Wieloetapowe dowody genetyczne, transkrypcyjne i jednokomórkowe wskazują na MAP1LC3A jako priorytetowy gen spośród genów związanych z ferroptozą w glejakach wielopostaciowych

Zhirui Liao; Mingming Xian; Fanmeng Zeng; Weikun Zhou; Jinshui Lin; Bo Yang; Wanchun Yin; Jianjun Ye

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł badawczy

Wieloetapowe dowody genetyczne, transkrypcyjne i jednokomórkowe wskazują na MAP1LC3A jako priorytetowy gen spośród genów związanych z ferroptozą w glejakach wielopostaciowych

94 wyświetleń

⸱

11 września 2026

Zhirui Liao^*¹ , Mingming Xian^*² , Fanmeng Zeng¹ , Weikun Zhou¹ , Jinshui Lin¹ , Bo Yang¹ , Wanchun Yin¹ , Jianjun Ye¹

¹Department of Cerebrovascular Neurosurgery, The First People's Hospital of Zhaoqing, ²The National Key Clinical Specialty, Guangdong Provincial Key Laboratory on Brain Function Repair and Regeneration, Department of Neuro-oncological Surgery, Zhujiang Hospital, Southern Medical University

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Genetycznie zakotwiczone, wieloetapowe podejście integrujące randomizację mendlowską, transkryptomikę guzów oraz analizy pojedynczych komórek pozwoliło wytypować MAP1LC3A jako gen związany z ferroptozą, który wiąże się z podatnością na glejakoludzkie i stanowi kandydata do przyszłej walidacji eksperymentalnej.

Streszczenie

Glejaki wielopostaciowe (GBM) pozostają wysoce agresywnym nowotworem złośliwym, a wkład genów związanych z ferroptozą w podatność na tę chorobę nie jest jeszcze w pełni poznany. W celu priorytetyzacji genów związanych z ferroptozą i powiązanych z GBM zastosowano zakotwiczone genetycznie, wieloetapowe ramy analityczne. Spośród 483 genów wyselekcjonowanych z bazy FerrDb V2, 315 posiadało kandydujące locus cech ilościowych ekspresji cis (cis-eQTLs) w bazie eQTLGen, 250 zachowało co najmniej trzy niezależne instrumenty po grupowaniu nierównowagi sprzężeń (linkage disequilibrium clumping), a 226 dostarczyło wiarygodnych szacunków randomizacji mendlowskiej metodą ważenia odwrotnością wariancji (IVW), wykorzystując badanie asocjacyjne całego genomu (GWAS) dla GBM obejmujące 6 183 przypadki i 18 169 osób z grupy kontrolnej. Trzydzieści cztery geny spełniły eksploracyjne kryteria odkrycia P < 0,05 oraz stopień fałszywych odkryć Benjamini–Hochberga (BH-FDR) < 0,20, wykazując zgodność kierunkową w szacunkach bajesowskiej ważonej randomizacji mendlowskiej (BWMR). Randomizacja mendlowska na etapie replikacji z wykorzystaniem cis-eQTLs krwi pełnej z bazy GTEx V10 potwierdziła cztery geny: ATG7, RPTOR, MAP1LC3A oraz CHMP6. Ocena w trzech niezależnych kohortach transkryptomicznych (guz–kontrola) wykazała, że MAP1LC3A był konsekwentnie niedoregulowany w tkance nowotworowej i wykazał istotny połączony szacunek efektów losowych (log₂ fold change, −1,273; 95% przedział ufności, −1,625 do −0,920; stopień fałszywych odkryć = 0,016), podczas gdy pozostałe trzy geny nie wykazały porównywalnego statystycznego wsparcia międzykohortowego. Następnie przeprowadzono analizę wirtualnego nokautu na poziomie pojedynczych komórek w zbalansowanym podzbiorze 2 400 komórek złośliwych wybranych z 4 916 kwalifikujących się komórek z 20 guzków GBM u dorosłych o dzikim typie IDH. W pięciu niezależnie zainicjowanych uruchomieniach zidentyfikowano odpowiednio 3, 15, 4 i 7 silnych genów downstream dla ATG7, RPTOR, MAP1LC3A i CHMP6. Powstałe zbiory konsensusowe obejmowały 17 unikalnych genów, z których RND3 był wspólny dla wszystkich czterech celów. Analiza Gene Ontology wskazała na wzbogacenie procesów adhezji komórkowej i procesów powierzchni komórkowej, natomiast żadne ścieżki KEGG ani Reactome nie pozostały istotne po korekcie na wielokrotne testowanie. Łącznie wyniki te priorytetyzują MAP1LC3A do przyszłych badań eksperymentalnych, jednocześnie odróżniając asocjację genetyczną, zgodność ekspresji w guzach i perturbacje obliczeniowe od definitywnych dowodów przyczynowości lub mechanizmu.

