Konstrukcja i implantacja systemu mikroinfuzyjnego do przedłużonego podawania czynników neuroaktywnych.

Podsumowanie

Wraz z ewolucją i wzrostem zaawansowania badań w dziedzinie neuronauki, analiza struktur i obwodów mózgowych wymaga coraz większej dokładności i wyższej rozdzielczości. Opracowaliśmy metodę przygotowania i implantacji przewlekłego systemu infuzyjnego w mózgu, wykorzystującą borokrzemianową mikrokanulę o średnicy końcówki wynoszącej 50 mikronów.

Streszczenie

Przedłużone podawanie substancji neuroaktywnych jest powszechnie stosowane w neuronauce, jednak wiąże się z wieloma wyzwaniami technicznymi. Konieczne jest precyzyjne dostarczenie substancji przy jednoczesnym minimalizowaniu lokalnych urazów i stanów zapalnych. Pożądaną cechą jest również możliwość dostosowania systemu do zwierząt różnych gatunków i wielkości. Niniejsza prezentacja wideo demonstruje konstrukcję systemu infuzyjnego, który można dopasować do konkretnego zwierzęcia laboratoryjnego. Średnica mikrokaniuli podającej jest około 10-krotnie mniejsza niż w większości obecnie stosowanych kaniul infuzyjnych. Przekłada się to na zwiększoną dokładność i zredukowanie urazów w badanym obszarze mózgu. Kaniulę podającą można również ukształtować zgodnie z konturem powierzchni czaszki zwierzęcia, co umożliwia staranne zamknięcie nacięcia skóry nad systemem infuzyjnym, eliminuje potrzebę stosowania podstawy montowanej na czaszce, zmniejsza ryzyko infekcji i zapewnia zwierzęciu większy komfort. System jest montowany w środowisku pozbawionym powietrza i wymaga od badacza wykonania szklanych mikropipet przy użyciu źródła ciepła. Metody konstrukcyjne te wymagają specjalistycznych umiejętności, które najlepiej nabyć osobiście lub, w innym przypadku, korzystając z instruktażu wideo. (Niniejszy artykuł opiera się na pracy opublikowanej pierwotnie w J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).

Protokół

Wstęp

Bezpośrednia infuzja czynników neuroaktywnych umożliwia badanie konkretnych obszarów mózgu z pominięciem bariery krew-mózg. Zastosowania tego podejścia w neuronauce są różnorodne i obejmują m.in. modyfikowanie poziomu aktywności mózgu w poszczególnych podregionach (Berretta et al., 2004; Gliddon et al., 2005; Kim et al., 2000), badanie działania substancji psychotropowych (Clinton et al., 2006; Di Benedetto et al., 2004), tworzenie kontrolowanych modeli stanu zapalnego mózgu (Hauss-Wegrzyniak et al., 1998; Marchalant et al., 2007; Rosi et al., 2004), badanie mechanizmów uzależnień (Kim et al., 2005; Lockman et al., 2005; Zhang et al., 2006) oraz umożliwienie długotrwałej podaży czynników troficznych (Naert et al., 2006; Radecki et al., 2005; Takahashi et al., 2006).

Standardowe metody przewlekłego podawania substancji często wykorzystują minipompę osmotyczną (np. ALZET Osmotic Pumps, Cupertino, CA) załadowaną neuroaktywnym agentem, który jest dostarczany do mózgu poprzez stalową kaniulę o średnicy wynoszącej od 0,25 mm (Williams et al., 1987) do 0,5 mm, przy czym najczęściej wynosi ona około 0,3 mm (Plastics One, Roanoke, VA; patrz Ryc. 6A). Chociaż kaniule dostarczające o takim rozmiarze mogą być odpowiednie dla wielu zastosowań, w których nie jest wymagana wysoka precyzja, a urazy mikrośrodowiska nie stanowią głównego problemu, są one nieoptymalne do podawania substancji w małe, delikatne obszary, w których rozmiar kaniuli jest porównywalny z rozmiarem (lub większy od rozmiaru) samej docelowej struktury lub gdzie funkcja nie może zostać upośledzona przez uraz mechaniczny.

