymagają specjalistycznych umiejętności, które najlepiej nabyć osobiście lub, w innym przypadku, korzystając z instruktażu wideo. (Niniejszy artykuł opiera się na pracy opublikowanej pierwotnie w J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).
Protokół
Wstęp
Bezpośrednia infuzja czynników neuroaktywnych pozwala na badanie konkretnych obszarów mózgu z pominięciem bariery krew-mózg. Zastosowania tego podejścia w neuronauce są różnorodne i obejmują m.in. modyfikację poziomu aktywności mózgu w poszczególnych podregionach (Berretta et al., 2004; Gliddon et al., 2005; Kim et al., 2000), badanie działania substancji psychotropowych (Clinton et al., 2006; Di Benedetto et al., 2004), tworzenie kontrolowanych modeli zapalenia mózgu (Hauss-Wegrzyniak et al., 1998; Marchalant et al., 2007; Rosi et al., 2004), badanie mechanizmów uzależnień (Kim et al., 2005; Lockman et al., 2005; Zhang et al., 2006) oraz umożliwienie długotrwałej podaży czynników troficznych (Naert et al., 2006; Radecki et al., 2005; Takahashi et al., 2006).
Standardowe metody przewlekłego podawania substancji często wykorzystują mini pompę osmotyczną (np. ALZET Osmotic Pumps, Cupertino, CA) załadowaną agentem neuroaktywnym, który jest dostarczany do mózgu poprzez kanulę ze stali nierdzewnej o średnicy wynoszącej od 0,25 mm (Williams et al., 1987) do 0,5 mm, przy czym najczęściej wynosi ona około 0,3 mm (Plastics One, Roanoke, VA; patrz Rys. 6A). Choć kanule podające o takiej wielkości mogą być odpowiednie dla wielu zastosowań, w których nie jest wymagana wysoka precyzja, a uszkodzenie mikrośrodowiska nie stanowi głównego problemu, są one suboptymalne do podawania substancji do małych, delikatnych obszarów, w których rozmiar kanuli jest porównywalny z rozmiarem docelowej struktury (lub jest od niej większy), bądź w przypadkach, gdy funkcja tkanki nie może zostać zaburzona przez uraz mechaniczny.
Przedstawiono tutaj metodę przygotowania i implantacji przewlekłego systemu infuzyjnego do podawania substancji neuroaktywnych do mózgu przy użyciu „mikrokaniuli” o znacznie zmniejszonej średnicy końcówki. Technika ta umożliwia celowanie w małe podstruktury i ogranicza urazy w obszarze zainteresowania. Przedstawiona procedura jest zatem nauczana jako alternatywa dla konwencjonalnych metod dla badaczy pragnących zminimalizować zaburzenia w badanym regionie mózgu.
Materiały i metody
Zwierzęta i schemat badania
Do zademonstrowania procedury i przetestowania funkcji opracowanej metody wykorzystano osiemnaście dorosłych samców szczurów rasy Sprague-Dawley (400-450 g). Dwunastu zwierzętom wszczepiono systemy mikroinfuzyjne, które posłużyły do oceny trwałości funkcji w czasie przez okres 4 dni. Sześć zwierząt wykorzystano do porównania stopnia urazu i gliozy reaktywnej 5 dni po implantacji standardowej kaniuli podażowej 28 ga (N=3) lub mikrokaniuli (N=3) podłączonej do mini-pompy osmotycznej wypełnionej solą fizjologiczną. Zwierzęta przebywały w przezroczystych plastikowych klatkach, w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność, z dostępem do pokarmu i wody ad libitum. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee szpitala McLean, zgodnie z obowiązującymi federalnymi i lokalnymi wytycznymi dotyczącymi eksperymentalnego wykorzystania zwierząt.
Montaż systemu mikroinfuzyjnego
Rysunek 1 przedstawia komponenty i montaż systemu mikroinfuzji. Zaleca się konstruowanie i implantację systemu z zachowaniem technik sterylnych. Ponadto, aby zapobiec przedostaniu się powietrza do układu, montaż odbywa się w kąpieli solnej. W przeprowadzonych testach zastosowano minipompy osmotyczne (MOPs) (ALZET, model #1002, Cupertino, CA) o czasie działania 14 dni, szybkości przepływu 0.25 µL /hr i pojemności 98.6 µL. Jednakże, ponieważ nadmierna szybkość przepływu może zalać mniejsze obszary zainteresowania w mózgu i spowodować uszkodzenia strukturalne, szybkość przepływu w tych badaniach zmniejszono do 0.125 µL /hr poprzez pokrycie połowy pompy MOP parafina zgodnie z instrukcjami producenta. W celu oceny urazu miejscowego pompy MOP wypełniono sterylną solą fizjologiczną. Do oceny długotrwałej funkcji systemów mikroinfuzji jako roztworu testowego wybrano Fast Green (1% w soli fizjologicznej, Fisher Scientific, Park Lane Pittsburgh, PA) ze względu na jego niską toksyczność, zdolność do dyfuzji w żywej tkance mózgowej oraz masę cząsteczkową (808.84) znajdującą się w górnym zakresie „małych cząsteczek” (<1000), które są najczęściej przedmiotem zainteresowania w przypadku infuzji przewlekłych (np. muskymol, pikrotoksyna, fluoksetyna itp.).
