Protokół standaryzowanej oceny ustandaryzowanej funkcji ukrwienia ogólnoustrojowego w ludzkiej mikrocyrkulacji skóry z zastosowaniem obrazowania kontrastu plamek laserowych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje zstandaryzowaną, nieinwazyjną metodę oceny ogólnoustrojowej funkcji mikrokrążenia w ludzkiej mikrokrążeniu skórnym z wykorzystaniem obrazowania kontrastu laserowego speckle w połączeniu z farmakologiczną jontoforeza i fizjologicznymi bodźcami w celu oceny reaktywności mikrokrążenia w warunkach badań klinicznych.

Streszczenie

Laser speckle contrast imaging (LSCI) to technika optyczna o wysokiej rozdzielczości, nieinwazyjna, która umożliwia wizualizację mikrokrążenia krwi w czasie rzeczywistym i na pełnym polu. Niniejszy protokół przedstawia standaryzowaną metodologię oceny funkcji mikrokrążenia w ludzkiej mikrokrążeniu skóry za pomocą LSCI. Ponieważ pomiary uzyskane za pomocą tej techniki są bardzo wrażliwe na środowiskowe i fizjologiczne czynniki zakłócające, protokół kładzie nacisk na ścisłe procedury standaryzacji w celu poprawy powtarzalności i niezawodności eksperymentalnej. Protokół szczegółowo opisuje istotne kontrole środowiskowe, w tym stabilizację temperatury w pomieszczeniu na poziomie 23°C ± 1°C, pozycjonowanie uczestnika, procedury aklimatyzacji i minimalizację zakłóceń zewnętrznych podczas akwizycji obrazu. Metodologia integruje LSCI z dwoma uzupełniającymi się działaniami prowokacyjnymi w celu oceny reaktywności mikrokrążenia skóry. Po okluzyjna reaktywna hiperemia jest stosowana do oceny zintegrowanej reaktywności mikrokrążenia, podczas gdy farmakologiczne wyzwania wywołane jontoforeza są stosowane do oceny funkcji endotelialnej. W szczególności Acetylocholinę podaje się w celu oceny zależnej od endotelialnego wazodylatacji, a nitroprusyk sodu podaje się w celu oceny niezależnej od endotelialnego wazodylatacji. Ten wizualizowany krok po kroku protokół ma na celu ułatwienie przyjęcia standaryzowanych metodologii LSCI w środowiskach badań klinicznych i translacyjnych. Podejście to zostało z powodzeniem zastosowane do identyfikacji upośledzenia mikrokrążenia w kilku warunkach klinicznych, w tym w opornym nadciśnieniu, cukrzycy i chorobie wieńcowej. Umożliwiając powtarzalną i nieinwazyjną ocenę reaktywności mikrokrążenia, ta metodologia zapewnia cennego narzędzia do badania zdrowia układu krążenia, monitorowania postępu choroby i oceny skuteczności interwencji ukierunkowanych na mikrokrążenie.

Wprowadzenie

Głównym celem niniejszego protokołu jest zapewnienie standaryzowanej, powtarzalnej metodologii oceny ogólnoustrojowej czynności mikrokrążenia i reaktywności z wykorzystaniem obrazowania kontrastu plamek laserowych (LSCI) w połączeniu z fizjologicznymi i farmakologicznymi bodźcami prowokacyjnymi. Mikrokrążenie, obejmujące końcowe naczynia krwionośne – tętniczki, naczynia włosowate i żyłki – mniejsze niż około 100 µm średnicy¹, jest głównym miejscem wymiany metabolicznej i krytycznym czynnikiem decydującym o obwodowym oporze naczyniowym². Dysfunkcja śródbłonka w tych małych naczyniach często poprzedza zmiany makronaczyniowe i służy jako wczesny biomarker chorób układu krążenia, w tym nadciśnienia tętniczego, cukrzycy i choroby wieńcowej³. Co ważne, choć upośledzenie mikrokrążenia znacząco przyczynia się do uszkodzenia końcowych narządów, działa ono we współpracy z mikroangiopatią i ogólnoustrojowym przewlekłym stanem zapalnym w wieloczynnikowym procesie chorobowym. Dlatego też nieinwazyjna ocena reaktywności mikrokrążenia jest niezbędna zarówno do wczesnej diagnozy, jak i monitorowania skuteczności terapii w badaniach translacyjnych⁴.

