Artykuł metodologiczny

Kardioonkologiczny model mysi kardiotoksyczności indukowanej antracyklinami u immunokompetentnych myszy z nowotworem piersi

6 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71633

⸱

1 października 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1INSERM UMR-S 942 MASCOT, Cardiovascular Biomarkers, Pathophysiology, and Therapeutic Strategies - CIRCUS, Paris Cité University, 2Medical and Surgical Intensive Care Unit, University Hospital Avicenne, AP-HP

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Klinicznie istotne modele mysie kardiotoksyczności indukowanej antracyklinami są rzadkie. W niniejszej pracy zaproponowano model z wykorzystaniem immunokompetentnych myszy z nowotworem, które otrzymują leczenie przeciwnowotworowe, co naśladuje protokoły kliniczne stosowane u pacjentów onkologicznych.

Streszczenie

Ostatnia aktualizacja Europejskiego Towarzystwa Kardiologicznego dotycząca przedklinicznych modeli dysfunkcji serca związanej z terapią nowotworową podkreśla krytyczną potrzebę opracowania bardziej reprezentatywnych i translacyjnych modeli in vivo. Wskazuje ona na konieczność tworzenia modeli wykorzystujących immunokompetentne zwierzęta z nowotworem, z uwzględnieniem wielu szczepów oraz obu płci, aby dokładniej odzwierciedlić heterogeniczność obserwowaną w populacjach klinicznych. W związku z tym opracowano klinicznie istotny model kardiotoksyczności indukowanej antracyklinami (AIC) u zwierząt z nowotworem piersi. W zależności od tła genetycznego myszy, podskórnie w dolny gruczół mleczny samców i samic wstrzyknięto odpowiednio komórki 4T1Luc (200k komórek) myszom Balb/c lub komórki PY8119 (200k komórek) myszom C57Bl/6J. Wzrost guza monitorowano za pomocą bioluminescencji i palpacji. Gdy masa guza była wykrywalna metodą palpacyjną, 2 tygodnie po wstrzyknięciu komórek nowotworowych, zwierzęta otrzymały przeciwnowotworowe leczenie doksorubicyną. Tolerancja myszy na doksorubicynę była zależna od szczepu. Funkcję serca oceniano przed rozpoczęciem protokołu (poziom bazowy) oraz co tydzień po nim, wykonując echo serca u myszy znieczulonych ketaminą. Kardiotoksyczność zdefiniowano jako spadek frakcji skracania lewej komory o co najmniej 10% względem poziomu bazowego, wartość bezwzględną <50% oraz częstość akcji serca >300 BPM. Protokół był powtarzalny przy 99% skuteczności rozwoju guza i >80% przeżywalności myszy. Kardiotoksyczność zaobserwowano u >90% leczonych myszy z nowotworem i podanych doksorubicyną.

Wprowadzenie

Kardioonkologia ma na celu poprawę wyników sercowo-naczyniowych u pacjentów onkologicznych przed, w trakcie i po chemioterapii. Modele przedkliniczne odegrały ogromną rolę w lepszym zrozumieniu współzależności między tymi dwiema chorobami. Niedawno, w badaniu zmieniającym paradygmat, zaobserwowano, że myszy z wrodzoną skłonnością do spontanicznych polipów jelitowych rozwijały więcej tych guzów po zawale mięśnia sercowego i okresie niewydolności serca (HF), co wykazało bezpośredni wpływ zdarzenia sercowo-naczyniowego na wzrost guza1. Od tego czasu w licznych badaniach zgłaszano spójne wyniki w różnych typach nowotworów i szczepach myszy, często wskazując na konkretne szlaki molekularne lub białka, co wzmocniło koncepcję, że progresja nowotworu jest przyspieszana przez choroby układu sercowo-naczyniowego (CVDs)2,3,4,5.

Odwrotnie, wpływ nowotworów na ryzyko rozwoju CVDs jest badany od kilku dekad. Dane epidemiologiczne wskazują, że osoby po przeżyciu nowotworu częściej zapadają na CVDs, co wynika zarówno ze wspólnych czynników ryzyka obu tych schorzeń, jak i ze znanych różnych toksyczności stosowanych metod leczenia przeciwnowotworowego 6,7,8,9,10. W badaniach przedklinicznych powszechnie wykorzystywano modele kacheksji indukowanej nowotworem w celu zidentyfikowania specyficznych celów, które mogłyby zostać zmodyfikowane u ludzi w celu poprawy długoterminowych wyników sercowo-naczyniowych11,12,13,14. Można jednak argumentować, że modele te w niewielkim stopniu odzwierciedlają typową sytuację kliniczną, ponieważ pacjenci są często leczeni przed wystąpieniem tego zaawansowanego zespołu nowotworowego, niemniej jednak przypuszcza się, że ogólna kacheksja wciąż w znacznym stopniu przyczynia się do całkowitej śmiertelności z powodu nowotworów15.

W pierwszych wytycznych z zakresu kardioonkologii Europejskiego Towarzystwa Kardiologicznego (ESC) stwierdzono, że konieczne są dalsze badania w celu lepszego zrozumienia zależności między nowotworami a chorobami układu sercowo-naczyniowego (CVDs)16. Dokładniej rzecz ujmując, w niedawnej aktualizacji grupy roboczej ESC ds. kardioonkologii wskazano, że badania przedkliniczne mają kluczowe znaczenie dla wypełnienia tej luki w wiedzy, szczególnie w przypadku modeli z wykorzystaniem zwierząt z implantowanym guzem17. Ponadto konieczna jest lepsza korelacja między badaniami przedklinicznymi a klinicznymi, ponieważ większość współczesnych badań klinicznych dotyczy metod leczenia przeciwnowotworowego, które były słabo badane w warunkach przedklinicznych18.

Antracykliny (AC), takie jak doksorubicyna (Dox), są powszechnie stosowane w chemioterapii wielu guzów litych oraz nowotworów krwi. Nawet przy dostępności nowocześniejszych terapii, ich niska cena, dobrze udokumentowane skutki uboczne i ewidentna skuteczność sprawią, że leki te będą stosowane przez wiele kolejnych lat19,20. Liczne dowody sugerują, że AC wywołują zależną od dawki kardiotoksyczność, objawiającą się głównie dysfunkcją lewej komory, co stanowi obecnie jeden z głównych czynników ograniczających ich zastosowanie kliniczne i często budzi niepokój kardiologów onkologicznych21,22. Literatura w tym zakresie opiera się głównie na badaniach nad rakiem piersi ze względu na jego wysoką zapadalność u ludzi, jednak badania kliniczne nad chłoniakami, rakiem płuc i białaczkami dostarczają podobnych obserwacji23. W związku z tym od kilku dekad prowadzone są badania przedkliniczne mające na celu zrozumienie podstawowych mechanizmów patofizjologicznych kardiotoksyczności indukowanej antracyklinami (AIC), które wykazały powszechny udział stresu oksydacyjnego, bezpośredniego i pośredniego uszkodzenia DNA, ferroptozy oraz uszkodzeń mitochondriów23,24.

Niemniej jednak istnieją ograniczone dowody na to, jak zapobiegać AIC lub jak je leczyć. Powszechnie stosowane leki w niewydolności serca były testowane w badaniach klinicznych z mieszanymi wynikami, a określenie optymalnego czasu podania nielicznych potencjalnych kandydatów okazało się trudne21,23,25,26,27,28. Deksrazoksan, lek modulujący poziom żelaza, wykazał obiecujące wyniki w zapobieganiu AIC, jednak obecnie nie jest stosowany systematycznie21. Podawanie AC w formach innych niż wolne w krwi, na przykład zamkniętych w liposomach, również przyniosło obiecujące rezultaty, ale wciąż napotyka trudności w zastąpieniu konwencjonalnych AC, częściowo ze względu na ich koszt21.

Jednym z wyjaśnień tej sytuacji jest brak klinicznie istotnych modeli zwierzęcych do badania AIC.17U ludzi Dox podaje się w określonym czasie. poprzez powtarzane iniekcje, a większość AIC obserwuje się w ciągu pierwszego roku po leczeniu. Jednakże, jak wykazano w niedawno opublikowanym przeglądzie, w literaturze odnotowuje się duże zróżnicowanie w protokołach badań na zwierzętach29Klasycznym przykładem modelu ostrej kardiotoksyczności są myszy bez guzów, które otrzymały pojedynczą iniekcję Dox w dawce 20 mg/kg.30W typowym modelu przewlekłej kardiotoksyczności w wielu badaniach opisuje się myszy bez nowotworów, które otrzymują jeden zastrzyk doksorubicyny w dawce 5 mg/kg raz w tygodniu, do całkowitej dawki skumulowanej wynoszącej 20 mg/kg.29,31Ten model przewlekłej kardiotoksyczności można zaobserwować również u zwierząt z nowotworem przy tej samej dawce doksorubicyny (Dox); jest to jednak zjawisko rzadko opisywane w literaturze.29,32.