Rysunek 1: Montaż systemu mikroinfuzyjnego. (A) Komponenty systemu ułożone w odpowiednich pozycjach do montażu. Zauważ, że kołnierz rurki modułu przepływowego został odłamany. Zaleca się przymocowanie drutu wyrównawczego tuż przed implantacją (patrz tekst). (B) Zmontowany system mikroinfuzyjny przed przymocowaniem drutu wyrównawczego i implantacją.
Przygotowanie mikrokanuli
Mikrokaniulę można wykonać przy użyciu standardowego poziomego lub pionowego wyciągacza elektrod (Stoelting Co., Wood Dale, IL) z ustawieniami umożliwiającymi wytworzenie szklanej elektrody z długim, łagodnie zwężającym się trzoniem (Rys. 2A). Do tego celu odpowiednie są rurki borokrzemowe (część 1B100F-6, 1,0 mm, 6 in; World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL), ponieważ mają one stosunkowo niską temperaturę topnienia, co pozwala na późniejsze wyginanie za pomocą skupionego ciepła. Najdalszy odcineł prostej mikrokaniuli można odciąć nożyczkami sekcyjnymi lub wykonać kontrolowane przełamanie za pomocą mikropincety (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL), aby uzyskać pożądany końcowy średnica końcówki (50 µm dla niniejszych demonstracji); przydatny do prowadzenia i potwierdzenia pożądanej średnicy jest mikrometr przedmiotowy mikroskopu. Odciętą końcówkę można krótko podgrzać, czyli poddać „polerowaniu ogniowym”, aby usunąć szorstkie lub ostre krawędzie. Następnie wykorzystuje się cewkę grzejną wyciągacza elektrod lub palnik Bunsena, aby nadać mikrokaniuli kąt prosty w określonej odległości od jej końcówki (Rys. 2B), umieszczając rurkę borokrzemową w cewce grzejnej (lub w płomieniu palnika) i delikatnie naciskając pincetą na odcineł dystalny podczas podgrzewania rurki. Określona długość mikrokaniuli dystalnie od nadanego kąta prostego jest ustalana na podstawie głębokości docelowego obszaru mózgu (np. 5 mm), biorąc pod uwagę grubość czaszki (~1 mm) oraz odległość roboczą nad czaszką (np. 1-2 mm). Zatem określona odległość od końcówki mikrokaniuli do nadanego kąta prostego dla niniejszych demonstracji wynosiła 7-8 mm. Następnie używa się rylca diamentowego, aby przeciąć rurkę borokrzemową około 8 mm proksymalnie od kąta prostego.
Rycina 2: Przygotowanie mikrokanuły. (A) Do wytworzenia mikrokanuły z długim, zwężającym się trzoniem używa się wyciągarki do elektrod (Stoelting Co. Wood Dale, IL). (B) Cewkę grzejną można zmienić orientacją dla ułatwienia obsługi, a następnie mikrokanułę umieszcza się wewnątrz cewki, co pozwala na utworzenie zagięcia pod kątem prostym przy użyciu pęsety podczas podgrzewania szklanej rurki.
Po przygotowaniu żądanej liczby mikrokaniul zalecamy sterylizację tlenkiem etylenu lub w autoklawie. Najbardziej dystalny odcinek 1-2 mm mikrokaniuli można oznaczyć sterylnym markerem chirurgicznym (lub niezmywalnym tuszem przed sterylizacją), aby umożliwić łatwą wizualizację końcówki mikrokaniuli podczas procedury chirurgicznej.
