Protokół standaryzowanej oceny układowej funkcji mikronaczyniowej w ludzkiej mikrokrążeniu skóry z wykorzystaniem laserowego obrazowania kontrastowego z plamkami

Summary

Protokół ten opisuje standaryzowaną, nieinwazyjną metodę oceny funkcji mikronaczyniowej układu układowego w mikrokrążeniu skóry u człowieka, wykorzystującą laserowe obrazowanie z kontrastem plamkowym w połączeniu z farmakologiczną jonoforezą i bodźcami fizjologicznymi do oceny reaktywności mikronaczyniowej w badaniach klinicznych.

Abstract

Laserowe obrazowanie z kontrastem plamkowym (LSCI) to wysokorozdzielcza, nieinwazyjna technika optyczna, która umożliwia wizualizację mikronaczyniowej krwi w czasie rzeczywistym w pełnym polu. Protokół ten przedstawia ustandaryzowaną metodologię oceny funkcji mikronaczyniowej układu układowego w mikrokrążeniu skóry u człowieka z wykorzystaniem LSCI. Ponieważ pomiary uzyskane tą techniką są bardzo wrażliwe na czynniki zakłócające środowiskowe i fizjologiczne, protokół kładzie nacisk na rygorystyczne procedury standaryzacyjne w celu poprawy powtarzalności i wiarygodności eksperymentów. Protokół szczegółowo opisuje kluczowe mechanizmy kontroli środowiska, w tym stabilizację temperatury pokojowej w temperaturze 23°C ± 1°C, pozycjonowanie uczestników, procedury aklimatyzacji oraz minimalizację zewnętrznych zakłóceń podczas akwizycji obrazu. Metodologia integruje LSCI z dwoma komplementarnymi manewrami prowokacyjnymi w celu oceny skórnej reaktywności mikronaczyniowej. Hiperemia reaktywna po okluzji służy do oceny zintegrowanej reaktywności mikronaczyniowej, natomiast do oceny funkcji śródbłonka stosuje się wyzwania farmakologiczne oparte na jontoforezie. Konkretnie, w celu oceny rozszerzenia naczyń zależnych od śródbłonka podaje się acetylocholinę, a nitropruzyd sodu do oceny niezależnego od śródbłonka rozszerzania naczyń krwi. Ten krok po kroku wizualizowany protokół ma na celu ułatwienie wdrażania standaryzowanych metodologii LSCI w badaniach klinicznych i translacyjnych. Podejście to zostało skutecznie zastosowane do identyfikacji upośledzeń mikronaczyniowych w kilku schorzeniach klinicznych, w tym opornym nadciśnieniu, cukrzycy i chorobie wieńcowej. Dzięki umożliwieniu powtarzalnej i nieinwazyjnej oceny reaktywności mikronaczyniowej, ta metodologia stanowi cenne narzędzie do badania ogólnoustrojowego zdrowia naczyniowego, monitorowania postępu choroby oraz oceny skuteczności interwencji ukierunkowanych na mikronaczynia.

Introduction

Głównym celem tego protokołu jest dostarczenie ustandaryzowanej, powtarzalnej metodologii oceny funkcji i reaktywności mikronaczyniowej układów ogólnoustrojowych za pomocą laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym (LSCI) w połączeniu z fizjologicznymi i farmakologicznymi manewrami prowokacyjnymi. Mikrokrążenie, obejmujące naczynia krwionośne końcowe — tętniczki, naczynia włosowate i żyłki — mniejsze niż około 100 μm średnicy¹, jest głównym miejscem wymiany metabolicznej i kluczowym czynnikiem determinującym obwodowy opór naczyń². Dysfunkcja śródbłonka w tych małych naczyniach często poprzedza zmiany makronaczyniowe i stanowi wczesny biomarker chorób sercowo-naczyniowych, w tym nadciśnienia, cukrzycy i choroby wieńcowej³. Co ważne, choć uszkodzenie mikronaczyń znacząco przyczynia się do uszkodzenia narządów końcowych, działa ono w połączeniu z miażdżycą makronaczyniową oraz przewlekłym stanem zapalnym ogólnoustrojowym w procesie choroby wieloczynnikowej. Dlatego nieinwazyjna ocena reaktywności mikronaczyniowej jest niezbędna zarówno dla wczesnej diagnozy, jak i monitorowania skuteczności terapeutycznej w badaniach translacyjnych⁴.

Uzasadnienie stosowania mikrokrążenia skóry jako zastępcy dla ogólnoustrojowego zdrowia naczyniowego tkwi w jego dostępności oraz roli jako reprezentatywnego okna na globalną funkcję śródbłonka ^5,6. Tradycyjnie laserowa przepływometria Dopplera (LDF) była uznawana za złoty standard w nieinwazyjnej ocenie skóry⁷. Jednak LDF jest ograniczony przez słabą rozdzielczość przestrzenną, ponieważ zapewnia pomiary punktowe, które są bardzo wrażliwe na wrodzoną heterogeniczność perfuzji skóry⁸. Dla porównania, LSCI oferuje znaczące zalety, zapewniając pełną wizualizację perfuzji tkanek w pełnym polu i czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością^{czasową i} przestrzenną 9. Analizując wzorzec interferencji generowany przez rozpraszanie światła laserowego, LSCI umożliwia jednoczesną ocenę wielu obszarów naczyniowych bez konieczności kontaktu fizycznego lub egzogennych barwników^10,11.

