Trans-Mitochondrialne Generozowanie Cybryd z Trombocytów Pacjentów z mtDNA: Skuteczny Protokół Optymalizujący Selekcję Kolonii i Walidację Funkcjonalną

Podsumowanie

Opisujemy zoptymalizowany protokół generacji hybryd trans-mitochondrialnych z trombocytów pacjentów z mtDNA, z naciskiem na parametry wzrostu i izolację kolonii. Takie podejście umożliwia badanie wariantów DNA mitochondrialnego na różnych poziomach heteroplazmii na wspólnym podłożu nuklearnym, aby określić ich funkcjonalne znaczenie na aktywnościach enzymatycznych łańcucha transportu elektronu i zintegrowanej zdolności oddechowej.

Streszczenie

Generowanie linii komórek cybrydowych trans-mitochondrialnych stanowi metodę standardową w ocenie patogenności, umożliwiając analizy biochemiczne konkretnego wariantu DNA mitochondrialnego (mtDNA) o wysokim i niskim odsetku (poziomach heteroplazji) w otoczeniu identycznego mtDNA i jądrowego genomu. Historycznie, proces tworzenia cybrydów był żmudny i mało efektywny. Przedstawiamy tutaj wysoce efektywny i skuteczny protokół generowania linii komórek cybrydowych trans-mitochondrialnych poprzez fuzję ludzkich płytek krwi z standardową linią komórek osteosarcoma 143B, aby uzyskać izogenną podstawę jądrową pozbawioną mtDNA (komórki Rho⁰). Izolowanie komórek pozwala na uchwycenie danego wariantu mtDNA, aby utworzyć stabilne linie komórek z różnymi stopniami heteroplazji lub porównać różne efekty wynikające z odmiennych haplogrup mitochondrialnych. Ponieważ cybrydy pochodzące od pacjentów z chorobami mitochondrialnymi mogą być trudniejsze do utworzenia z wykorzystaniem standardowych protokołów, obecna metodyka koncentruje się na izolowaniu wariantów mtDNA, gdzie aktywność łańcucha transportu elektronu jest zaburzona. Przedstawiamy tutaj techniki wyboru kolonii, które skracają czas i poprawiają wydajność generowania wysokiego poziomu heteroplazji mutacji mtDNA w cybrydach. Przedstawiamy przykład generowania cybrydów dla wariantu o nieznanym znaczeniu w MT-ND1, m.3985G>A (p.E227K). Analizujemy efektywność procesu generowania cybrydów przy użyciu tego protokołu i przeprowadzamy badania funkcjonalne z wykorzystaniem wysokiej rozdzielczości respirometrii. Mutacje cybrydów MT-ND1 m.3985G>A o wysokim poziomie heteroplazji wygenerowane za pomocą tego protokołu wykazują upośledzoną oddychalność mitochondrialną zależną od kompleksu I w porównaniu do kontroli typu dzikiego, co sugeruje, że mutacja m.3985G>A jest prawdopodobnie patogenna.

Wprowadzenie

Ustanowienie patogenności mutacji DNA mitochondrialnego (mtDNA) jest wyzwaniem ze względu na ich rzadkość, heteroplazmię polegającą na zmiennych poziomach zmutowanego i dzikotypowego genomu mtDNA w różnych tkankach, różnorodne mechanizmy patofizjologiczne i złożone interakcje z tłem genomu jądrowego^1,2,3,4. Z tych powodów linie komórek cybrydowych z przeniesieniem mitochondria są nadal metodą złotych standardów do ustalania patogenności wariantów mtDNA^5,6,7,8,9,10 (Rysunek 1). Linie komórek cybrydowych zawierają izogenniczne tło jądrowe i mitochondria o określonym procentowym stężeniu heteroplazmi dla badanego wariantu mtDNA^11,12. W ten sposób, testy funkcjonalne takie jak respirometria (poprzez polarografię) lub testy aktywności enzymów transportu elektronu (poprzez spektrofotometrię) mogą być przeprowadzane w liniach cybrydowych o stężeniu heteroplazmi od 0% do 100%, aby określić potencjalne patogenne efekty danego wariantu mtDNA, jak również względny wpływ haplogrup mitochondrialnych, które mogą się różnić między liniami cybrydowymi¹. Inne typy komórek mogą być używane do badania patogenności i są najlepiej stosowane jako uzupełnienie generacji cybrydów i analizy funkcjonalnej, ponieważ każdy typ komórki ma swoje zalety i wady. Fibroblasty pacjenta pochodzą bezpośrednio od pacjenta, ale są ograniczone w dziedziczonej heteroplazmi i brak izogenowe kontroli jądrowej, aby wyeliminować efekty genów jądrowych. Edycja mtDNA staje się coraz bardziej popularna, ale cierpi na edycję niedocelowych i ograniczone edytowalne miejsca w mtDNA¹³. Pochodne komórki macierzyste pluripotencjalne (iPSCs) mogą być zróżnicowane, aby badać efekt mutacji na różnych typach komórek, takich jak neurony i komórki zwojowe siatkówki, ale indukcja pluripotencji może prowadzić do utraty wariantu mtDNA lub skutkować dodatkowymi de novo wariantami¹⁴. Badanie cybrydów polega na utworzeniu bardziej sztucznego systemu opartego na tle jądrowym linii komórkowych nowotworowych (klasycznie osteosarkoma 143B), ale klasycznie dobrze się rozwija, co sprawia, że jest przydatne w badaniach wysoko przepustowości kandydatów do interwencji. Ograniczenia dotyczące generacji cybrydów na wysokim poziomie heteroplazmi obejmują jakość płytek krwi, początkową heteroplazmię i selektywne wady mutantycznych mitochondriów, które są długo omawiane w tym protokole.