Przygotowanie MOP
MOP-y przygotowano zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, plastikową kołnierzę z rurki MOP wykonanej ze stali nierdzewnej („modulator przepływu”) należy najpierw usunąć za pomocą nożyczek lub kleszczy kostnych. Odcinek rurki polietylenowej (Plastics One, Roanoke, VA, #C312 VT; OD, 1.22 mm; ID: 0.72 mm) mocuje się do fragmentu rurki ze stali nierdzewnej, w miejscu, gdzie wcześniej znajdowała się kołnierza (~4 mm), wsuwając rurkę ze stali nierdzewnej do światła rurki polietylenowej i zabezpieczając połączenie odpowiednim klejem wzdłuż zewnętrznego obwodu. Szczególnie użyteczny jest LumaBond (myNeuroLab, Inc., St. Louis, MO), ponieważ utwardza się w ciągu kilku sekund pod wpływem skupionego światła (np. z lampy światłowodowej). Długość rurki powinna odpowiadać odległości między podstawą czaszki zwierzęcia a najbardziej rostralną częścią łopatek (np. około 1.5-3.0 cm w przypadku szczurów laboratoryjnych). Pompę napełnia się zgodnie z instrukcją, a następnie rurkę ALZET ze stali nierdzewnej, z przymocowanym do jej końca odcinkiem rurki polietylenowej, wprowadza się do napełnionej pompy. Niewielka objętość roztworu z pompy zostanie wypchnięta na zewnątrz styku pompy z rurką (należy ją odsączyć) oraz do proksymalnego odcinka rurki polietylenowej. Napełnioną pompę z przymocowaną rurką inkubuje się następnie w sterylnym roztworze soli fizjologicznej przez 12 godzin w temperaturze 37°C. Jeśli pompa działa prawidłowo, po tym okresie inkubacji powinno być widać, że płyn przemieścił się o kilka milimetrów wewnątrz rurki polietylenowej.
Budowa systemu mikroinfuzji
Pompa wraz z podłączonymi przewodami zostaje zanurzona w 10 cm szalce Petriego zawierającej jałową sól fizjologiczną, a pozostałe powietrze wewnątrz przewodów polietylenowych jest usuwane za pomocą strzykawki wypełnionej tym samym roztworem, która jest wyposażona w przewód o małej średnicy umożliwiający wprowadzenie go do wnętrza przewodów polietylenowych. W ten sposób roztwór może zostać wstrzyknięty do przewodów polietylenowych w celu zastąpienia powietrza. Analogicznie mikrokaniulę zanurza się w kąpieli z soli fizjologicznej, a powietrze usuwa się poprzez wstrzyknięcie roztworu. Można to łatwo osiągnąć za pomocą drugiej strzykawki wypełnionej roztworem, wyposażonej w elastyczny (np. silikonowy) przewód, który pasuje do szerokiego (proksymalnego) końca mikrokaniuli.
Następnie proksymalny koniec rurki borokrzemianowej jest wprowadzany do rurki polietylenowej. Należy zauważyć, że może to wymagać rozszerzenia rurki polietylenowej poprzez mocne wciśnięcie zamkniętych końcówek mikropincety do światła rurki, co poszerzy otwór i ułatwi wprowadzenie rurki borokrzemianowej. Bezzapowietrzony system infuzyjny jest następnie wyjmowany z kąpieli solnej, kładziony na sterylnej powierzchni i delikatnie osuszany gazą lub patyczkiem bawełnianym. Połączenie mikrokaniuli z rurką polietylenową zabezpiecza się obwodową warstwą kleju (np. LumaBond).
Jeśli system został prawidłowo złożony i MOP nadal funkcjonuje prawidłowo, podczas końcowego etapu tej procedury na końcówce mikrokanuli zwykle pojawi się kropla roztworu, ponieważ mechanizm osmotyczny w pompie nadal pracuje podczas przygotowania. Szybkość przepływu MOP można proporcjonalnie zmniejszyć, pokrywając odpowiednią powierzchnię parafiną zgodnie z instrukcją producenta. W prezentowanych demonstracjach 50% każdego MOP zostało pokryte poprzez krótkie zanurzenie w stopionej parafinie i pozostawienie do ostygnięcia, co zredukowało szybkość przepływu o połowę do 0,125 µL/hr. Gotowy system mikroinfuzyjny jest następnie zanurzany w sterylnej soli fizjologicznej i przechowywany w temperaturze 37°C do momentu implantacji.