W szerszej literaturze integracja LSCI z farmakologicznymi prowokacjami wywołanymi jonoforezą, takimi jak acetylocholina (ACh) i nitropruzyd sodu (SNP), została zweryfikowana jako solidne podejście do oceny szlaków rozszerzających naczynia zależnych od śródbłonka i niezależnych od niego^12,13. Ponadto hiperemia reaktywna po okluzywnej reakcji (PORH) zapewnia zintegrowaną ocenę reaktywności mikronaczyniowej z udziałem mediatorów śródbłonka, neurogennych nerwów czuciowych oraz funkcji mięśni gładkich naczyń¹². Pomimo zalet, wysoka wrażliwość LSCI na zmienność środowiskową i fizjologiczną wymaga ścisłych procedur standaryzacyjnych. Protokół ten rozwiązuje te wyzwania, szczegółowo opisując kluczowe mechanizmy kontroli środowiskowej, w tym stabilizację temperatury pokojowej na 23°C ± 1°C oraz standaryzowane pozycjonowanie uczestników, aby poprawić powtarzalność wewnątrzobiektową i międzyobiektową¹⁰. Ta metodologia jest odpowiednia dla badaczy klinicznych i translacyjnych, którzy poszukują metodologicznie opartego, nieinwazyjnego podejścia do badania mikronaczyniowej patofizjologii w różnorodnych grupach pacjentów.

Protocol

Wszystkie procedury z udziałem uczestników ludzkich były wykonywane zgodnie ze standardami etycznymi Narodowego Instytutu Kardiologii (Ministerstwo Zdrowia, Brazylia), zgodnie z krajowymi przepisami (Narodowy Komitet Etyki ds. Badań – INAEP – zgodnie z Ustawą nr 14 874, maj 2024) oraz Deklaracją Helsińską (zaktualizowaną w 2024 roku).

1. Przygotowanie uczestników i kontrola środowiskowa

1. Stabilizacja środowiska egzaminu
   1. Stabilizacja temperatury w pomieszczeniu badanym (RT; 23°C ± 1°C) za pomocą dedykowanego termostatu, aby utrzymać stabilne środowisko termiczne.
   2. Monitoruj RT co 10 minut za pomocą skalibrowanego termometru cyfrowego (dokładność ±0,1°C).
      UWAGA: Funkcja mikronaczyniowa skóry jest bardzo wrażliwa na wahania temperatury.
2. Przygotuj uczestnika przed oceną
   1. Uczcie uczestników powstrzymania się od palenia, spożywania kofeiny lub alkoholu oraz wykonywania intensywnych ćwiczeń przez 24 godziny przed oceną.
   2. Instruuj uczestników, aby pościli co najmniej 2 godziny przed oceną, przy jednoczesnym dopuszczeniu do spożycia wody.
      UWAGA: Powstrzymanie się od kofeiny i intensywnych ćwiczeń minimalizuje zewnętrzne zakłócenia napięcia naczyń skórnych. Kofeina, jako antagonista receptora adenozynowego, oraz ćwiczenia, poprzez wpływ na napęd współczulny i termoregulację, mogą wywołać długotrwałe zmiany w reaktywności mikronaczyniowej, które utrzymują się przez kilka godzin po ekspozycji ^4,14.
3. Ustawij uczestnika do akwizycji obrazu
   1. Ustaw niedominujące ramię uczestnika na poziomie serca, używając poduszek ciała, aby utrzymać przedramię w pozycji poziomej i stabilnej.
   2. Użyj brzusznej powierzchni przedramienia jako miejsca oceny.
      UWAGA: Niedominujące przedramię minimalizuje wpływ lateralizowanego przebudowy naczyń związanych z codziennymi czynnościami. Przedramię brzuszne zapewnia korzystne cechy anatomiczne do obrazowania optycznego, w tym niższą gęstość włosów i zmniejszoną grubość skóry, co minimalizuje artefakty sygnałowe i poprawia powtarzalność dostarczania leków jonoforetycznych.
4. Pozwól na stabilizację układu krążenia
   1. Utrzymuj uczestnika w spoczynku przez co najmniej 20 minut przed rozpoczęciem badań mikronaczyniowych.
   2. Ogranicz uczestnika od mówienia, poruszania ocenianą kończyną lub korzystania z urządzeń elektronicznych podczas przerwy odpoczynku.
      UWAGA: Okres stabilizacji minimalizuje fluktuacje autonomiczne i sercowo-naczyniowe przed nabyciem stanów wyjściowych.
5. Minimalizacja artefaktów ruchu
   1. Umieść niedominujące przedramię uczestnika na systemie próżniowym poduszek.
   2. Dostosuj poduszkę, aby utrzymać powierzchnię przedramienia brzuszną w stabilnej pozycji poziomej podczas akwizycji obrazu.
6. Przygotuj powierzchnię skóry
   1. Wybierz miejsca skóry bez widocznych owłosień dla wszystkich pomiarów.
   2. Usuwaj włosy maszynką chirurgiczną 24 godziny przed oceną, jeśli jest to konieczne.
      UWAGA: Nie używaj maszynki do usuwania owłosienia, ponieważ podrażnienie skóry może zakłócać pomiary mikronaczyniowe.
7. Mierzenie ciśnienia tętnicowego
   1. Wybierz rozmiar mankietu zgodnie z obwodem ramienia uczestnika.
   2. Wykonaj trzy kolejne pomiary ciśnienia krwi za pomocą skalibrowanego automatycznego urządzenia oscylometrycznego z 1-minutowym odstępem między pomiarami.
   3. Pierwszy pomiar odrzuć i oblicz średnią z dwóch ostatnich pomiarów, aby określić średnie ciśnienie tętnicze (MAP), zgodnie z wytycznymi ESC/ESH i AHA.