Podstawą użycia mikrokrążenia skóry jako substytutu zdrowia układu krążenia jest jego dostępność oraz jego rola jako reprezentatywnego okna na globalną czynność śródbłonka^5,6. Tradycyjnie pomiar przepływu laserowego Dopplera (LDF) był uważany za złoty standard nieinwazyjnej oceny skóry⁷. Jednak LDF ma ograniczenia związane z niską rozdzielczością przestrzenną, ponieważ zapewnia pomiary punktowe, które są bardzo wrażliwe na naturalną niejednorodność perfuzji skóry⁸. Natomiast LSCI oferuje znaczne zalety, zapewniając pełne, czasowe wizualizacje perfuzji tkanek z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną⁹. Analizując wzór interferencji generowaną przez rozpraszanie światła laserowego, LSCI umożliwia jednoczesną ocenę wielu regionów naczyniowych bez potrzeby kontaktu fizycznego lub stosowania ekzogennych barwników^10,11.

W szerszej literaturze przedmiotu integracja LSCI z farmakologicznymi bodźcami prowokacyjnymi, takimi jak acetylocholina (ACh) i nitroprusyk sodu (SNP), została zweryfikowana jako solidne podejście do oceny endotelialnie zależnych i niezależnych ścieżek wazodylatacyjnych^12,13. Ponadto, reaktywna hiperemia pooperacyjna (PORH) zapewnia zintegrowaną ocenę reaktywności mikrokrążenia, która obejmuje mediatory śródbłonkowe, nerwy czuciowe neurogenne i funkcję mięśni gładkich naczyń¹². Mimo swoich zalet, wysoka wrażliwość LSCI na zmienność środowiskową i fizjologiczną wymaga ścisłych procedur standardyzacji. Niniejszy protokół radzi sobie z tymi wyzwaniami, szczegółowo opisując krytyczne kontrole środowiskowe, w tym stabilizację temperatury pomieszczenia na poziomie 23°C ± 1°C i standaryzowane pozycjonowanie uczestników, aby poprawić powtarzalność w obrębie jednego i między różnymi badanymi¹⁰. Ta metodyka jest odpowiednia dla badaczy klinicznych i translacyjnych, którzy poszukują metodycznie uzasadnionego, nieinwazyjnego podejścia do badania mikrokrążeniowej patofizjologii w różnorodnych populacjach pacjentów.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem osób zostały przeprowadzone zgodnie z normami etycznymi Narodowego Instytutu Kardiologii (Ministerstwo Zdrowia, Brazylia), zgodnie z krajowymi regulacjami (Krajowy Komitet Etyczny ds. Badań – INAEP – zgodnie z ustawą nr 14 874, maj 2024) oraz Deklaracją Helsińską (zmieniona 2024).