W niniejszym materiale przedstawiono metodę przygotowania i implantacji przewlekłego systemu infuzyjnego do podawania substancji neuroaktywnych do mózgu, z wykorzystaniem „mikrokaniuli” o znacznie mniejszej średnicy końcówki. Technika ta pozwala na celowanie w małe podstruktury i ogranicza uraz w obszarze zainteresowania. Niniejsza procedura jest zatem prezentowana jako alternatywa dla konwencjonalnych metod dla badaczy pragnących zminimalizować zaburzenia w badanym regionie mózgu.

Materiały i metody

Zwierzęta i projekt badania

Do zademonstrowania procedury i przetestowania funkcji opracowanej metody wykorzystano osiemnaście dorosłych samców szczurów linii Sprague-Dawley (400-450 g). Dwunastu zwierzętom wszczepiono systemy mikroinfuzyjne, które posłużyły do oceny trwałości funkcji w czasie w ciągu 4 dni. Sześć zwierząt wykorzystano do porównania stopnia urazu i reaktywnej gliozy 5 dni po implantacji albo standardowej kaniuli doprowadzającej 28 ga (N=3), albo mikrokaniuli (N=3) podłączonej do wypełnionej solą fizjologiczną minipompy osmotycznej. Zwierzęta przetrzymywano w przezroczystych plastikowych klatkach, stosując 12-godzinny cykl światła i ciemności, z dostępem do pożywienia i wody ad libitum. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) szpitala McLean, zgodnie z obowiązującymi federalnymi i lokalnymi wytycznymi dotyczącymi eksperymentalnego wykorzystania zwierząt.

Montaż systemu mikroinfuzyjnego

Rysunek 1 przedstawia komponenty i montaż systemu mikroinfuzji. Zalecamy konstruowanie i implantację systemu z zachowaniem technik sterylnych. Ponadto, aby zapobiec przedostaniu się powietrza do systemu, jest on montowany podczas zanurzenia w kąpieli solnej. W niniejszych badaniach zastosowano mini-pompy osmotyczne (MOPs) (ALZET, model #1002, Cupertino, CA) o czasie działania 14 dni, szybkości przepływu 0,25 µL /hr i pojemności 98,6 µL. Jednakże, ponieważ zbyt wysokie szybkości przepływu mogą zalać mniejsze obszary zainteresowania w mózgu i spowodować uszkodzenia strukturalne, szybkość przepływu w tych badaniach została zmniejszona do 0,125 µL /hr poprzez pokrycie jednej połowy pompy MOP parafiną zgodnie z instrukcjami producenta. W celu oceny urazów miejscowych pompy MOP wypełniono sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Do oceny trwałości funkcji systemów mikroinfuzji wybrano Fast Green (1% w soli fizjologicznej, Fisher Scientific, Park Lane Pittsburgh, PA) jako roztwór testowy ze względu na jego niską toksyczność, zdolność do dyfuzji w żywej tkance mózgowej oraz masę cząsteczkową (808,84) znajdującą się w górnej granicy zakresu dla „małych cząsteczek” (<1000), które są powszechnie stosowane w przewlekłej infuzji (np. muscimol, picrotoxin, fluoxetine itp.).

Rycina 1: Montaż systemu mikroinfuzji. (A) Komponenty systemu rozmieszczone w pozycjach odpowiednich do montażu. Należy zauważyć, że kołnierz rurki modulatora przepływu został odłamany. Zaleca się przymocowanie drutu pozycjonującego tuż przed implantacją (patrz tekst). (B) Zmontowany system mikroinfuzji przed przymocowaniem drutu pozycjonującego i implantacją.