Aby przyczynić się do zmniejszenia tej luki w wiedzy, opracowano pragmatyczny i istotny klinicznie model immunokompetentnych myszy z nowotworem piersi do badania AIC, a mianowicie u myszy Balb/c z linią 4T1, a jego solidność potwierdzono u myszy C57Bl/6J z linią PY8119; w przypadku tych ostatnich, zgodnie z wiedzą autorów, jest to pierwszy raz, gdy model kardioonkologiczny został opracowany z wykorzystaniem potrójnie ujemnego raka piersi w szczepie C57Bl/6J. Przed podaniem zwierzętom Dox, który wykazał kardiotoksyczność, uzyskano dokładne odwzorowanie wzrostu guza poprzez kwantyfikację bioluminescencji oraz wdrożono protokół pobierania organów, aby badać mikrośrodowisko guza równolegle z eksperymentem kardioonkologicznym. Co więcej, zaobserwowano wyniki podobne do opisanych w literaturze w odniesieniu do wrażliwości zależnej od szczepu i płci. Oczekuje się, że niniejsza praca przyczyni się do standaryzacji i usprawnienia protokołów zwierzęcych w przyszłych badaniach kardioonkologicznych, ponieważ myszy C57Bl/6J są niezwykle cenne ze względu na wysoki wskaźnik przeżywalności w eksperymentach AIC29.

Zaletą proponowanej metody jest wykorzystanie szczepu C57Bl/6J, który jest łatwy do modyfikacji genetycznych, posiada dobrze scharakteryzowany genom, jest tani w pozyskaniu oraz wykazuje tolerancję na wysokie skumulowane dawki AC29,33,34. Jeśli w konkretnym badaniu z wykorzystaniem AC konieczne jest znokautowanie genu, model ten jest do tego celu bardzo odpowiedni. Ponadto wykorzystanie raka piersi potrójnie ujemnego pochodzącego z tego szczepu ma znaczenie translacyjne, ponieważ kobiety z rakiem piersi potrójnie ujemnym to pacjentki, które najczęściej otrzymują AC i mają najgorsze rokowania35. Stosowanie tego modelu prawdopodobnie przyczyni się do pogłębienia wiedzy na temat AIC, szczególnie w odniesieniu do tych pacjentek.

Atutem tego modelu jest również fakt, że myszy są poddawane wstępnemu warunkowaniu guzem, który może realnie wpływać na przebudowę układu sercowo-naczyniowego36,37. Ponadto model ten plasuje się pomiędzy modelami ostrymi a w pełni przewlekłymi AIC, z możliwością wydłużenia czasu monitorowania zwierząt ze względu na ich wysoką przeżywalność, co może mieć dużą wartość w przypadku rozważenia innych cykli AC.

Jednakże model ten prawdopodobnie nie jest najlepiej dostosowany do specyficznej charakterystyki guza na koniec protokołu, ze względu na pragmatyczne podejście do inokulacji nowotworu. Jeśli jest to kluczowe dla hipotezy naukowej, należy zastosować zmodyfikowaną wersję wstrzykiwania guza. Ponadto iniekcja komórek 4T1 u myszy Balb/c jest uznanym modelem w podejściu bardziej onkologicznym, na przykład do badania przerzutów, co nie zostało tutaj opisane i powinno być wzięte pod uwagę, jeśli przerzuty są istotne dla postawionego pytania badawczego38. Model ten jest realizowany na dorosłych myszach; jednakże, jeśli celem jest badanie AIC w kontekście pediatrycznym, należy rozważyć zastosowanie młodszych myszy, dla których odpowiedź na protokół nie została w niniejszej pracy zbadana.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były zgodne z wytycznymi lokalnej komisji etyki ds. zwierząt (Lariboisière-Villemin) i zostały zatwierdzone przez francuskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań (MESRI) w ramach protokołu nr APAFIS 46086. Podczas opracowywania protokołu uwzględniono zasady 3R. Myszy Balb/c i C57Bl/6J zakupiono od producentów zwierząt, takich jak Janvier Labs lub Envigo. W niniejszym protokole myszy w momencie włączenia do badania miały od 10 do 18 tygodni, co odpowiada młodym dorosłym, podobnie jak kobiety cierpiące na trójujemny rak piersi. Zwierzęta utrzymywano w grupach po 2–5 osobników w pomieszczeniu z 12-godzinnym cyklem ciemności/światła, temperaturą pokojową od 20 °C do 24 °C i wilgotnością od 30% do 70%. Wodę i pokarm podawano ad libitum. Podczas realizacji protokołu zachowano ostrożność, aby przestrzegać humanitarnych punktów końcowych zdefiniowanych przed rozpoczęciem procedury, zgodnie z opisem w Tabeli uzupełniającej 1. Należy upewnić się, że użyty został filtr izofluranu do zbierania gazów odpadowych, aby zapewnić bezpieczeństwo osobie obsługującej aparat do znieczulania izofluranem. Należy obchodzić się ze zwierzętami z należytą starannością, nosząc rękawiczki i okulary ochronne na każdym etapie protokołu. Postępowanie ze wszystkimi materiałami niebezpiecznymi powinno być zgodne z lokalnymi przepisami instytucjonalnymi; w tym przypadku wszystkie zanieczyszczone próbki (krew, igły, fiolki zawierające doksorubicynę itp.) utylizowano w pojemnikach na odpady medyczne niebezpieczne biologicznie. Przegląd protokołu przedstawiono na Rysunku 1A. Wykorzystane odczynniki i sprzęt wymieniono w Tabeli materiałów.

1. Tydzień 0: Przygotowanie komórek i ich wstrzyknięcie do organizmu zwierzęcia

UWAGA: Poniższe kroki zostały opisane dla komórek 4T1Luc i były identyczne w przypadku użycia komórek PY8119. Należy jednak dostosować je do każdej linii komórkowej zgodnie z zaleceniami producenta. Aby zoptymalizować protokół, jedna osoba może zajmować się przygotowaniem komórek, podczas gdy druga zajmuje się przygotowaniem zwierząt.

  1. Po uzyskaniu konfluencyjnej hodowli komórek w kolbie (konfluencja 80%–90%), należy dodać 3 mL trypsyny i inkubować przez 5 min w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  2. Należy delikatnie opukać kolbę, aby odłączyć wszystkie komórki, unikając powstawania skupisk, a następnie resuspendować je w medium do hodowli komórkowej.
  3. Komórki należy policzyć za pomocą komory Malasseza (lub inną techniką, w zależności od dostępności).
  4. Komórki należy odwirować z prędkością 300 × g przez 5 min, a następnie resuspendować w równiej objętości PBS, aby wstrzyknąć 200 000 komórek w 100 µL.
    UWAGA: Liczbę komórek wybrano na podstawie przeglądu literatury (patrz Tabela uzupełniająca 2).
  5. Za pomocą strzykawki 26 G należy delikatnie pobrać 500 µL zawiesiny komórkowej. Aby uniknąć nadmiernego czasu przebywania zawiesiny komórkowej w strzykawce, zaleca się napełnianie jej objętością mniejszą niż ta niezbędna dla 5 zwierząt.
  6. Równocześnie (jeśli to możliwe) należy umieścić myszy w komorze z izofluranem i szybko wprowadzić w stan znieczulenia za pomocą 3% izofluranu przy przepływie 1 L/min w powietrzu otoczenia. Gdy tylko zwierzę zaśnie, należy ułożyć je w pozycji grzbietowej z pyszczkiem w stożku zawierającym 1% izofluranu.
  7. Za pomocą patyczka kosmetycznego należy nałożyć łagodny krem do depilacji na klatkę piersiową oraz lewą dolną ścianę brzucha zwierzęcia na 1 min. Włosy i krem należy usunąć wodą, a następnie osuszyć skórę chusteczką.
  8. Należy upewnić się, że znieczulenie jest wystarczające, wykonując ucisk palca u nogi.
  9. Należy zlokalizować górny brzuszny lewy sutek mleczny. Należy go delikatnie chwycić pęsetą i unieść do góry (patrz Rycina 1B).
  10. Igłę strzykawki należy wprowadzić podskórnie, aż znajdzie się ona pod gruczołem mlecznym.
  11. Należy wstrzyknąć 100 µL zawiesiny komórkowej. Pod sutkiem powinien utworzyć się pęcherzyk podskórny (patrz Rycina 1C). Zwierzęta kontrolne powinny otrzymać PBS. Randomizację można przeprowadzić za pomocą oprogramowania do randomizacji (takiego jak RandoMice, darmowe narzędzie online) lub poprzez przydzielenie leczenia myszom w zdefiniowanym stosunku 1:1 lub 2:2 (lub wyższym).
  12. Należy delikatnie wyjąć igłę i puścić sutek trzymany pęsetą.
  13. Należy zważyć zwierzę, aby uzyskać wagę wyjściową dla protokołu.
  14. Należy pozwolić zwierzęciu obudzić się w powietrzu otoczenia przed powrotem do klatki.

