Dzielenie się doświadczeniem na temat długoterminowego przeżycia w modelu przeszczepu wątroby szczura bez tętnic

Podsumowanie

Celem przedstawionego protokołu jest podzielenie się zoptymalizowanym doświadczeniem chirurgicznym w celu opracowania modelu przeszczepu wątroby szczura bez arterii, ze szczególnym uwzględnieniem udoskonaleń technicznych zapewniających długoterminowe przeżycie zwierząt powyżej 100 dni.

Streszczenie

W eksperymentalnych przeszczepach wątroby model szczura jest złotym standardem do badania immunologii transplantacji i procesów metabolicznych; Jednak rekonstrukcja niezwykle drobnej tętnicy wątrobowej (~0,5 mm) stanowi poważne wyzwanie techniczne. Aby temu zapobiec, szeroko stosuje się uprośony model nietętniczej transplantacji wątroby szczura (NArLT). Niestety, poważne powikłania dróg żółciowych — takie jak wyciek żółci czy niedokrwienne zapalenie żółci żółciowej — wynikające z deprywacji tętnic często ograniczają długoterminowe przeżycie biorców. Ta przeszkoda znacząco ogranicza badania nad kluczowymi tematami, w tym długoterminową immunokompatybilnością z przeszczepem gospodarza oraz przewlekłym odrzuceniem choroby. Przedstawiamy tutaj zoptymalizowany protokół dla modelu NArLT, który zawiera kluczowe udoskonalenia techniczne, aby skutecznie pokonać te niedokrwienne urazy dróg żółciowych. Kluczowe ulepszenia obejmują znacznie skróconą fazę anhepatyczną, technikę rozwarstwienia dróg żółciowych "bez dotykania", dokładne płukanie dróg żółciowych oraz zoptymalizowaną metodę stentowania dróg żółciowych wewnętrznie. Po wdrożeniu tej ulepszonej procedury wskaźnik przeżywalności biorcy przekroczył 94% w trakcie 100-dniowej obserwacji. Ostatecznie ten zoptymalizowany protokół zapewnia wysoce powtarzalną i solidną platformę do badania mechanizmów leżących u podstaw długoterminowej tolerancji transplantacyjnej, wspierając tym samym rozwój nowych strategii terapeutycznych w medycynie transplantacyjnej.

Wprowadzenie

Model przeszczepu wątroby szczura jest najczęściej wykorzystywaną platformą eksperymentalną do podstawowych badań transplantacyjnych. Jednak szersze zastosowanie często utrudnia jego ostra krzywa uczenia się, która może znacząco utrudniać postęp dalszych badań eksperymentalnych ^1,2. Ponadto konwencjonalne modele przeszczepów wątroby szczurów często mają nieoptymalny sukces chirurgiczny i niskie wskaźniki długoterminowego przeżycia. Dzięki krytycznemu usprawnieniu procedur chirurgicznych, dopracowaniu szczegółów operacyjnych oraz wykonywaniu rekonstrukcji naczyń i dróg żółciowych pod bezpośrednią wizualizacją, krzywa uczenia się związana z tym złożonym modelem mikrochirurgicznym może zostać znacznie skrócona^{na 3,4}. Przeszczep wątroby pozostaje jedyną terapią leczniczą końcowego stadium chorób wątroby, co czyni ustanowienie modeli przeszczepów wątroby szczurów niezwykle istotnym dla badań naukowych ^5,6.

Model nietętniczego przeszczepu wątroby szczura (NArLT) oferuje istotne zalety w chirurgii eksperymentalnej: omija poważne wyzwanie mikronaczyniowej zespolenia tętnic, skraca cały czas operacji i skraca czas znieczulenia szczurów. Pomimo niedoboru ukrwienia tętnic, powstała odpowiedź przewodów żółciowych w tym modelu oferuje unikalną perspektywę do badania niedokrwiennych urazów dróg żółciowych. Jednak konwencjonalne modele NArLT wiążą się z wysokim wskaźnikiem powikłań drżuciowych sięgającym nawet 30%⁷, co poważnie ogranicza długoterminowe przeżycie. W tradycyjnym klasycznym modelu przeszczepu wątroby szczura długoterminowa przeżywalność biorcy wynosi poniżej 70%–85%⁸. Aby temu zaradzić, badanie wprowadza zoptymalizowany protokół wykorzystujący miękki stent żółciowy leczony heparyną. Poprzez zastosowanie techniki "bezdotykowej" sekcji dróg żółciowych, aby zmaksymalizować zachowanie sieci mikronaczyniowej obwodowej, wraz z dokładnym płukaniem dróg żółciowych za pomocą zimnej perfuzji, podejście to ma na celu fundamentalne złagodzenie powikłań przewodów żółciowych poprzez wsparcie fizyczne i ochronę niedokrwienną⁹, ostatecznie zapewniając solidną i stabilną platformę do długoterminowego monitorowania immunologicznego.

Dlatego maksymalizacja skuteczności procedur i przedłużenie przeżycia biorcy są głównymi celami każdej innowacji technicznej w przeszczepach wątroby szczura. Osiągnięcie tych celów jest kluczowym warunkiem zapewniającym terminowy i nieprzerwany postęp dalszych badań eksperymentalnych¹⁰.