Przygotowanie mikrokaniuli

Mikrokaniulę można wykonać za pomocą standardowego poziomego lub pionowego wyciągacza elektrod (Stoelting Co., Wood Dale, IL), stosując ustawienia umożliwiające otrzymanie szklanej elektrody z długim, łagodnie zwężającym się trzoniem (Ryc. 2A). Do tego celu odpowiednia jest rurka borokrzemianowa (część 1B100F-6, 1,0 mm, 6 cali; World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL), ponieważ ma ona stosunkowo niską temperaturę topnienia, co pozwala na późniejsze gięcie za pomocą skupionego ciepła. Najbardziej dystalną część prostej mikrokaniuli można odciąć nożyczkami sekcyjnymi lub wykonać kontrolowane przełamanie za pomocą mikropincety (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL), aby uzyskać pożądany końcowy rozmiar końcówki (50 µm w niniejszych demonstracjach); do prowadzenia i potwierdzenia pożądanego rozmiaru przydatny jest mikrometryczny pomiarnik przedmiotowy. Odciętą końcówkę można krótko podgrzać, czyli „wypolerować ogniem”, aby usunąć szorstkie lub ostre krawędzie. Następnie, aby nadać mikrokaniuli kąt prosty w określonej odległości od jej końcówki (Ryc. 2B), używa się cewki grzejnej wyciągacza elektrod lub palnika Bunsena, umieszczając rurkę borokrzemianową w cewce grzejnej (lub w płomieniu palnika) i przykładając delikatną siłę pincetą do części dystalnej podczas podgrzewania rurki. Wyznaczoną długość mikrokaniuli dystalnie od nadanego kąta prostego ustala się na podstawie głębokości docelowego obszaru mózgu (np. 5 mm), biorąc pod uwagę grubość czaszki (~1 mm) oraz odległość roboczą nad czaszką (np. 1-2 mm). Zatem wyznaczona odległość od końcówki mikrokaniuli do kąta prostego w niniejszych demonstracjach wynosiła 7-8 mm. Następnie za pomocą rylca diamentowego odcina się rurkę borokrzemianową w odległości około 8 mm proksymalnie od kąta prostego.

Rysunek 2: Przygotowanie mikrokaniuli. (A) Do wytworzenia mikrokaniuli z długim, zwężającym się trzoniem używa się wyciągacza elektrod (Stoelting Co. Wood Dale, IL). (B) Cewka grzewcza może zostać zmieniona orientacją dla ułatwienia pracy; mikrokaniulę umieszcza się wewnątrz cewki, co pozwala na wykonanie zgięcia pod kątem prostym za pomocą pęsety podczas podgrzewania szklanej rurki.

Po przygotowaniu odpowiedniej liczby mikrokanul zaleca się ich sterylizację tlenkiem etylenu lub w autoklawie. Najdalszy odcinek 1-2 mm mikrokanuli można oznaczyć sterylnym markerem chirurgicznym (lub niezmywalnym pisakiem przed sterylizacją), aby umożliwić łatwą wizualizację końcówki mikrokanuli podczas zabiegu chirurgicznego.

Przygotowanie MOP

MOP-y przygotowano zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, plastikową kryzę z rurki MOP wykonanej ze stali nierdzewnej („modulator przepływu”) usuwa się najpierw za pomocą nożyczek lub kleszczy kostnych. Odcinek rurki polietylenowej (Plastics One, Roanoke, VA, #C312 VT; OD, 1,22 mm; ID: 0,72 mm) mocuje się do fragmentu rurki ze stali nierdzewnej, w którym wcześniej znajdowała się kryza (~4 mm), wsuwając rurkę stalową do światła rurki polietylenowej i zabezpieczając połączenie odpowiednim klejem na zewnętrznym obwodzie. Szczególnie użyteczny jest LumaBond (myNeuroLab, Inc., St. Louis, MO), ponieważ utwardza się w ciągu kilku sekund po wystawieniu na działanie skupionego światła (np. z lampy światłowodowej). Długość rurki powinna odpowiadać odległości między podstawą czaszki zwierzęcia a najbardziej rostralną częścią łopatki (np. około 1,5-3,0 cm w przypadku szczurów laboratoryjnych). Pompę napełnia się zgodnie z instrukcją, a stalową rurkę ALZET, z przymocowanym do jej końca odcinkiem rurki polietylenowej, wprowadza się do napełnionej pompy. Mała objętość roztworu z pompy zostanie wypchnięta na zewnątrz miejsca styku pompy z rurką (należy ją osuszyć) oraz do proksymalnego odcinka rurki polietylenowej. Napełnioną pompę z przymocowaną rurką inkubuje się następnie w sterylnej soli fizjologicznej przez 12 godzin w temperaturze 37°C. Jeśli pompa działa prawidłowo, po tym okresie inkubacji powinno być widać, że płyn przemieścił się o kilka milimetrów wewnątrz rurki polietylenowej.