Implantacja systemu mikroinfuzji
System mikroinfuzyjny jest implantowany przy użyciu standardowych metod stereotaktycznych, zgodnie z wcześniejszym opisem (Cooley, 1990). Po przygotowaniu pola operacyjnego wykonuje się otwór trepanacyjny w celu wprowadzenia mikrokanuli. W razie potrzeby można również umieścić śruby czaszkowe, aby ustabilizować związek wiążący użyty do zamocowania mikrokanuli. Związek stosowany w tym laboratorium (Geribond, Den-Mat Inc., Santa Maria, CA) nie wymaga dodatkowego kotwiczenia; powierzchnia czaszki musi jednak zostać przygotowana poprzez oczyszczenie ją patyczkiem nasączonym acetonem. Na dystalnym końcu drutu wyrównującego wykonuje się „haczyk” o średnicy 1-2 mm (patrz Rys. 1), co pozwala na objęcie nim zagięcia rurki borokrzemianowej. Następnie zostaje on unieruchomiony (za pomocą LumaBond) w orientacji wzdłuż tej samej osi co dystalna część mikrokanuli (która ma zostać wprowadzona do mózgu, patrz Rys. 3B). System infuzyjny jest następnie montowany na nośniku stereotaktycznym (Rys. 3) poprzez zacisnięcie drutu wyrównującego w uchwycie. Do przymocowania pompy infuzyjnej do górnej części manipulatora stereotaktycznego używa się sterylnej nici chirurgicznej, co pozwala na jej zawieszenie i zapobiega utracie orientacji podczas procedury z powodu ciężaru (i momentu obrotowego) pompy (Rys. 3B). Mikrokanulę można następnie ustawić w pożądanej orientacji (np. dokładnie pionowo), delikatnie wyginając pęsetą drut wyrównujący dystalnie względem zacisku nośnika. Końcówka mikrokanuli zostaje ustawiona nad punktem odniesienia (np. bregma lub lambda), a następnie przesunięta do punktu wejścia do mózgu. Współrzędne zastosowane dla zwierząt w tych eksperymentach wynosiły: Bregma +0.2 mm, lateralnie 3.2 mm oraz ventralnie 5.0 mm poniżej twardówki, przy głowie zwierzęcia w pozycji skull-flat.
Po wprowadzeniu mikrokanuli na odpowiednią głębokość w obrębie mózgu, system zostaje unieruchomiony za pomocą masy do budowy postumentu (np. Geribond). Postument można uformować tak, aby znajdował się blisko powierzchni czaszki, co ułatwia zamknięcie rany. Po utwardzeniu masy postumentu (~2 min), drut wyrównawczy zostaje odcięty na równi z postumentem przy użyciu tarczy tnącej wiertarki. Można użyć niewielkiej ilości masy, aby przykryć i wygładzić pozostały zadzior z odciętego drutu. Następnie MOP jest wprowadzany podskórnie i umieszczany pomiędzy łopatkami zwierzęcia. Na koniec ranę przemywa się sterylną solą fizjologiczną, a cięcie zamyka się za pomocą szwów lub klipsów chirurgicznych (Ryc. 3, panel D).
Rysunek 3: Implantacja systemu mikroinfuzji. (A) Pozycjonowanie systemu mikroinfuzji na urządzeniu stereotaktycznym. (B) MOP jest przymocowany za pomocą sterylnej nici chirurgicznej, aby jego ciężar nie zakłócał orientacji mikrokanuli. Mikrokanula jest ustawiona do precyzyjnego pionowego wprowadzenia do mózgu przy użyciu drutu wyrównawczego. (C) System mikroinfuzji jest ustawiony do umieszczenia i utrwalenia w organizmie zwierzęcia. (D) Konstrukcja systemu mikroinfuzji umożliwia łatwe zamknięcie nacięcia nad niskoprofilowym cokołem, co zmniejsza ryzyko infekcji i minimalizuje dyskomfort zwierzęcia.
Przygotowanie i implantacja standardowego systemu infuzyjnego
Procedura przygotowania standardowego systemu infuzyjnego jest identyczna z procedurą dla systemu mikroinfuzyjnego, z wyjątkiem tego, że mikrokanulę zastępuje się „kanulą łącznika pompy osmotycznej” o średnicy 300 µm (28 ga; Plastics One, Roanoke, VA, #3300PM/SPC; patrz Rys. 5a). Implantacja standardowego systemu jest również identyczna jak w przypadku systemu mikroinfuzyjnego, w tym mocowanie drutu wyrównawczego w celu zapewnienia precyzyjnego pionowego pozycjonowania kanuli wprowadzanej do mózgu.
Histologia i analiza
Aby zbadać zdolność systemu mikroinfuzji do zapewnienia długotrwałego dostarczania Fast Green, grupy po trzy zwierzęta uśmiercano po 12 hr, 1 dniu, 2 dniach i 4 dniach od operacji. Obiekty poddano głębokiej anestezji za pomocą pentobarbitalu sodu (120 mg/kg, ip), a następnie przeprowadzono perfuzję transkardialną 200 mL 0,1M soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS), a następnie 400 mL 4% paraformaldehydu w buforze fosforanowym 0,1M. Roztwory perfuzyjne utrzymywano w temperaturze 4°C przy pH 7,4 i podawano z prędkością 50 mL na minutę przy użyciu pompy perystaltycznej. Aby usunąć kaniule bez uszkadzania tkanki pośmiertnej, perfundowane zwierzę unieruchomiono w aparacie stereotaktycznym, cokoł przymocowano klejem do sztywnego drutu przytwierdzonego do zacisku ramienia manipulatora, a czaszkę ostrożnie usunięto wokół cokołu za pomocą wiertła dentystycznego. W ten sposób cokoł i znajdująca się pod nim kaniula zostały usunięte wzdłuż tej samej trajektorii, po której kaniula była wprowadzana podczas implantacji. Następnie mózgi wyjęto z czaszki i zanurzono na 12 godzin w tym samym utrwalaczu.