Protokół

Wszystkie eksperymenty i operacje na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Eksperymentalnych Zwierząt Uniwersytetu Qingdao (nr 20260301SD5020260401065). Dokładaj wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie zwierząt.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

1. Zwierzęta doświadczalne
   1. Wykorzystaj dorosłych samców szczurów Sprague–Dawley (SD) w wieku 8–10 tygodni i ważących 220–250 g jako dawców. Upewnij się, że waga biorcy jest nieco większa niż dawcy, z różnicą w granicach 50 g.
   2. Szczury domowe w określonych warunkach wolnych od patogenów w kontrolowanej temperaturze 22°C ± 2°C i wilgotności względnej 50% ± 10%.
   3. Utrzymuj 12-godzinny cykl światła/ciemności z gęstością 2–3 szczurów na klatkę.
   4. Zapewnij standardową dietę dla laboratoryjnych gryzoni. Pozwól szczurom przyzwyczaić się do środowiska laboratoryjnego przez co najmniej tydzień przed zabiegiem chirurgicznym.
   5. Zwierzęta szybkie przez 12 godzin przed operacją. Pozwalać na ad libitum dostęp do wody.
      UWAGA: Post przed operacją pomaga zminimalizować ryzyko aspiracji podczas znieczulenia i zapobiega rozszerzaniu żołądka, które może zaburzyć funkcjonowanie oddechowe i utrudnić ekspozycję chirurgiczną.
2. Narzędzia chirurgiczne i materiały
   1. Używaj narzędzi niezbędnych do operacji transplantacji, jak pokazano na Rysunku 1. Szczegóły materiałów użytych w zabiegu wymienić szczegóły dotyczące materiałów używanych podczas zabiegu.
   2. Wybierając osłony cewników zewnątrzoponowych 5F i 6F, dopasowując zewnętrzną średnicę cewników do fizjologicznych średnic wewnętrznych naczyń docelowych u samców szczurów SD ważących 220–250 g.
   3. Użyj osłonki 5F (około 1,67 mm) do żyły wrotnej (PV). Użyj osłonki 6F (około 2,00 mm) dla żyły podwotwarotwarkowej dolnej (IHIVC).
      UWAGA: Wybierz rozmiar cewnika na podstawie kombinacji standardów anatomicznych oraz śródoperacyjnej oceny wzrokowej pod mikroskopem chirurgicznym. Wykonaj porównanie w czasie rzeczywistym między zewnętrzną średnicą cewnika a wewnętrznym światłem naczynia docelowego. Odpowiednie dopasowanie osiąga się, gdy cewnik zajmuje około 70%–80% lumenu naczynia, co pozwala na płynne wprowadzenie bez nadmiernego rozciągania ściany naczynia lub nadmiernego luźnego rozluźnienia. Dla szczurów SD w określonym zakresie wagowym do początkowego wyboru rozmiaru można zastosować zdefiniowane średnice naczyń anatomicznych, które powinny być dostosowywane wewnątrzoperacyjnie w zależności od indywidualnych zmian. Operatorzy powinni ustalić to dopasowanie między naczyniami a cewnikami poprzez wcześniejsze szkolenie mikrochirurgiczne.
   4. Dla szczurów SD w wieku 8–10 tygodni wybierz pochewki na cewniki zewnątrzoponowe 5F i 6F jako mankiety odpowiednio dla PV i IHIVC (Rysunek 2A).
   5. Przygotuj mankiety o całkowitej funkcjonalnej długości (korpus rurkowy) 2,0–2,5 mm. Utrzymuj długość wydłużenia 3,0–4,0 mm do obsługi kleszczy.
   6. Zacisnąć ścianę mankietu szczękami kleszczy komarów, aby stworzyć rowek obwodowy, znajdujący się około 0,5–1,0 mm od bliższej krawędzi mankietu (szczegóły patrz Rysunek 2A ). Utrzymuj głębokość rowka około 0,1–0,2 mm, aby ułatwić bezpieczne wiązanie węzłów i późniejsze umocowanie.
   7. Upewnij się, że rowek zapobiega zsuwaniu się ligatury zabezpieczającej 7-0 z sztywnej powierzchni cewnika.
   8. Przycinaj cewnik dożylny 22G, aby stworzyć stent przewodu żółciowego z pochylonymi lub fazowanymi końcami. Zadbaj o długość 5–7 mm.
   9. Wolę długość stentu 7 mm. Dostosuj długość na podstawie zmienności anatomicznej, używając poziomego poziomu prawej żyły żołądkowej jako punktu orientacyjnego. Oszacuj odległość od tego punktu orientacyjnego do hilum wątrobowego, aby wskazać wybór długości stentu.
   10. Skróć stent (do około 5–6 mm), jeśli szacowana odległość jest ograniczona lub jeśli podczas wstawiania napotyka się opór. Upewnij się, że około 2–3 mm stentu można wprowadzić do przewodu żółciowego bez zginania, zaginania czy wystańca.
   11. Mocz stent w soli fizjologicznej z heparyną (100 IU/mL) w temperaturze pokojowej (23°C ± 2°C). Utrzymuj stent zanurzony przez co najmniej 30 minut przed użyciem, aby zapobiec krzepnięciu żółci wewnątrzświatłowej po włożeniu do lumenu odpowiedzialności żółciowej dawcy (Rysunek 2A).
       UWAGA: Przygotuj mankiet przed operacją i użyj kleszczy przeciwkomarowych, aby zrobić rowki w ścianie mankietu, ułatwiając wiązanie i fiksację po udanej kanilowaniu. Upewnij się, że końce przyciętego stentu żółciowego nie są zbyt ostre, aby zapobiec przebiciu przewodów żółciowych. Pod mikroskopem chirurgicznym (powiększenie 10×–16× potwierdzić, że krawędź cięcia jest czysta i wolna od postrzępionych plastikowych zadziorów; Jeśli końcówka wygląda jak igła, lekko ją tęp mikronożyczkami. Podczas manipulacji używaj tylko drobnych, bezząbkowych mikrokleszczy do obsługi stentu. Unikaj stosowania nadmiernej siły zewnętrznej, co wskazuje na spłaszczanie, owalizację lub załamanie lumen stentu; Odrzuć i zamień wszelkie zdeformowane stenty, ponieważ zwężenie luminalnego zwiększa ryzyko powikłań w drógach żółciowych po operacji.