2. Tydzień 1: Kontrola wzrostu guza za pomocą bioluminescencji

UWAGA: Czynność tę można wykonać w dowolnym dniu po iniekcji w celu kontrolowania wzrostu. Ponadto można ją przeprowadzić w wielu punktach czasowych, jeśli przedmiotem zainteresowania jest tempo wzrostu guza. Jednak po 10–14 dniach sygnał może zanikać z powodu naturalnej selekcji komórek nowotworowych podczas wzrostu raka. Ponadto odrost włosów nie powinien stanowić problemu dla prawidłowej rejestracji fotonów, jeśli protokół został poprawnie wykonany na początku. Reprezentatywne wyniki bioluminescencji ilościowo określonej w dniach 2, 5, 8 i 11 po iniekcji guza przedstawiono na Rysunku 2A,B.

  1. Umieść zwierzęta w komorze z izofluranem i szybko wprowadź w stan znieczulenia przy użyciu 3% isofluranu.
  2. Gdy zwierzęta zasną, wstrzyknij 10 µL/g masy ciała lucyferyny dojszywnie (IP) za pomocą strzykawki 26-G. Unikaj wstrzykiwania lucyferyny po lewej stronie ze względu na obecność guza, który po kilku dniach może być już wyczuwalny.
  3. Umieść myszy w urządzeniu do obrazowania fotonowego w pozycji na plecach, aby zoptymalizować wychwyt fotonów, ponieważ guz znajduje się po stronie brzusznej. Umieść pysk w stożku nosowym i zmniejsz stężenie isofluranu do 1%.
    UWAGA: Prawidłowe umieszczenie 5 zwierząt w urządzeniu do wychwytu fotonów zajmuje pewien czas; zacznij je umieszczać co najmniej 2 min przed rozpoczęciem akwizycji.
  4. Rozpocznij akwizycję aktywności luminescencyjnej 10 min po wstrzyknięciu lucyferyny i kontynuuj ją przez 5 min (zob. Rycina 2A). Tryb akwizycji dla użytego tutaj urządzenia to BLI z czasem 89 ms na klatkę, rozmiarem obrazu 220 mm x 165 mm i rozmiarem piksela BVR wynoszącym 153 µm.
  5. Po zakończeniu akwizycji pozwól zwierzęciu obudzić się na powietrzu przed powrotem do klatki.
  6. Użyj oprogramowania do kwantyfikacji dostosowanego do urządzenia do obrazowania fotonowego, zgodnie z zaleceniami producenta.

3. Tydzień 2: Leczenie doksorubicyną

UWAGA: Ocena echokardiograficzna powinna zostać przeprowadzona przed rozpoczęciem iniekcji Dox. W związku z tym należy wykorzystać znieczulenie wprowadzone po echokardiografii do podania iniekcji, gdy zwierzę śpi, aby zminimalizować stres związany z pierwszym podaniem Dox. Ponadto dawkę skumulowaną należy dostosować do każdego szczepu myszy. W tym przypadku, w oparciu o wcześniejsze dane wewnętrzne oraz literaturę29, zastosowano 16 mg/kg dla myszy Balb/c oraz 24 mg/kg dla C57Bl/6J (patrz Rycina 3A–C).

  1. Resuspendować i rozcieńczyć doxorubicinę w proszku w roztworze soli fizjologicznej. Rozcieńczenie należy przygotować w taki sposób, aby dawka 4 mg/kg Dox odpowiadała objętości 240–360 µL. Sugeruje się zatem przygotowanie roztworu o stężeniu 2 mg/mL, a następnie wykonanie 6-krotnego rozcieńczenia roztworem soli fizjologicznej (stężenie końcowe 0,33 mg/mL).
  2. Dwa tygodnie po wstrzyknięciu komórek nowotworowych upewnić się, że guz jest wyczuwalny w dolnej lewej części brzucha, ale ma wielkość mniejszą niż 1 cm.
  3. Zważyć zwierzę w celu monitorowania utraty masy ciała po leczeniu Dox.
  4. Za pomocą strzykawki 26 G wstrzyknąć odpowiednią objętość, aby osiągnąć dawkę 4 mg/kg IP w dolnej prawej części brzucha. Zwierzęta kontrolne powinny otrzymać roztwór soli fizjologicznej. Randomizację można przeprowadzić zgodnie z krokiem 1.11.
  5. Powtarzać tę procedurę codziennie przez 4 dni, aby osiągnąć dawkę skumulowaną 16 mg/kg (dodać 2 dni, aby osiągnąć 24 mg/kg w przypadku myszy C57Bl/6J).

4. Tydzień 2–5: Monitorowanie kardiotoksyczności

UWAGA: Procedurę tę można przeprowadzać w cyklu tygodniowym. Częstsza ocena wymaga ostrożności, ponieważ zwierzęta są często najbardziej podatne na stres w 3. i 4. tygodniu protokołu, a niektóre szczepy myszy są wrażliwe na narkozę ogólną, co może prowadzić do zwiększonej śmiertelności. Echokardiografię wykonuje się w znieczuleniu ketaminą, aby zoptymalizować szanse na zarejestrowanie dysfunkcji serca, ponieważ izofluran indukuje depresję mięśnia sercowego; dawkę 40 mg/kg stosuje się dla myszy Balb/c, a 80 mg/kg dla myszy C57Bl/6J39. Zaleca się wykonanie jednego badania USG przed wstrzyknięciem guza, aby określić potencjalny wpływ wzrostu nowotworu na funkcję serca przed rozpoczęciem chemioterapii.

  1. Zważ zwierzę. W przypadku zaobserwowania istotnego spadku masy ciała, należy zastosować Tabela uzupełniająca 1.
  2. Zanurz zwierzęta w lekkiej narkozie, podając dożylnie (IP) ketaminę za pomocą strzykawki 26 G w dawce 40 mg/kg (myszy Balb/c) lub 80 mg/kg (myszy C57Bl/6J).
  3. Umieść zwierzę na podgrzewaczu, aby zapobiec hipotermii.
  4. Po uśpieniu zwierzęcia należy je ogolić zgodnie z opisem w punkcie 1.7, aby uzyskać wolną od owłosienia strefę klatki piersiowej.
  5. Dziesięć minut po wstrzyknięciu ketaminy należy przeprowadzić echokardiografię przez maksymalnie 5 min. Należy użyć podgrzanego żelu do USG. W zależności od użytego urządzenia należy skupić się na trybie M i/lub przeprowadzić kwantyfikację odkształcenia (strain).
  6. W przypadku zastosowania trybu M, należy zarejestrować przekroje w połowie komory w widoku długiej osi przymostkowej, obejmujące co najmniej 4 s skurczów, powtarzając czynność przynajmniej 3 razy w celu uzyskania reprezentatywnej średniej funkcji serca myszy (patrz Rycina 4A,B). Tutaj częstotliwość klatek ustawiono na 100 kl./s, częstotliwość nadawania na 38,4 MHz przy mocy 100%, częstotliwość odbioru na 96 MHz, prędkość dźwięku na 1538 m/s, a szybkość sweep na 1200 Hz.
  7. Po około 5 minutach zwierzę będzie zbyt rozbudzone, aby można było przeprowadzić echokardiografię. Po usunięciu żelu użytego do badania ultrasonograficznego umieść zwierzę z powrotem w klatce.
  8. Kwantyfikuj funkcję serca w sposób zaślepiony39,40Istotna dysfunkcja w tym modelu jest definiowana jako wartość o 10% niższa od wartości bazowej oraz wartość bezwzględna <50% skrócenia frakcyjnego (FS) lewej komory, podczas gdy częstość akcji serca pozostaje >300 BPM. Jeśli wartość FS przed przygotowaniem próbki jest zbyt niska, należy rozważyć wykluczenie zwierzęcia z analizy.
    UWAGA: Do każdej analizy ilościowej z 4-sekundowych fragmentów nagrań wymagane są co najmniej 3 cykle pracy serca, jednak w miarę możliwości należy wykorzystać większą liczbę cykli. Jeśli to możliwe, wszystkie badania echokardiograficzne powinny być wykonywane przez tego samego badacza, a analiza ilościowa przez inną osobę, aby zapewnić ślepy przebieg analizy. Zalecenia dotyczące kontroli jakości echokardiografii zostały opublikowane w innym opracowaniu.40.
  9. Przeprowadź analizę statystyczną (patrz krok 6). Rekomendowanym testem do analizy dwóch grup w całym protokole jest dwuczynnikowa analiza wariancji (two-way ANOVA), ponieważ porównywane są dwa czynniki: czas i metoda leczenia.
  10. Należy przeprowadzać tę procedurę w cyklach tygodniowych. Dysfunkcja pojawia się już po jednym tygodniu leczenia doksorubicyną.
    UWAGA: Jeśli w określonym punkcie czasowym po podaniu doksorubicyny (Dox) konieczne jest pobranie krwi, na przykład w celu pomiaru biomarkerów sercowych, należy pobrać krew bezpośrednio po echokardiografii, aby uniknąć kolejnego wstrzyknięcia środka znieczulającego, zminimalizować stres zwierzęcia i zoptymalizować czas.

5. Tydzień 5: Procedura uśmiercania

UWAGA: Optymalnie protokół pobierania organów powinien być przeprowadzany przez dwie osoby.