W celu oceny przedłużonej infuzji Fast Green, wykonano przekroje o grubości 200 µm przy użyciu wibrotomu (myNeuroLab, St. Louis, MO), a następnie zamontowano je na mokro na szkiełkach przedmiotowych. Reprezentatywne przekroje obrazowano za pomocą skanera Canon CanoScan LiDE 600F. W celu oceny urazu miejscowego i reaktywnej gliozy, przekroje o grubości 70µm wykonane wibrotomem najpierw zamontowano na mokro i sfotografowano bez barwienia, aby zapobiec deformacji tkanki, która może wystąpić podczas procesów histologicznych, takich jak suszenie, barwienie i odwadnianie. Te same przekroje pozostawiono do wyschnięcia na szkiełkach pokrytych żelatyną, a następnie zabarwiono hematoksyliną i eozyną (H&E), odwodniono przy użyciu alkoholi o rosnącym stężeniu i zamontowano pod przykrywkami z użyciem Permount.
Sąsiednie przekroje o grubości 70 µm poddano standardowej procedurze immunofluorescencji w celu wykrycia kwaśnego białka włókienstwa gliałego (GFAP), które jest ekspresowane przez astrocyty podczas procesu reaktywnej gliozy w odpowiedzi na uraz (Ding et al., 2000; Ma et al., 1991). W skrócie, swobodnie pływające przekroje przepłukano PBS i zablokowano 10% normalną surowicą osiołkową (NDS) oraz 3% albuminą surowiczą bydlęcą w 0,1 M PBS z 0,3% Triton X-100 (PBS/Triton) przez jedną godzinę, a następnie inkubowano w przeciwciałach króliczych przeciwko GFAP (1:500; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) w PBS/Triton z 1% NDS przez 12 godzin w temperaturze 4°C. Następnie przekroje przepłukano PBS i inkubowano z wtórnym przeciwciałem osiołkowym antykróliczym Alexa Fluor® 594 (1:500; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) w PBS z 5% NDS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Przekroje ponownie dokładnie przepłukano PBS i przebarwiono zielonym fluorescencyjnym barwnikiem Nissla NeuroTrace® (1:500 w PBS przez 5 minut; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Po końcowym przepłukaniu PBS przekroje zamocowano na szkiełkach powlekanych żelatyną i przykryto szkiełkami cover-slip przy użyciu medium Slow-Fade (Molecular Probes). Wszystkie mikrofotografie wykonano przy użyciu mikroskopu Zeiss Axioskop z oprogramowaniem AxioVision (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY).
Wyniki
Badania in vitro
Przed oceną na zwierzętach przygotowano trzy systemy mikroinfuzji, umieszczając wypełnione barwnikiem Fast Green pompki mikroosmotyczne (MOP) w jednej komorze (probówka stożkowa 15 ml), a mikrokanule w drugiej komorze (probówka Eppendorf 1 ml), obie zawierające sterylną sól fizjologiczną w temperaturze 37°C. Każdy system wykazywał ciągły przepływ barwnika przez 12 godzin obserwacji. Rysunek 4 ilustruje działanie typowego systemu w ciągu 3 godzin.
Rycina 4: In vitro demonstracja działania systemu mikroinfuzji. (A) Przepływ barwnika Fast Green jest wyraźnie widoczny i niezakłócony z mikrokaniuli na początku okresu testu in vitro. (B) W miarę kontynuacji przepływu roztwór w zbiorniku nasyca się (B), a ostatecznie staje się nieprzezroczysty z powodu zabarwienia (C).
Ocena systemu mikroinfuzji in vivo
Po perfuzji dokładnie sprawdzono usunięte mikrokanule oraz ich połączenia; we wszystkich przypadkach pozostały one całkowicie nienaruszone. W związku z tym nie doszło do pęknięcia szkła borokrzemianowego w tkance, ani nie stwierdzono żadnych wad w połączeniach komponentów systemu. Do zastosowania delikatnego przepływu na przeciętym końcu rurki polietylenowej podłączonej do mikrokanuli użyto strzykawki Hamiltona o pojemności 10 µL wypełnionej solą fizjologiczną, z krótkim odcinkiem rurki silikonowej przymocowanym do igły. Wszystkie dwanaście mikrokanul umożliwiało ciągły przepływ i nie wykazywało oznak niedrożności. Ponadto, po wyjęciu każdego MOP z organizmów zwierząt, zmierzono objętość pozostałego roztworu, która okazała się odpowiednia dla szybkości przepływu MOP (0,125 µL/hr) oraz czasu jego działania.