Rysunek 1. Narzędzia chirurgiczne używane podczas przeszczepu. (A) Stalowa misa nerkowa. (B) Uchwyty na mikroigły. (C) Mikronożyczki. (D) Mikro-kleszcze (proste i zakrzywione). (E) Mikronaczyniowe klipsy i małe klamry typu komarów typu bulldog. (F) Standardowy uchwyt na igły. (G) Proste kleszcze hemostatyczne (kleszcze przeciwkomarowe). (H) Zacisk naczyniowy. (I) Standardowe nożyczki chirurgiczne. (J) Gumka recepturka (wykonana z mankietu sterylnej rękawicy chirurgicznej). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2. Indywidualnie wykonane mankiety chirurgiczne, stent w drógach żółciowych i planowane nacięcia brzucha. (A) Przygotowanie mankietów naczyniowych i stentu przewodu żółciowego wraz z milimetrową linijką. Od lewej do prawej: oczko cewnika zewnątrzoponowego 6F użyte do stożka żyły dolnej podwodno-półkowej (IHIVC), oczko 5F do mankietu żyły wrotnej (PV) oraz stent żółciowy o średnicy 5–7 mm przycięty z cewnika dożylnego 22G. (B) Nacięcie krzyżowe na brzuchu dawcy szczura, aby zmaksymalizować ekspozycję chirurgiczne. (C) Standardowe nacięcie laparotomii środkowej na odwłoku szczura biorca. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