  1. Po ostatnim badaniu echokardiograficznym w 5. tygodniu, ponownie wstrzyknij zwierzętom ketaminę w dawce 100 mg/kg drogą IP. Zastosuj znieczulenie miejscowe, nakładając kroplę 1% tetracaïny na oko, które zostanie wykorzystane do pobrania krwi.
  2. Używając kapilary heparynowej, wykonaj upuszczenie krwi z splotu zatwarczowego, aby zebrać jak największą ilość krwi do probówki z heparyną (lub kapilary EDTA do probówki z EDTA).
  3. Gdy nie będzie można pobrać więcej krwi, wykonaj zwichnięcie szyi zgodnie z zatwierdzonymi w instytucji protokołami. Zebraną krew natychmiast umieść na lodzie do czasu dalszego przetwarzania, kontynuując protokół uśmiercania opisany w kroku 5.5.
  4. Wiruj krew przy 2000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C, aby oddzielić komórki krwi od osocza. Gwałtownie zamroź probówkę z osoczem w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do dalszej analizy.
  5. Umieść zwierzę na pokrywie z pianki polistyrenowej pokrytej papierem chłonnym i zabezpiecz 4 kończyny za pomocą pinsetów.
  6. Guz powinien mieć znaczną wielkość (co najmniej 2 cm). Wytnij go z szerokim marginesem tkanek wokół guza, aby go oddzielić. Dalszą sekcję można przeprowadzić po zebraniu pozostałych organów opisanych w kroku 5.15.
  7. W oddzielnym obszarze ostrożnie wypreparuj guz za pomocą małych, ostrych nożyczek, trzymając go pęsetą. Aby zwiększyć napięcie bez uszkadzania guza, przypnij nadmiar skóry do pokrywy. Ułatwi to sekcję.
  8. Gdy guz zostanie w pełni wypreparowany, delikatnie oczyść go za pomocą PBS, aby usunąć krew, włosy i inne przylegające zanieczyszczenia. Zważ guz.
  9. Umieść siatkę nylonową o oczkach 22 µm w probówce wirówkowej o pojemności 5 mL, ostrożnie połóż na niej guz i trzymaj na lodzie do czasu wirowania.
  10. Wiruj probówkę przy 100 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C, aby zebrać płyn śródmiąższowy (patrz Rycina 5A). Uzyskana objętość mieści się w zakresie od 1 do 20 µL i często ma czerwony kolor (Rycina 5B). Przenieś go do probówki do mikrowirowania o pojemności 200 µL i przechowuj w temperaturze -80 °C do dalszej analizy.
    UWAGA: Pozostałą część guza można pociąć na mniejsze kawałki, umieścić w probówkach do przechowywania, gwałtownie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze –80 °C do dalszej analizy.
  11. Aby pobrać szpik kostny, przetnij nożyczkami prawą nogę, wypreparuj skalpelem i pęsetą kość udową oraz piszczelową, usuwając wszystkie mięśnie, tkankę łączną i tłuszcz. Odetnij nasady po obu stronach obu kości za pomocą skalpela. Umieść oczyszczone kości w PBS na 12-dołkowych płytkach hodowlanych, kończąc pobieranie organów od myszy, jak opisano w kroku 5.15.
    UWAGA: Bardziej szczegółowe informacje na temat izolacji szpiku kostnego opublikowano w innym opracowaniu41.
  12. Przebij dno probówek do mikrowirowania o pojemności 500 µL igłą 18 G, włóż do nich dwie kości, a następnie umieść probówkę w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 mL wypełnionej 400 µL PBS.
  13. Wiruj probówki przy 10 000 x g przez 1 min w temperaturze 4 °C. Na dnie probówki 1,5 mL widoczny jest pellet komórek; są to wszystkie komórki szpiku kostnego, podczas gdy stroma szpiku kostnego jest wymieszana w PBS. Odsącz cały nadsączek (stroma szpiku kostnego) do osobnej probówki do przechowywania, gwałtownie zamroź materiał w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C.
  14. Za pomocą nożyczek wykonaj cięcie poprzeczne poniżej klatki piersiowej na poziomie przepony i przetnij mostek wzdłuż jego osi podłużnej, aby odsłonić płuca i serce.
    UWAGA: Jeśli jest to wymagane do dalszej analizy, w tym miejscu można przeprowadzić usunięcie krwi pełnej za pomocą roztworu soli fizjologicznej.
  15. Zbierz wszystkie organy potrzebne do analiz biomolekularnych i histologicznych. Zważ je i potnij na mniejsze kawałki, aby ułatwić przyszłe analizy biomolekularne. Gwałtownie zamroź wszystkie probówki w ciekłym azocie natychmiast po pocięciu organu na mniejsze kawałki, a następnie przechowuj je w temperaturze -80 °C.
  16. W przypadku serca oddziel wierzchołek od górnej części serca i umieść go w plastikowych formach wypełnionych OCT. Po umieszczeniu w OCT umieść go w zimnym izopentanie przed gwałtownym zamrożeniem w ciekłym azocie i przechowywaniem w temperaturze -80 °C.

6. Analiza statystyczna

UWAGA: Wszystkie analizy statystyczne oraz wykresy zostały wykonane przy użyciu oprogramowania statystycznego i graficznego, zgodnie z zaleceniami przewodnika statystycznego42.

  1. Przedstawione dane są podane jako średnia ± SEM.
  2. Dla wszystkich wykresów skrócenia frakcyjnego należy zastosować tę samą skalę.
  3. Na każdym wykresie należy zaznaczyć każdą indywidualną jednostkę eksperymentalną (mysz).
  4. W celu oceny normalności rozkładów w każdej grupie eksperymentalnej należy przeprowadzić test Shapiro-Wilka, przyjmując poziom istotności alfa p = 0,05.
  5. W przypadku porównywania dwóch grup należy zastosować test Welcha lub test Manna-Whitneya, w zależności od normalności rozkładu (test Welcha dla rozkładów normalnych w obu grupach, test Manna-Whitneya, jeśli jedna lub obie grupy mają rozkłady nienormalne). Należy wybrać opcję obustronną, przy poziomie ufności wynoszącym 95%.
  6. W celu porównania więcej niż dwóch grup w jednym konkretnym punkcie czasowym należy ponownie określić, czy rozkłady w grupach są normalne, zgodnie z krokiem 6.4. Jeśli rozkład jest normalny, należy przeprowadzić jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie zastosować korektę Holma-Sidaka dla porównań wielokrotnych.
    UWAGA: Jeśli rozkład nie jest normalny, zamiast tego należy przeprowadzić test Kruskala-Wallisa z korektą Dunna dla porównań wielokrotnych. Próg alfa dla całej rodziny testów ustawiono na 0,05 w celu określenia istotności.
  7. W przypadku danych podłużnych do badania różnic między grupami w konkretnym punkcie czasowym zastosowano dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami, a następnie korektę Sidaka dla porównań wielokrotnych. Próg alfa dla całej rodziny testów ustawiono na 0,05 w celu określenia istotności.

Wyniki

Protokół ten, przedstawiony na Rysunku 1A, jest procedurą 5-tygodniową, w wyniku której powstają następujące grupy eksperymentalne: myszy bez nowotworu niepodawane doksorubicyną, myszy bez nowotworu poddawane leczeniu doksorubicyną, myszy z nowotworem niepodawane doksorubicyną oraz myszy z nowotworem poddawane leczeniu doksorubicyną. Liczbę tych grup można podwoić w zależności od tego, czy w badaniu uwzględniono obie płcie. Pierwsze 2 tygodnie wzrostu guza, przed rozpoczęciem leczenia doksorubicyną, są wystarczające, aby nowotwór rozwinął się po wstrzyknięciu 200 000 komórek do 4tego lewego gruczołu mlekowego zwierząt (Rysunek 1B). Potwierdzeniem prawidłowego wstrzyknięcia podskórnego powinno być pojawienie się pęcherzyka pod sutkiem podczas delikatnego podawania zawiesiny komórek nowotworowych (Rysunek 1C). Tabela 1 krótko podsumowuje kluczowe parametry protokołu dla każdego szczepu myszy wraz z głównymi wynikami, które zostaną omówione poniżej.

Rycina 2A przedstawia reprezentatywny obraz sygnału bioluminescencyjnego uzyskanego po wstrzyknięciu lucyferyny jednej myszy bez guza (po lewej) oraz jednej myszy z guzem (po prawej), przy czasie zbierania fotonów wynoszącym 5 min. Analiza ta wymaga, aby guzy wykazywały ekspresję genu lucyferazy w celu generowania fotonów po wstrzyknięciu lucyferyny. Łącznie monitorowano bioluminescencję przez 11 dni u 33 myszy Balb/c po wstrzyknięciu komórek 4T1Luc, wykorzystując przy tym 9 kontroli. Rycina 2B potwierdza, że guz rośnie szybko, jednak intensywność sygnału zaczyna osiągać plateau po 8. dniu; wydaje się również, że początkowy wzrost guza jest szybszy u samic niż u samców myszy Balb/c, co pokazano na Rycynie 2C. Tylko 1 z 45 myszy Balb/c nie rozwinęła guza po 5 tygodniach, podczas gdy wszystkie myszy C57Bl/6J miały guza po 5 tygodniach (Rycina 2D).