2. Konfiguracja systemu LSCI i oprogramowanie

1. Przygotuj system LSCI
   1. Włącz system LSCI co najmniej 10 minut przed akwizycją obrazu, aby umożliwić stabilizację źródła lasera.
   2. Przed rozpoczęciem nagrywania sprawdź stabilizację lasera za pomocą wskaźnika statusu oprogramowania.
2. Ustawienie głowicy lasera
   1. Ustaw głowicę lasera bezpośrednio nad przedramieniem uczestnika.
   2. Ustaw głowicę lasera dokładnie 15 cm od powierzchni skóry za pomocą dostarczonego przez producenta narzędzia do pomiaru odległości (Rysunek 1A)
      UWAGA: Utrzymanie stałej odległości akwizycji zapewnia optymalną ostrość obrazu i spójne pole widzenia między uczestnikami.
3. Konfiguruj oprogramowanie do akwizycji
   1. Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazów i stwórz nowy plik badawczy.
   2. Wprowadź dane demograficzne uczestnika oraz wcześniej obliczoną mapę mapową.
      UWAGA: Dołącz szczegółowe instrukcje obsługi oprogramowania oraz reprezentatywne zrzuty ekranu jako materiały uzupełniające, jeśli to możliwe.
4. Konfiguruj parametry akwizycji
   1. Ustaw częstotliwość pobierania próbkowania na 1 obraz/s (1 Hz).
   2. Dostosuj rozdzielczość przestrzenną do około 0,1 mm/piksel dla obszaru docelowego nabycia.
      UWAGA: Częstotliwość próbkowania 1 Hz zapewnia odpowiednią równowagę między rozdzielczością czasową a stosunkiem sygnału do szumu, jednocześnie odpowiednio rejestrując kinetykę odpowiedzi hiperemicznej i farmakologicznej.
5. Minimalizacja zakłóceń światła otoczenia
   1. Przed akwizycją przeprowadź sprawdzenie szumu tła lub odejmowanie ciemnych klatek zgodnie z wymaganiami systemowymi.
   2. Przyciemniaj światła w pokoju i blokuj zewnętrzne światło słoneczne za pomocą zasłon zaciemniających podczas wszystkich nagrań, gdy odejmowanie ciemnych kadrów jest niedostępne.
      UWAGA: Standaryzowane oświetlenie otoczenia minimalizuje interferencje optyczne i poprawia powtarzalność sygnału.
6. Zdefiniuj obszary zainteresowania (ROI)
   1. Utworzenie co najmniej trzech okrągłych ROI o średnicy około 80 mm² na ekranie podglądu na żywo w oprogramowaniu akwizycji.
   2. Umieść dwa ROI nad punktami elektrod jontoforezy i jeden ROI nad punktem oceny PORH.
   3. Wszystkie ROI umieść na brzusznym przedramieniu, około 5 cm dalej od dołu przedkubitalnego, unikając widocznych żył powierzchownych.
      UWAGA: Standaryzacja obszaru ROI minimalizuje wpływ heterogeniczności przestrzennej w perfuzji skórnej i zmniejsza artefakty krawędziowe związane z komorami podawania leków.
7. Zdobądź podstawowe nagranie perfuzji
   1. Rejestruj spoczynkowy przekrywanie krwi skórnej przez 5 minut przed stymulacją naczyń.
   2. Monitoruj sygnał perfuzji w czasie rzeczywistym i potwierdzaj brak impulsów wywołanych ruchem podczas pomiaru bazowego.
   3. Zdefiniuj stabilność bazową jako zmianę sygnału perfuzji o <10% w ciągłym, 2-minutowym odstępie.
8. Umożliwienie analizy przewodności skórnej naczyniowej (CVC)
   1. Wprowadź MAP uczestnika do oprogramowania do pozyskiwania.
   2. Włącz automatyczne obliczanie CVC w ustawieniach oprogramowania.
9. Zapisz dane perfuzji i przewodności
   1. Konfiguruj oprogramowanie do automatycznego obliczania CVC, dzieląc wartości perfuzji w czasie rzeczywistym (APU) przez MAP.
   2. Rejestruj zarówno surowe jednostki perfuzji (PU), jak i obliczane wartości CVC jednocześnie w całym protokole.
      
      UWAGA: Ekspresja mikronaczyniowej perfuzji jako CVC minimalizuje zakłócający wpływ ogólnoustrojowych wahań ciśnienia krwi i umożliwia bardziej wiarygodne porównania między uczestnikami o różnych profilach hemodynamicznych.

Rysunek 1. Eksperymentalne przygotowanie do oceny perfuzji mikronaczyniowej skóry za pomocą laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym (LSCI) w połączeniu z jonoforezą. (A) Reprezentatywne wyposażenie eksperymentalne stosowane do oceny mikronaczyniowej skóry z wykorzystaniem laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym oraz jonoforezy środków rozszerzających naczynia. (B) Reprezentatywna mikronaczyniowa odpowiedź perfuzji podczas transdermalnego jontoforetycznego podawania skumulowanych dawek acetylocholiny (ACh). (C) Reprezentatywny obraz jonoforezy ACh. (D) Reprezentatywny obraz elektrody sterującej zawierającej pojazd. Etykiety wskazują następujące elementy: (1) głowica obrazu; (2) elektrody do dostarczania leków z jonoforezy; oraz (3) elektroda dyspersyjna. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