2. Operacja dawcy

1. Początkowe kroki
   1. Znieczulaj szczura-dawcę za pomocą izofluranu 5% przy przepływie powietrza 1 L/min w komorze indukcyjnej. Oceń głębokość znieczulenia, potwierdzając brak spontanicznego ruchu kończyn i odruchu wycofania.
      UWAGA: Głębokość znieczulenia ocenia się na podstawie braku spontanicznych ruchów kończyn, braku odruchu odstawienia oraz częstości oddechu. Aby zapewnić płynny i bezpieczny przebieg operacji, parametry te są ściśle oceniane co 20 minut przez cały zabieg.
   2. Podawaj 1% pentobarbitalu (40–45 mg/kg) przez zastrzyk wewnątrzotrzewnowy w prawą dolną część brzucha, około 1–2 cm bocznie od linii środkowej (linea alba) i 1–2 cm czaszki od prawego więzadła pachwinowego. Potwierdź odpowiednie znieczulenie, szczypiąc tylną łapę i upewniając się, że nie ma odruchu wycofania.
   3. Ułóż szczura-dawcę w pozycji leżącej na termoforze o temperaturze 37°C, aby utrzymać temperaturę ciała podczas operacji.
   4. Ogol obszar chirurgiczny brzucha. Dezynfekuj okolicę powidonem jodem trzy razy.
2. Procedury przed perfuzją wątroby
   1. Wykonaj nacięcie krzyżowe, które rozciąga się aż do wyrostka ksifoidalnego, w dół do współstyki łonowej i bocznie do linii środkowej pachu, aby zmaksymalizować ekspozycję pola chirurgicznego (Rysunek 2B).
      UWAGA: Wykonaj laparotomię w dwóch warstwach. Najpierw naciń skórę i tkankę podskórną. Następnie obłóż linea alba kleszczami i wykonaj małe początkowe nacięcie, aby umożliwić przedostanie się powietrza, powodując opadanie wnętrzności. Przedłuż nacięcie nożyczkami, utrzymując dolną ostrzę równolegle do ściany brzucha, aby zapobiec uszkodzeniu narządów.
   2. Owiń jelita gazą nasączoną solą fizjologiczną. Umieść je na sterylnym polu operacyjnym po lewej stronie odbrzucha, aby odsłonić obszar operacyjny.
      UWAGA: Niezbędne jest utrzymanie stałej wilgotności wypatroszonych jelit przez cały zabieg, aby zapobiec wysychaniu niedokrwiennemu i hipotermii. Okresowo nawilżaj gazę pokrywającą, nakładając krople ciepłej (37°C) soli fizjologicznej co około 10–15 minut lub natychmiast za każdym razem, gdy gaza zaczyna schnąć pod oświetleniem chirurgicznym.
   3. Podziel więzadło strączkowate. Zacisnąć i cofnąć wyrostek ksofoidowy czaszkowo, aby odsłonić nadwłosową żyłę dożynową (SHIVC) oraz lewą dolną żyłę przedrową.
   4. Podziel więzadło trójkątne na lewej stronie. Podwiązać lewą żyłę przeponkową blisko SHIVC za pomocą 7-0 lub 8-0 szew (Rysunek 3A).
      UWAGA: Podczas podwiązywania lewej dolnej żyły przedrowej ustaw podwiązanie blisko SHIVC. Pamiętaj, że igła szwów może łatwo przebić przeponę i spowodować odma opłucnowa; Szew blisko naczynia krwionośnego.
   5. Zaleca się elektrokauteryzację przy podziale naczyń, aby osiągnąć szybkie hemostazy i skrócić czas operacji, co poprawia spójność procedur i powtarzalność.
      UWAGA: Elektrokauteryzacja standaryzuje hemostazę, skraca czas działania i poprawia powtarzalność między operatorami.
   6. Mobilizuj płaty ogonowe i brodawkowe (Rysunek 3B).
   7. Użyj mikroskopijnych kleszczy, aby usunąć tłuszcz i tkankę łączną z powierzchni IHIVC.
      UWAGA: Usuń tkankę łączną, aż ściana naczynia będzie gładka i przezroczysta. Odpowiednia ekspozycja jest osiągana, gdy zaciski naczyniowe można zastosować bez zakłóceń i nie pozostawia tkanek pozostałych, które mogłyby utrudniać mankiety lub szycie.
   8. Podwiązać żyłę nadnerczy prawej strony z IHIVC. Izoluj prawą żyłę nerkową i podwiązuj ją do równowagi z IHIVC.
   9. Kontynuuj rozcinanie IHIVC kaudalnie do poziomu tuż powyżej lewej żyły nerkowej (Rysunek 3C).
      UWAGA: Upewnij się, że IHIVC jest dokładnie szkieletowane (oddzielenie naczyń krwionośnych od tłuszczowej tkanki łącznej) podczas rozwarstwienia. Ułatwia to kolejne zabiegi wysadzania wątroby i mocowania mankietów.
   10. Delikatnie unieś wątrobę za pomocą wacika kosmetycznego. Rozcinać przyczepy więzadeł między prawym dolnym płatem wątroby a otrzewną zatylną.
       UWAGA: Zidentyfikować SHIVC jako krótkie, szerokie, cienkościenne naczynie niebieskawe na górnym biegunie wątroby. Zakończ rozwarstwienie, gdy przednia powierzchnia jest usunięta i sąsiednie włókna przeponowe staną się widoczne.
   11. Przerwać sekcję po dotarciu do SHIVC.
       UWAGA: Należy bardzo ostrożnie traktować wątrobę, aby zapobiec uszkodzeniu mięścia. Zachowaj ostrożność, aby chronić dożylną podczas rozwarstwienia czaszki zaotrzewnowej i zaotrzewnejowej.
   12. Rozciąć tkankę łączną między PV a właściwym HA. Odizoluj PV.
   13. Podwiązuj prawą żyłę żołądkową (żyłę odźwiernicową) i wypłuj z PV. Kontynuuj rozwarstwienie do korzenia żyły śledzionowej.
   14. Ujawnij przenośne hepati. Zidentyfikuj tkankę tłuszczową przypominającą pępowinę znajdującą się po lewej stronie PV, otaczającą wspólny przewód żółciowy (CBD) i HA.
   15. Wykonaj nacięcie w kształcie litery "V" na przedniej ścianie CBD, 3–5 mm dalej od rozgałęzienia przewodu wątrobowego.
   16. Użyj mikrokleszczy do przytrzymania stentu żółciowego. Wsuń stent około 3 mm w głąb dróg żółciowych, zachowując równoległe wyrównanie z przewodem.
       UWAGA: Przesuwaj stent płynnie bez oporu. Upewnij się, że nie wypukliny boczne, nie są kątowe ani nie przesuwają się ściany kanałów. Jeśli wystąpi opór lub deformacja, należy wyciągnąć i wyrównać przed ponownym włożeniem.
   17. Zabezpiecz stent jedwabnym wiązaniem o obwodzie 7-0. Związać HA na poziomie nacięcia i przeciąć go blisko (Rysunek 3D).
       UWAGA: Ściśle unikaj nadmiernej "szkieletyzacji" podczas sekcji CBD dawcy. Zachowaj tkankę łączną obwodową, sploty nerwowe i sieci mikronaczyniowe, aby wspierać wczesne krążenie boczne i pooperacyjne gojenie drst żółciowych. Ponieważ dalszy koniec przewodu dawcy jest najbardziej niedokrwiennym obszarem, należy trzymać miejsce anastomotyczne blisko hilum wątrobowego, aby zminimalizować obciążenie niedokrwienne.
3. Perfuzja wątroby
   1. Odsłonić aortę brzuszną. Wprowadź igłę do żyły głowy o masie 23 gG (około 1 cm) o grubości 23 g, połączoną ze strzykawką 20 mL wypełnioną zimnym (4°C) roztworem Uniwersytetu Wisconsin (UW).
      UWAGA: Włóż igłę do aorty brzusznej pod niewielkim kątem (15°–20°). Potwierdź wejście, obserwując powrót krwi tętniczej, następnie lekko przesuń igłę i wyrównuj igłę równolegle do naczynia, aby zapobiec przebiciu tylnej ściany.
   2. Usuń powietrze ze strzykawki przed infuzją. Zacisnąć i naprawić aortę brzuszną oraz igłę za pomocą zacisku naczyniowego.
      UWAGA: Usuń całe powietrze ze strzykawki przez stuknięcie, aby usunąć pęcherzyki i wypychanie płynu, aż widoczna jest ciągła kropla na czubku igły. Potwierdź brak powietrza w głowie igły przed kanilowaniem.
   3. Powoli inicjuj perfuzję, ręcznie naciskając strzykawkę z stałą częstotliwością 3–3,5 mL/min (Rysunek 3E).
      UWAGA: Potwierdź prawidłowe umieszczenie wewnątrznaczyniowe, obserwując powrót krwi w rurce.
   4. Naciń przeponę. Całkowicie odsłonić dożylną klatkę dożylną klatki piersiowej oraz aortę piersiową.
   5. Zacisnąć dożylną klatkę dożylną klatki piersiowej na jej styku z prawym przedsionkiem oraz aortą piersiową, używając zacisków naczyniowych.
   6. Przeciąć dożylną część klatki piersiowej bezpośrednio poniżej zacisku, aby umożliwić wypływ perfuzacji.
      UWAGA: Zacisk należy założyć jak najbardziej do czaszki i przeciąć poniżej niego, aby zachować długość naczynia. Rozpocznij perfuzję natychmiast, aby zapobiec krzepnięciu i zachować jakość przeszczepu.
   7. Kontynuuj perfuzję w stałym tempie (3–3,5 mL/min) do całkowitej objętości około 40 mL.
   8. Przerwij perfuzję, gdy parenchyma wątroby całkowicie zbladnie (żółtawo-brązowa) (Rysunek 3F).
      UWAGA: Wystarczająca perfuzja potwierdza się, gdy wątroba staje się jednolicie blada (żółtawo-brązowa), a wypływanie z przeciętego IHIVC jest czyste, bez resztek krwi.
   9. Przetnij IHIVC z lewą żyłą nerkową. Przeciąć PV na poziomie żyły śledzionowej.
      UWAGA: Unikaj szybkich lub gwałtownych wstrzyków perfuzatu, aby zapobiec uszkodzeniom śródbłonka i mięźmiu.
   10. Powiększ nacięcie przepony. Pobierz przeszczep wątroby en bloc z przyczepioną przeponą.
   11. Umieść szczep w sterylnej szalce Petriego zawierającej zimny roztwór UW.
   12. Utrzymuj przeszczep w zimnym roztworze UW w temperaturze 4°C. Przeszczep zakończ w ciągu 2 godzin od pobrania.

