Standaryzowane obrazowanie immunofluorescencyjne nanorur tunelowych i transferu mitochondriów między astrocytami a neuronami

Podsumowanie

Ten protokół standaryzuje metody fiksacji, barwienia i obrazowania konfokalnego w celu wizualizacji nanorurek tunelowych i transferu mitochondriów między astrocytami a neuronami in vitro.

Streszczenie

Mitochondria są niezbędnymi organellami, które regulują produkcję energii, sygnalizację komórkową i homeostazę metaboliczną w komórkach nerwowych. Tunele nanorurkowate (TNTs) to cienkie struktury błonowe, które pośredniczą w długodystansowej komunikacji międzykomórkowej i ułatwiają przenoszenie składników komórkowych, w tym mitochondriów, między połączonymi komórkami. Niezawodne wizualizowanie TNTs i transferu mitochondriów wymaga starannego postępowania z próbkami, ponieważ te struktury są bardzo kruche i wrażliwe na warunki fiksacji, płukania i obrazowania. Ten protokół opisuje standaryzowane procedury fiksacji, barwienia i konfokalnego obrazowania TNTs w astrocytach i współkulturach astrocytów i neuronów. Przepływ pracy obejmuje barwienie błony i szkieletu komórkowego dla wizualizacji TNT, znakowanie mitochondriów dla śledzenia lokalizacji mitochondriów oraz barwienie immunofluorescencyjne dla analizy kolokalizacji Miro1. Przez cały proces podkreśla się kluczowe kroki dla zachowania morfologii TNT, w tym delikatne płukanie i obsługa chroniąca przed światłem. Protokół opisuje również podejścia do obrazowania dla charakteryzacji TNT i mitochondriów w preparatach stałych. Te metody zapewniają odtwarzalną ramę eksperymentalną do badania formowania się TNT i transferu mitochondriów między komórkami nerwowymi in vitro.

Wprowadzenie

Mitochondria służą jako fabryki energii komórki, dostarczając energii potrzebnej do działań komórkowych poprzez produkcję adenozynotrifosforanu, a także odgrywają ważne role w przekaźnictwie sygnałowym komórkowym i bilansie redoks¹. W układzie nerwowym metabolity mitochondrialne mogą zwiększać złożoność i pobudliwość procesów neuronowych, wspierając tym samym wzrost i rozwój neuronów². Mitochondria nie są statycznymi organellami; ciągle zmieniają swoją morfologię, lokalizację i rozmieszczenie, aby przystosować się do różnych wewnątrz- i pozakomórkowych stresów oraz zapotrzebowań metabolicznych³. Przekazywanie mitochondriów międzykomórkowe przyczynia się do utrzymania homeostazy tkankowej i wspomaga rozwój w warunkach fizjologicznych, podczas gdy w warunkach patologicznych uczestniczy w naprawie uszkodzeń, regulacji odporności i progresji choroby^4,5.

Międzykomórkowa komunikacja materiałów i energii jest niezbędna dla różnych procesów biologicznych, w tym dla homeostazy komórkowej, naprawy tkanek i regulacji sieci neuronowych. Obecne badania ujawniły wiele trybów komunikacji międzykomórkowej, wśród których tunele nanorurkowate (TNT) reprezentują jeden z najbardziej szczegółowo badanych mechanizmów związanych z międzykomórkowym przekazaniem mitochondriów⁶. TNT to oparte na F-aktinie, mostopodobne struktury błony o rurkowej morfologii, o średnicy od 50 do 200 nm i długości sięgającej kilku średnic komórek⁷. Badania wykazały, że TNT mogą służyć jako fizyczne połączenia między komórkami nerwowymi i są ściśle związane z występowaniem i progresją chorób neurodegeneracyjnych, raka mózgu i innych zaburzeń. Na przykład, przekazywanie mitochondriów z mikrogleju do neuronów poprzez TNT zostało zgłoszone jako uratowanie komórek nerwowych^8,9.