Budowa systemu mikroinfuzyjnego

Pompa wraz z przymocowanym przewodem zostaje zanurzona w 10 cm szalce Petriego zawierającej sterylną sól fizjologiczną, a pozostałe w przewodzie z polietylenu powietrze jest usuwane za pomocą strzykawki wypełnionej tym samym roztworem, która została wyposażona w przewód o małej średnicy, możliwy do wprowadzenia do wnętrza przewodu polietylenowego. W ten sposób do przewodu polietylenowego można wstrzyknąć roztwór w celu zastąpienia powietrza. Analogicznie, mikrokaniulę zanurza się w kąpieli z soli fizjologicznej i usuwa powietrze poprzez wstrzykiwanie roztworu. Można to łatwo osiągnąć za pomocą drugiej strzykawki wypełnionej roztworem, wyposażonej w elastyczny (np. silikonowy) przewód, który pasuje do szerokiego (proksymalnego) końca mikrokaniuli.

Następnie proksymalny koniec rurki borokrzemianowej zostaje wsunięty do rurki polietylenowej. Należy pamiętać, że może to wymagać rozszerzenia rurki polietylenowej poprzez mocne wciśnięcie zamkniętych końcówek mikropincety do światła rurki, co poszerzy otwór i ułatwi wprowadzenie rurki borokrzemianowej. System infuzyjny pozbawiony powietrza jest następnie wyjmowany z kąpieli solnej, umieszczany na sterylnej powierzchni i delikatnie osuszany gazą lub patyczkiem bawełnianym. Połączenie mikrokaniuli z rurką polietylenową zostaje zabezpieczone obwodową warstwą kleju (np. LumaBond).

Jeśli system został prawidłowo zmontowany i jeśli MOP nadal funkcjonuje prawidłowo, podczas ostatniego kroku tej procedury na końcówce mikrokaniuli zazwyczaj pojawi się kropla roztworu, gdyż mechanizm osmotyczny w pompie nadal działa podczas przygotowania. Szybkość przepływu MOP można proporcjonalnie zmniejszyć, pokrywając odpowiednią powierzchnię parafiną zgodnie z instrukcją producenta. W niniejszych demonstracjach 50% każdego MOP pokryto, krótko zanurzając go w stopionej parafinie i pozwalając jej ostygnąć, co zredukowało szybkość przepływu o połowę, do 0,125 µL/hr. Gotowy system mikroinfuzyjny jest następnie zanurzony w sterylnym roztworze soli fizjologicznej i przechowywany w temperaturze 37°C do momentu implantacji.