Wprowadzenie

Glioblastoma (GBM) pozostaje paradygmatycznym przykładem nowotworu opornego na leczenie. Mimo coraz bardziej precyzyjnej klasyfikacji molekularnej i opieki multidyscyplinarnej, trwałe poprawy w wynikach leczenia pacjentów były ograniczone¹. W przypadku pacjentów w dobrym stanie ogólnym aktualne postępowanie obejmuje maksymalną bezpieczną resekcję, po której następuje radioterapia z jednoczesnym i uzupełniającym podawaniem temozolomidu – schemat ten został ustanowiony w przełomowym badaniu randomizowanym i utrzymany we współczesnych wytycznych klinicznych¹^,². Niemniej jednak, rozproszona infiltracja oraz rozległa heterogenność komórkowa i molekularna ograniczają trwałą kontrolę nad chorobą, a u większości pacjentów ostatecznie dochodzi do progresji lub nawrotu, na które nie istnieje uniwersalnie skuteczna standardowa metoda leczenia¹^,³. Ta uporczywa luka między postępami w charakterystyce choroby a wynikami klinicznymi podkreśla potrzebę zidentyfikowania biologicznie istotnych zależności molekularnych, które mogą stać się podstawą nowych strategii terapeutycznych w leczeniu GBM.

Ferroptoza jest zależną od żelaza formą regulowanej śmierci komórkowej, charakteryzującą się niekontrolowaną peroksydacją fosfolipidów oraz niewydolnością komórkowych systemów obrony antyoksydacyjnej, co odróżnia ją mechanistycznie od apoptozy i innych kanonicznych programów śmierci komórkowej⁴^,⁵. Proces ten ma szczególne znaczenie w przypadku GBM, gdzie zmiany genetyczne i plastyczność metaboliczna przekształcają homeostazę żelaza, równowagę redoks oraz metabolizm lipidów. Zintegrowane profilowanie genomiczne i lipidomiczne wykazało, że delecja CDKN2A powoduje redystrybucję utlenialnych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, tworząc tym samym zależną od genotypu podatność na ferroptozę w modelach GBM⁶. Podobnie, analizy porównawcze guzów pierwotnych i nawrotowych pozwoliły zidentyfikować związane z nawrotem zmiany w GPX4, ACSL4 oraz innych regulatorach ferroptozy⁷. Wykazano również, że eksperymentalna modulacja szlaków obrony przed ferroptozą wpływa na odpowiedź komórek GBM i modeli ksenoprzeszczepów na temozolomid⁸. Zbiorczo wyniki te wskazują na ferroptozę jako biologicznie uzasadnioną słabość terapeutyczną w GBM. Odzwierciedlają one jednak przede wszystkim powiązania ze stanem guza lub kontekstowe obserwacje eksperymentalne i nie rozstrzygają, czy konstytutywna zmienność w ekspresji genów związanych z ferroptozą przyczynia się do dziedzicznej podatności na GBM.

Większość badań nad ferroptozą w glejakach u ludzi opierała się na analizach różnicowej ekspresji, modelowaniu przeżywalności oraz subtypowniu molekularnym z wykorzystaniem zbiorów danych TCGA, CGGA i GEO⁹^,¹⁰. Chociaż badania te wykazały istotność prognostyczną programów transkrypcyjnych związanych z ferroptozą, ich obserwacyjny charakter nie pozwala określić, czy zmieniona ekspresja genów przyczynia się do podatności na GBM, czy jest raczej konsekwencją rozwoju nowotworu. Randomizacja mendlowska w skali całego transkryptomu pozwoliła następnie na zidentyfikowanie regulowanych genetycznie, zależnych od tkanki genów związanych z ryzykiem glejaka, natomiast nowsze badania oparte na loci cech ilościowych ekspresji (eQTL) i białek (pQTL) zaczęły priorytetyzować potencjalne cele terapeutyczne dla GBM¹¹^,¹². Niemniej jednak wcześniejsze analizy zazwyczaj przyjmowały podejście obejmujące cały transkryptom lub zorientowane na cele leków, zamiast oceniać predefiniowany, kompleksowy zestaw genów związanych z ferroptozą. Co więcej, niewiele badań zintegrowało duże badanie asocjacyjne całego genomu (GWAS) dla GBM z randomizacją mendlowską na etapie replikacji przy użyciu niezależnego zasobu eQTL, a następnie przeprowadziło ocenę w wielu kohortach transkryptomicznych nowotwór-kontrola. Rozróżnienie to jest istotne, ponieważ genetyczna regulacja ekspresji genów różni się znacznie w zależności od tkanki, a asocjacje eQTL pochodzące z krwi nie muszą odzwierciedlać efektów regulacyjnych w obrębie guzów mózgu¹¹^,¹³. W związku z tym konieczne jest opracowanie zintegrowanego modelu łączącego asocjację genetyczną, randomizację mendlowską na etapie replikacji, transkryptomikę nowotworów w wielu kohortach oraz funkcjonalną predykcję na poziomie pojedynczych komórek pochodzących od pacjentów, aby zidentyfikować geny związane z ferroptozą, których udział w GBM jest potwierdzony przez zbieżne linie dowodów.