Rysunek 3. Kluczowe kroki chirurgiczne podczas mobilizacji wątroby dawcy oraz perfuzji in situ. (A) Odsłonięcie i podwiązanie lewej dolnej żyły przedrowej. (B) Izolacja i podział gałęzi komunikujących się wątrobo-przełyk. (C) Rozwarstwienie IHIVC, wykazujące podwiązanie żyły nadnercznej prawej i prawej nerki. (D) Wprowadzenie niestandardowego stentu żółciowego do wspólnego przewodu żółciowego (CBD) za pomocą techniki "bezdotykowej" w celu zachowania tkanki łącznej obwodowej. (E) Kanyluacja aorty brzusznej w celu zainicjowania zimnej perfuzji in situ. (F) W pełni przepustniona wątroba dawcy o jednolitym bladym wyglądzie, co wskazuje na pomyślne wypłukanie krwi. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

3. Przygotowanie szczepu ex vivo

UWAGA: Całe przygotowanie do szczepów ex vivo wykonuj na lodzie (Rysunek 4A). Utrzymuj szczep w roztworze UW w temperaturze 4°C ± 2°C i okresowo monitoruj temperaturę, aby zapewnić odpowiednią konserwację w zimnie.

Rysunek 4. Przygotowanie przeszczepu wątroby dawcy ex vivo. ( A) Pobrany przeszczep wątroby umieszczony w sterylnej szalce Petriego zawierającej zimny roztwór konserwujący UW, umieszczony na kruszonym lodzie, aby utrzymać hipotermię. (B) Kajdanki PV dawcy przez odwrócenie się na niestandardowy mankiet i fiksację wiązką obwodową. (C) Zakończenie przygotowania mankietu do PV i IHIVC, z założonym stentem żółciowym. (D) Przygotowanie nadwłosowego dożynowego (SHIVC) z ułożeniem szwów na obu bocznych rogach w celu ułatwienia późniejszej anastomozy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

1. Przygotowanie mankietu PV
   1. Chwyć ogon mankietu PV kleszczami przeciwkomarowymi i zabezpiecz go tak, aby koniec był skierowany w dół, prostopadle do dolnej części szalki Petriego.
   2. Przeprowadź mikrokleszcze przez lumen mankietu. Przeciągnij PV przez mankiet.
   3. Wyreguluj przednią ścianę PV. Około 3 mm ściany naczynia przesuwaj się na rozszerzony koniec mankietowego ogona.
   4. Przymocuj wysunięte naczynie do zewnętrznej ściany mankietu za pomocą jedwabnego wiązania 7-0 (Rysunek 4B).
      UWAGA: Upewnij się, że naczynie i mankiet są wyrównane bez skręcania i kąta. Po utrwaleniu przepłucz mankiet PV około 1 mL roztworu UW i potwierdź przechodność, obserwując wypływ z SHIVC.
2. Przygotowanie mankietu IHIVC
   1. Przygotowanie i zakażanie IHIVC odbywa się zgodnie z dokładnie tymi samymi krokami, jak opisano w kroku 3.1 dla PV. W skrócie, obejmuje to mobilizację naczyń, przycinanie i utrwalanie mankietów według tego samego ustandaryzowanego protokołu, aby zapewnić spójność eksperymentu i powtarzalność. (Rysunek 4C).
      UWAGA: Potwierdź przechodność mankietu IHIVC, obserwując niezakłócony wypływ z SHIVC po spłukaniu.
3. Flushing dróg żółciowych
   1. Delikatnie przepłukaj przewod żółciowy przez stent dróg żółciowych za pomocą strzykawki o pojemności 1 mL zawierającej 0,5 mL roztworu UW.
   2. Upewnij się, że podczas spłukiwania nie dochodzi do wycieku płynu.
      UWAGA: Brak wycieku płynu potwierdza integralność przewodu żółciowego.
4. Przygotowanie do SHIVC
   1. Przyciąć SHIVC przeszczepu wątroby poprzez usunięcie resztkowej przepony.
   2. Upewnij się, że SHIVC jest całkowicie zredukowany do szkieletu, zgodnie z definicją w kroku 2.2.7.
5. Umiejscowienie szwów utrzymujących
   1. Użyj 7-0 lub 8-0 szwy zależą od preferencji operatora.
      UWAGA: Pod względem wyników chirurgicznych (w tym przechodzenia anastomotycznego i przeżycia biorcy), oba rozmiary szwów są funkcjonalnie równoważne w tym modelu. Wybór między nimi może opierać się całkowicie na osobistych preferencjach operatora lub dostępności laboratorium, bez wpływu na powtarzalność procedury.
   2. Delikatnie spłaszcz kikut SHIVC. Szwy należy umieścić w lewym i prawym bocznym rogu, przesuwając igłę od środka do zewnątrz, około 1 mm od krawędzi (Rysunek 4D).