Dostarczanie in vivo
Ocena przekrojów wieńcowych tkanki nasyconej barwnikiem Fast Green wykazała niewielką zmienność w rozkładzie między zwierzętami w grupach w każdym z określonych punktów czasowych (12 h, 1 dzień, 2 dni i 4 dni). Rycina 5 przedstawia reprezentatywne obszary dyfuzji Fast Green w tych punktach czasowych, wykazując progresywny wzrost infiltracji barwnika w ciągu czterech dni. Należy zauważyć, że wcześniejsze eksperymenty z użyciem wyższych stężeń Fast Green (np. 5-15%) prowadziły do szybkiego zmętnienia miąższu, co uniemożliwiało dokładną ocenę funkcjonowania systemu mikroinfuzji w czasie. Choć pełny zakres dyfuzji 1% barwnika może być trudny do dokładnego określenia podczas oględzin makroskopowych, obszary infiltracji były łatwo rozróżnialne przy powiększeniu 2,5X i są zaznaczone przerywanymi liniami na Rycinie 5.
Rysunek 5: In vivo demonstracja ciągłej mikroinfuzji Fast Green. (A) Dwanaście godzin po intrastriatalnym umieszczeniu systemu mikroinfuzji załadowanego Fast Green, widoczna jest dyfuzja barwnika do miąższu otaczającego miejsce wprowadzenia mikrokanuły. Obserwacje po 1 dniu (B), 2 dniach (C) i 4 dniach (D) wskazują na kontynuację podawania roztworu Fast Green z coraz większymi obszarami infiltracji barwnika. Zewnętrzna granica dyfuzji została zaobserwowana pod mikroskopem przy małym powiększeniu i jest tutaj zaznaczona przerywanymi liniami. Pasek skali, 2 mm.
Ocena urazu i gliozy reaktywnej
Makroskopowa obserwacja świeżo wyciętych, niebarwionych przekrojów tkanki wykazała, że system mikroinfuzji doprowadził do zmniejszenia miejscowego urazu w miejscu podania. W przypadku standardowej kaniuli niezmiennie obserwowano uszkodzenie i przemieszczenie większego obszaru tkanki (Ryc. 6B i C), co jest lepiej widoczne przy większym powiększeniu w barwieniu H & E (Ryc. 6D i E). Ponadto w miejscu standardowej infuzji często stwierdzano gromadzenie się krwi (Ryc. 6D), co sugeruje większy stopień uszkodzenia naczyń krwionośnych i wskazuje na zmniejszoną integralność bariery krew-mózg.
System mikroinfuzyjny doprowadził również do znacznego ograniczenia reaktywnej gliozy, co potwierdzono poprzez zmniejszoną immunoreaktywność dla GFAP w okolicy miejsca infuzji za pomocą mikrokanuli (Rys. 6G) w porównaniu z zastosowaniem standardowej kanuli (Rys. 6F). Chociaż barwienie GFAP indukowane mikrokanulą było podwyższone powyżej poziomu normalnego (Rys. 6H), nie zaobserwowano tak gwałtownego wzrostu reaktywnej gliozy, jaki wystąpił przy umieszczeniu standardowej kanuli i przeprowadzeniu infuzji (6F), gdy zastosowano system mikroinfuzyjny.