W niniejszym badaniu zbadano, czy genetycznie regulowana ekspresja genów związanych z ferroptozą wiąże się z podatnością na GBM. Randomizacja mendlowska na etapie odkrywania i etapie replikacji została połączona z analizami ekspresji genów w trzech niezależnych kohortach transkrypcyjnych (guz–kontrola). Geny potwierdzone w obu etapach randomizacji mendlowskiej zostały następnie ocenione w danych transkrypcyjnych pojedynczych komórek pochodzących od pacjentów z wykorzystaniem wirtualnej perturbacji w celu charakterystyki przewidywanych odpowiedzi transkrypcyjnych w komórkach złośliwych. Zamiast priorytetyzować geny wyłącznie na podstawie sygnatur ekspresji w guzach, ten wieloetapowy schemat wykorzystał najpierw dziedziczoną zmienność genetyczną, a następnie ocenił wzorce ekspresji istotne dla choroby wraz z profilami perturbacji obliczeniowych w rozdzielczości pojedynczych komórek. Wynikowe dowody zbieżne posłużyły do wyłonienia priorytetowych genów związanych z ferroptozą do przyszłych badań eksperymentalnych w GBM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejsze badanie zostało zwolnione z oceny etycznej przez Komisję Etyki Medycznej Pierwszego Szpitala Ludowego w Zhaoqing (numer referencyjny B2026-08-03). W badaniu wykorzystano retrospektywnie zgromadzone, zanonimizowane dane genetyczne i transkrypcyjne na poziomie zbiorczym, w tym dane z kontrolowanym dostępem zatwierdzone przez Komitet Dostępu do Danych z EGAD00010001657 oraz zestawy danych uzyskane z GEO, eQTLGen i GTEx zgodnie z ich odpowiednimi warunkami dostępu i użytkowania. Nie rekrutowano nowych uczestników, nie pobierano biospecymentów ani nie uzyskano dostępu do możliwych do zidentyfikowania danych na poziomie uczestnika. Zgoda etyczna i świadoma zgoda na badania pierwotne zostały uzyskane przez odpowiednich twórców danych, a dane z kontrolowanym dostępem były wykorzystywane zgodnie z obowiązującą Umową o Dostępie do Danych.

Projekt badania

W niniejszym badaniu zastosowano wieloetapowy schemat w celu priorytetyzacji genów związanych z ferroptozą, które korelują z podatnością na glejak wielopostaciowy (GBM), oraz oceny ich efektów transkrypcyjnych istotnych dla przebiegu choroby (Rycina 1). W pierwszej kolejności geny związane z ferroptozą, wyselekcjonowane z bazy FerrDb V2, oceniono za pomocą randomizacji mendlowskiej (MR) dla dwóch próbek, wykorzystując dane o cis-ekspresyjnych locus cech ilościowych (cis-eQTL) oraz szerokie badanie asocjacyjne całego genomu (GWAS) dla GBM. Podstawową metodą przesiewową była MR z ważeniem odwrotnością wariancji (IVW), bayesowska randomizacja mendlowska z ważeniem (BWMR) zapewniła uzupełniającą ocenę odporności wyników, a niezależny zbiór danych eQTL posłużył do MR na etapie replikacji. Po drugie, geny potwierdzone w analizach genetycznych oceniono w trzech niezależnych kohortach transkrypomicznych (guz–kontrola), a następnie przeprowadzono metaanalizę międzykohortową. Po trzecie, dane transkrypomiczne z pojedynczych komórek pochodzących od pacjentów wykorzystano do przeprowadzenia wirtualnej perturbacji genów w komórkach złośliwych oraz identyfikacji powtarzalnych odpowiedzi transkrypcyjnych downstream. Odpowiedzi te scharakteryzowano następnie poprzez analizy wzbogacenia funkcjonalnego oraz analizy sieci wspólnych. Ogólnie rzecz biorąc, analizy genetyczne zaprojektowano w celu identyfikacji genów związanych z podatnością na GBM, natomiast analizy transkrypomiczne i analizy pojedynczych komórek służyły ocenie zgodności biologicznej i generowaniu hipotez do późniejszej walidacji eksperymentalnej.