3. Jonoforeza i prowokacja farmakologiczna

1. Przygotuj skórę do jonoforezy
   1. Oczyść wybrane miejsca skórne przedramienia za pomocą bezalkoholowego roztworu soli fizjologicznej lub łagodnego środka do mycia skóry.
   2. Delikatnie osusz skórę przed założeniem elektrody.
      UWAGA: Unikaj nadmiernej stymulacji mechanicznej podczas przygotowania skóry, ponieważ mechanicznie indukowane rozszerzenie naczyń może zakłócać pomiary wyjściowe.
2. Ustawienie elektrod dostarczających leki
   1. Przymocuj dwie elektrody podawające leki do przygotowanych miejsc skórnych za pomocą dwustronnych dysków klejących (Rysunek 1A).
   2. Utrzymuj odległość między elektrodami około 5 cm, aby zapobiec zakłóceniom prądu elektrycznego.
3. Przygotuj rozwiązanie ACh
   1. Napełnij pierwszą komorę elektrody 200 μL roztworu 2% ACh przygotowanego w soli fizjologicznej^{0,9% 14,15}.
   2. Użyj elektrody ACh do oceny rozszerzenia naczyń zależnych od śródbłonka.
      UWAGA: Wybrane stężenie leku zostało zoptymalizowane tak, aby wywołać silną odpowiedź mikronaczyniową zależną od dawki, minimalizując jednocześnie niespecyficzne podrażnienie i artefakty galwaniczne.
4. Przygotuj rozwiązanie SNP
   1. Napełnij drugą komorę elektrody 200 μL roztworu 2% SNP przygotowanego w soli fizjologicznej 0,9%.
   2. Użyj elektrody SNP do oceny niezależnego od śródbłonka rozszerzania naczyń krwionośnych.
      UWAGA: SNP jest światłoczułe. Chroń roztwór przed światłem za pomocą folii aluminiowej i użyj go w ciągu 4 godzin od przygotowania, aby zachować stabilność farmakologiczną.
      UWAGA: Wybrane stężenie SNP ułatwia stabilne rozszerzenie naczyń wazyjnych, minimalizując jednocześnie niespecyficzne efekty elektryczne.
5. Usuń uwięzione pęcherzyki powietrza
   1. Przed przymocowaniem skóry sprawdź komory elektrod pod kątem uwięzionych pęcherzyków powietrza.
   2. Usuwając widoczne pęcherzyki powietrza, delikatnie stukając w komorę elektrody lub używając sterylnej plastikowej końcówki strzykawki.
      UWAGA: Pęcherzyki powietrza mogą blokować przepływ prądu i powodować niejednorodne dostarczanie leków.
6. Ustawienie elektrody referencyjnej
   1. Przymocuj elektrodę referencyjną (neutralną) w odległości około 15 cm bliższej do elektrod podawających lek, używając przewodzącego żelu lub kleju (Rysunek 1A).
   2. Potwierdź stabilny kontakt elektrody przed rozpoczęciem jonoforezy.
      UWAGA: Przestrzenne rozdzielenie między obszarami farmakologicznymi a oceną PORH minimalizuje interakcje zakłócające i zapobiega nakładaniu się odruchu aksonowego wywołanego przez ACh z obszarem pomiarowym PORH.
7. Podłącz system jonoforezy
   1. Podłącz wszystkie elektrody do jednostki dostarczającej jonoforezę przed zastosowaniem bieżącego.
   2. Potwierdź polaryzację elektrod przed rozpoczęciem protokołu (anodalny dla ACh, katodalny dla SNP).
      UWAGA: Nieprawidłowa polaryzacja elektrod może obniżyć efektywność podawania leków i zmienić reakcje naczyniowe.
8. Przeprowadzenie protokołu prądu jonoforezy
   1. Dla obu środków farmakologicznych należy podać sześć dawek stopniowego przepływu po 30, 60, 90, 120, 150 i 180 μA.
   2. Stosuj każdą aktualną dawkę przez 10 sekund.
      UWAGA: Protokół inkrementalnego prądu umożliwia konstrukcję krzywej dawka-odpowiedź oraz ułatwia ocenę wrażliwości mikronaczyniowej i odpowiedzi plateau¹¹. Połączenie niskich amplitud prądu i krótkich interwałów stymulacji minimalizuje niespecyficzne galwaniczne rozszerzenie naczyń krwionośnych.
9. Zachowaj odstęp między bodźcami
   1. Utrzymuj 60-sekundowy odstęp między kolejnymi bieżącymi aplikacjami.
   2. Monitoruj sygnał perfuzji podczas okresu stabilizacji między dawkami.
      UWAGA: Wybrany przedział pozwala na stabilizację odpowiedzi mikronaczyniowej przy jednoczesnym utrzymaniu lokalnej dostawy leku bez skutków ogólnoustrojowych.
10. Zapisz odpowiedź mikronaczyniową
    1. Rejestruj sygnał perfuzji mikronaczyniowej nieprzerwanie podczas wszystkich stymulacji jonoforezy.
    2. Kontynuuj nagrywanie przez co najmniej 10 minut po ostatnim bieżącym zastosowaniu, aby uchwycić maksymalną odpowiedź plateau. Reprezentatywna odpowiedź zależna od dawki pokazana jest na Rysunku 2A.