4. Operacja odbiorcy

1. Początkowe kroki
   1. Znieczulaj szczura biorcę, stosując ten sam protokół, co opisany dla dawcy (Krok 2.1.1).
   2. Umieść szczura, który otrzymał poduszkę, na termostatycznie sterowanej poduszce grzewczej utrzymywanej w temperaturze 37°C.
   3. UWAGA: Przed znieczuleniem zważ szczura, który otrzymał pacjenta. Upewnij się, że jego masa ciała przewyższa wagę dawcy o około 50 g.
2. Mobilizacja wątroby biorcy
   1. Wykonaj laparotomię środkową.
   2. Cofnij ścianę brzucha bocznie za pomocą czterech elastycznych retraktorów. Dwa górne retraktory ustaw bocznie względem obustronnych brzegów brzegowych, a dwa dolne bocznie względem obustronnych obszarów pachwinowych, aby osiągnąć optymalną ekspozycję.
      UWAGA: Należy stosować wystarczające wycofanie, aby odsłonić pole operacyjne, unikając jednocześnie nadmiernego napięcia, które może powodować blanszowanie tkanek lub utrudniać oddychanie.
   3. Podwiązuj lewą dolną żyłę przedrową (LIPV) w taki sam sposób, jak opisano w procedurze dawcy (patrz krok 2.2.1).
   4. Przeciąć więzadła między lewym płatem wątroby a otrzewną zaotrzewną. Mobilizuj płaty ogonowe i brodawkowe.
   5. Podziel więzadła i gałęzie łączące przełyk z lewym płatem wątroby za pomocą elektrokauteryzacji.
      UWAGA: Zaleca się elektrokauteryzację, aby zapewnić szybkie krwawienie, skrócić czas operacji oraz poprawić powtarzalność proceduralną.
   6. Bezpośrednio rozciął IHIVC aż do poziomu prawej żyły nerkowej.
   7. Ostrożnie izoluj i podwiązuj lewą żyłę nadnercza około 2 mm od jej połączenia z IHIVC.
   8. Zarządzaj prawym dolnym płatem wątroby w taki sam sposób, jak opisano przy zabiegu dawcy (patrz krok 2.2.4).
   9. Przełóż gumkę recepturką (wykonaną z mankietu sterylnej rękawicy chirurgicznej, około 10 cm długości) poprzecznie za SHIVC.
      UWAGA: Stosuj delikatną trakcję, aby odsłonić SHIVC bez ograniczania ruchu oddechowego.
   10. Zostaw gumkę na miejscu do użycia podczas kolejnego przecięcia SHIVC.
   11. Rozcinać i izolować PV od hilum wątrobowego do poziomu gałęzi żyły odźwiernika.
       UWAGA: Ogranicz rozwarstwienie PV do obszaru anastomotycznego. Zachowaj otaczające dopływy, aby zmniejszyć uraz chirurgiczny.
   12. Wyizoluj HA w miejscu wrzaska wątrobowego.
   13. Podwiązuj HA równo z hilum i przetnij go blisko.
   14. Zidentyfikować zbieg lewego i prawego przewódu wątrobowego, tworząc CBD poniżej wrzasca wątrobowego. Podwiązuj CBD w tym miejscu za pomocą szwu Prolene 7-0 i przeciń go (rysunek 5A).
       UWAGA: Minimalizuj urazy chirurgiczne w tym regionie. Zachowanie maksymalnej możliwej długości HA wraz z tkanką łączną obwodową, splotami nerwowymi i siecią mikronaczyniową, aby ułatwić wczesne powstanie krążenia bocznego.
3. Hepatektomia u biorącego
   1. Załóż mikronaczyniowe klamry, aby natychmiast zatkać IHIVC do prawej żyły nerki.
   2. Załóż mikronaczyniowy zacisk, aby zatkać PV tuż powyżej połączenia z żyłą odźwiernicową.
   3. Potwierdzenie skutecznego zamknięcia naczyniowego, obserwując widoczne ciemnienie mięźmiaszka wątroby.
      UWAGA: Potwierdź okluzję naczyniową poprzez jednolite przyciemnienie wątroby (sinicę), utratę turgoru przydzielniczego oraz zapadnięcie się PV.
   4. Do PV należy włożyć igłę do żyły głowy o pojemności 23 g podłączoną do strzykawki 5 mL.
   5. Należy zainfuzować 2 mL 5% roztworu glukozy przez około 30 sekund, aby wypłukać krew wewnątrzwątrobową do krążenia układowego.
      UWAGA: Wstrzykuj powoli przez PV w pobliżu wrzatki wątroby, aby przepłukać krew wewnątrzwątrobową do krążenia układowego.
   6. Należy nałożyć trakcję w dół na gumkę, aby odsłonić SHIVC.
   7. Załóż zacisk krzyżowy SHIVC za pomocą zacisku naczyniowego (rysunek 5B).
   8. Przeciąć IHIVC, PV i SHIVC z parenchymą wątrobowym.
   9. Całkowicie usuń rodzimą wątrobę z jamy brzusznej.
      UWAGA: Utrzymuj fazę anhepatyczną w ciągu 26 minut (nie przekraczającej 30 minut). Naczynia transekcyjne stykają się z wątrobą, aby zachować odpowiednią długość i zapewnić gładkie kikuty naczyniowe.
4. Wszczepienie przeszczepu wątroby
   1. Rekonstrukcja SHIVC
      1. Umieść przeszczep wątroby w jego ortotopowej orientacji anatomicznej.
      2. Użyj wcześniej ustawionego szwu 7-0 w lewym rogu, aby rozpocząć ciągłe szycie tylnej ściany w kierunku prawego narożnika.
      3. Przymocuj szew do szwu stabilizacyjnego w prawym rogu.
      4. Kontynuuj prowadzenie szwu wzdłuż przedniej ściany, aby zakończyć zespolenie (Rysunek 6A–6C).
      5. Utrzymuj odległość wejścia igły 0,5–1,0 mm od krawędzi naczynia.
      6. Utrzymuj rozstaw szwów 1,0–1,5 mm.
         UWAGA: Utrzymuj stałe rozstawy igieł i kąt szwów, aby zapewnić bezpieczną i beznapięciową anastomozę.
      7. Zaciskaj szew po każdym ściegu, aby wyeliminować martwą przestrzeń i utrzymać odpowiednie napięcie.
         UWAGA: Przed zakończeniem szycia przedniej ściany przepłucz SHIVC roztworem UW za pomocą igły zatrzymującej się, aby usunąć resztkowe powietrze i zapobiec zatorowości powietrznej.
   2. Rekonstrukcja fotowoltaiczna
      1. Umieść szwy 7-0 na lewym i prawym rogu wicketu PV stump.
      2. Zastosuj trzypunktową trakcję, aby stworzyć trójkątne otwarcie.
      3. Włóż PV z mankietami do lumenu.
      4. Zabezpiecz za pomocą ligatury 7-0 zawiązanej wokół rowka obwodowego (rysunek 6D–6F).
   3. Rekonstrukcja IHIVC
      1. Rekonstruuj IHIVC przy użyciu tej samej techniki co rekonstrukcja PV (patrz krok 4.4.2) (Rysunek 6G–6I).
   4. Reperfuzja
      1. Kolejno uwalniaj zaciski naczyniowe na SHIVC, PV i IHIVC.
      2. Powierdź skuteczną reperfuzję, obserwując jednolitą odbudowę koloru przeszczepu bez zatkania, krwotoku czy przecieku (Rysunek 7A).
         UWAGA: Aktywna produkcja żółci z przewodu żółciowego wskazuje na przywrócenie perfuzji wątroby i wczesną funkcję przeszczepu.
   5. Rekonstrukcja dróg żółciowych
      1. Wykonaj małe nacięcie poprzeczne (połowa średnicy przewodu) na przedniej ścianie kikuta CBD biorcy.
      2. Wprowadź stent dawcy dróg żółciowych około 3 mm w głębokości lumenu CBD.
      3. Zabezpiecz stent szwem obwodowym 7-0 (rysunek 7B).
         UWAGA: Przed zakończeniem rekonstrukcji obserwuj aktywny wylot żółci z dalszego końca stentu dawcy. Potwierdza to przechodność i wczesną funkcję przeszczepu.
5. Ponowne podgrzewanie odbiorcy
   1. Płukać jamę otrzewną 150 mL soli fizjologicznej w temperaturze 37°C przed zamknięciem jamy brzusznej.
      UWAGA: Ten etap usuwa resztki krwi, przywraca temperaturę ciała i umożliwia inspekcję hemostazy w miejscach SHIVC, IHIVC i PV.
6. Zamknięcie brzucha i opieka pooperacyjna
   1. Zamknij warstwę mięśniowo-powięziową za pomocą ciągłego szwu z wchłanialną nićą 4-0, wykonując ugryzienia o długości 5 mm co 1 cm.
   2. Zamknij skórę za pomocą ciągłego szwu z jedwabną nić 4-0.
   3. Podawaj buprenorfinę (0,1 mg/kg) podskórnie co 12 godzin, łącznie 2 dawki.
   4. Przenieś szczura, który otrzymał do czystej, kontrolowanej temperatury klatki.
   5. Monitorowanie w ciągu dnia do pełnego powrotu do zdrowia po znieczuleniu i wznowienia normalnych spontanicznych ruchów.