Źródła danych

Geny związane z ferroptozą pozyskano z bazy FerrDb V2, co po harmonizacji symboli genów i usunięciu duplikatów dało 483 unikalne ludzkie geny kodujące białka¹⁴. Statystyki podsumowujące cis-ilościowych cech ekspresyjnych (cis-eQTL) krwi pełnej z konsorcjum eQTLGen wykorzystano jako zbiór danych ekspozycji w etapie odkrywania w ramach randomizacji mendlowskiej (MR), natomiast dane cis-eQTL krwi pełnej z wersji GTEx V10 posłużyły jako niezależny zbiór danych ekspozycji w etapie replikacji MR¹¹^,¹⁵. Powiązania z wynikiem GBM uzyskano ze statystyk podsumowujących badań asocjacyjnych całego genomu (GWAS) z kontrolowanym dostępem, dostępnych w European Genome-phenome Archive, obejmujących 6183 przypadki i 18 169 kontroli pochodzenia europejskiego¹⁶. Ekspresję na poziomie tkankowym genów o priorytecie genetycznym oceniono w trzech niezależnych kohortach Gene Expression Omnibus (GEO): GSE196533, obejmującej 61 próbek glejaka stopnia 4 opisanych w metadanych jako GBM oraz dziewięć nieżełudkowych próbek mózgu; GSE4290, obejmującej próbki GBM oraz nieguzowe próbki mózgu pochodzące od pacjentów z epilepsją; oraz GSE116520, zawierającej sparowane próbki rdzenia guza i obszarów okołoguzowych wraz z nieżełudkowymi kontrolami¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Dane Smart-seq2 pochodzące od pacjentów z GSE131928 wykorzystano do analizy wirtualnej perturbacji komórek złośliwych²⁰. Charakterystyka zbiorów danych oraz ich odpowiednie role analityczne zostały podsumowane w Tabeli 1. Wszystkie analizy przeprowadzono z wykorzystaniem wcześniej zgromadzonych, zanonimizowanych zbiorów danych, dla których w oryginalnych badaniach uzyskano zgodę komisji etycznej oraz świadomą zgodę uczestników.

Wybór instrumentów genetycznych i harmonizacja danych

Instrumenty kandydujące ograniczono do cis-ekspresyjnych loci cech ilościowych (cis-eQTLs) powiązanych z ekspresją genów na poziomie istotności całego genomu (P < 5 × 10⁻⁸). Warianty pogrupowano (clumping) z wykorzystaniem panelu referencyjnego dla populacji europejskiej z projektu 1000 Genomes Project, stosując próg nierównowagi sprzężeń (LD) r² < 0.001 w oknie 10 000 kb. Geny, które po grupowaniu posiadały mniej niż trzy niezależne instrumenty, zostały wykluczone z głównej analizy randomizacji mendlowskiej (MR). Ze względu na eksploracyjny cel przesiewowy, z góry określono minimum trzech instrumentów, aby zachować geny ze słabym, ale silnym wsparciem cis-eQTL, umożliwiając jednocześnie estymację IVW przy użyciu wielu instrumentów. Próg ten został uzupełniony rygorystycznym grupowaniem LD oraz filtrowaniem statystyk F; estymacje oparte na zaledwie trzech lub czterech instrumentach interpretowano z ostrożnością, a analizy wrażliwości przeprowadzano tylko wtedy, gdy było to metodologicznie zasadne. Siłę instrumentu oceniano dla każdego wariantu za pomocą statystyki F (F = β²/SE²), gdzie β i SE reprezentują odpowiednio szacunek efektu cis-eQTL i jego błąd standardowy. Warianty z F < 10 zostały wykluczone, aby zminimalizować błąd wynikający ze słabych instrumentów²¹^,²². Zbiory danych ekspozycji i wyniku zharmonizowano poprzez wyrównanie alleli efektowych i kierunków efektu. Wykluczono warianty powielone, warianty niedostępne w zbiorze danych GBM GWAS oraz warianty z niekompatybilnym kodowaniem alleli. Ponieważ częstotliwości alleli efektowych nie były dostępne dla GBM GWAS, warianty palindromiczne o niejednoznacznej orientacji nici zostały usunięte zamiast być wnioskowane. Z tego samego powodu nie przeprowadzono formalnego testu kierunkowości Steigera.