Rysunek 3A  oraz Rysunek 3B wykazują, że skumulowana redukcja dawki Dox prowadzi do poprawy przeżywalności 3 tygodnie po rozpoczęciu podawania Dox: podczas gdy przy dawce 24 mg/kg nie przeżyła żadna mysz Balb/c z nowotworem, przy dawce 16 mg/kg przeżywalność wyniosła 50%. Jednak myszy C57Bl/6J z nowotworem są bardziej oporne, nawet przy dawce 24 mg/kg Dox, ponieważ >80% z nich przeżywa 3 tygodnie po rozpoczęciu chemioterapii (Rysunek 3D). Płeć miała istotny wpływ na wynik: samice myszy Balb/c wykazały znacznie lepszą przeżywalność niż samce (przeżyło 16 z 29 samic w porównaniu do 3 z 16 samców). Rysunek 3C przedstawia różnice między płciami u myszy Balb/c otrzymujących 16 mg/kg Dox (ze względu na niską liczbę samców nie przeprowadzono testu statystycznego). U myszy C57Bl/6J nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w przeżywalności między obiema płciami (patrz Rysunek 3E).

Reprezentatywny obraz prawidłowej funkcji serca myszy, ocenionej za pomocą echokardiografii przed leczeniem doksorubicyną (Dox), przedstawiono na Rysunek 4Aa jeden z myszy z dysfunkcją serca po podaniu Dox pokazano w Rysunek 4BWartość FS wyznaczona w trybie M u 17 myszy szczepu C57Bl/6J z nowotworem, leczonych dawką 24 mg/kg Dox, wykazuje istotny spadek po dwóch tygodniach (59,3% przed podaniem Dox kontra 44,3% po podaniu Dox, p < 0.0001, Rycina 4C). Tylko 1 z 12 przeżyłych myszy (8%) nie spełniło zdefiniowanych wcześniej kryteriów kardiotoksyczności. Częstość akcji serca nieznacznie, lecz istotnie spadła z 623 BPM przed podaniem Dox do 569 BPM po podaniu Dox (p < 0.05, Rysunek 4D). Wszystkie parametry ilościowo określone w trybie M można znaleźć w Tabela uzupełniająca 3.

Potwierdzenie efektu kardiotoksycznego doksorubicyny uzyskano poprzez analizę makro- i mikroskopową. Rysunek 6A,B wykazuje, że absolutna masa serca uległa znacznemu zmniejszeniu po leczeniu doksorubicyną u niewielkiej liczbie przeżyłych samic myszy Balb/c z nowotworem, natomiast normalizacja masy serca do całkowitej masy ciała wykazuje jedynie tendencję w tym kierunku. W eksperymencie na myszach C57Bl/6 bez nowotworów, podanie 24 mg/kg doksorubicyny wywołało oczekiwane zmiany w poziomie mRNA w sercu dla następujących genów tydzień po rozpoczęciu podawania leku: wzrost poziomu Atrogin i Murf1 wskazujący na atrofię, wzrost poziomu NQO1 wskazujący na stres oksydacyjny oraz wzrost poziomu Bax wskazujący na sytuację proapoptotyczną (Rysunek 6C–F).

Rycina 5A przedstawia schemat protokołu pozyskiwania płynu śródmiąższowego z guza. Reprezentatywne zdjęcie pobranego płynu pokazano na Rycini 5B: otrzymana objętość jest niewielka.

figure-results-1
Rycina 1: Reprezentatywne ilustracje protokołu eksperymentalnego. (A) Schematyczny przegląd protokołu eksperymentalnego. Utworzone w BioRender (licencja nr JE29USE7LU). (B) Schematyczne przedstawienie podskórnej inokulacji guza. Utworzone w BioRender (licencja nr SO29JHW7R6). (C) Schematyczne przedstawienie udanej podskórnej implantacji guza. Utworzone w BioRender (licencja nr SO29JHW7R6). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 2: Obrazowanie bioluminescencyjne i wskaźnik implantacji guza. (A) Reprezentatywne obrazy bioluminescencji myszy kontrolnej (lewo) oraz myszy z guzem (prawo). (B) Sygnał bioluminescencji w czasie (średnia ± SEM; dwuczynnikowa analiza wariancji [ANOVA] z powtarzanymi pomiarami; *P < 0.05). (C) Porównanie sygnałów bioluminescencji u samców i samic myszy Balb/c (średnia ± SEM). (D) Wskaźniki sukcesu implantacji guza w obu szczepach myszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3: Analiza przeżywalności myszy z nowotworem. (A) Krzywa przeżywalności Kaplana-Meiera dla myszy Balb/c leczonych doksorubicyną (Dox) w dawce 24 mg/kg. (B) Krzywa przeżywalności Kaplana-Meiera dla myszy Balb/c leczonych Dox w dawce 16 mg/kg. (C) Krzywa przeżywalności Kaplana-Meiera porównująca samce i samice myszy Balb/c leczone Dox w dawce 16 mg/kg. Ze względu na ograniczoną liczbę samców nie przeprowadzono analizy statystycznej. (D) Krzywa przeżywalności Kaplana-Meiera dla myszy C57BL/6J leczonych Dox w dawce 24 mg/kg. (E) Krzywa przeżywalności Kaplana-Meiera porównująca samce i samice myszy C57BL/6J leczone Dox w dawce 24 mg/kg (test log-rank, P = 0.86). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4Echokardiograficzna ocena kardiotoksyczności indukowanej doksorubicyną. (A) Reprezentatywny echokardiogram w trybie M zdrowej myszy. (B) Reprezentatywny echokardiogram w trybie M u myszy z kardiotoksycznością wywołaną doksorubicyną. (C) Skrócenie frakcyjne (FS) u myszy C57BL/6J przed i 14 dni po leczeniu doksorubicyną. (D) Częstość akcji serca (HR) u myszy C57BL/6J przed oraz 14 dni po leczeniu doksorubicyną. Dane przedstawiono dla n = 17 myszy. Porównania statystyczne przeprowadzono za pomocą testu Welcha test t-Studenta. *P < 0.05; ****P ≤ 0,0001. Skróty: FS, skrócenie frakcyjne; HR, częstość akcji serca. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rycina 5: Protokół pobierania próbek z narządów. (A) Schematyczne przedstawienie protokołu pobierania płynu śródmiąższowego z guza. Utworzono za pomocą BioRender (licencja nr HV29USD91R). (B) Reprezentatywny obraz przedstawiający pobieranie płynu śródmiąższowego z guza podczas pobierania próbek z narządów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-6
Rysunek 6Kardiotoksyczność indukowana doksorubicyną. (A) Masa serca zmierzona 3 tygodnie po rozpoczęciu leczenia doksorubicyną w dawce 16 mg/kg u myszy Balb/c z nowotworem. (B) Masa serca znormalizowana do całkowitej masy ciała, zmierzona 3 tygodnie po rozpoczęciu leczenia doksorubicyną w dawce 16 mg/kg u myszy Balb/c z nowotworem. (C) Ekspresja mRNA atroginy w mięśniu sercowym myszy C57BL/6J 1 tydzień po rozpoczęciu leczenia doksorubicyną w dawce 24 mg/kg. (D) Ekspresja mRNA Murf1 w mięśniu sercowym myszy C57BL/6J 1 tydzień po rozpoczęciu leczenia doksorubicyną w dawce 24 mg/kg. (E) Ekspresja mRNA NQO1 w mięśniu sercowym myszy C57BL/6J 1 tydzień po rozpoczęciu leczenia doksorubicyną w dawce 24 mg/kg. (F) ekspresja mRNA BAX w mięśniu sercowym myszy C57BL/6J 1 tydzień po rozpoczęciu leczenia doksorubicyną w dawce 24 mg/kg. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu testu Welcha test t-Studenta lub testu U Manna–Whitneya, w zależności od rozkładu danych. ns, P > 0.05; *P < 0,05; **P < 0.01. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Szczep myszyBalb/cC57Bl/6J
Użyta linia komórkowa4T1LucPY8119
Liczba wstrzykniętych komórek200 000200 000
PłećSamce i samiceSamce i samice
Liczba dni iniekcji46
Dawka dobowa4 mg/kg4 mg/kg
Kumulatywna dawka doksorubicyny16 mg/kg24 mg/kg
Dawka ketaminy40 mg/kg80 mg/kg
Częstość występowania kardiotoksyczności>90%>90%
Wskaźnik przeżywalności19/4516/19

Tabela 1: Kluczowe parametry protokołu dla każdej linii myszy. Porównanie głównych zmiennych eksperymentalnych i stężeń odczynników stosowanych w protokołach dla myszy Balb/c i C57BL/6J.