Badaniu TNT obecnie towarzyszy kilka wyzwań, w tym strukturalna nietrwałość TNT, która sprawia, że są one podatne na pękanie i mogą w konsekwencji wpływać na wyniki eksperymentów; trudność w odróżnieniu TNT od wypustek aksonowych lub innych wypustek błonowych; oraz wyzwania związane z dokładnym ilościowym określeniem międzykomórkowych TNT. Aby poprawić reprodukcyjność i spójność badań związanych z TNT, wymagane są standaryzowane metody dotyczące płukania, fiksacji, barwienia i obrazowania TNT, aby umożliwić dokładną ocenę ich struktury i rozmieszczenia, minimalizując jednocześnie różnorodność eksperymentalną. Czynniki takie jak gęstość komórek przed fiksacją, ochrona przed światłem, intensywność płukania, czas fiksacji i warunki barwienia po fiksacji mogą wszystkie wpływać na strukturę i stabilność TNT. W niniejszym badaniu opisano procedury dotyczące przetwarzania, barwienia i konfokalnego obrazowania TNT oraz struktur związanych z mitochondriami w układach hodowlanych astrocytów i astrocytów-neuronów.

Niniejszy protokół badań może być ogólnie stosowany w większości ustawień laboratoryjnych. Walidacja w pierwotnych astrocytach i linii komórek nerwowych hipokampu mysiego potwierdziła, że protokół jest odpowiedni zarówno dla pierwotnych komórek nerwowych, jak i uwiecznionych linii komórkowych. Jednakże ten protokół nadal ma kilka ograniczeń. Mikroskopia konfokalna zapewnia niższą rozdzielczość przestrzenną niż podejścia superrezolucjonujące do wizualizowaniu TNT, a ocena transferu mitochondrialnego oparta na MitoTrackerze może być wpłynięta na przecieki barwników i interferencję sygnałów nie-mitochondrialnych¹⁰.

Protokół

To study TNTs in astrocytes, this study used commercially obtained or established cell lines, and no ethical approval was required.

1. Barwienie TNT w astrocytach

1. Sianie komórek
   1. Zasiej izolowane pierwotne astrocyty szczurze na przejściu 3 (P3) do szklanych doniczek o średnicy 35 mm w stężeniu 5 x 10⁴ komórek na doniczkę. Dodaj 2 ml kompletnego pożywka Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) uzupełnionego o 10% fetalnego surowicy wołowej (FBS) i 1% potrójnego mieszania antybiotyków (penicylina G, streptomycyna i amfoterycyna B). Hoduj komórki w 37°C w inkubatorze skondycjonowanym zawierającym 5% CO₂.
   2. Inkubauj komórki przez około 24 godziny do momentu przylgnięcia.
2. Przedprzygotowanie i fiksacja
   1. Przenieś doniczki kulturowe do czystej ławki w warunkach chronionych przed światłem po przylgnięciu komórek.
      UWAGA: Minimalizuj niepotrzebne ruchy i wibracje podczas manipulacji, aby zachować integralność TNT.
   2. Delikatnie usuń pożywkę kulturową w warunkach słabego oświetlenia.
      UWAGA: Unikaj całkowitego wysuszenia powierzchni komórek podczas usuwania pożywki, ponieważ TNT mogą załamać się i przylgnąć do podłoża kulturowego.
   3. Delikatnie przepłucz komórki raz z 500 μl buforu fosforanowego (PBS) bez jonów wapnia i magnezu (pH 7,3–7,5). Dodaj i usuń PBS powoli wzdłuż ścianki doniczki kulturowej, aby uniknąć zakłócenia międzykomórkowych TNT podczas płukania.
   4. Delikatnie usuń PBS.
   5. Fiksuй komórki komercyjnym 4% roztworem fiksującym komórki tkankowe zawierającym paraformaldehyd (pH 7,2–7,4) przez 30 min w temperaturze pokojowej (RT; 20°C–25°C) w warunkach słabego oświetlenia.
      UWAGA: Obsługuj roztwory fiksujące z zachowaniem należytej ochrony osobistej i wykonuj wszystkie procedury zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa chemicznego.
   6. Usuń roztwór fiksujący.
   7. Przepłucz komórki raz z PBS.
3. Permeabilizacja komórek i barwienie fluorescencyjne
   1. Permeabilizuй komórki 500 μl gotowego do użycia roztworu permeabilizującego Triton X-100 przez 20 min w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Triton X-100 może zakłócić kruche struktury TNT. Minimalizuj nadmierną agitację podczas permeabilizacji.
   2. Usuń roztwór permeabilizujący.
   3. Przepłucz komórki raz z PBS.
   4. Natychmiast przed użyciem przygotuj roztwór barwiący. Rozcieńcz barwnik F-aktyny w PBS do końcowej koncentracji 1 μM i użyj 4′,6-diamino-2-fenylindol (DAPI) jako gotowego do użycia barwnika jądrowego. Dokładnie wymieszaj dwie roztwory barwiące przed użyciem.
      ​UWAGA: Reagenty barwiące na bazie faloidyny mogą być używane jako alternatywy dla wizualizowania F-aktyny.
   5. Wymieszaj roztwory barwiące F-aktyny i jądra w proporcji 1:1 (równe objętości) w warunkach chronionych przed światłem.
   6. Dodaj przygotowany roztwór barwiący do doniczek kulturowych.
   7. Inkubauj komórki przez 30 min w 37°C w ciemności.
   8. Usuń roztwór barwiący.
   9. Przepłucz komórki trzy razy z PBS używając 500 μl na jedno płukanie przez 1 min.
   10. Dodaj 1 ml PBS, aby zapobiec wysychaniu komórek podczas przygotowywania do obrazowania.
4. Zdjęcia konfokalne
   1. Pobieraj obrazy za pomocą inwertowanego mikroskopu konfokalnego Nikona wyposażonego w obiektyw 20x. Użyj 405 nm do wzbudzania DAPI i 488 nm do wzbudzania barwienia F-aktyny. Zdrap obrazy z rozdzielczością 1024 x 1024 pikseli w warunkach chronionych przed światłem w temperaturze pokojowej.
   2. Przeprowadź jakościową ocenę i ręczne ilościowe określenie przynajmniej pięciu losowo wybranych pól widzenia na próbkę. Określ liczbę TNT i liczbę komórek zawierających jedno lub więcej TNT w każdym polu widzenia (Rysunek 1A i 1B).
      UWAGA: Zdrap obrazy natychmiast po barwieniu, aby zminimalizować utratę fluorescencji i zakłócenia strukturalne TNT.