Analizy randomizacji mendlowskiej

Związek między genetycznie przewidywaną ekspresją genów a podatnością na GBM oceniono za pomocą dwupróbkowej randomizacji mendlowskiej (MR). W etapie odkrywania uwzględniono wyłącznie geny posiadające co najmniej trzy niezależne instrumenty cis-eQTL (cis-expression quantitative trait locus), a głównym podejściem analitycznym była metoda ważonej odwrotnością wariancji (IVW). Szacunki efektów przedstawiono jako ilorazy szans (OR) z 95% przedziałami ufności (CI) na jednostkę wzrostu genetycznie przewidywanej ekspresji genów. Aby uwzględnić wielokrotne testowanie w obrębie ocenianych genów, wartości P dla metody IVW skorygowano przy użyciu procedury Benjamini-Hochberga²³. Jako kandydaci eksploracyjni zachowano geny z wartością P < 0,05 oraz wskaźnikiem fałszywych odkryć Benjamini-Hochberga (BH-FDR) < 0,20. Wybrano ten stosunkowo liberalny próg FDR, aby uniknąć przedwczesnego wykluczenia potencjalnie istotnych genów na etapie odkrywania; w związku z tym status kandydata interpretowano w powiązaniu z późniejszymi analizami, a nie jako dowód potwierdzający. Następnie do kandydatów z etapu odkrywania zastosowano bayesowską ważoną randomizację mendlowską (BWMR), wykorzystując te same zharmonizowane instrumenty²⁴. Zgodność między wynikami IVW i BWMR oceniano na podstawie istotności statystycznej oraz kierunku efektu. W przypadkach, gdy pozwalała na to liczba dostępnych instrumentów, przeprowadzono test Q Cochrana, test przecięcia MR-Egger, analizę MR-PRESSO oraz analizy leave-one-out w celu oceny heterogeniczności, plejotropii horyzontalnej, wpływowych wariantów odstających oraz wpływu poszczególnych polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP)²².

MR na etapie replikacji przeprowadzono z wykorzystaniem danych cis-eQTL z krwi pełnej z GTEx V10. W przypadku dostępności tylko jednego instrumentu zastosowano metodę stosunku Walda, natomiast w przypadku genów z dwoma lub więcej instrumentami wykorzystano metodę IVW. Replikację zdefiniowano jako P < 0,05, BH-FDR < 0,20 oraz kierunek efektu zgodny z odpowiadającą mu szacunkową wartością z etapu odkrycia. Ponieważ kilka szacunków replikacyjnych GTEx oparto na zaledwie jednym lub dwóch instrumentach, zinterpretowano je jako dowody wspierające replikację, a nie jako niezależne dowody przyczynowości.

Międzykohortowa ocena transkryptomiczna

Cztery geny wyłonione w analizach randomizacji mendlowskiej (MR) w fazie odkrywania i replikacji zostały ocenione w trzech niezależnych kohortach transkryptomicznych. W przypadku GSE196533 surowe dane liczbowe z sekwencjonowania RNA analizowano przy użyciu DESeq2²⁵. Wykluczono geny z liczbą zliczeń poniżej 10 we wszystkich próbach z wyjątkiem dwóch, natomiast cztery geny docelowe zachowano niezależnie od filtrowania ekspresji. Ekspresję różnicową oceniano pomiędzy 61 próbkami glejaka stopnia 4, oznaczonymi jako GBM w złożonych metadanych, a dziewięcioma niepotworowymi próbkami mózgu.

W przypadku zestawu GSE4290 wykluczono cztery próbki bez jednoznacznej diagnozy histopatologicznej, co pozostawiło 77 próbek GBM oraz 23 nieguzowe próbki mózgu. Przetworzone intensywności mikromacierzy poddano transformacji log₂, normalizacji kwantylowej oraz analizie przy użyciu odpornych liniowych modeli empirycznego Bayesa zaimplementowanych w limma²⁶. W sytuacjach, gdy wiele sond mapowało do tego samego genu, wybierano sondę o najwyższej średniej ekspresji we wszystkich uwzględnionych próbkach, niezależnie od istotności ekspresji różnicowej.

Zbiór GSE116520 obejmował sparowane próbki z rdzenia guza oraz obszarów peritumoranych pochodzące od 17 pacjentów, a także osiem kontroli nienowotworowych. Zdeponowane dane ekspresji, poddane transformacji logarytmicznej i normalizacji kwantylowej, zostały przeanalizowane przy użyciu pakietu limma. Korelacje wewnątrzpacjenckie między próbkami z rdzenia guza a próbkami peritumoranymi uwzględniono poprzez blokowanie na poziomie pacjenta oraz funkcję duplicateCorrelation. Porównanie rdzenia guza z grupą kontrolną stanowiło uprzednio określone zestawienie dla metaanalizy międzykohortowej, natomiast porównania peritumorane oraz trend uporządkowany kontrola–peritumoralny–rdzeń guza oceniano oddzielnie.