Tabela uzupełniająca 1: Punkty końcowe dobrostanu zwierząt. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Przegląd literatury dotyczący protokołów eksperymentalnych dla linii 4T1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 3: Parametry echokardiograficzne mierzone w trybie M u 17 myszy C57BL/6J z guzami, leczonych doksorubicyną w dawce 24 mg/kg. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W niniejszej pracy opracowano model kardiotoksyczności indukowanej doksorubicyną u myszy z nowotworem piersi, który w ocenie autorów posiada wysoką istotność kliniczną dla przyszłych badań w dziedzinie kardioonkologii. Celem było odwzorowanie klinicznej ścieżki pacjenta, od momentu przybycia do szpitala z zdiagnozowanym nowotworem, aż po leczenie potencjalnie kardiotoksyczną chemioterapią. Protokół opiera się na pragmatycznym schemacie i wykorzystuje immunokompetentne myszy dostępne na całym świecie, co umożliwia innym zespołom jego reprodukcję w innych laboratoriach. Wysoki wskaźnik sukcesu implantacji guza sprawia, że model ten jest silnym kandydatem do przyszłych badań toksykologicznych w kardioonkologii.

Do częstych błędów w tym protokole należy przeprowadzanie echokardiografii u myszy z niską częstotliwością akcji serca, co może skutkować sztucznie niskim skróceniem frakcyjnym (FS). Pozostawienie myszy do czasu regeneracji po początkowych ujemnych efektach chronotropowych środków znieczulających przed oceną echokardiograficzną pomaga zapewnić dokładne pomiary FS. W przypadku myszy Balb/c może być konieczne dalsze zmniejszenie dawki środka znieczulającego, jeśli śmiertelność pozostaje wysoka. Wszystkie oceny echokardiograficzne w trakcie badania powinien przeprowadzać ten sam badacz, ponieważ zmienność międzyobserwacyjna może być znacząca43. Podczas implantacji guza wycofanie strzykawki w trakcie wstrzykiwania może spowodować powstanie guza w kształcie linii, który może urosnąć bardziej niż guzy powstałe w wyniku prawidłowego wstrzyknięcia. Kluczowe jest również wstrzyknięcie do odpowiedniego sutka mlecznego, ponieważ umieszczenie go w sutku brzusznym górnym może utrudniać ocenę echokardiograficzną w późniejszych etapach rozwoju guza. Aby zapewnić, że każda mysz otrzyma porównywalną liczbę komórek, a tym samym zminimalizować różnice w wielkości guza na koniec protokołu, zaleca się ręczne liczenie komórek w zawiesinie oraz dokładne wymieszanie przed wstrzyknięciem. W przypadku konieczności cotygodniowego pobierania krwi, objętość pobranej próbki powinna być ściśle kontrolowana, ponieważ myszy stają się bardziej wrażliwe po leczeniu doksorubicyną. Zaleca się pobieranie maksymalnej całkowitej objętości krwi wynoszącej 50 µL w każdym punkcie czasowym, gdyż większe objętości mogą zwiększyć śmiertelność w trakcie protokołu. Częstotliwość i objętość pobierania krwi powinny być również zgodne z lokalnymi wymogami etycznymi dotyczącymi zwierząt oraz wytycznymi instytucjonalnego ośrodka dla zwierząt. Zastąpienie pobranej objętości krwi równoważną objętością soli fizjologicznej podanej podskórnie może pomóc w rekompensacie utraty płynów po pobraniu krwi.

Aby porównać tę procedurę z zastosowaniem doksorubicyny, w niedawno opublikowanym przeglądzie modeli zwierzęcych AIC zauważono, że w większości modeli przedklinicznych (88%) stosowano powtarzane iniekcje Dox, a pomiary wyników (często za pomocą echokardiografii) przeprowadzano kilka tygodni później29. W większości artykułów zgłoszono użycie szczepu C57Bl/6J (73,8%), prawdopodobnie ze względu na jego odporność i niski koszt29. Niestety, znaczna liczba badań pominęła wpływ guza na biologię zwierzęcia przed wstrzyknięciem AC17,29. Tylko 46 z 736 badań zgłosiło modele z nowotworem, z czego 12 wykorzystywało linię komórkową 4T1 (rak piersi typu potrójnie ujemnego) u myszy Balb/c, a tylko jedno było modelem raka piersi u myszy C57Bl/6J (a konkretnie raka piersi typu EGFR2-dodatniego)29. Inne badanie wykorzystało myszy C57Bl/6J z rakiem piersi typu EGFR-2-dodatniego, ale nie dopuszczono do wzrostu guza przed rozpoczęciem chemioterapii, co ogranicza aspekt translacyjny tego modelu32.

Modele ksenoprzeszczepów z wykorzystaniem myszy z niedoborem odporności umożliwiają stosowanie ludzkich linii komórkowych nowotworów, lecz brak w nich funkcjonalnego układu odpornościowego, co ogranicza badanie mechanizmów immunologicznie zapośredniczonej kardiotoksyczności i stanowi istotne ograniczenie w obliczu rosnącego znaczenia kardiotoksyczności związanej z inhibitorami punktów kontrolnych układu odpornościowego. W dziedzinie kardioonkologii pojawiają się modele na dużych zwierzętach, jednak zawsze będą one obarczone wadami w postaci wysokich kosztów i ograniczonych możliwości inżynierii genetycznej44. Systemy in vitro oraz 2D/3D oparte na ludzkich komórkach (np. kardiomiocyty pochodzące z ludzkich iPSC, organoidy serca) umożliwiają wysokoprzepustowy screening mechanistyczny i toksykologiczny, ale nie mogą odtworzyć zintegrowanej fizjologii całego organizmu (hemodynamiki, regulacji neurohormonalnej, interakcji immunologicznych) uchwyconych przez modele in vivo. W porównaniu z tymi podejściami, ten syngeneiczny, immunokompetentny model z nowotworem oferuje bardziej relewantny klinicznie kontekst do badania interakcji między obciążeniem nowotworowym a kardiotoksycznością indukowaną chemioterapią, kosztem większej zmienności biologicznej, wyższej śmiertelności w niektórych szczepach oraz niższej przepustowości niż w przypadku prostszych modeli in vitro lub modeli in vivo bez nowotworu.

Modele kardiotoksyczności AC u zwierząt bez nowotworu, najczęściej stosowane do tej pory, oferują wysoką powtarzalność, niskie koszty oraz łatwiejszą ocenę echokardiograficzną i przeżywalność, lecz nie oddają systemowych efektów obciążenia nowotworowego, stanu zapalnego związanego z rakiem oraz kacheksji w odniesieniu do serca, które są coraz częściej uznawane za istotne czynniki zakłócające kardiotoksyczność u pacjentów17,45. Ponadto przeprogramowanie metaboliczne serca, a w konsekwencji jego funkcja kurczliwa, mogą być zmienione przez wydzielane onkometabolity, takie jak D-2-hydroksyglutaran lub bursztynian14. Dlatego też, jeśli model kardioonkologiczny ma służyć do biochemicznej analizy serca z wykorzystaniem różnych omik (na przykład proteomiki i metabolomiki), obecność guza przed chemioterapią jest niezbędna. Istnieją również dowody na to, że sam nowotwór może wywoływać wyraźną dysfunkcję serca, choć nie jest to spójne w literaturze. Podczas gdy niektóre modele wykazały szkodliwy wpływ inokulacji guza na FS lub parametry przewodzenia elektrycznego, inne wykazały, że obecność nowotworu chroniła myszy przed przebudową indukowaną przez poprzeczne zwężenie aorty11,13,46. W zależności od wstępnej hipotezy niezbędne są również zwierzęta bez nowotworu. Stanowią one jedyne środowisko, w którym bezpośredni efekt kardiotoksyczny leku chemioterapeutycznego może zostać odizolowany od zakłócającego wpływu samego guza, co jest niezbędnym warunkiem do ustanowienia związku przyczynowo-skutkowego i wyjaśnienia specyficznych dla leku mechanizmów działania. Zwierzęta te będą służyć jako grupy kontrolne dla efektu terapii przeciwnowotworowej oraz jej interakcji z guzem w zakresie kardiotoksyczności. Bez takiego porównania niemożliwe byłoby rozstrzygnięcie, który komponent obserwowanego fenotypu serca wynika z działania leku, obecności guza lub ich wzajemnej interakcji. Rozróżnienie to jest kluczowe nie tylko dla zrozumienia mechanizmów, ale także dla racjonalnego projektowania strategii kardioprotekcyjnych. Należy zatem uznać, że każdy z tych modeli odpowiada na odrębne i uzupełniające się pytania naukowe oraz że żaden z modeli z osobna nie jest wystarczający do pełnego odwzorowania złożoności klinicznej kardioonkologii; często wymagane jest łączone lub sekwencyjne zastosowanie obu modeli, aby sformułować wiarygodne wnioski mechanistyczne i translacyjne.