Rysunek 1: Fluorescencyjne barwienie nanotuneli (TNT) w astrocytach. (A) Reprezentatywne obrazy mikroskopii konfokalnej pokazujące barwienie jądrowe i F-aktyny w astrocytach hodowanych w szklanych doniczkach kulturowych. (B) Powiększenie obszaru oznaczonego na rysunku A. Białe strzałki wskazują na

Wyniki

W preparatach monokultury astrocytów zaobserwowano cienkie wypustki błony łączące sąsiednie komórki po barwieniu F-aktyny i jądra (Rysunek 1A i 1B). Wykryto wiele struktur podobnych do TNT biegnących między sąsiednimi astrocytami, a pojedyncze astrocyty często tworzyły połączenia z kilkoma otaczającymi komórkami. Skuteczne zachowanie struktur podobnych do TNT było związane z delikatnym postępowaniem podczas mycia i fiksacji. Nadmierne mechaniczne zaburzenie podczas usuwania medium lub mycia skutkowało zmniejszoną wykrywalnością i uszkodzeniem strukturalnym tych połączeń błonowych, jak pokazano na zniszczonych strukturach podobnych do TNT po niewłaściwej obsłudze próbki (Rysunek 1C i 1D).

W preparatach współkultury astrocytów i neuronów zaobserwowano sygnały fluorescencji związane z mitochondriami w strukturach podobnych do TNT łączących sąsiednie komórki po barwieniu MitoTracker i obrazowaniu konfokalnym (Rysunek 2A i 2B). Struktury te były wizualizowane razem z barwieniem F-aktyny i jądra, aby wspomóc morfologiczną ocenę połączeń podobnych do TNT. Właściwa ochrona przed światłem i minimalizowana intensywność mycia poprawiły zachowanie sygnału fluorescencji i morfologii TNT podczas przygotowywania obrazu.

W eksperymentach kolokalizacji immunofluorescencyjnej zaobserwowano nakładające się sygnały fluorescencji odpowiadające barwieniu związanemu z mitochondriami i immunobarwieniu Miro1 w strukturach podobnych do TNT w preparatach współkultury astrocytów i neuronów (Rysunek 3A). Obserwacje te sugerują potencjalne powiązanie między Miro1 a mitochondriami zlokalizowanymi w strukturach podobnych do TNT. Trójwymiarowe zrekonstruowane obrazy Z-stack dalece wsparły obecność struktur podobnych do TNT rozciągających się między sąsiednimi komórkami (Rysunek 3B i 3C). Zachowanie TNT, intensywność sygnału fluorescencyjnego i jakość obrazu były wpływane przez warunki fiksacji, permeabilizacji i obrazowań.