Rysunek 5. Kluczowe kroki chirurgiczne podczas mobilizacji wątroby biorcy i hepatektomii. (A) Identyfikacja i ligacja biorącego CBD w pobliżu bifurkacji hilarnej. (B) Ekspozycja i zaciskanie SHIVC. Za SHIVC umieszcza się gumkę, aby zapewnić przyczepność i poprawić widoczność podczas zaciskania. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 6. Kluczowe kroki chirurgiczne w rekonstrukcji naczyniowej podczas implantacji przeszczepu wątroby. Rekonstrukcja SHIVC: (A) wyrównanie przy użyciu szwów narożnych, (B) ciągłe szycie tylnej ściany oraz (C) zakończenie szycia przedniej ściany. Rekonstrukcja PV z użyciem techniki mankietowej: (D) trakcja trzypunktowa, (E) wszczepienie PV z mankietami w kajdankach oraz (F) podwiązanie zabezpieczające mankiet. Rekonstrukcja IHIVC przy użyciu tej samej techniki mankietu: (G) ekspozycja, (H) wszczepienie oraz (I) podwiązanie. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 7. Weryfikacja funkcji przeszczepu, rekonstrukcja dróg żółciowych oraz pooperacyjna rekonwalescencja. (A) Ocena wczesnej funkcji przeszczepu po reperfuzji, z widocznym wypływem żółci z stentu dawcy odpowiedzialności żółciowej. Widoczne są rekonstrukcje PV i IHIVC. (B) Zakończenie rekonstrukcji dróg żółciowych z wszczepieniem i utrwaleniem stentu dawczyni żółciowej do CBD biorcy. (C) Reprezentatywny szczur biorcy wykazujący pełne pooperacyjne powrót do zdrowia z prawidłową postawą i spontaniczną aktywnością. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Wyniki