W niniejszym protokole kardiotoksyczność zdefiniowano zgodnie z wytycznymi ESC z 2022 r. dotyczącymi kardioonkologii, według których umiarkowana bezobjawowa dysfunkcja serca związana z terapią przeciwnowotworową jest definiowana jako spadek frakcji wyrzutowej lewej komory (LVEF) o >10% przy wartości LVEF między 40% a 49%16. Jednakże dokładna kwantyfikacja LVEF wymaga modułu 3D w aparacie USG39. Aby uniknąć błędnej oceny funkcji skurczowej serca oraz zachować prosty protokół, który mógłby zostać wdrożony w laboratoriach korzystających ze starszych aparatów USG, preferowano użycie FS jako markeru dysfunkcji serca, który jest prawidłowo i łatwo uzyskiwany za pomocą analizy w trybie M u myszy, przy zastosowaniu tych samych kryteriów, co w wytycznych ESC. Stosując ten protokół, 90% przeżywających myszy spełnia kryteria kardiotoksyczności, co czyni go silnym kandydatem do przyszłych badań translacyjnych. Efekt kardiotoksyczny Dox potwierdzono za pomocą oceny makroskopowej (zmniejszona masa serca) u myszy Balb/c. W badaniu nie uwzględniono grupy z samym guzem u myszy C57Bl/6, w związku z czym porównanie w tym szczepie nie jest jeszcze dostępne. Co więcej, u myszy C57Bl/6 bez guzów dawka Dox wywołała zmiany zgodne z dotychczasową literaturą na temat mechanizmów kardiotoksyczności antracyklin: zwiększoną atrofię, stres oksydacyjny oraz apoptozę19,20.

Jednakże z powodów technicznych nie określono tutaj bardziej nowoczesnych zmiennych stosowanych u pacjentów, takich jak globalne odkształcenie podłużne (GLS) mierzone metodą speckle-tracking. Jeśli jest to lokalnie możliwe, określenie GLS wniosłoby dodatkową wartość, ponieważ powszechnie uważa się je za bardziej czułe w wykrywaniu wczesnych uszkodzeń serca23. W celu zwiększenia pewności wykrywania kardiotoksyczności można również ocenić krążące biomarkery sercowe, takie jak troponina; jednakże ilość osocza tradycyjnie wymagana do tych analiz u myszy może być czynnikiem ograniczającym ze względu na niską całkowitą objętość krwi tych zwierząt. Ponadto kruchość tych zwierząt po leczeniu Dox może zwiększyć wskaźniki śmiertelności podczas lub po pobraniu krwi. Ostatnim czynnikiem ograniczającym jest czułość tych testów w odniesieniu do takich biomarkerów, co często może utrudniać interpretację.

Mimo że wszystkie pomiary ultrasonograficzne przeprowadził ten sam doświadczony badacz, zaobserwowano wysoką zmienność tygodniową u tych samych myszy Balb/c, nawet bez zastosowania leczenia. Można to wyjaśnić wrażliwością tego szczepu na znieczulenie ketaminą47. Rzeczywiście, początkowo odnotowano wysoką śmiertelność podczas procedur z znieczuleniem, co prowadziło do niewielkiej liczby zwierząt docierających do końca protokołu; skutkowało to obniżeniem dawki stosowanej ketaminy z 80 mg/kg do 40 mg/kg dla myszy Balb/c. Analizując wykresy przeżywalności myszy Balb/c z Dox, można zauważyć, że część zgonów następuje w momencie znieczulenia (podczas cotygodniowej echokardiografii), jednak większość z nich występuje wywołańcu w pomieszczeniach dla zwierząt, poza jakimkolwiek aktywnym zabiegiem, co podkreśla, że Dox jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do śmiertelności u tych myszy. Niemniej jednak, przy interpretacji wykresów przeżywalności dla tego modelu w porównaniu dwóch lub więcej szczepów, należy pamiętać o zgonach związanych ze znieczuleniem. Aby zmniejszyć ryzyko śmiertelności związanej ze znieczuleniem, można by przeprowadzać echokardiografię u myszy przytomnych, co jednak wymaga odpowiedniego przeszkolenia i aklimatyzacji zwierząt przed włączeniem ich do protokołu. W odniesieniu do Dox, nawet przy zmniejszonych dawkach, prawie połowa myszy Balb/c nie dotarła do końca protokołu. Można by podjąć próbę indukcji kardiotoksyczności przy użyciu jeszcze niższych dawek Dox, jednak wiąże się to z ryzykiem zmniejszenia liczby zwierząt spełniających kryteria kardiotoksyczności. Inną strategią mogłoby być wydłużenie czasu regeneracji zwierzęcia po każdym wstrzyknięciu Dox, czego w niniejszym badaniu nie zastosowano, mimo że w literaturze istnieją dowody na poprawę przeżywalności przy takim podejściu29.

Obserwacje poczynione podczas budowy tego modelu, wskazujące na to, że myszy Balb/c są bardziej wrażliwe na Dox niż myszy C57Bl/6J, a samice są bardziej odporne na Dox niż samce, są zgodne z wcześniejszą literaturą29. Ponadto, podobne i powtarzalne wyniki uzyskane w obu szczepach myszy dodatkowo potwierdzają solidność proponowanego modelu. Dzięki osiągnięciu wysokich dawek skumulowanych poprzez umiarkowanie wysokie dawki dobowe w krótkim okresie czasu, uzyskano wysoki stopień kardiotoksyczności przy wysokiej przeżywalności. Budowa modelu raka piersi (PY8119 jest rakiem piersi podobnym do potrójnie ujemnego) u myszy C57Bl/6J będzie bardzo przydatna w dalszych badaniach, ponieważ myszy te reprezentują jedno z głównych tłem genetycznych dla modeli transgenicznych34. Wysoki wskaźnik sukcesu inokulacji guzów, potwierdzający skuteczność wybranej metody wstrzykiwania, jest również obiecujący dla tego modelu. Ponadto, wysoka tolerancja Dox u tych myszy otwiera drogę do dłuższych badań z ponowną ekspozycją na Dox, aby naśladować częstą sytuację kliniczną w postaci nowotworu wtórnego lub przerzutów. Wreszcie, protokół pobierania organów prowadzi do zgromadzenia wszystkich organów litych, guzów i ich płynu śródmiąższowego oraz szpiku kostnego i jego zrębu, co pozwala na bardzo dokładną analizę modelu.

Model ten posiada pewne ograniczenia. Ze względu na pragmatyczną konstrukcję i chęć uniknięcia inwazyjnego zabiegu chirurgicznego, dokładna lokalizacja guza (tj. konkretny gruczoł piersiowy zamiast tkanki tłuszczowej podskórnej) nie może być precyzyjnie kontrolowana przy iniekcji podskórnej, co może mieć istotne znaczenie w zależności od badanego pytania naukowego48. Jeśli wymagana jest precyzyjna iniekcja w miejsce występowania nowotworu, do wykonania iniekcji ortotopowej lepiej może być dostosowany bardziej rozległy zabieg chirurgiczny, choć wydaje się to mieć rzeczywiste znaczenie głównie w przypadku planowania analizy biochemicznej guza, ponieważ objętość, czas utajenia i częstość występowania dają podobne wyniki niezależnie od metody iniekcji48. Można również argumentować, że stosowanie wyłącznie antracyklin (ACs) nie koreluje idealnie z sytuacją kliniczną, w której pacjenci często otrzymują schematy łączone, na przykład z cyklofosfamidą lub cisplatiną. Mogłoby to być właściwe rozwinięcie tego protokołu; należy jednak starannie przeprowadzić adaptację dawki dla każdego zastosowanego leku chemioterapeutycznego. Co więcej, śmiertelność przekraczająca 50% u myszy Balb/c 3 tygodnie po rozpoczęciu leczenia Dox pozostaje bardzo wysoka; redukcja dawki mogłaby poprawić przeżywalność, być może kosztem mniej wyraźnej kardiotoksyczności. Ponadto w odniesieniu do dawek zastosowanych w tym modelu należy zauważyć, że są one wyższe niż dawki powszechnie stosowane obecnie u ludzi, co może ograniczać potencjał translacyjny tego modelu.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów związany z niniejszym manuskryptem.