Dyskusja

Pierwszym krytycznym etapem w opisanym wyżej protokoła eksperymentalnym jest ochrona przed światłem przed fiksacją. Struktury podobne do TNT są bardzo kruche, a utrzymanie warunków chroniących przed światłem po usunięciu z inkubatora jest ważne dla zachowania intensywności sygnału fluorescencji i integralności strukturalnej podczas przygotowania próbki. Drugim kluczowymi etapem jest wykonanie płukania w buforze PBS z delikatnym manipulowaniem, aby zminimalizować zakłócenia struktur podobnych do TNT spowodowane przepływem płynu. Przestrzeganie tych kluczowych procedur obsługi pomaga zachować morfologię i stabilność struktur podobnych do TNT oraz poprawia spójność kolejnych wyników obrazowania. Nadmierne aspirację, przedłużone płukanie lub silne agitowanie płynu może prowadzić do załamania lub fragmentacji struktur podobnych do TNT podczas przetwarzania próbki. Ze względu na ich wysoce dynamiczny charakter, TNT są wrażliwe na światło. Fototoksyczność spowodowana ekspozycją na światło może powodować uszkodzenie TNT, utrudniając wizualizację tych struktur¹¹. Dlatego warunki chroniące przed światłem powinny być utrzymywane podczas eksperymentów związanych z TNT.

Ruch mitochondriami wewnątrzkomórkowy przyczynia się do dystrybucji energii komórkowej, szczególnie w neuronach. Badania wykazały, że mitochondria mogą poruszać się wzdłuż filamentów aktynowych i mikrotubul¹². Ostatnie badania wykazały również, że TNT mogą funkcjonować jako struktury komunikacji międzykomórkowej na duże odległości związane z transferem mitochondrialnym między komórkami nerwowymi¹³. Opisany w tym badaniu podejście metodologiczne umożliwia wizualizację struktur podobnych do TNT i sygnałów fluorescencyjnych związanych z mitochondriami w systemach hodowania komórek nerwowych. Poprzednie badania wykazały, że transfer mitochondrialny między komórkami nerwowymi może przyczyniać się do naprawy tkanek i procesów neuroprotekcyjnych w chorobach neurologicznych, takich jak choroba Parkinsona i ostra niedokrwienia mózgu^14,15. Stosując metody opisane w tym badaniu, struktury podobne do TNT obserwowano między astrocytami i między astrocytami i neuronami, wraz z sygnałami fluorescencyjnymi związanymi z mitochondriami zlokalizowanymi wewnątrz tych struktur.

Jak zauważono w poprzednich badaniach¹⁰, barwienie MitoTracker jest podatne na wycieki barwnika i transfer sygnału pozamitochondrialnego, co może zmniejszyć wiarygodność danych. Aby przeciwdziałać tej ograniczonej, przyszłe badania powinny zastosować bardziej solidne metody, takie jak genetycznie zakodowane znakowanie mitochondriami, aby uzyskać bardziej przekonujące wyniki. W obecnych warunkach eksperymentalnych, dwa typy komórek były rozróżniane głównie na podstawie morfologii komórkowej, podejście, które może zmniejszyć specyficzność identyfikacji typu komórki. Przyszłe badania powinny uwzględnić fluorescencyjne znakowanie specyficzne dla typu komórki, aby poprawić dokładność analizy kokultur.

Miro1 jest białkiem adaptacyjnym zlokalizowanym na zewnętrznej błonie mitochondrialnej i jest zaangażowany w procesy transportu mitochondrialnego w neuronach^16,17. Za pomocą protokołu kolokalizacji immunofluorescencyjnej opisanego w tym badaniu, obserwowano nakładające się sygnały fluorescencyjne odpowiadające barwieniu związanemu z mitochondriami i immunobarwieniu Miro1 wewnątrz struktur podobnych do TNT. Te obserwacje sugerują potencjalne powiązanie między Miro1 a mitochondriami zlokalizowanemi wewnątrz struktur podobnych do TNT. Jednakże, przestrzenna rozdzielczość konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej może ograniczać ostateczną ocenę kolokalizacji molekularnej wewnątrz cienkich wypustek błonowych.