Implantacja systemu mikroinfuzyjnego

System mikroinfuzyjny implantuje się przy użyciu standardowych metod stereotaktycznych, zgodnie z wcześniejszym opisem (Cooley, 1990). Po przygotowaniu pola operacyjnego wykonuje się otwór trepanacyjny w miejscu wprowadzenia mikrokanuły. W razie potrzeby można również umieścić śruby czaszkowe w celu stabilizacji związku wiążącego użytego do zabezpieczenia mikrokanuły. Związek stosowany w tym laboratorium (Geribond, Den-Mat Inc., Santa Maria, CA) nie wymaga dodatkowego zakotwiczenia; jednak powierzchnię czaszki należy przygotować, oczyszczając ją patyczkiem nasączonym acetonem. Na dystalnym końcu drutu wyrównawczego wykonuje się „haczyk” o średnicy 1-2 mm (patrz ryc. 1), co pozwala mu objąć zagięcie rurki borokrzemianowej. Następnie zostaje on zabezpieczony (przy użyciu LumaBond) w orientacji wzdłuż tej samej osi co dystalna część mikrokanuły (która zostanie wprowadzona do mózgu, patrz ryc. 3B). System infuzyjny montuje się następnie na uchwycie stereotaktycznym (ryc. 3), mocując drut wyrównawczy w uchwycie za pomocą zacisku. Do przywiązania pompy infuzyjnej do górnej części manipulatora stereotaktycznego używa się sterylnej nici chirurgicznej, aby ją zawiesić i zapobiec utracie orientacji podczas procedury ze względu na ciężar (i moment obrotowy) pompy (ryc. 3B). Mikrokanułę można następnie ustawić w pożądanej orientacji (np. precyzyjnie pionowo), używając pęsety do delikatnego wygięcia drutu wyrównawczego za zaciskiem uchwytu. Końcówkę mikrokanuły ustawia się nad punktem odniesienia (np. bregma lub lambda), a następnie przesuwa do punktu wprowadzenia do mózgu. Współrzędne stosowane dla zwierząt w tych eksperymentach wynosiły: Bregma +0.2 mm, bocznie 3.2 mm i brzusznie 5.0 mm poniżej opony twardej, przy głowie zwierzęcia w pozycji skull-flat.

Po wprowadzeniu mikrokanuły na odpowiednią głębokość w mózgu, system zostaje unieruchomiony za pomocą masy do tworzenia podstawy (np. Geribond). Podstawę można uformować blisko powierzchni czaszki, aby ułatwić zamknięcie rany. Po utwardzeniu masy podstawy (~2 min), drut wyrównawczy zostaje odcięty równo z podstawą przy użyciu tarczy tnącej wiertarki. Niewielką ilość masy można wykorzystać do zakrycia i wygładzenia pozostałego zadzioru po odciętym drucie. Następnie MOP zostaje wprowadzony podskórnie i umieszczony między łopatkami zwierzęcia. Na koniec ranę przemywa się sterylną solą fizjologiczną, a nacięcie zamyka się za pomocą szwów lub klipsów chirurgicznych (Rys. 3, panel D).

Rycina 3: Implantacja systemu mikroinfuzji. (A) Pozycjonowanie systemu mikroinfuzji na urządzeniu stereotaktycznym. (B) MOP jest przymocowany sterylną nicią chirurgiczną, aby jego ciężar nie zaburzył orientacji mikrokanuli. Mikrokanulę ustawia się do precyzyjnego pionowego wprowadzenia do mózgu za pomocą drutu wyrównawczego. (C) System mikroinfuzji jest ustawiony do umieszczenia i utrwalenia w organizmie zwierzęcia. (D) Konstrukcja systemu mikroinfuzji umożliwia łatwe zamknięcie nacięcia nad niskoprofilowym postumentem, co zmniejsza ryzyko infekcji i minimalizuje dyskomfort zwierzęcia.

Przygotowanie i implantacja standardowego systemu infuzyjnego

Procedura przygotowania standardowego systemu infuzyjnego jest identyczna jak w przypadku systemu mikroinfuzyjnego, z wyjątkiem tego, że mikrokaniulę zastępuje się „kaniulą łączącą z pompą osmotyczną” o średnicy 300 µm (28 ga; Plastics One, Roanoke, VA, #3300PM/SPC; patrz Ryc. 5a). Implantacja standardowego systemu jest również identyczna jak w przypadku systemu mikroinfuzyjnego, w tym mocowanie drutu wyrównawczego, który umożliwia precyzyjne pionowe ustawienie kaniuli wprowadzanej do mózgu.