Specyficzne dla badania zmiany log₂ fold change oraz błędy standardowe zestawiono, wykorzystując model efektów losowych z ograniczoną maksymalną wiarygodnością i wnioskowaniem Hartunga–Knappa, zaimplementowany w pakiecie metafor. Heterogeniczność międzybadawczą oceniono za pomocą statystyki Q Cochrana oraz I². Połączone wartości P dla czterech genów docelowych skorygowano za pomocą procedury Benjamini–Hochberg. Silne wsparcie transkrypcyjne zdefiniowano jako stopień fałszywych odkryć (FDR) w metaanalizie < 0,05, istotność FDR na poziomie kohorty w co najmniej dwóch zbiorach danych oraz zgodny kierunek efektu we wszystkich trzech kohortach.

Analiza wirtualnego nokautu na poziomie pojedynczych komórek

Dane Smart-seq2 pochodzące od pacjentów z zestawu GSE131928 zostały wykorzystane do oceny czterech genów zreplikowanych w MR w komórkach złośliwych. Dorosłe komórki złośliwe zidentyfikowano zgodnie z adnotacjami zawartymi w oryginalnym badaniu, a z każdego kwalifikującego się pacjenta pobrano losowo taką samą liczbę komórek, aby zminimalizować dysproporcje w reprezentacji pacjentów. Wirtualny knockout przeprowadzono przy użyciu scTenifoldKnk i powtórzono w pięciu niezależnych seriach. Geny z wartością P < 0,05 po korekcie Benjamini–Hochberg w pojedynczej serii uznano za istotne. Geny downstream, które pojawiły się w co najmniej trzech z pięciu serii, zdefiniowano jako główny zestaw konsensusowy, natomiast do analizy czułości zastosowano bardziej rygorystyczne kryterium czterech z pięciu serii. Wyniki te zinterpretowano jako obliczeniowe przewidywania zaburzeń transkrypcyjnych, a nie jako dowód bezpośredniej regulacji molekularnej.

Analiza wzbogacenia funkcjonalnego i wspólnych sieci

Analizę wzbogacenia funkcjonalnego przeprowadzono z wykorzystaniem genów downstream specyficznych dla celu, które zostały powtarzalnie zidentyfikowane w co najmniej trzech z pięciu uruchomień wirtualnego nokautu. Wzbogacenie ścieżek Gene Ontology (GO), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) oraz Reactome oceniono za pomocą jednostronnych testów hipergeometrycznych, przyjmując 1 004 geny ujęte w wnioskowaniu sieci jako tło zestawu genów. Wartości P korygowano oddzielnie dla każdej bazy adnotacji zgodnie z procedurą Benjamini–Hochberga; za statystycznie istotne uznano skorygowaną wartość P < 0,05.

W celu przedstawienia relacji między czterema celami knockoutu a ich konsensusowymi genami downstream skonstruowano sieć bipartycyjną. Geny powiązane z wieloma celami zidentyfikowano na podstawie ich wspólnego stopnia, a stopień pokrycia zestawów genów specyficznych dla danych celów określono za pomocą liczby części wspólnych oraz indeksów Jaccarda. Krawędzie sieci reprezentują powiązania między powtarzalnymi perturbacjami obliczeniowymi i nie powinny być interpretowane jako dowód bezpośrednich oddziaływań molekularnych.

Analiza statystyczna i powtarzalność

O ile nie określono inaczej, testy statystyczne były dwustronne, a porównania wielokrotne kontrolowano przy użyciu procedury Benjamini–Hochberg. Kryteria istotności specyficzne dla poszczególnych analiz opisano w odpowiednich podrozdziałach. Wszystkie analizy przeprowadzono przy użyciu języków R lub Python. W procedurach randomizowanych zastosowano wcześniej określone ziarna (seeds), a kod analityczny, wersje oprogramowania oraz szczegółowe ustawienia parametrów zarchiwizowano w celu zapewnienia powtarzalności. Wszystkie zbiory danych zostały zebrane wcześniej i zanonimizowane; zgody etyczne oraz świadome zgody uczestników uzyskano w ramach oryginalnych badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wybór genów związanych z ferroptozą oraz instrumentów genetycznych