Rysunek 2. Reprezentatywne zapisy perfuzji mikronaczyniowej skóry podczas jontoforezy oraz hiperemii reaktywnej po okluzji (PORH). ( A) Reprezentatywne rejestrowanie strumienia krwi w mikronaczyniach skórnych uzyskanych za pomocą LSCI podczas jonoforezy 2% ACh dostarczanego przy rosnących prądach anodalnych 30, 60, 90, 120, 150 i 180 μA przez 10-sekundowe odstępy oddzielone 1 minutą. (B) Reprezentatywne nagranie uzyskane podczas oceny PORH. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

4. Hiperemia reaktywna po okluzji (PORH)

1. Ustawij mankiet okluzyjny
   1. Na górnej części ramienia tej samej kończyny, która była używana do nagrywania LSCI, umieść standardowy pneumatyczny mankiet (szerokość około 12 cm).
   2. Umieść mankiet blisko wybranego miejsca oceny mikronaczyniowej.
2. Zdefiniuj region oceny PORH
   1. Stwórz trzeci ROI na przedramieniu brzusznym, przylegającym do miejsc elektrod jontoforezy.
   2. Umieść zwrot z inwestycji w obszarze skóry wolnego od leczenia, aby uniknąć zakłóceń farmakologicznych.
      UWAGA: Utrzymywanie przestrzennego oddzielenia między miejscami stymulacji farmakologicznej a obszarem oceny PORH, aby zachować niezależne odpowiedzi naczyniowe.
3. Zdobądź nagranie bazowe PORH
   1. Zapisz ciągłe odpoczynkowe perfuzję skórną przez 5 minut przed zatkaniem tętnic.
   2. Monitoruj sygnał perfuzji wyjściowej, aby potwierdzić stabilność sygnału przed napompowaniem mankietu.
4. Wywołanie okluzji tętnic
   1. Napompuj pneumatyczny mankiet szybko w ciągu < 5 sekund, używając automatycznego nadmuchiwacza lub ręcznej żarówki do nadmuchiwania.
   2. Zwiększ ciśnienie w mankietach do 50 mmHg powyżej wcześniej zmierzonego ciśnienia skurczowego (SBP) uczestnika.
      UWAGA: Przed rozpoczęciem okresu zatkania tęgiczniczego należy potwierdzić całkowite zatkanie tętnic, ponieważ niepełne zatkanie może osłabić odpowiedź hiperemiczną.
5. Utrzymanie okresu zasłony
   1. Utrzymuj nieprzerwanie okluzję tętnic dokładnie przez 3 minuty.
   2. Zweryfikować całkowitą okluzję, potwierdzając, że sygnał LSCI spada do biologicznego zerowego plateau (< 10 APU).
      UWAGA: Biologiczny sygnał zerowy odzwierciedla ruch resztkowy komórek krwi niezależny od skierowanego przepływu krwi, w tym ruch Browna.
6. Zwolnij mankiet okluzyjny
   1. Natychmiastowe uwolnienie ciśnienia w mankietach za pomocą zaworu szybkiego wylotu.
   2. Pozwól na natychmiastowe przywrócenie przepływu krwi, aby rozpocząć reakcję hiperemiczną reaktywną.
7. Zapisz reakcję hiperemiczną
   1. Kontynuuj nagrywanie LSCI przez co najmniej 5 minut po zwolnieniu mankietu.
   2. Uchwyć szczytową odpowiedź perfuzji i późniejszy powrót do poziomu wyjściowego perfuzji. Reprezentatywna odpowiedź PORH pokazana jest na Rysunku 2B.
8. Określ odpowiedź PORH
   1. Oblicz szczytowe CVC w oprogramowaniu do akwizycji obrazu.
   2. Oblicz pole pod krzywą (AUC) sygnału odpowiedzi hiperemicznej za pomocą oprogramowania analitycznego.