Podziękowania

Dziękujemy zespołowi świetlicy dla zwierząt za pomoc w codziennym monitorowaniu dobrostanu zwierząt. Dziękujemy Léanne Borges, Eliasowi Ait Assie oraz Clémence Chabaud za pomoc w opracowaniu protokołu dla zwierząt. Za przekazanie linii komórkowej PY8119 dziękujemy dr Julie Helft z jednostki INSERM 932. Szczególne podziękowania kierujemy do dr Sylvaina Provost oraz jego studentki Mel Gavens za pomoc w badaniach bioluminescencyjnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki 4T1LucATCCCRL-2539
Doksorubicyna w proszkuCliniscience23214-92-8
EchokardiografVisual SonicsVEVO LT-200
LucyferynaPerkin Elmer E1605
Siatka nylonowaMerckNY2002500
PhotonImager OptimaBioSpace Lab
Komórki PY8119Dar od dr Julie Helft

Bibliografia

  1. Meijers WC, et al. Heart failure stimulates tumor growth by circulating factors. Circulation. 2018;138(7):678-691.
  2. de Wit S, et al. Pressure overload-induced cardiac hypertrophy stimulates tumor growth in tumor-prone Apc(Min) mice. Circ Heart Fail. 2023;16(9):e010740.
  3. Avraham S, et al. Early cardiac remodeling promotes tumor growth and metastasis. Circulation. 2020;142(7):670-683.
  4. Langier Goncalves I, et al. Heart failure promotes cancer progression in an integrin β1-dependent manner. Int J Mol Sci. 2023;24(24):17367.
  5. Koelwyn GJ, et al. Myocardial infarction accelerates breast cancer via innate immune reprogramming. Nat Med. 2020;26(9):1452-1458.
  6. Wong J, Soh CH, Wang B, Marwick T. Long-term risk of heart failure in adult cancer survivors: a systematic review and meta-analysis. Heart. 2024;110(19):1188-1195.
  7. Kuiper JG, et al. Risk of heart failure among colon and rectal cancer survivors: a population-based case-control study. ESC Heart Fail. 2022;9(4):2139-2146.
  8. Mamidanna R, Nachiappan S, Bottle A, Aylin P, Faiz O. Defining the timing and causes of death amongst patients undergoing colorectal resection in England. Colorectal Dis. 2016;18(6):586-593.
  9. Armstrong GT, et al. Aging and risk of severe, disabling, life-threatening, and fatal events in the Childhood Cancer Survivor Study. J Clin Oncol. 2014;32(12):1218-1227.
  10. Herrmann J. Adverse cardiac effects of cancer therapies: cardiotoxicity and arrhythmia. Nat Rev Cardiol. 2020;17(8):474-502.
  11. Kelm NQ, Straughn AR, Kakar SS. Withaferin A attenuates ovarian cancer-induced cardiac cachexia. PLoS One. 2020;15(7):e0236680.
  12. Graca FA, et al. Progressive development of melanoma-induced cachexia differentially impacts organ systems in mice. Cell Rep. 2023;42(1):111934.
  13. Xiong S, et al. Development of an efficient mice model of cancer-associated cardiac cachexia. Anim Models Exp Med. 2025; 8(11):1960-1970.
  14. Karlstaedt A, Moslehi J, de Boer RA. Cardio-onco-metabolism: metabolic remodelling in cardiovascular disease and cancer. Nat Rev Cardiol. 2022;19(6):414-425.
  15. Murphy KT. The pathogenesis and treatment of cardiac atrophy in cancer cachexia. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2016;310(4):H466-H477.
  16. Lyon AR, et al. 2022 ESC Guidelines on cardio-oncology developed in collaboration with the European Hematology Association (EHA), the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology (ESTRO) and the International Cardio-Oncology Society (IC-OS). Eur Heart J. 2022;43(41):4229-4361.
  17. Ghigo A, et al. Update on preclinical models of cancer therapy-related cardiac dysfunction: challenges and perspectives. A scientific statement of the Heart Failure Association (HFA) of the ESC, the ESC Council of Cardio-Oncology, and the European Association of Preventive Cardiology. Eur J Heart Fail. 2025;27(6):1028-1046.
  18. Cagnazzo R, et al. Mismatch between preclinical cardio-oncology and clinical oncology research. JACC CardioOncol. 2025;7(6):770-773.
  19. Mattioli R, et al. Doxorubicin and other anthracyclines in cancers: activity, chemoresistance and its overcoming. Mol Aspects Med. 2023;93:101205.
  20. Martins-Teixeira MB, Carvalho I. Antitumour anthracyclines: progress and perspectives. ChemMedChem. 2020;15(11):933-948.
  21. Fabiani I, Chianca M, Cipolla CM, Cardinale DM. Anthracycline-induced cardiomyopathy: risk prediction, prevention and treatment. Nat Rev Cardiol. 2025;22(8):551-563.
  22. Rivero-Santana B, et al. Anthracycline-induced cardiovascular toxicity: validation of the Heart Failure Association and International Cardio-Oncology Society risk score. Eur Heart J. 2025;46(3):273-284.
  23. Camilli M, Cipolla CM, Dent S, Minotti G, Cardinale DM. Anthracycline cardiotoxicity in adult cancer patients: JACC: CardioOncology state-of-the-art review. JACC CardioOncol. 2024;6(5):655-677.
  24. Díaz-Guerra A, et al. Anthracycline cardiotoxicity induces progressive changes in myocardial metabolism and mitochondrial quality control. JACC CardioOncol. 2024;6(2):217-232.
  25. Omland T, et al. Sacubitril-valsartan and prevention of cardiac dysfunction during adjuvant breast cancer therapy: the PRADA II randomized clinical trial. Circulation. 2025: 152(16):1136-1145.
  26. Henriksen PA, et al. Multicenter, prospective, randomized controlled trial of high-sensitivity cardiac troponin I-guided combination angiotensin receptor blockade and beta-blocker therapy to prevent anthracycline cardiotoxicity: the Cardiac CARE trial. Circulation. 2023;148(21):1680-1690.
  27. Sobiborowicz-Sadowska AM, Kamińska K, Cudnoch-Jędrzejewska A. Neprilysin inhibition in the prevention of anthracycline-induced cardiotoxicity. Cancers (Basel). 2023;15(1):312.
  28. Stansfeld A, et al. Pharmacological strategies to reduce anthracycline-associated cardiotoxicity in cancer patients. Expert Opin Pharmacother. 2022;23(14):1641-1650.
  29. Li M, et al. Optimizing dose selection for doxorubicin-induced cardiotoxicity in mice: a comprehensive analysis of single and multiple-dose regimens. Eur J Pharmacol. 2025;1003:177883.
  30. Gambardella J, et al. Infiltrating macrophages amplify doxorubicin-induced cardiac damage: role of catecholamines. Cell Mol Life Sci. 2023;80(11):323.
  31. Chen Y, et al. Cysteine imaging reveals early redox dysregulation and identifies gnetol as a ferroptosis-modulating agent in doxorubicin cardiotoxicity. Redox Biol. 2026;92:104131.
  32. Luo W, et al. Critical role of the cGAS-STING pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Circ Res. 2023;132(11):321587.
  33. Mouse Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 2002;420(6915):520-562.
  34. Mekada K, Yoshiki A. Substrains matter in phenotyping of C57BL/6 mice. Exp Anim. 2021;70(2):145-160.
  35. Yin L, Duan JJ, Bian XW, Yu SC. Triple-negative breast cancer molecular subtyping and treatment progress. Breast Cancer Res. 2020;22(1): doi.org/10.1186/s13058-020-01296-5.
  36. Akbay EA, et al. D-2-hydroxyglutarate produced by mutant IDH2 causes cardiomyopathy and neurodegeneration in mice. Genes Dev. 2014;28(5):479-490.
  37. Springer J, et al. Prevention of liver cancer cachexia-induced cardiac wasting and heart failure. Eur Heart J. 2014;35(14):932-941.
  38. Herndon ME, et al. The highly metastatic 4T1 breast carcinoma model possesses features of a hybrid epithelial/mesenchymal phenotype. Dis Model Mech. 2024;17(9):dmm050771.
  39. Lindsey ML, Kassiri Z, Virag JAI, De Castro Brás LE, Scherrer-Crosbie M. Guidelines for measuring cardiac physiology in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2018;314(4):H733-H752.
  40. Zacchigna S, et al. Towards standardization of echocardiography for the evaluation of left ventricular function in adult rodents: a position paper of the ESC Working Group on Myocardial Function. Cardiovasc Res. 2021;117(1):43-59.
  41. Assad N, et al. Crosstalk between circulating DPP3 and immune cells in the context of cardio-systemic stress. iScience. 2026;29(3):115114.
  42. Motulsky HJ. GraphPad Statistics Guide. 2016. http://www.graphpad.com/guides/prism/10/statistics/index.htm.
  43. Garcia-Elcano L, et al. Accurate estimation of interobserver variability in echocardiography segmentation measured from 35 experts and impact on derived clinical metrics. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 2025;26(Suppl 1): jeae333.044.
  44. Medina-Hernandez D, et al. SGLT2i therapy prevents anthracycline-induced cardiotoxicity in a large animal model by preserving myocardial energetics. JACC CardioOncol. 2025;7(2):171-184.
  45. Asnani A, et al. Preclinical models of cancer therapy-associated cardiovascular toxicity: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 2021;129(1):e21–e34.
  46. Awwad L, Shofti R, Haas T, Aronheim A. Tumor growth ameliorates cardiac dysfunction. Cells. 2023;12(14):1853.
  47. Levin-Arama M, et al. Subcutaneous compared with intraperitoneal ketamine-xylazine for anesthesia of mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2016;55(6):794-800.
  48. Fleming JM, Miller TC, Meyer MJ, Ginsburg E, Vonderhaar BK. Local regulation of human breast xenograft models. J Cell Physiol. 2010;224(3):795-806.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model kardioonkologicznykardiotoksyczność antracyklinmyszy z nowotworem piersileczenie doksorubicynąUSG sercabioluminescencja guzafunkcja lewej komorymyszy z nowotworemprzedkliniczna kardiotoksyczność

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.