Z bazy danych FerrDb V2 pozyskano łącznie 483 genów związanych z ferroptozą (Rysunek 1). Spośród nich 315 genów dopasowano do zbioru danych eQTLGen, a każdy z nich posiadał co najmniej jeden kandydujący cis-ilościowy cecha locus ekspresji (cis-eQTL). Po przeprowadzeniu klasteryzacji w oparciu o nierównowagę sprzężeń (linkage disequilibrium clumping), 250 genów zachowało co najmniej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym badaniu zintegrowano analizy asocjacji genetycznych, randomizację mendlowską (MR) na etapie replikacji, transkryptomikę guzów oraz modelowanie w pojedynczych komórkach pochodzących od pacjentów, aby wytypować geny związane z ferroptozą, które są powiązane z podatnością na glejak wielopostaciowy (GBM). Przesiew 483 wyselekcjonowanych genów w oparciu o badanie asocjacji całego genomu (GWAS) dla GBM, obejmujące 6183 przypadki i 18 169 kontroli, pozwolił na zidentyfikowanie 34 kandydatów na etapie odkrywczym, z ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie istnieją żadne konflikty interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują zespołowi Cancer Genomics z The Institute of Cancer Research za udostępnienie statystyk zbiorczych GWAS dla glejaków poprzez European Genome-phenome Archive (zestaw danych EGAD00010001657). Pierwotne pozyskanie tych danych było wspierane przez Cancer Research UK, w tym Bobby Moore Fund, Wellcome Trust oraz DJ Fielding Medical Research Trust (C1298/A8362).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BWMR	pakiet R	BWMR	Bayesowska ważona randomizacja mendlowska
DESeq2	Bioconductor	Version 1.46.0	Analiza różnicowej ekspresji w sekwencjonowaniu RNA
FerrDb V2	FerrDb	Version 2	Źródło 483 wyselekcjonowanych genów związanych z ferroptozą
Glioblastoma bulk microarray	NCBI Gene Expression Omnibus	GSE4290	Kohorta oceny transkryptomicznej
Glioblastoma GWAS summary statistics	European Genome-phenome Archive	EGAD00010001657	Dane o wynikach z kontrolowanym dostępem; 6 183 przypadki i 18 169 kontrole
Glioblastoma Smart-seq2 single-cell RNA sequencing	NCBI Gene Expression Omnibus	GSE131928	Analiza wirtualnego nokautu komórek złośliwych
Grade 4 glioma bulk RNA sequencing	NCBI Gene Expression Omnibus	GSE196533	Kohorta oceny transkryptomicznej
GTEx whole-blood cis-eQTL summary statistics	Genotype-Tissue Expression project	GTEx V10	Dane ekspozycji w etapie replikacji
limma	Bioconductor	Version 3.62.2	Analiza różnicowej ekspresji w mikromierzach
metafor	pakiet R	Version 4.8-0	Metaanaliza z efektami losowymi
R	R Foundation for Statistical Computing	Version 4.4.2	Środowisko obliczeń statystycznych
scTenifoldKnk	pakiet R	Version 1.0.3	Analiza wirtualnego nokautu w pojedynczych komórkach
Tumour-core and peritumoural bulk microarray	NCBI Gene Expression Omnibus	GSE116520	Kohorta oceny transkryptomicznej
TwoSampleMR	pakiet R	Version 0.6.29	Randomizacja mendlowska dla dwóch próbek
Whole-blood cis-eQTL summary statistics	eQTLGen Consortium	eQTLGen	Dane ekspozycji w etapie odkrywania