Przeprowadziliśmy obrazowanie Z-stack, aby potwierdzić obecność struktur podobnych do TNT między komórkami, wspierając w ten sposób strukturalną walidację tych połączeń membranowych. Chociaż obecny protokół jest odpowiedni dla większości środowisk eksperymentalnych, obrazowanie konfokalne fiksowanych komórek może prowadzić do utraty kruchych struktur podobnych do TNT podczas przetwarzania próbki w porównaniu z obrazowaniem żywych komórek, co ogranicza dokładne ilościowe określenie TNT¹⁸. Ponadto, obrazowanie fiksowanych komórek nie pozwala na jednoznaczne określenie kierunku transferu mitochondrialnego, co wymaga dalszych badań w przyszłości. Ten protokół zapewnia standaryzowany eksperymentalny przepływ pracy do barwienia struktur podobnych do TNT, sygnałów związanych z mitochondriami i powiązanych białek w systemach hodowania komórek nerwowych. W porównaniu z niekontrolowanymi procedurami płukania i fiksacji, protokół podkreśla delikatne przetwarzanie próbki i zachowanie fluorescencji podczas przygotowania do obrazowania. Te metody mogą pomóc poprawić spójność eksperymentalną i reprodukowalność w badaniach obrazowania związanych z TNT.

Podsumowując, niniejsze badanie dostarcza praktycznego i powszechnie stosowanego protokołu laboratoryjnego do jakościowej oceny TNT oraz badania transportu mitochondrialnego poprzez struktury podobne do TNT. Jednak kroki przetwarzania próbek, takie jak fiksacja i płukanie, mogą wprowadzać zmienność ilościową w porównaniu z podejściami do obrazowania żywych komórek. Ponadto, mikroskopii konfokalnej zapewnia niższą rozdzielczość przestrzenną niż mikroskopii superrozdzielczości, co ogranic

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1% mikstura potrójnego antybiotyku	Biosharp	BL142A	Zapobiega zakażeniom bakteryjnym i grzybiczym podczas hodowli komórkowej
4% utrwalacz tkankowo-komórkowy	Solarbio	P1110	Środek do utrwalania komórek
Przeciwciało przeciwko Miro1	Abcam	AB319154	Przeciwciało pierwotne przeciwko Miro1
Astrocyty	Komórki pierwotne izolowanych w laboratorium	NA	Astrocyty zostały wyizolowane z kory mózgowej noworodków szczurów SD w wieku 1–3 dni. Czystość wyizolowanych komórek potwierdzono za pomocą barwienia GFAP i wyniosła >95%, a do wszystkich eksperymentów użyto komórek w przejściu 3 (P3)
Środek do hodowli komórek astrocytów (DMEM/F-12)	Gibco	6125011	DMEM i F-12 zostały wymieszane w stosunku 1:1 (v/v), uzupełnione o 10% płodowego surowicy wołowej (FBS) i 1% potrójnych antybiotyków
Mikroskop konfokalny	Nikon AX	ECLIPSE TI2-E	Obrazy zostały nabyte za pomocą konfokalnego mikroskopu Nikon AX (Nikon Corporation, Japonia) sterowanego przez NIS-Elements (wersja 5.4)
DAPI	Servicebio	G1012-100ML	Barwnik do barwienia jąder
DMSO	BioFroxx	1084ML100	Rozpuszczalnik stosowany do przygotowywania roztworów stężonych barwników fluorescencyjnych
Barwnik do barwienia F-aktyny	Thermo Fisher Scientific	A57243	Środek do barwienia F-aktyny do wizualizacji struktur cytoszkieletu i tunelowych nanorurek
Płodowa surowica wołowa	ExCell Bio	FSD500	Dostarcza niezbędne składniki odżywcze do hodowli komórek
Fluorescencyjne przeciwciało wtórne (Kozie przeciwko Królikowi IgG)	ABclonal	AS039	Przeciwciało wtórne do barwienia immunofluorescencyjnego
Miska do hodowli komórek ze szklanym dnem	NEST	801001	Miska do obrazowania do mikroskopi konfokalnej
Surowicy koziej	Solarbio	210C051	Środek blokujący do barwienia immunofluorescencyjnego
MitoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	M22426	Barwnik do barwienia mitochondriów
Neurony	Bank Komórek CAS	HT22-GNM47	Uwiecznione mysie neurony hipokampalne były utrzymywane w pełnym medium DMEM. Komórki w przejściu 3 (P3) zostały zebrane i wykorzystane do kolejnych eksperymentów.
Środek do hodowli neuronów (DMEM)	Servicebio	G4511-500ML	DMEM uzupełnione o GlutaPlus i piórwinian sodu, bez HEPES, uzupełnione o 10% płodowej surowicy wołowej (FBS) i 1% potrójnych antybiotyków
Bufor słony fosforanowy (PBS)	Servicebio	G4203-500ML	Bufor do mycia stosowany podczas utrwalania i barwienia
Triton X-100	Solarbio	P1080	Środek do permeabilizacji komórek