5. Ekstrakcja danych i analiza statystyczna

1. Otwórz i zweryfikuj zarejestrowane dane
   1. Otwórz nagrane pliki akwizycji za pomocą oprogramowania do analizy obrazów.
   2. Sprawdź, czy wszystkie z góry zdefiniowane ROI pozostają prawidłowo umieszczone nad odpowiednimi miejscami pomiarowymi.
      UWAGA: Zwrot z inwestycji w przemiana tylko wtedy, gdy artefakty ruchu lub dryf akwizycji naruszają pierwotne położenie.
2. Zdefiniuj przedziały analizy
   1. Zidentyfikuj konkretne przedziały analizy na wykresach trendów perfuzji i CVC.
   2. Wybierz ciągły 60-sekundowy odstęp bazowy bezpośrednio przed pierwszym bodźcem naczyniowym.
   3. Wybierz ostatnie 30 sekund każdego 60-sekundowego interwału po stymulacji jonoforezy, aby uchwycić mikronaczyniową odpowiedź plateau.
      UWAGA: Zdefiniuj stabilność bazową jako współczynnik zmienności (CV) < 5% sygnału perfuzyjnego, aby zminimalizować wpływ oscylacji wazoruchowych i artefaktów ruchu przed analizą danych.
3. Zidentyfikuj zmienne odpowiedzi PORH
   1. Zidentyfikuj sygnał biologicznego zera podczas fazy okluzji tętnic protokołu PORH.
   2. Natychmiast po zwolnieniu mankietu zidentyfikuj szczytową wartość CVC.
4. Oblicz wartości średnie przedziału
   1. Oblicz średnią wartość CVC dla każdego wcześniej zdefiniowanego przedziału analizy za pomocą oprogramowania do analizy obrazów.
   2. Przed potwierdzeniem ostatecznych obliczonych wartości sprawdź brak artefaktów ruchowych.
5. Zorganizuj wyodrębnione dane
   1. Eksportuj lub ręcznie przepisz średnie wartości surowego PU i średniej wartości CVC do uporządkowanego arkusza kalkulacyjnego.
   2. Zorganizuj zbiór danych według grup badawczych i bodźców naczyń, w tym acetylocholiny, nitropruzydu sodu oraz odpowiedzi PORH.
      UWAGA: Utrzymuj spójne kody nazw plików i identyfikacji uczestników podczas przetwarzania danych, aby zminimalizować błędy transkrypcji.
6. Obliczanie wtórnych wyników naczyniowych
   1. Oblicz procentowy wzrost względem wyjściowych wartości perfuzji lub CVC, aby określić reaktywność naczyniową.
   2. Oblicz AUC, gdy jest to konieczne do analizy punktów końcowych wtórnych.
7. Wykonaj analizę statystyczną
   1. Analizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej.
      UWAGA: W razie potrzeby dołącz reprezentatywne zrzuty ekranu lub instrukcje dotyczące analizy oparte na oprogramowaniu jako materiały uzupełniające.
   2. Ocena rozkładu danych
      1. Oceń normalność danych za pomocą testu Shapiro-Wilka.
      2. Wyraż dane rozłożone normalnie jako średnią ± odchylenia standardowego (SD).
      3. Dane nienormalnie rozkładane jako mediana i zakres interkwartylny (IQR).
   3. Porównaj odpowiedzi mikronaczyniowe
      1. Porównaj zbiory danych dwóch grup za pomocą niezależnego testu t, gdy spełnione są założenia normalności.
      2. Porównaj kilka grup za pomocą jednokierunkowego testu ANOVA, a następnie testu post-hoc Tukeya.
   4. Zdefiniuj kryteria istotności statystycznej
      1. Zdefiniuj istotność statystyczną jako p < 0,05.
      2. Obsługa brakujących danych spowodowanych artefaktami ruchu za pomocą parowego usuwania lub wykluczania z analizy.
         UWAGA: Stosuj tę samą strategię dotyczącą brakujących danych konsekwentnie we wszystkich grupach badawczych, aby zachować integralność analityczną.

Results

Skuteczne zastosowanie tego protokołu daje stabilny punkt wyjściowy, po którym następują wyraźne i rozpoznawalne odpowiedzi mikronaczyniowe na każdy bodziec naczyniowy. W technicznie udanym eksperymencie pomiar bazowy pokazuje stabilny sygnał perfuzji z minimalnymi wahaniami, definiowany jako SD < 10% średniego sygnału. Podczas jonoforezy ACh i SNP spodziewany jest stopniowy wzrost APU, co odzwierciedla zależność od dawki rozszerzenie naczyń. Udana odpowiedź PORH charakteryzuje się szybkim spadkiem perfuzji do stabilnego biologicznego zera podczas zatkania tętnic, po czym następuje gwałtowny szczyt hiperemiczny zaraz po zwolnieniu mankietu, zazwyczaj osiągający wartości kilkukrotnie powyżej poziomu wyjściowego u zdrowych osób. Rysunek 1A ilustruje eksperymentalny układ stosowany do oceny mikronaczyniowej skóry z wykorzystaniem LSCI i jotoforezy. Rysunki 1B–1D pokazują reprezentatywne odpowiedzi jonoforezy oraz pozycjonowanie elektrod. Rysunek 2A przedstawia reprezentatywną odpowiedź mikronaczyniową zależną od dawki podczas jonoforezy ACh, natomiast Rysunek 2B pokazuje reprezentatywną odpowiedź PORH.

Nagrania nieoptymalne lub technicznie nieudane charakteryzują się zwykle niestabilnością sygnału lub artefaktami związanymi z ruchem. Skoki o wysokiej częstotliwości lub nagłe wahania poziomu bazowego zazwyczaj wskazują na ruch uczestnika lub niewystarczającą stabilizację systemu podparcia próżniowego. Zmniejszona lub brak reakcji rozszerzającej naczynia podczas jonoforezy u zdrowego uczestnika często wskazuje na słaby kontakt elektrody ze skórą lub uwięzienie pęcherzyków powietrza w komorze elektrody, co skutkuje upośledzeniem dostawy prądu elektrycznego. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywny przykład nieakceptowalnego nagrania charakteryzującego się niestabilnością sygnału związaną z ruchem.

Rysunek 3. Reprezentatywny przykład niedopuszczalnego zapisu perfuzji mikronaczyniowej podczas jonoforezy. Reprezentatywne rejestrowanie przepływu krwi w mikronaczyniach skórnych uzyskanych za pomocą LSCI podczas jonoforezy ACh, wykazujące niestabilność sygnału oraz artefakty związane z ruchem nieodpowiednie do analizy ilościowej. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Brak osiągnięcia stabilnego biologicznego zera podczas fazy okluzji PORH wskazuje na niepełne zatkanie tętniczne, często spowodowane nieprawidłowym ustawieniem mankietów lub niewystarczającym ciśnieniem napompowanim mankietów. W tych warunkach następująca odpowiedź hiperemiczna staje się osłabiona i nieodpowiednia do wiarygodnej interpretacji.