1. Przygotowanie uczestnika i kontrola środowiska

1. Stabilizuj środowisko badania
   1. Stabilizuj temperaturę w pomieszczeniu badawczym (RT; 23°C ± 1°C) za pomocą dedykowanego termostatu, aby utrzymać stabilne środowisko termiczne.
   2. Monitoruj RT co 10 min za pomocą skalibrowanego termometru cyfrowego (dokładność ±0,1°C).
      ​UWAGA: Mikrokrążenie skórne jest bardzo wrażliwe na wahania temperatury.
2. Przygotuj uczestnika przed badaniem
   1. Poinstruuj uczestników, aby powstrzymali się od palenia, spożywania kofeiny lub alkoholu oraz wykonywania intensywnych ćwiczeń przez 24 h przed badaniem.
   2. Poinstruuj uczestników, aby pościeli się przez co najmniej 2 h przed badaniem, zezwalając na spożywanie wody.
      ​UWAGA: Wstrzymanie się od kofeiny i intensywnych ćwiczeń minimalizuje zewnętrzne zakłócenia w skurczach naczyń skóry. Kofeina, jako antagonista receptorów adenozynowych, i ćwiczenia, poprzez wpływ na napęd współczulny i termoregulację, mogą wywołać trwałe zmiany w reaktywności mikrokrążenia, które utrzymują się przez kilka godzin po ekspozycji^4,14.
3. Umieść uczestnika w pozycji do akwizycji obrazu
   1. Umieść niedominującą rękę uczestnika na poziomie serca, używając poduszek ciała, aby utrzymać przedramię w pozycji poziomej i stabilnej.
   2. Użyj brzusznej powierzchni przedramienia jako miejsca oceny.
      UWAGA: Przedramię niedominujące minimalizuje wpływ bocznego remodelowania naczyń związanego z codzienną aktywnością. Brzuszna strona przedramienia zapewnia korzystne cechy anatomiczne dla obrazowania optycznego, w tym niższą gęstość włosów i mniejszą grubość skóry, minimalizując w ten sposób artefakty sygnału i poprawiając powtarzalność dostarczania leków elektroforezą.
4. Pozwól na stabilizację układu krążenia
   1. Utrzymuj uczestnika w spoczynku przez co najmniej 20 min przed rozpoczęciem rejestracji mikrokrążenia.
   2. Zabronić uczestnikowi rozmawiania, poruszania się badaną kończyną lub używania urządzeń elektronicznych podczas okresu odpoczynku.
      ​UWAGA: Okres stabilizacji minimalizuje autonomiczne i krążeniowe wahania przed uzyskaniem wartości wyjściowych.
5. Minimalizuj artefakty ruchowe
   1. Umieść niedominujące przedramię uczestnika na saliaku z efektem próżni.
   2. Dostosuj salik, aby utrzymać brzuszną powierzchnię przedramienia w stabilnej poziomej pozycji przez cały czas akwizycji obrazu.
6. Przygotuj powierzchnię skóry
   1. Wybierz miejsca na skórze bez widocznych włosów na wszystkie pomiary.
   2. Usuń włosy za pomocą chirurgicznej maszynki do golenia 24 h przed badaniem, gdy jest to konieczne.
      ​UWAGA: Nie używaj brzytwy do usuwania włosów, ponieważ podrażnienie skóry może zakłócić pomiary mikrokrążenia.
7. Zmierzyć ciśnienie tętnicze krwi
   1. Wybierz wielkość mankietu zgodnie z obwodem ramienia uczestnika.
   2. Wykonaj trzy kolejne pomiary ciśnienia tętniczego za pomocą skalibrowanego urządzenia oscylometrycznego z przerwą 1 min pomiędzy pomiarami.
   3. Odrzuć pierwsze pomiar i oblicz średnią z ostatnich dwóch pomiarów, aby określić średnie ciśnienie tętnicze (MAP), zgodnie z wytycznymi ESC/ESH i AHA w dziedzinie kardiologii.

2. Konfiguracja systemu LSCI i oprogramowania

1. Przygotuj system LSCI
   1. Włącz system LSCI co najmniej 10 min przed akwizycją obrazu, aby umożliwić stabilizację źródła lasera.
   2. Sprawdź stabilizację lasera za pomocą wskaźnika statusu oprogramowania przed rozpoczęciem rejestracji.
2. Umieść głowicę laserową
   1. Umieść głowicę laserową bezpośrednio nad przedramiem uczestnika.
   2. Dostosuj głowicę laserową do odległości dokładnie 15 cm od powierzchni skóry za pomocą narzędzia do pomiaru odległości dostarczonego przez producenta (Rysunek 1A)
      UWAGA: Utrzymanie stałej odległości akwizycji zapewnia optymalny ostrość obrazu i spójne pole widzenia między uczestnikami.
3. Skonfiguruj oprogramowanie do akwizycji
   1. Uruchom oprogramowanie do akwizycji