Rycina 6: Zlokalizowany uraz spowodowany przez mikrokaniulę w porównaniu do standardowej kaniuli do podawania leków po 5 dniach infuzji soli fizjologicznej. (A) Mikrokaniula wyciągnięta z rurek borokrzemianowych o średnicy końcówki 50 µm umożliwia swobodny, nieograniczony przepływ większości czynników neuroaktywnych, a jednocześnie jest 6X mniejsza od standardowej kaniuli do podawania (28 ga, 0,30 mm). (B, C) Niebarwione preparaty mokre przekrojów koronarnych (grubość 70 µm) ilustrujące większe miejscowe uszkodzenie tkanki (strzałki) spowodowane przez standardową kaniulę (B) w porównaniu do mikrokaniuli (C). (D, E) Mikrofotografie przy większym powiększeniu przekrojów barwionych H&E przedstawionych odpowiednio w B i C. Standardowa kaniula spowodowała bardziej rozległy uraz traumatyczny, co zilustrowano w D, przemieszczając większy obszar tkanki i powodując większe uszkodzenie naczyń krwionośnych, co objawiało się gromadzeniem krwi w jamie urazu (strzałka). Uraz spowodowany przez mikrokaniulę jest jednak znacznie mniejszy i mniej niszczy tkankę w miejscu infuzji. (F, G, H) Immunofluorescencja przeciwko GFAP wykazuje gwałtowny wzrost liczby astrocytów GFAP+ wokół urazu po standardowej kaniuli (F) w porównaniu do mikrokaniuli (G) oraz prawidłowego, nieuszkodzonego prążkowia (H). Paski skali: A i B, 1 mm; D - H, 250 µm.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Różne badania wykazały, że zmniejszenie rozmiaru kaniuli do infuzji wewnątrzczaszkowych redukuje urazy tkankowe i uszkodzenia bariery krew-mózg (Perry et al., 1993), zmniejsza stan zapalny i osłabia odpowiedź immunologiczną (Finsen et al., 1991) oraz ogranicza reaktywną gliozę (Nikkhah et al., 1994). Przedstawiamy tutaj metodę przewlekłego podawania substancji neuroaktywnych do mózgu za pomocą mikrokaniuli o średnicy sześciokrotnie mniejszej w porównaniu do konwencjonalnie stosowanych kaniuli do infuzji. Wykazaliśmy, że ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Mini-pompy osmotyczne (MOPs) | Narzędzie |  ALZET | model #1002 | |
| Wyciągacz elektrod | Narzędzie | Stoelting Co. | ||
| Rurki borokrzemowe | Chirurgia | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | |
| Mikropincety | Chirurgia | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Rurki polietylenowe | Chirurgia | Plastics One | #C312 VT | |
| LumaBond | Odczynnik | myNeuroLab, Inc |
Bibliografia
- Berretta, S., Lange, N., Bhattacharyya, S., Sebro, R., Garces, J., Benes, F. M. Long-term effectsof amygdala GABA receptor blockade on specific subpopulations of hippocampalinterneurons. Hippocampus. 14, 876-894 (2004).
- Clinton, S. M., Sucharski, I. L., Finlay, J. M. Desipramine attenuates working memoryimpairments induced by partial loss of catecholamines in the rat medial prefrontal cortex. Psychopharmacology. 183, 404-412 (2006).
- Cooley, R., et al. Stereotaxic surgery in the rat. , A.J. Kirby Co. Ontario, Canada. (1990).
- Di Benedetto, M., Feliciani, D., D'Addario, C., Izenwasser, S., Candeletti, S. Romualdi P.Effects of the selective norepinephrine uptake inhibitor nisoxetine on prodynorphin geneexpression in rat CNS. Brain Res Mol Brain Res. 127, 115-120 (2004).
- Ding, M., Haglid, K. G., Hamberger, A. Quantitative immunochemistry on neuronal loss,reactive gliosis and BBB damage in cortex/striatum and hippocampus/amygdala aftersystemic kainic acid administration. Neurochemistry international. 36, 313-318 (2000).
- Finsen, B. R., Sorensen, T., Castellano, B., Pedersen, E. B., Zimmer, J. Leukocyte infiltrationand glial reactions in xenografts of mouse brain tissue undergoing rejection in the adultrat brain. A light and electron microscopical immunocytochemical study. JNeuroimmunol. 32, 159-183 (1991).
- Gliddon, C. M., Darlington, C. L., Smith, P. F. Effects of chronic infusion of a GABAA receptoragonist or antagonist into the vestibular nuclear complex on vestibular compensation inthe guinea pig. J Pharmacol Exp Ther. 313, 1126-1135 (2005).
- Hauss-Wegrzyniak, B., Dobrzanski, P., Stoehr, J. D., Wenk, G. L. Chronic neuroinflammation in rats reproduces components of the neurobiology of Alzheimer's disease. Brain Res. 780, 294-303 (1998).
- Kim, H. S., Choi, H. S., Lee, S. Y., Oh, S. Changes of GABA(A) receptor binding and subunitmRNA level in rat brain by infusion of subtoxic dose of MK-801. Brain Res. 880, 28-37 (2000).
- Kim, S. Y., Chudapongse, N., Lee, S. M., Levin, M. C., Oh, J. T., Park, H. J., Ho, I. K. Proteomicanalysis of phosphotyrosyl proteins in morphine-dependent rat brains. Brain Res MolBrain Res. 133, 58-70 (2005).
- Lockman, P. R., McAfee, G., Geldenhuys, W. J., Schyf, C. J., Abbruscato, T. J., Van Allen, D. D. der Schyf CJ, Abbruscato TJ, Allen DD.Brain uptake kinetics of nicotine and cotinine after chronic nicotine exposure. J Pharmacol Exp Ther. 314, 636-642 (2005).
- MA, K. C., Chang, Z. H., Shih, H., Zhu, J. H., Wu, J. Y. The compensatory 'rebound' of reactiveastrogliosis: glial fibrillary acidic protein immunohistochemical analysis of reactiveastrogliosis after a puncture wound to the brain of rats with portocaval anastomosis. Acta neuropathologica. 82, 72-77 (1991).