Histologia i analiza

Aby zbadać zdolność systemu mikroinfuzyjnego do zapewnienia długotrwałego podawania Fast Green, grupy po trzy zwierzęta uśmiercano odpowiednio po 12 hr, 1 dniu, 2 dniach i 4 dniach po operacji. Obiekty poddano głębokiej narkozie za pomocą pentobarbatalu sodu (120 mg/kg, ip), a następnie przeprowadzono perfuzję transkardialną 200 mL 0,1M soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS), a następnie 400 mL 4% paraformaldehydu w 0,1M buforze fosforanowym. Roztwory perfuzyjne utrzymywano w temperaturze 4°C przy pH 7,4 i podawano z szybkością 50 mL na minutę przy użyciu pompy perystaltycznej. Aby usunąć kaniule bez uszkodzenia tkanek pośmiertnych, poddanego perfuzji zwierzę unieruchomiono w aparacie stereotaksycznym, podstawkę przymocowano klejem do sztywnego drutu przytwierdzonego do zacisku ramienia manipulatora, a czaszkę ostrożnie usunięto wokół podstawki za pomocą wiertarki stomatologicznej. W ten sposób podstawkę i znajdującą się pod nią kaniulę usunięto wzdłuż tej samej trajektorii, po której kaniula była wprowadzana podczas implantacji. Następnie mózgi wyjęto z czaszki i zanurzono na 12 godzin w tym samym utrwalaczu.

W celu oceny długotrwałej infuzji Fast Green, wycięto przekroje o grubości 200 µm przy użyciu wibratomu (myNeuroLab, St. Louis, MO) i zamontowano je na mokro na szkiełkach przedmiotowych. Reprezentatywne przekroje obrazowano za pomocą skanera Canon CanoScan LiDE 600F. W celu oceny urazu miejscowego i reaktywnej gliozy, przekroje o grubości 70 µm wykonane wibratomem najpierw zamontowano na mokro i sfotografowano bez barwienia, aby zapobiec zniekształceniom tkanki, które mogą wystąpić podczas procesów histologicznych, takich jak suszenie, barwienie i dehydratacja. Te same przekroje pozostawiono do wyschnięcia na pokrytych żelatyną szkiełkach przedmiotowych, następnie zabarwiono hematoksyliną i eozyną (H&E), odwodniono za pomocą alkohołów o zwiększonym stężeniu i zamontowano szkiełkami nakrywkami z użyciem Permount.

Sąsiednie przekroje o grubości 70 µm poddano standardowej procedurze immunofluorescencji w celu wykrycia kwaśnego białka włókienistego gleju (GFAP), które jest ekspresjonowane przez astrocyty podczas procesu reaktywnej gliozy w odpowiedzi na uraz (Ding et al., 2000; Ma et al., 1991). W skrócie, wolno pływające przekroje przemyto PBS i zablokowano 10% normalnym surowicą osła (NDS) oraz 3% albuminą surowicy bydlęcej w 0,1 M PBS z 0,3% Triton X-100 (PBS/Triton) przez jedną godzinę, a następnie inkubowano z przeciwciałem króliczym anty-GFAP (1:500; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) w PBS/Triton z 1% NDS przez 12 godzin w temperaturze 4°C. Następnie przekroje przemyto PBS i inkubowano z wtórnym przeciwciałem oslim anty-króliczym Alexa Fluor® 594 (1:500; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) w PBS z 5% NDS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Przekroje ponownie dokładnie przemyto PBS i zabarwiono kontrastowo zielonym fluorescencyjnym barwnikiem Nissla NeuroTrace® (1:500 w PBS przez 5 minut; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Po końcowym płukaniu PBS przekroje zamontowano na szkiełkach pokrytych żelatyną i przykryto szkiełkiem cover-slip z zastosowaniem medium Slow-Fade (Molecular Probes). Wszystkie mikrofotografie wykonano przy użyciu mikroskopu Zeiss Axioskop z oprogramowaniem AxioVision (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY).