Aby zapewnić spójną jakość chirurgiczną i powtarzalność w modelach NArLT, wszystkie zabiegi były wykonywane przez tego samego doświadczonego mikrochirurga. W trakcie badania przeprowadzono łącznie 50 przeszczepów wątroby szczurów. Średnie czasy trwania zabiegów chirurgicznych były następujące: operacja dawcy wynosiła średnio 25,3 ± 2,6 min, przygotowanie przeszczepu ex vivo średnio 13,1 ± 2,1 min, operacja biorcy średnio 43,0 ± 1,6 min, a faza anhepatyczna średnio 15,7 ± 1,2 min.

Osoby poddane...

Dyskusja

Model NArLT jest fundamentem badań eksperymentalnych nad przeszczepami ze względu na unikanie złożonej mikronaczyniowej zespolenia tętnicowego¹¹. Jednak konwencjonalne metody NArLT historycznie borykają się z wysokim wskaźnikiem powikłań dróg żółciowych — nawet do 30% — które poważnie ograniczają długoterminowe przeżycie i utrudniają przewlekłe badania immunologiczne². Znaczenie proponowanej metody polega na jej zdolności do omijania tych niedokrwiennych urazów dróg żółciow...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szew 4-0 Chłonny	Ethicon	W9109H	Stosowany do zamknięcia warstwy mięśniowo-powięziowej (linea alba)
4-0 Szew jedwabny	Ethicon	VCP304H	Stosowane do zamykania skóry
7-0 lub 8-0 Szwy / Jedwabny Krawat	Ethicon	Z1711E	Stosowane do podwiązywania naczyń (np. lewej żyły przeponowej)
Cewnik dożylny 22G	B. Braun	4252098B	Przycięte do 5– 7 mm z pochylonymi końcami do przygotowania stentu żółciowego
23G igły żyły głowy	Shandong Qinkai Medical Industry Co., Ltd.	MDLSSVS	Stosowany do wstawiania do aorty brzusznej w celu perfuzji wątroby
Buprenorfina	Instytut Badań Farmaceutycznych w Tiencinie, Pharmaceutical Co., Ltd.	H12020275	Podawane jako podskórne środki przeciwbólowe po operacji
Patyczek watowy	Aoocn	216-236	Używane do delikatnego podnoszenia wątroby podczas sekcji
Rozdrobniony lód	Nie ma	Nie ma	Używany do utrzymania temperatury szczepu podczas przygotowania ex vivo
Elastyczne retraktory	Nie ma	Nie ma	Wykorzystywane do cofania ściany brzucha podczas laparotomii
Pochewki cewników zewnątrzoponowych	Jiangsu Maichuang Medical Device Co., Ltd.	20173084015	Rozmiary 5F i 6F; używane jako kajdanki dla PV i IHIVC
Gaza	Central Medical Technology Co., Ltd.	CH-1001	nasączone solą fizjologiczną; Używana do okrywania i ochrony jelit
Roztwór glukozy (5%)	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	H20044307	Używany do płukania krwi wewnątrzwątrobowej podczas hepatektomii biorcy
Sól z heparyną	Shenzhen Life Biotechnology Co., Ltd.	H2012003	100 IU/mL; Używana do moczenia stentu żółciowego
Igła mieszkająca	B. Braun	4254074B	Używany do płukania SHIVC, aby usunąć powietrze przed zakończeniem anastomozy
Izofluran	Jinan Guangshengyuan Biotechnology Co., Ltd.	153107015	5% stężenie; stosowany do indukcji znieczulenia & nbsp;
Zaciski mikronaczyniowe	Shanghai Medical Devices Co., Ltd.	JCZ200	Stosowane do zamykania naczyń podczas operacji
Kleszcze komarskie	Shanghai Medical Devices Co., Ltd.	J31010	Wykorzystywane do precyzyjnej manipulacji i przygotowania mankietów
Sól fizjologiczna normalna (0,9%)	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	H20044304	Używany do nawadniania i moczenia gazą (37 stopni; C)
Pentobarbital (1%)	Shanghai Yuansi Technology Co., Ltd.	P0500000	40– 45 mg/kg; Stosowane w znieczuleniu chirurgicznym
Obwodowo wprowadzony cewnik żylny (PIVC)	Covidien	8888145015	Używano do przepłukiwania mankietowanych PV i potwierdzania przechodności.
Povidone-jod	Shanxi Trinda Biotechnology Co., Ltd.	41836054	Wykorzystywane do dezynfekcji miejsc chirurgicznych
Gumka gumowa (z Surgical Glove)	Ansell	Nie ma	Wykorzystywany do trakcji SHIVC podczas operacji biorcy
Sprague– Dawley Rats	Huafukang (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.	22001A	Dorosłe samce szczurów, 8– 10 tygodni, 220 i ndash; 250 g
Sterylna szalka Petriego (10 cm)	Shandong Enyou Biotechnology Co., Ltd.	H905001	Używany do trzymania graftu w roztworze UW podczas przygotowań ex vivo
Strzykawka (20 mL)	Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd.	20163141593	Stosowany do kontrolowanej perfuzji wątroby (3– 3,5 mL/min)
UW Preservation Solution	Most do życia	BTL-UW-1L	Utrzymywane na wysokości 4 stopni; C; Stosowane do perfuzji wątroby dawcy i konserwacji przeszczepów