Pomyślnie wykonane protokoły generują powtarzalne krzywe perfuzji i CVC. Maksymalne plateau CVC obserwowane podczas jontoforezy SNP odzwierciedla całkowitą zdolność rozszerzania naczyń i integralność strukturalną naczyń, podczas gdy odpowiedź wyzywana przez ACh odzwierciedla głównie funkcję mikronaczyniową zależną od śródbłonka. Standaryzowane porównanie tych odpowiedzi naczyniowych umożliwia rozróżnienie wzorców zgodnych z zachowaną a upośledzoną funkcją mikronaczyniową. Reprezentatywne ilościowe parametry mikronaczyniowe uzyskane od zdrowych młodych osób oraz pacjentów z opornym nadciśnieniem tętniczym przedstawiono w Tabeli 1.

Parametr mikronaczyniowy	Jednostka	Zdrowe młode grupy kontrolne (n = 25)	Pacjenci z opornym nadciśnieniem tętniczymi (n = 50)	wartość p
Bazowy CVC	APU/mmHg	0.37 ± 0.13	0.29 ± 0.12	0.01
Szczyt CVC indukowany przez ACh	APU/mmHg	0.67 ± 0.23	0.51 ± 0.19	0.004
Szczytowe CVC indukowane przez SNP	APU/mmHg	0.60 ± 0.21	0.41 ± 0.17	0.0003
PORH Peak CVC	APU/mmHg	0.87 ± 0.18	0.60 ± 0.16	< 0.0001

Tabela 1: Reprezentatywne parametry reaktywności mikronaczyniowej u zdrowych młodych osób oraz pacjentów z opornym nadciśnieniem tętniczym. Wartości wyraża się jako średnią ± odchylenie standardowe (SD). wartości p obliczono za pomocą niezależnego testu t do porównania między grupami. Skróty: ACh, acetylocholina; SNP, nitropruzyd sodu; PORH, hiperemia reaktywna po okluzji; CVC, przewodność naczyń skórnych; APU, dowolne jednostki perfuzji. Dane reprezentują nieopublikowane wyniki z laboratorium autorów.

Discussion

LSCI oferuje standaryzowane i nieinwazyjne podejście do oceny funkcji mikronaczyniowych układów ogólnoustrojowych z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. W porównaniu z LDF, który ogranicza się do pomiarów jednopunktowych i jest bardzo wrażliwy na przestrzenną heterogeniczność perfuzji skóry, LSCI umożliwia obrazowanie w pełnym polu oraz jednoczesną ocenę wielu ROI. Ta cecha znacząco poprawia powtarzalność pomiarów i zmniejsza współczynnik zmienności w klinicznych badaniach mikronaczyniowych. Ponadto bezkontaktowy charakter LSCI minimalizuje lokalne artefakty ciśnienia powszechnie kojarzone z technikami opartymi na sondzie, zwiększając jego przydatność do powtarzanych ocen w badaniach translacyjnych i klinicznych.

Kluczowym elementem tego protokołu jest normalizacja danych perfuzji do MAP w celu obliczenia CVC. Ponieważ perfuzja krwi skórnej jest silnie zależna od ogólnoustrojowego ciśnienia perfuzyjnego, sama interpretacja surowego APU może prowadzić do istotnych zakłóceń, szczególnie w populacjach o zmienionych profilach hemodynamicznych, takich jak nadciśnienie czy dyslipidemia. Z tego powodu protokół zaleca raportowanie zarówno surowych wartości PU, jak i znormalizowanych wartości CVC, aby poprawić interpretację funkcji mikronaczyniowej w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych. Kolejnym kluczowym elementem protokołu jest ścisła stabilizacja środowiskowa i uczestników, w tym kontrola temperatury w pomieszczeniu, minimalizacja artefaktów ruchu oraz standaryzowane pozycjonowanie uczestników, które są niezbędne do uzyskania powtarzalnych nagrań.

Należy również wziąć pod uwagę kilka ograniczeń LSCI. Technika ta głównie ocenia powierzchowne mikrokrążenie skórne na głębokości około 0,5–1 mm, dlatego może nie w pełni reprezentować głębszych łóżek naczyniowych. Ponadto pigmentacja skóry i zakłócenia światła otoczenia mogą wpływać na stosunek sygnału do szumu, co podkreśla znaczenie kontroli środowiskowych opisanych w tym protokole. Kolejnym ograniczeniem jest zastosowanie jednego pomiaru bazowego MAP do obliczeń CVC przez cały zabieg. Chociaż ciśnienie ogólnoustrojowe może się wahać w ciągu około 40-minutowego okresu pomiaru, powtarzające się nadmuchiwanie mankietu było celowo unikane, ponieważ powtarzające się pomiary ciśnienia mogą wywołać aktywację współczulną i ruchowe artefakty zakłócające sygnał laserowy. Przyszłe badania integrujące ciągłe, nieinwazyjne monitorowanie hemodynamiczne mogą dodatkowo poprawić fizjologiczną interpretację pomiarów przewodności mikronaczyniowej.

Kluczowe kroki protokołu obejmują stabilizację środowiska, kontrolę ruchu, pozycjonowanie elektrod oraz całkowite zatkanie tętnic podczas PORH. Niestabilne wyniki pomiarów bazowych są często spowodowane ruchem uczestników lub niewystarczającymi okresami odpoczynku i można je zminimalizować poprzez ponowne ustabilizowanie systemu poduszek próżniowych oraz wydłużenie okresu aklimatyzacji. Stępione odpowiedzi jonoforetyczne często wskazują na słaby kontakt elektrody ze skórą lub uwięzione pęcherzyki powietrza w komorze dostarczającej; Staranne napełnianie komory i przestawianie elektrod zazwyczaj rozwiązują te problemy. Nieosiągnięcie biologicznego zera podczas fazy okluzji PORH zwykle odzwierciedla niepełne zatkanie tętnic spowodowane niewystarczającym napompowaniem mankietów lub nieprawidłowym ustawieniem mankietów. W tych warunkach powstała odpowiedź hiperemiczna staje się osłabiona i nieodpowiednia do wiarygodnej interpretacji.