Wyniki

Badania in vitro

Przed oceną na zwierzętach przygotowano trzy systemy mikroinfuzyjne, umieszczając wypełnione barwnikiem Fast Green MOP-y w jednej komorze (probówka stożkowa 15 ml), a mikrokaniule w drugiej komorze (probówka Eppendorf 1 ml); obie komory zawierały sterylną sól fizjologiczną w temperaturze 37°C. W każdym systemie zaobserwowano ciągły przepływ barwnika podczas 12-godzinnej obserwacji. Rysunek 4 przedstawia działanie typowego systemu w ciągu 3 godzin.

Rysunek 4: Demonstracja in vitro działania systemu mikroinfuzyjnego. (A) Przepływ barwnika Fast Green jest wyraźnie widoczny i niezakłócony z mikrokaniuli na początku okresu testowego in vitro. (B) W miarę kontynuacji przepływu roztwór w zbiorniku nasyca się (B), a ostatecznie staje się nieprzezroczysty z powodu zabarwienia (C).

Ocena systemu mikroinfuzji in vivo

Po perfuzji dokładnie sprawdzono usunięte mikrokanule oraz ich połączenia; wszystkie okazały się całkowicie nienaruszone. W związku z tym nie doszło do żadnego pęknięcia szkła borokrzemianowego wewnątrz tkanki, ani nie stwierdzono żadnych wad w połączeniach komponentów systemu. W celu zastosowania łagodnego przepływu do odciętego końca rurki polietylenowej przymocowanej do mikrokanuli użyto strzykawki Hamiltona o pojemności 10 µL wypełnionej roztworem soli fizjologicznej, z krótkim odcinkiem rurki silikonowej przymocowanym do igły. Wszystkie dwanaście mikrokanul zapewniało ciągły przepływ i nie wydawały się być zatkane. Ponadto po usunięciu każdego MOP z organizmów zwierząt zmierzono objętość pozostałego roztworu, która okazała się odpowiednia dla szybkości przepływu MOP (0.125 µL/hr) oraz czasu jego funkcjonowania.

Podawanie in vivo

Ocena przekrojów koronalnych tkanki infuzowanej Fast Green wykazała niewielką zmienność w rozkładzie barwnika między zwierzętami w grupach w każdym z punktów czasowych (12 hrs, 1 day, 2 days i 4 days). Rysunek 5 przedstawia reprezentatywne obszary dyfuzji Fast Green w tych punktach czasowych, wykazując postępujący wzrost infiltracji barwnika w ciągu czterech dni. Należy zauważyć, że wcześniejsze eksperymenty z zastosowaniem wyższych stężeń Fast Green (np. 5- 15%) prowadziły do szybkiego zmętnienia miąższu, co uniemożliwiało dokładną ocenę funkcji systemu mikroinfuzji w czasie. Chociaż pełen zakres dyfuzji 1% barwnika może być trudny do dokładnego określenia podczas oceny makroskopowej, obszary infiltracji były łatwo rozróżnialne przy powiększeniu 2,5X i są zaznaczone przerywanymi liniami na Rysunku 5.

Rycina 5: In vivo demonstracja ciągłej mikroinfuzji Fast Green. (A) Dwanaście godzin po wewnątrzstriatalnym umieszczeniu systemu mikroinfuzji wypełnionego Fast Green, widoczna jest dyfuzja barwnika do miąższu otaczającego miejsce wprowadzenia mikrokaniuli. Obserwacje po 1 dniu (B), 2 dniach (C) i 4 dniach (D) wskazują na ciągłe podawanie roztworu Fast Green z coraz większymi obszarami infiltracji barwnika. Zewnętrzną granicę dyfuzji zaobserwowano przy użyciu mikroskopii przy małym powiększeniu i zaznaczono tutaj przerywanymi liniami. Pasek skali, 2 mm.