- Marchalant, Y., Rosi, S., Wenk, G. L. Anti-inflammatory property of the cannabinoid agonistWIN-55212-2 in a rodent model of chronic brain inflammation. Neuroscience. 144, 1516-1522 (2007).
- Naert, G., Ixart, G., Tapia-Arancibia, L., Givalois, L. Continuous i.c.v. infusion of brainderivedneurotrophic factor modifies hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity,locomotor activity and body temperature rhythms in adult male rats. Neuroscience. 139, 779-789 (2006).
- Nikkhah, G., Olsson, M., Eberhard, J., Bentlage, C., Cunningham, M. G., Bjorklund, A. Amicrotransplantation approach for cell suspension grafting in the rat Parkinson model: adetailed account of the methodology. Neuroscience. 63, 57-72 (1994).
- Perry, V. H., Andersson, P. B., Gordon, S. Macrophages and inflammation in the centralnervous system. Trends Neurosci. 16, 268-273 (1993).
- Radecki, D. T., Brown, L. M., Martinez, J., Teyler, T. J. BDNF protects against stress-inducedimpairments in spatial learning and memory and LTP. Hippocampus. 15, 246-253 (2005).
- Rosi, S., Ramirez-Amaya, V., Hauss-Wegrzyniak, B., Wenk, G. L. Chronic brain inflammationleads to a decline in hippocampal NMDA-R1 receptors. J Neuroinflammation. 1, 12-12 (2004).
- Takahashi, M., Kakita, A., Futamura, T., Watanabe, Y., Mizuno, M., Sakimura, K., Castren, E., Nabeshima, T., Someya, T., Nawa, H. Sustained brain-derived neurotrophic factor upregulationand sensorimotor gating abnormality induced by postnatal exposure tophencyclidine: comparison with adult treatment. J Neurochem. 99, 770-780 (2006).
- Williams, L. R., Vahlsing, H. L., Lindamood, T., Varon, S., Gage, F. H., Manthorpe, M. A smallgaugecannula device for continuous infusion of exogenous agents into the brain. Experimental neurology. 95, 743-754 (1987).
- Zhang, X., Lee, T. H., Xiong, X., Chen, Q., Davidson, C., Wetsel, W. C. Ellinwood EH.Methamphetamine induces long-term changes in GABAA receptor alpha2 subunit andGAD67 expression. Biochem Biophys Res Commun. 351, 300-305 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.
Posted by JoVE Editors on 4/01/2012. Citeable Link.
A correction was made to: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents. A key reference was excluded and a revised abstract was republished.
Additional Reference:
22. Cunningham, M.G., Ames, H.M., Donalds, R.A., & Benes, F.M. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of Neuroscience Methods 167, 213-220, doi:10.1016/j.jneumeth.2007.08.016 (2008).
Revised Abstract:
Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with high precision while minimizing localized trauma and inflammation. Also, the ability to customize the system to accommodate animals of different species and sizes is desirable. This video presentation demonstrates the construction of an infusion system that can be fitted to any particular research animal. The delivery microcannula diameter is approximately 10-fold smaller than most infusion cannulas presently used. This translates into enhanced accuracy and reduced trauma to the brain region under study. The delivery cannula can also be sculpted to fit the contour of the surface of the animal's skull, thereby allowing closure of the scalp incision neatly over the infusion system, precluding the need for a skull-mounted pedestal, reducing risk of infection, and ensuring a greater level of comfort to the animal. The system is assembled in an air-free environment and requires the researcher to fashion glass micropipettes with a heat source. These construction methods require special skills that are best acquired, if not in person, using video instruction. (This article is based on work first reported in J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).
Original Abstract:
Experimental protocols used for chronic infusion of neuroactive agents within regions of the brain often utilize a mini-osmotic pump system. Agents are commonly delivered via a stainless steel cannula with a diameter of 0.30 mm or greater. Systems utilizing a cannula of this caliber may impose trauma to the area of interest resulting in architectural damage, thereby compromising structural integrity and normal functioning. As neuroscience inquiry becomes more sophisticated, investigation of brain structures and circuitry requires improved levels of accuracy and higher resolution. We have developed a method for the preparation and implantation of a chronic infusion system within the brain utilizing a borosilicate microcannula with a tip diameter of 50 microns. This technique reduces damage to the local environment and diminishes reactive gliosis at the site of infusion. The configuration of the microinfusion system is also able to conform to the surface of the animal's skull, precluding the need for large cranial pedestals, thus facilitating closure of the scalp incision and reducing the risk of infection. We demonstrate reliable sustained delivery of a dye having a representative molecular weight using an in vitro model and in vivo studies in rats.