Wyniki

Sukcesywna aplikacja tego protokołu daje stabilną linię bazową, za którą następuje jasne i rozróżnialne reakcje mikrokrążenia na każdy stymulus naczyniowy. W technicznie udanym eksperymencie, zapis bazowy wykazuje stabilny sygnał perfuzji z minimalnymi wahaniami, określanymi jako SD < 10% średniego sygnału. Podczas jontoforezy ACh i SNP oczekuje się stopniowego wzrostu APU, co odbija zależną od dawki dylatację naczyń. Sukcesywna odpowiedź PORH charakteryzuje się szybką redukcją perfuzji do stabilnej biologicznej zera pod...

Dyskusja

LSCI zapewnia standaryzowany i nieinwazyjny sposób oceny ogólnoustrojowej funkcji mikrokrążenia z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. W porównaniu z LDF, która jest ograniczona do pomiarów w jednym punkcie i jest bardzo wrażliwa na przestrzenną niejednorodność perfuzji skóry, LSCI umożliwia pełne obrazowanie i jednoczesną ocenę wielu ROI. Ta cecha znacznie poprawia powtarzalność pomiarów i zmniejsza współczynnik zmienności w badaniach mikrokrążenia klinicznego. Ponadto bezkontaktowa natura LSCI minimalizuje lo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wyposażenie
Automatyczny oscylometryczny monitor ciśnienia krwi	Omron Healthcare	HEM-7120	Służy do oceny podstawowego średniego ciśnienia tętniczego (MAP) (3 pomiary)
Cyfrowy kalibrowany termometr	Delta OHM	HD2301.0	Dokładność ± 0,1°C dla monitorowania temperatury pokojowej
Elektroda rozpraszająca (referencyjna)	Perimed AB	PF 384	Neutralna elektroda o dużej powierzchni
Elektrody do podawania leku	Perimed AB	PF 383 / LI 611	Nieinwazyjne komory jontoforetyczne (około 80 mm²
Kontroler mocy do jontoforezi	Perimed AB	PeriIont Microvascular Diagnosis System	Kontroler prądu dwukanałowego (do 200 μA)
System obrazowania kontrastu plamek laserowych (LSCI)	Perimed AB	PeriCam PSI NR	Wysokiej rozdzielczości obrazowanie perfuzji krwi
Poduszka próżniowa klasy medycznej	AB Germa	N/A	Służy do stabilnego ustawienia przedramienia na wysokości serca
Jednoręczna pompa próżniowa	AB Germa	N/A	Służy do ewakuacji poduszek próżniowych
Szybki inflator mankietu	D.E. Hokanson, Inc.	E20 Rapid Cuff Inflator	Służy do standaryzowanej 3-minutowej okluzji tętnic
Czynniki reaktywne i materiały jednorazowego użytku
Chlorku acetylocholiny (ACh)	Sigma-Aldrich	A6625	Układ zależny od endotelium, przygotowany na 2%
Podkładki do odkażania alkoholem	Becton Dickinson	326895	Podkładki z 70% alkoholem izopropylowym do przygotowania skóry
Woda dejonizowana	Sigma-Aldrich	38796	Służy do ostatecznego płukania elektrod
Chlorku sodu (0,9% roztwór fizjologiczny)	Lokalny dostawca	N/A	Rozpuszczalnik do przygotowywania leków i czyszczenia skóry
Nitroprusydek sodu (SNP)	Sigma-Aldrich	S0501	Układ niezależny od endotelium, przygotowany na 2%
Sterylna gaza	Lokalny dostawca	N/A	Służy do osuszania powierzchni skóry po czyszczeniu
Oprogramowanie
Oprogramowanie do analizy perfuzji	Perimed AB	PIMSoft	Oprogramowanie do nabywania danych LSCI i analizy ROI
Oprogramowanie do analizy statystycznej	GraphPad Software	Prism 10	Służy do dopasowywania krzywych dawki-odpowiedź i obliczania powierzchni pod krzywą (AUC)