Ocena urazu i gliozy reaktywnej

Makroskopowa obserwacja świeżo wyciętych, niebarwionych przekrojów tkanek wykazała, że system mikroinfuzji doprowadził do zmniejszenia zlokalizowanych urazów w miejscu podania. W przypadku standardowej kaniuli niezmiennie obserwowano uszkodzenie i przemieszczenie większego obszaru tkanki (Ryc. 6B i C), co jest lepiej widoczne przy większym powiększeniu po barwieniu H & E (Ryc. 6D i E). Co więcej, w miejscu standardowej infuzji często stwierdzano gromadzenie się krwi (Ryc. 6D), co sugeruje większy stopień uszkodzenia naczyń krwionośnych i wskazuje na obniżoną integralność bariery krew-mózg.

System mikroinfuzji doprowadził również do znacznego ograniczenia gliozy reaktywnej, co wykazano poprzez zmniejszenie immunoreaktywności GFAP w okolicy miejsca infuzji za pomocą mikrokaniuli (Ryc. 6G) w porównaniu do standardowej kaniuli (Ryc. 6F). Choć barwienie GFAP indukowane mikrokaniulą było podwyższone powyżej poziomów normalnych (Ryc. 6H), nie zaobserwowano tak gwałtownego wzrostu gliozy reaktywnej, jaki występuje przy umieszczeniu standardowej kaniuli i przeprowadzeniu infuzji (6F), gdy zastosowano system mikroinfuzji.

Rysunek 6: Uraz miejscowy wywołany przez mikrokanulę w porównaniu ze standardową kanulą do podawania po 5 dniach infuzji soli fizjologicznej. (A) Mikrokanula wyciągnięta z rurki borokrzemianowej o średnicy końcówki 50 µm umożliwia swobodny, nieograniczony przepływ większości czynników neuroaktywnych, będąc jednocześnie 6-krotnie mniejszą od standardowej kanuli do podawania (28 ga, 0,30 mm). (B, C) Niebarwione preparaty świeże przekrojów czołowych (grubość 70 µm) ilustrujące większe miejscowe uszkodzenie tkanki (strzałki) wywołane przez standardową kanulę (B) w porównaniu z mikrokanulą (C). (D, E) Mikrofotografie przy większym powiększeniu przekrojów barwionych H&E przedstawionych odpowiednio w B i C. Standardowa kanula spowodowała rozleglejszy uraz traumatyczny, co zilustrowano w D, przemieszczając większy obszar tkanki i powodując większe uszkodzenie naczyń krwionośnych, na co wskazuje obecność krwi w jamie uszkodzenia (strzałka). Zmiana wywołana przez mikrokanulę jest jednak znacznie mniejsza i mniej destrukcyjna dla tkanki w miejscu infuzji. (F, G, H) Immunofluorescencja przeciwko GFAP wykazuje gwałtowny wzrost liczby astrocytów GFAP+ wokół uszkodzenia po standardowej kanuli (F) w porównaniu z mikrokanulą (G) oraz prawidłowym, nieuszkodzonym prążkowiem (H). Paski skali: A i B, 1 mm; D - H, 250 µm.

Dyskusja

Różne badania wykazały, że zmniejszenie rozmiaru kaniuli do infuzji wewnątrzczaszkowych redukuje urazy tkankowe i uszkodzenia bariery krew-mózg (Perry et al., 1993), zmniejsza stan zapalny i osłabia odpowiedź immunologiczną (Finsen et al., 1991) oraz ogranicza reaktywną gliozę (Nikkhah et al., 1994). Przedstawiamy tutaj metodę przewlekłego podawania substancji neuroaktywnych do mózgu za pomocą mikrokaniuli o średnicy sześciokrotnie mniejszej w porównaniu do konwencjonalnie stosowanych kaniuli do infuzji. Wykazaliśmy, że ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mini-pompy osmotyczne (MOPs)	Narzędzie	ALZET	model #1002
Wyciągacz elektrod	Narzędzie	Stoelting Co.
Rurki borokrzemowe	Chirurgia	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-6
Mikropincety	Chirurgia	World Precision Instruments, Inc.
Rurki polietylenowe	Chirurgia	Plastics One	#C312 VT
LumaBond	Odczynnik	myNeuroLab, Inc