Mimo że generacja cybrydów jest standardem złotem w funkcjonalnym określaniu patogenności wariantów mtDNA, niewiele laboratoriów generuje cybrydy w celu badania chorób mitochondrialnych^{9,10,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27}. Zamiast tego, więcej cybrydów jest generowanych w celu badania raka i starzenia się^28,29. Tutaj używamy podejrzanego przypadku pacjenta z chorobą mitochondrialną, aby pokazać strategie optymalizacji opracowane w celu ułatwienia generacji cybrydów z płytek krwi pacjentów z mutacjami mtDNA, w tym procesy selekcji i przygotowania komórek potrzebne do ustanowienia linii komórek cybrydowych o wysokim lub niskim poziomie heteroplazmi dla docelowego wariantu mtDNA. Szczególnie demonstrujemy metodykę generowania linii komórek cybrydowych dla podjednostki zespołu I (CI) MT-ND1 wariantu m.3985G>A, w którym przeprowadzamy badania biochemiczne, które pokazują patogenną naturę tego wariantu. Rysunek 2 przedstawia harmonogram generacji cybrydów, gdzie główne kroki metodologiczne obejmują fuzję, selekcję i metody izolacji, aby uzyskać odrębne kolonie.

Protokół

Płytki krwi zostały uzyskane zgodnie z badaniem IRB Szpitala Dziecięcego w Filadelfii (CHOP) nr 08-6177.

1. Przygotowanie płytek

1. Dzień 1: Pobranie krwi do probówek z buforem kwasu cytrynowego i dekstry (ACD), gdy tylko jest pobranych.
   UWAGA: Krew należy umieścić na obracaczu natychmiast. Idealnie płytki powinny być pozyskiwane maksymalnie 4 godziny po pobraniu krwi.
2. Zapisanie objętości krwi. Zalecana objętość krwi wynosi 5–6 ml.
3. Centryfugacja krwi w temperaturze 200 × g przez 20 min w temperaturze 12 °C.
   UWAGA: Wirowanie w temperaturze 12 °C zachowuje integralność próbki i zapobiega aktywacji płytek.
4. Przeniesienie surowiczej części (osocza) do nowej probówki do wirowania.
5. Zapisanie objętości osocza.
6. Wirowanie osocza w temperaturze 1500 × g przez 20 min w temperaturze 12 °C.
7. Zapisanie szacunkowej objętości pelletu płytek.
   UWAGA: Zbyt dużo płytek może być utrudniające w tym protokole. Po fuzji, podczas rozsiewu komórek Rho⁰ i płytek, nadmiar płytek może przykleić się do dna kolby i uniemożliwić przyleganie komórek Rho⁰. Zaleca się użycie mniej niż 50 μL objętości pelletu płytek do fuzji. Nadmiar płytek można zamrozić, dzieląc je w następujący sposób.
8. Usunięcie surowiczej części.
   UWAGA: Jeśli pellet jest duży, usunięcie pelletu można wykonać poprzez aspirację. Płytki pacjenta są czasem drastycznie zmniejszone w liczbie i nie są bardzo lepkie. Jeśli tak jest, użyj pipety, aby powoli usunąć osocza.
9. Jeśli kontynuuje się z świeżymi płytkami, zawieś pellet w 1 ml modyfikacji Spinnera minimalnego środowiska Eagle (SMEM) i przenieś do mikroprobówki.
10. Jeśli zamraża się, zawieś pellet (płytki) w 1,05 ml SMEM i 450 μL roztworu do zamrażania płytek (350 μL surowicy wołowej [FBS] + 100 μL dimetylosulfonu [DMSO]).
    UWAGA: Niektóre płytki pacjentów nie są stabilne podczas procedury zamrażania, a po zamrożeniu nie można uzyskać wysokiego mutanta cybrydu. Zaleca się użycie świeżej preparacji.
11. Jeśli komórki Rho⁰ nie są gotowe na czas, umieść płytki w temperaturze 37 °C z lekkim wstrząsaniu z prędkością 60 rpm.
    UWAGA: Najlepiej jest skorygować czas, aby płytki i komórki Rho⁰ były gotowe w tym samym czasie. Nie zaleca się czekać więcej niż 2 godziny.