Bibliografia

Weller M, et al. EANO guidelines on the diagnosis and treatment of diffuse gliomas of adulthood. Nat Rev Clin Oncol. 2021;18:170-186.
Stupp R, et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 2005;352:987-996.
McBain C, et al. Treatment options for progression or recurrence of glioblastoma: a network meta-analysis. Cochrane Database Syst Rev. 2021;5:CD013579.
Dixon SJ, et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 2012;149:1060-1072.
Stockwell BR, et al. Ferroptosis: A regulated cell death nexus linking metabolism, redox biology, and disease. Cell. 2017;171:273-285.
Minami JK, et al. CDKN2A deletion remodels lipid metabolism, priming glioblastoma for ferroptosis. Cancer Cell. 2023;41:1048-1060.e1049.
Kram H, et al. Glioblastoma relapses show increased markers of vulnerability to ferroptosis. Front Oncol. 2022;12:841418.
Miao Z, et al. A targetable PRR11-DHODH axis drives ferroptosis- and temozolomide-resistance in glioblastoma. Redox Biol. 2024;73:103220.
Liu HJ, et al. Ferroptosis-related gene signature predicts glioma cell death and glioma patient progression. Front Cell Dev Biol. 2020;8:538.
Dong J, et al. Ferroptosis-related gene contributes to immunity, stemness, and predicts prognosis in glioblastoma multiforme. Front Neurol. 2022;13:829926.
Robinson JW, et al. Transcriptome-wide Mendelian randomization study prioritizing novel tissue-dependent genes for glioma susceptibility. Sci Rep. 2021;11:2329.
Zhang H, Wang Z, Qiao X, Wu J, Cheng C. Investigating potential drug targets for the treatment of glioblastoma: a Mendelian randomization study. BMC Cancer. 2025;25:654.
GTEx Consortium. The GTEx Consortium atlas of genetic regulatory effects across human tissues. Science. 2020;369:1318-1330.
Zhou N, et al. FerrDb V2: update of the manually curated database of ferroptosis regulators and ferroptosis-disease associations. Nucleic Acids Res. 2023;51:D571-D582.
Võsa U, et al. Large-scale cis- and trans-eQTL analyses identify thousands of genetic loci and polygenic scores that regulate blood gene expression. Nat Genet. 2021;53:1300-1310.
Melin BS, et al. Genome-wide association study of glioma subtypes identifies specific differences in genetic susceptibility to glioblastoma and non-glioblastoma tumors. Nat Genet. 2017;49:789-794.
Zeng C, et al. Dissection of transcriptomic and epigenetic heterogeneity of grade 4 gliomas: implications for prognosis. Acta Neuropathol Commun. 2023;11:133.
Sun L, et al. Neuronal and glioma-derived stem cell factor induces angiogenesis within the brain. Cancer Cell. 2006;9:287-300.
Kruthika BS, et al. Transcriptome profiling reveals PDZ binding kinase as a novel biomarker in peritumoral brain zone of glioblastoma. J Neurooncol. 2019;141:315-325.
Neftel C, et al. An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma. Cell. 2019;178:835-849.e821.
Burgess S, Thompson SG. Avoiding bias from weak instruments in Mendelian randomization studies. Int J Epidemiol. 2011;40:755-764.
Papadimitriou N, et al. Physical activity and risks of breast and colorectal cancer: a Mendelian randomisation analysis. Nat Commun. 2020;11:597.
Song W, et al. Causal relationship between gut microbiota and lung squamous cell carcinoma: a bidirectional two-sample Mendelian randomization study. Postgrad Med J. 2025;101:526-534.
Zhao J, et al. Bayesian weighted Mendelian randomization for causal inference based on summary statistics. Bioinformatics. 2020;36:1501-1508.
Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 2014;15:550.
Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43:e47.
Yun D, et al. A novel prognostic signature based on glioma essential ferroptosis-related genes predicts clinical outcomes and indicates treatment in glioma. Front Oncol. 2022;12:897702.
Li R, et al. Identification of candidate genes associated with prognosis in glioblastoma. Front Mol Neurosci. 2022;15:913328.
Bai H, Inoue J, Kawano T, Inazawa J. A transcriptional variant of the LC3A gene is involved in autophagy and frequently inactivated in human cancers. Oncogene. 2012;31:4397-4408.
Hayashima K, Kimura I, Katoh H. Role of ferritinophagy in cystine deprivation-induced cell death in glioblastoma cells. Biochem Biophys Res Commun. 2021;539:56-63.
Wu Y, et al. ALDH1-mediated autophagy sensitizes glioblastoma cells to ferroptosis. Cells. 2022;11:4015.
Carriere A, et al. ERK1/2 phosphorylate Raptor to promote Ras-dependent activation of mTOR complex 1 (mTORC1). J Biol Chem. 2011;286:567-577.
Dai E, Meng L, Kang R, Wang X, Tang D. ESCRT-III-dependent membrane repair blocks ferroptosis. Biochem Biophys Res Commun. 2020;522:415-421.
Comincini S, et al. microRNA-17 regulates the expression of ATG7 and modulates the autophagy process, improving the sensitivity to temozolomide and low-dose ionizing radiation treatments in human glioblastoma cells. Cancer Biol Ther. 2013;14:574-586.
Wang L, et al. Autophagy mediates glucose starvation-induced glioblastoma cell quiescence and chemoresistance through coordinating cell metabolism, cell cycle, and survival. Cell Death Dis. 2018;9:213.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Geny ferroptozy podatność na glejak wielopostaciowy randomizacja mendlowska analiza pojedynczych komórek kohorty transkrypomiczne analiza eQTL ontologia genów downregulation w guzie asocjacja genetyczna