Integracja prowokacji fizjologicznych i farmakologicznych stanowi główną zaletę tego protokołu, ponieważ podejścia te oceniają komplementarne aspekty regulacji mikronaczyniowej. PORH zapewnia zintegrowaną fizjologiczną ocenę reaktywności mikronaczyniowej obejmującej mechanizmy mięśni gładkich wewnątrzbłonowych, neurogennych i naczyniowych, wywołane przez przejściowe niedokrwienie i naprężenie ścinające¹⁶. Natomiast jonoforeza umożliwia selektywną ocenę szlaków rozszerzających naczynia zależnych od śródbłonkowego i niezależnych od śródbłonkowego¹⁵. ACh ocenia rozszerzenie naczyń zależne od tlenku azotu zależne od endotelu, podczas gdy SNP, bezpośredni dawca tlenku azotu, ocenia reakcję mięśni gładkich naczyń niezależnych od sygnalizacji śródbłonkowej¹⁵. Porównawcza interpretacja tych odpowiedzi pozwala rozróżnić funkcjonalne uszkodzenie śródbłonka od strukturalnej remodelacji mikronaczyniowej. To rozróżnienie jest szczególnie istotne w przypadku starzenia się, opornego nadciśnienia, cukrzycy oraz przewlekłych chorób metabolicznych, gdzie upośledzona sygnalizacja śródbłonka i rozrzedzenie mikronaczyniowe mogą współistnieć^14,17.

Podsumowując, ten standaryzowany protokół LSCI dostarcza powtarzalną i translacyjną istotną metodę nieinwazyjnej oceny zdrowia mikronaczyniowego człowieka. Połączenie farmakologicznej jotoforezy z fizjologicznymi testami niedokrwio-reperfuzyjnymi umożliwia szczegółową charakterystykę funkcji śródbłonka i strukturalnego naczyń przy jednoczesnym minimalizowaniu zmienności eksperymentalnej poprzez rygorystyczną standaryzację środowiskową i hemodynamiczną. Ze względu na wrażliwość na wykrywanie wczesnych dysfunkcji mikronaczyniowych w różnych zaburzeniach sercowo-naczyniowych i metabolicznych, to podejście stanowi cenne narzędzie do badań klinicznych, monitorowania podłużnego oraz oceny terapeutycznej w translacyjnej medycynie naczyniowej.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprzęt
Automatyczny oscylometryczny monitor ciśnienia	Omron Healthcare	HEM-7120	Wykorzystywane do oceny średniego ciśnienia tętnicznego (MAP) bazowego (3 pomiary)
Cyfrowy Kalibrowany Termometr	Delta OHM	HD2301.0	Dokładność i plusmn; 0,1 stopnia; C oznacza monitorowanie temperatury pokojowej
Elektroda dyspersyjna (referencyjna)	Perimed AB	PF 384	Elektroda neutralna o dużej powierzchni
Elektrody podawające leki	Perimed AB	PF 383 / LI 611	Nieinwazyjne komory jonoforezy (około 80 mm²)
Regulator zasilania jonoforezy	Perimed AB	System diagnostyki mikronaczyniowej PeriIont	Dwukanałowy kontroler prądu (do 200 i mikro; A)
System Laserowego Obrazowania Kontrastowego Strumienia Plamkowego (LSCI)	Perimed AB	PeriCam PSI NR	Wysokorozdzielczy obraznik perfuzji krwi
Poduszka próżniowa medycznej jakości	AB Germa	Nie ma	Stosowany do stabilnej pozycji przedramienia na poziomie serca
Jednoręczna pompa próżniowa	AB Germa	Nie ma	Wykorzystywane do ewakuacji poduszek próżniowych
Szybki napompowator mankietów	D.E. Hokanson, Inc.	E20 Rapid Cuff Inflator	Stosowany do standaryzowanej 3-minutowej okluzji tętnic
odczynniki i materiały jednorazowe
Chlorek acetylocholiny (ACh)	Sigma-Aldrich	A6625	Endothelium zależny od rozszerzenia naczyń przygotowawany w dawce 2%
Wkładki do przygotowania alkoholu	Becton Dickinson	326895	Podpaski z alkoholem izopropylowym 70% do przygotowania skóry
Woda dejonizowana	Sigma-Aldrich	38796	Używany do końcowego płukania elektrod
Chlorek sodu (0,9% soli fizjologicznej)	Lokalny dostawca	Nie ma	Rozpuszczalnik do przygotowywania leków i oczyszczania skóry
Nitroprusyd sodu (SNP)	Sigma-Aldrich	S0501	Niezależny od śródbłonka preparat rozszerzający naczynia krwi przygotowany w dawce 2%
Sterylna Gaza	Lokalny dostawca	Nie ma	Używany do suszenia powierzchni skóry po czyszczeniu
Oprogramowanie
Oprogramowanie do analizy perfuzji	Perimed AB	PIMSoft	Oprogramowanie do akwizycji danych LSCI i analizy zwrotu z inwestycji
Oprogramowanie do analizy statystycznej	Oprogramowanie GraphPad	Prism 10	Wykorzystywane do dopasowywania krzywej dawka-odpowiedź oraz obliczania powierzchni pod krzywą (AUC)