2. Przygotowanie komórek Rho⁰

1. Użyj świeżo rozmrożonych komórek osteosarcoma Rho⁰ 143B lub komórek Rho⁰, które rosły do prawie konfluencji.
   UWAGA: Zaleca się użycie komórek Rho⁰, które rosły w inkubatorze do prawie konfluencji. Można użyć świeżo rozmrożonych komórek Rho⁰, ale zaleca się użycie zamrożonego fiolka komórek Rho⁰ o wysokiej gęstości komórek. Pozostaw komórki, aby przylegały przez dwie lub więcej godzin przed fuzją.
2. Spłucz kolbę T75 5 ml buforem PBS.
3. Dodaj 1 ml trypsyny-EDTA 0,25%, aby pokryć komórki Rho⁰.
4. Inkubacja przez 5 min w temperaturze 37 °C.
5. Po potrząśnięciu kolby spłucz dno kolby 5 ml SMEM.
6. Zbieranie komórek Rho⁰ w 15 ml stożkowej probówce.
7. Wirowanie w temperaturze 200 × g przez 5 min, aby skoncentrować pomiar liczby komórek.
8. Usunięcie surowiczej części i ponowne zawieszenie w 1 ml SMEM.
9. Zliczenie komórek.
   UWAGA: Idealnie powinno być 1,5 miliona komórek na każdą fuzję; jednak udane fuzje były wykonywane nawet z tak małymi jak 30 tysięcy komórek.
10. Rozdzielanie 1,5 miliona komórek do 1,5 mikroprobówek i doprowadzenie objętości do 1 ml.
    UWAGA: Upewnij się, że masz dodatkową probówkę "fuzji kontrolnej". Ta probówka będzie zawierała tylko komórki Rho⁰ i zostanie użyta do pomocy w procesie selekcji.
11. Wirowanie płytek w temperaturze 1700 × g przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Komórki Rho⁰ są wrażliwe na niskie temperatury.
12. Usunięcie surowiczej części z płytek.
13. Dodanie 1 ml komórek Rho⁰ na pellet płytek.
14. Wirowanie komórek Rho⁰ i płytek w temperaturze 200 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej.

3. Fuzja

1. Usunięcie surowiczej części z komórek Rho⁰ i pelletu płytek.
2. Dodanie 150 μl buforu do fuzji (50% polietylenoglikolu [PEG]/10%DMSO) i triturowanie przez 90 s, aby ponownie zawie

Wyniki

Aby zademonstrować różnice metodologiczne i drogę do optymalizacji protokołu, przedstawiamy wyniki generacji cybrydów od jednego pacjenta z podejrzeniem choroby mitochondrialnej, który posiada wariant o nieznanym znaczeniu (VUS) w MT-ND1 zespołu I (CI) łańcucha transportu elektronu. Po klinicznym sekwencjonowaniu genomu mtDNA w wielu tkankach w dwóch różnych laboratoriach diagnostycznych zatwierdzonych przez CLIA, jedynym podejrzanym wariantem patogennym był MT-ND1 m.3985G>A. Heteroplazmia we krwi pacje...

Dyskusja

Przedstawiamy tutaj wysoce wydajny protokół do generowania linii komórek cybrydowych trans-mitochondrialnych z płytek krwi pacjentów z mutacjami mtDNA. Demonstrujemy możliwość zastosowania protokołu w przypadku wariantu MT-ND1 o niepewnym znaczeniu, jak również znaczenie starannego rozważenia parametrów wzrostu i selekcji. Po optymalizacji tych głównych kwestii, udało się wybrać cybrydy zawierające warianty mtDNA, które mogą upośledzać funkcję łańcucha oddechowego. Ten protokół może być wykorzystany do generowan...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ADP	Sigma Aldrich	A5285-1G
Antimycyna A	Sigma Aldrich	A8674-25MG
Askorbinian	Sigma Aldrich	11140-250G
Azyd	Sigma Aldrich	S2002-100G
Dializowane FBS	Fisher Scientific	35071CV
Digitonina	Sigma Aldrich	D141-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	Cybrid media
DMEM	Corning	10-017-CM	Media selekcyjne
FBS	Cytiva	SH30910.03
FCCP	Apex Bio	B5004
Glutamina	Sigma Aldrich	G5889-100G
Graphpad Prism	Graphpad
Hybri-Max	Sigma Aldrich	P7306	bufor fuzyjny
Malanian	Sigma Aldrich	M1000-100G
Bufor MiR05	Oroboros Instruments	60101-01
O2K respirometr	Oroboros Instruments	C-0050
Oligomycyna	Sigma Aldrich	O4876-5MG
Pirogronianu	Sigma Aldrich	P2256-100G
Rotenon	Sigma Aldrich	R8875-1G
SMEM	Sigma	M8167
Bursztynian	Sigma Aldrich	S2378-100G
TMPD	Sigma Aldrich	T3134-5G
Trypsyna-EDTA 0,25%	Thermo Scientific	25200056
Uridynian	Sigma Aldrich	U3750-25G